Nghiên cứu xây dựng phương pháp chuẩn phân tích hoocmon clenbuterol trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký khối phổ (gc-ms)

§Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008




1
BỘ CÔNG THƯƠNG
VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
–––––––––––––––––––––––––––––––





BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI R-D CẤP BỘ



Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
CHUẨN PHÂN TÍCH HOOCMON CLENBUTEROL
TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ KHỐI PHỔ (GC/MS”




Chủ nhiệm Đề tài: PHẠM VĂN THÀNH

7313
23/4/2009



Hà Nội, 12-2008
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008




2
Phần I: Tổng quan

1.1 Cơ sở pháp lý của đề tài :
Đề tài thực hiện theo Hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công
nghệ số 89.08.RD/HĐ-KHCN ký ngày 28 tháng 01 năm 2008 giữa Bộ Công
Thơng và Viện Công nghiệp thực phẩm.(Phụ lục kèm theo).
1.2 Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài
Clenbuterol thuộc nhóm - agonist, có công thức hóa học C
12
H
18
Cl

2
N
2
O
đợc sử dụng rộng rãi nh là một chất tăng trọng, nó đợc bổ sung vào thức
ăn chăn nuôi (TĂCN) lợn, gà, bò nhằm kích thích sinh trởng, tăng tỷ lệ nạc,
nhằm giảm chi phí thức ăn. Tuy nhiên, lợng Clenbuterol tồn d trong vật nuôi
có tác động xấu đến sức khoẻ con ngời nh: làm rối loạn nhịp tim, run cơ, co
thắt phế quản, phù nề, liệt cơ, tăng huyết áp. Các nớc Châu âu từ 1988 đã
cấm đa Clenbuterol vào thức ăn chăn nuôi, Mỹ cấm năm 1991.
ở Việt nam, từ năm 2002 theo quyết định số 54/QĐ-BNN của Bộ trởng
Bộ NN& PTNT ký ngày 20/06/2002 đã cấm sản xuất, nhập khẩu, lu thông và
sử dụng Clenbuterol trong sản xuất và kinh doanh thức ăn chăn nuôi. Mặc dù
vậy, việc sử dụng Clenbuterol trộn vào thức ăn chăn nuôi cha phải đã hết do
những mối lợi từ tác dụng của Clenbutarol đem lại. Những kết quả nghiên
cứu của Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam cho thấy, trong 83
mẫu thức ăn hỗn hợp và đậm đặc của 12 công ty có 9 mẫu dơng tính ( chiém
10,8%). Kết quả thử nhanh trên 80 mẫu thịt có 05 mẫu dơng tính ( Chiếm
6,25%). Kết quả của Chi cục Thú y thành phố HCM cũng cho thấy, trong 334
mẫu khả nghi có tồn d Clenbuterol cao thì có 52 mẫu dơng tính (chiếm
15.57%).
Gần đây nhất, cuối năm 2006, đầu năm 2007 Cục Chăn nuôi đã cùng với
các Sở NN-PTNN của 64 tỉnh, thành phố tổ chức lấy mẫu TĂCN tại các đại
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008




3
lý, các trang trại chăn nuôi và cơ sở sản xuất TĂCN để kiểm tra; đã nhận đựơc

kết quả 114 mẫu phân tích có 19 mẫu dơng tính ( chiếm 6,4%). Rõ ràng,
kiểm soát hàm lợng Clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi và trong thực phẩm
là việc phải làm thờng xuyên. Nhằm góp phần giải quyết yêu cầu cấp thiết
của xã hội và công tác kiểm soát VSAT thực phẩm , chúng tôi tiến hành đề tài
: Nghiên cứu xây dựng phơng pháp chuẩn phân tích hocmon Clenbuterol
trong thực phẩm bằng phơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS) . Mục tiêu
của đề tài là :
Xây dựng qui trình chuẩn để phân tích Clenbuterol trong các mẫu thực phẩm
có độ chính xác cao bằng phơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS).
1.3 Đối tợng, phạm vi và nội dung nghiên cứu.
Từ đặc tính và mục đích sử dụng Clenbuterol, dễ dàng nhận thấy các sản
phẩm thực phẩm có khả năng chứa d lợng Clenbuterol không thể nào khác
là thịt gia súc và các sản phẩm từ thịt. Tuy nhiên nguồn cung tạo d lợng chất
độc hại này lại xuất phát từ thức ăn chăn nuôi, vì vậy kiểm soát tận gốc để
phòng ngừa và tránh rủi ro là rất cần thiết. Vì lý do đó, chúng tôi tiến hành xây
dựng qui trình phân tích Clenbuterol bằng sắc ký khí khối phổ cho hai đối
tợng là thức ăn chăn nuôi và thịt động vật. Những nội dung chính của đề tài
nghiên cứu bao gồm :
a. Nghiên cu la chn iu kin tách, lm sch v lm giu mu
Clenbuterol tách chit t m
u.
b. Xác nh iu kn phân tích Clenbuterol trên máy GC/MS.
c. Xác nh hiệu suất thu hồi mẫu, khả năng phát hiện của phơng pháp
d. áp dung phơng pháp đã xây dng khảo sát mt s mu tht v sn
phm thc phm khác trên a bn H Ni; so sánh kết quả kiểm tra với một
số phòng thí nghiệm khác.
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008

4
1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nớc.
1.4.1 Nghiên cứu ứng dụng phơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS).
Sự kết hợp giữa phơng pháp sắc ký và phơng pháp khối phổ (GC/MS) tạo
nên một phơng pháp phân tích đặc biệt có hiệu quả trong lĩnh vực hoá phân
tích. Hai thiết bị này có khả năng bổ sung và hỗ trợ cho nhau trong quá trình
phân tích (GC: tách, MS: phát hiện), vì vậy phơng pháp này đợc sử dụng rất
hữu hiệu cho quá trình khảo sát, định lợng các chất [13]. Hai kỹ thuật trên
ghép nối với nhau có thể tách và định lợng các chất có nồng độ 10
-8
gram
hoặc nhỏ hơn nữa, đây là nồng độ rất khó phát hiện ở các phơng pháp phân
tích công cụ. Ngoài ra, với sự kết nối này, những mẫu không bền trong thời
gian bảo quản cũng có thể đợc phân tích một cách thuận lợi, đặc biệt là việc
phân tích các hỗn hợp phức tạp. Nhờ đó, có thể tiết kiệm khá nhiều thời gian
thực nghiệm vì phân lập mẫu theo nguyên tắc điều chế trớc khi đa vào khối
phổ do vậy giảm nhẹ yêu cầu kỹ thuật đối với các kỹ thuật viên.
Sơ đồ hệ sắc ký khí khối phổ có thể mô tả tóm tắt nh sau:


Về cơ bản, thiết bị sắc ký sử dụng cột nhồi hoặc cột mao quản có thể
ghép nối thiết bị khối phổ loại hội tụ chùm tia đơn hoặc kép [2], [17]. Có nhiều
giải pháp kỹ thuật khác nhau để thực hiện việc ghép nối trong hệ thống. Với
thiết bị hiện đại ngày nay toàn bộ dòng khí thoát ra (khí mang và mẫu) từ cột
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008

5
nhồi hoặc cột mao quản đợc chuyển thẳng vào bộ phận chiết khí mang trung
gian, sau đó đợc đa trực tiếp vào nguồn ion hoá mẫu. Thiết bị chiết khí
mang trung gian có thể có những cấu trúc khác nhau, nhng khi làm việc
chúng phải tuân theo một nguyên lý chung là khuếch tán qua hệ thống lỗ xốp
hoặc khếch tán trong một thiết bị tách khuếch tán phân tử.
Sắc ký đồ đợc ghi lại từ tín hiệu của dòng ion tổng cộng. Những sắc đồ
thu đợc từ tín hiệu dòng ion hoá và detector ion hoá ngọn lửa nói chung tơng
tự nhau.
Sắc ký khối phổ đã đợc sử dụng rộng rãi, đặc biệt nó có thể giúp phát hiện
các cấu tử trong hỗn hợp phức tạp. Nhiều cải tiến quan trọng đã đợc áp dụng,
đặc biệt trong phân tích các hợp chất sinh hoá. Ngoài ra các chơng trình xử lý
số liệu khi ghép nối với máy tính khiến quá trình phân tích trở nên đơn giản
hơn và cho phép thu đợc những kết quả đáng tin cậy.
Phổ khối đợc sử dụng nh một detector đặc biệt, có độ nhạy cao. Trong
trờng hợp này, các thiết bị sẽ cho các giá trị số khối khác nhau và dòng ion
đáp ứng đợc tập hợp và ghi lại dới dạng một sắc đồ (phân mảnh khối). Quá
trình này cho phép xác định đợc cả các mẫu có nồng độ rất nhỏ (tới 10
-10
g).
Về nguyên tắc hoạt động của detector khối phổ, khi cho một chất ở trạng thái
khí va chạm với một dòng electron thì phân tử chất có thể bị tách ra một hoặc
hai electron để trở thành các ion dơng mang điện tích 1 hoặc 2; cũng có thể
quá trình va chạm này làm phân tử chất tiếp nhận thêm electron để trở thành
ion âm, gọi là ion hoá phân tử. Khi va chạm mạnh hơn thì phân tử còn có thể
bị phá vỡ ra thành nhiều phần khác nhau mang điện tích dơng hay âm. Sự phá
vỡ này hoàn toàn phụ thuộc vào năng lợng va chạm, dẫn đến các cách phá vỡ
phân tử khác nhau. Các ion này sẽ đợc tách và đo khối lợng sau đó ghi trên
sắc phổ đồ.
Về kỹ thuật phân tích khối phổ phải tuân thủ các bớc gồm:

Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008




6
Hoá khí chất mẫu: mẫu đợc dẫn vào bình chứa, ở đó áp suất có thể giảm
tới 10
-6
mmHg, sau đó dòng khí này đợc dẫn vào buồng ion hoá để sản ra các
ion, lợng mẫu có thể ghi nhận đợc rất nhỏ 10
-13
g/giây.
Ion hoá mẫu, có thể sử dụng các phơng pháp:
- Ion hoá nhờ các tia hay các phần tử mang năng lợng (electron, photon, hạt
nhân).
- Ion hoá nhờ điện trờng mạnh.
- Ion hoá nhờ sự phòng điện.
- Ion hoá nhờ sự phòng điện.
- Ion hoá nhờ sự đốt nóng (nguồn nhiệt Lazer).
- Ion hoá nhờ tơng tác ion (ion hoá học).
Trên thực tế hiện nay, ngời ta sử dụng phơng pháp ion hoá qua sự va
chạm electron.
Phơng pháp va chạm electron là dòng khí đợc dẫn đi qua một dòng
electron thẳng góc với nó, tuỳ thuộc năng lợng của dòng electron này lớn hay
nhỏ mà các ion đợc sản ra nhiều hay ít (nhìn chung năng lợng này khoảng
70ev).
Tách các ion theo khối lợng, về nguyên tắc việc tách này dựa trên sự khác
nhau về khối lợng của ion hơn là sự khác nhau về điện tích. Trớc tiên ngời
ta tăng tốc độ cho các ion, nhờ cho qua một điện trờng mạnh, vận tốc của các

ion đợc tính theo công thức :


m
eU
V
2
=


Trong đó :
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008




7
- e : Điện tích ion.
- U : Thế tăng tốc.
- m : Khối lợng.
- V : Vận tốc.

Tốc độ này ở trong máy phân tích đạt 100km/s. Sau khi tăng tốc, các ion
đợc bay qua một từ trờng, đờng bay của chúng sẽ bị lệch khác nhau do tác
dụng của từ trờng với bán kính lệch R đợc tính theo công thức:

m 2U
R
2
= x

e H
2


Trong đó:
- R : Bán kính lệch.
- m: Khối lợng ion.
- e: Điện tích ion.
- H: Cờng độ từ trờng.
Một u điểm của sự kết hợp GC/MS là có thể đợc áp dụng một cách hữu
hiệu cho việc nghiên cứu và phân tích các chất đồng vị bền. Nhờ những u
điểm đó mà kỹ thuật phân tích GC/MS ngày càng đợc ứng dụng rộng rãi, có
thể kể ra một số ứng dụng phân tích sau:
- Phân tích các hợp chất chứa nhóm sunfua: áp dụng trong việc kiểm soát ô
nhiễm môi trờng đặc biệt là ô nhiễm bẩn dầu trong nớc biển và ô nhiễm
nguồn cung cấp thức ăn cho con ngời từ cá biển. Các hợp chất chứa
sunfua có thể coi là thớc đo đánh giá sự ô nhiễm trong cá và cá hồi. Trong
các nghiên cứu ngời ta nhận thấy C
3
H
17
- naphtalen ở giá trị m/z 170 và
C
3
H
7
- banzothiophen ở giá trị m/z 176, alkyl benothiophen C
10
H
10

S m/z
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008




8
162 và alkyl naphtalen C
12
H
12
m/z 160. Ngời ta cũng phát hiện ra 5 đồng
phân của alkyl benzothiophen.
- Phân tích các hợp chất hữu cơ có trong nớc ngầm: rất nhiều thực nghiệm
đẫ đợc tiến hành để phân tích lợng vết của các hợp chất hữu cơ tồn tại
trong nớc. Khả năng ứng dụng của phơng pháp sắc ký khí - khối phổ đối
với việc định tính và định lợng các hợp chất hữu cơ độc hại trong các mẫu
nớc thải sinh hoạt, nớc thải công nghiệp ngày càng nhiều. Tuy nhiên việc
phân tích các hợp chất hữu cơ chứa trong nớc tơng đối khó khăn bởi
chúng thay đổi rất nhanh và ở nồng độ rất nhỏ. Vì lý do đó đầu tiên ngời
ta phải sử dụng khối phổ ký để cắt nhỏ các cấu tử, sau đó từ sắc ký khối
phổ đồ này kết hợp với các ion mảnh đợc thể hiện trên các pic, cùng số
liệu thời gian lu của cột để xác định thành phần và nồng độ của chúng.
- Phân tích các cấu tử polyclorua: trong phân tích naphtalen clorua bằng sắc
ký khí khối phổ, ngời ta sử dụng phơng pháp so sánh cờng độ pic
(intensity matching method). Trong phơng pháp này, các đồng phân tự
nhiên của các thành phần chứa các nguyên tử clo hoặc brom trong phân tử
cũng có thể đợc xác định để khẳng định sự có mặt của hợp chất
polyclorua
- Phân tích nitrosamin: nitrosamin là một trong những chất gây ung th, sự

tồn tại của nó trong môi trờng rất nguy hiểm đối với đời sống con ngời.
Mức độ độc hại của nitrosamin rất cao, vì vậy nó thu hút đợc sự chú ý của
rất nhiều nhà khoa học. Có thể sử dụng nhiều phơng pháp để xác định
nitrosamin nh GC, LC Tuy nhiên đối với chất này thì GC/MS vẫn là
phơng pháp không thể thiếu vì sử dụng GC/MS ta có thể xác định đ
ợc
cấu trúc hoá của các thành phần N- nitroso, đây là u điểm lớn của phơng
pháp.
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008




9
- Ngoài các nghiên cứu, ứng dụng trên, hiện nay phơng pháp GC/MS còn
đợc sử dụng rất nhiều trong phân tích d lợng các chất bảo vệ thực vật,
các chất kích thích, các hoá chất độc dễ bay hơi
ở trong nớc, việc tiếp cận với các kỹ thuật phân tích mới, đặc biệt là kỹ
thuật sắc ký khá phổ biến từ khoảng những năm 90, đây là thời kỳ một số
phòng thí nghiệm của các trờng đại học, các Viện nghiên cứu đợc trang
bị các hệ thống sắc ký hiện đại. Với sắc ký khí khối phổ (GC/MS) tuy cha
nhiều nhng bắt đầu có các nghiên cứu ứng dụng của các trờng đại học
nh Đại học Khoa học Tự nhiên với nghiên cứu: Phân tích các hợp chất
hữu cơ dễ bay hơi trong nớc bằng phơng pháp sắc ký khí khối phổ, dùng
kỹ thuật lấy mẫu bay hơi; Nghiên cứu xác định PANs trong khí thải nhà
máy giấy Bãi Bằng, của tác giả Phạm Hùng Việt và cộng sự; Nghiên cứu
xác định Chloramphenicol trong mẫu sinh học bằng phơng pháp sắc ký
khí khối phổ, của tác giả Vũ Công Sáu tuy nhiên cha có công bố
trong nớc nào về nghiên cứu ứng dụng GC/MS để xác định Clenbuterol
trong thực phẩm.

1.4.2 Nghiên cứu xác định Clenbuterol.
Clenbuterol, 4-amino alpha- tert-butylaminomethyl 3,5
dichlorobenzyl alcohol, là một beta- agonist có công thức hóa học
C
12
H
18
Cl
2
N
2
O; phân tử lợng 277,18 trong đó C: 52,00%, H: 6,54%, Cl:
25,58%, N: 10,11%, O: 5,77%.

ở Việt Nam, hiện nay phơng pháp xác định Clenbuterol chủ yếu dựa vào
phơng pháp Eliza, nhng phơng pháp này cho độ tin cậy cha cao nên kết
OH
H
N
Cl
H
2
N
C
l
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008

10
quả kiểm nghiệm đang còn gây nhiều tranh cãi. Để xác định hàm lợng
Clenbuterol trong các mẫu TĂCN Bộ NN&PTNN đã phải gửi mẫu thử sang
Singapore để kiểm tra. Việc làm này đã gây mất nhiều chi phí về tiền của và
thời gian.
Hiện nay, trên thế giới các phơng pháp dùng phát hiện Clenbuterol gồm:
phơng pháp Eliza, Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Sắc ký lỏng hiệu
năng cao khối phổ (LC/MS), Sắc ký khí khối phổ (GC/MS ) trong các
phơng pháp nêu trên, phơng pháp Eliza có u điểm phát hiện nhanh,
mang tính sàng lọc các mẫu thử nhng có độ tin cậy và độ chính xác không
cao. Để định lợng chính xác hàm lợng Clebuterol, ngời ta thờng sử dụng
phơng pháp HPLC/MS hoặc GC/MS. Tuy nhiên phơng pháp HPLC/MS có
độ nhậy thấp hơn, chi phí đắt hơn so với phơng pháp GC/MS; vì vậy xu
hớng xác định d lợng Clenbuterol bằng phơng pháp GC/MS ngày càng
đợc quan tâm ở nhiều nớc.
Theo các tạp chí phân tích chuyên ngành, những phơng pháp phát hịên
Clenbuterol và beta- agonists khác trong các mẫu sinh học đã đợc công bố
trên thế giới có thể thấy: những phơng pháp này phát hiện ở nhiều mức độ
khác nhau, từ phơng pháp miễn dịch enzyme (EIA- enzyme immunoassays),
sắc ký bản mỏng (TLC- thin layer chromatography) tới sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC- high performance liquid chromatography) và sắc ký khí khối phổ
(GC/MS gas chromatography- mass spectrometry) [9]. (Girault and
Fourtillan, 1990; Blanchflower et. al., 1993; Wilson et. al., 1994; Kingston et
al., 1995; Batjoens et al., 1996; Gigosos et al, 1996; Abou- Basha and Aboul-
Enen, 1996; Sangiorgi and Curatolo, 1997). Do có sự trùng hợp về các phản
ứng của beta- agonists và một số steroit, các phơng pháp EIA và RIA (radio
immunoassay) không xác định đầy đủ, chính xác sự hiện diện của các beta-
agonists trong các mẫu sinh học; do đó cần thiết phải sử dụng phơng pháp có
tính đặc hiệu cao. HPLC và GC đáp ứng đợc điều này nhng lại không xác
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008

11
định đợc cấu trúc và các thông tin đầy đủ để khẳng định chắc chắn
Clenbuterol. Khắc phục thiếu sót này, một kỹ thuật có độ nhạy, sự chọn lọc,
phát hiện cao có thể khẳng định kết quả đó là phơng pháp sắc ký khí khối phổ
(GC/MS- gas chromatography- mass spectrometry).
Việc nghiên cứu ứng dụng phơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS) để
phân tích và định lợng Clenbuterol đã đợc nhiều nhà khoa học trên thế giới
quan tâm ngay từ khoảng những năm 1993 1996 (Blanchflower et al., 1993;
Garcia- Regueiro et. al., 1993; Kingston et. al., 1995; Batijoens et. al., 1996).
Ngoài ra cũng đã có những công bố về nghiên cứu ứng dụng GC-MS-MS để
xác định Clenbuterol nhng cha nhiều.
Một hớng khác là ứng dụng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) để xác định
Clenbuterol cũng đã đợc quan tâm. Tác giả E. Ciranni Signoretti, C.
DArpino và F. Latorre đã nghiên cứu phát hiện Clen buterol trong nớc ngọt
(Journal of Chromatography, 473; 301-304) [5].
ở Trung quốc, ít khi có việc vi phạm pháp luật khi sử dụng Clenbuterol vào
thức ăn chăn nuôi vì thờng đợc thay thế bằng Ractopamine. Tuy nhiên việc
kiểm soát đồng thời cả Ractopamine và Clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi
đợc các cơ quan chức năng của Chính phủ quản lý nghiêm ngặt. Việc phát
hiện Clenbuterol và Ractopamine hyđrochlorie trong thức ăn chăn nuôi và thịt
động vật đợc sử dụng phơng pháp HPLC với detector điện hoá (Turberg et.
al., 1994), khả năng phát hiện là 1mg/kg. Năm 2005, Zhang và cộng sự đã
phát triển phơng pháp, sử dụng detector huỳnh quang để phát hiện
Ractopamine trong thức ăn chăn nuôi. Với nghiên cứu này tác giả đã đa giới
hạn phát hiện lên 0,5 mg/kg. Khi sử dụng kỹ thuật LC-UV để phát hiện
Clenbuterol, Chang có thể tìm ra Clenbuterol ở giới hạn 0,05 mg/kg.

Ngoài các nghiên cứu trên, một và tác giả trên thế giới còn sử dụng phơng
pháp Sắc ký khí quang phổ hồng ngoại chuyển hoá fourier để khẳng định sự
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008




12
có mặt của các beta- agonists trong mẫu (T.Visser, M J Vredenbreg and
A.PJM Jong), các công bố này cho thấy khi sử dụng kỹ thuật này khả năng
phát hiện các beta agonists khá cao [22].
Ngoài các nghiên cứu lựa chọn các phơng pháp để phát hiện Clenbuterol
nói riêng, các beta- agonists nói chung, các nhà khoa học trên thế giới
(Milagro Reig, Natalia Batlle, Jose Luis navarro, Fidel Toldra) cũng rất quan
tâm đến các nghiên cứu làm ổn định chúng trong quá trình phân tích [16].
Chiết tách, xử lý và làm sạch mẫu luôn là vấn đề quan tâm đối với các nhà
phân tích. Trong nghiên cứu xác định d lợng Clenbuterol, một số tác giả đã
đề cập đến xử lý mẫu nớc tiểu bằng chiết pha rắn (SPE) ( Christin Berggren,
Sami Bayoudh, David Sherington, Kees Ensing Department of Analytical
Chemistry and Toxicology, University Centre for Pharmacy, Antonius
Deusinglaan 1, 9713 AV Groningen, Netherlands; Department of Pure and
Applied Chemistry, University of Strathclyde), hay trong các mẫu thức ăn gia
súc và chế phẩm sinh học (Gianfranco Brambilla, Maurizio Fiori, Barbara
Rizzo, Vittorio Crescenzi, Giancarlo Masci- laboratorio Medicina Veterinaria,
Viale Regina Elena 299, 1-00161 Rome, Italy; Department of Chemistry,
University of Rome, Italy). Các nghiên cứu này đều cho thấy khi sử dụng kỹ
thuật chiết pha rắn (SPE), các mẫu phân tích đợc làm sạch và làm giầu lên rất
nhiều [4].
1.5 Các phơng pháp xác định Clenbuterol:
Hiện nay các phơng pháp cơ bản đợc sử dụng để xác định d lợng

Clenbuterol gồm có: phơng pháp EIA, phơng pháp HPLC, phơng pháp
GC, ( mở rộng có phơng pháp LC MS, và phơng pháp GC- MS) [8] [9]
[18] [24].
- Phơng pháp EIA hay ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) là
phơng pháp thử nghiệm miễn dịch, gắn enzyme theo phơng pháp cạnh
tranh trực tiếp. Dung dịch chiết xuất từ mẫu đợc trộn với conjugate (kết
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008




13
gắn). Hỗn hợp đợc chuyển vào các giếng phủ kháng thể, tại đó chất cần
phân tích và conjugate cạnh tranh nhau để gắn kết với kháng thể. Phơng
pháp này sử dụng kit thử đợc chế tạo sẵn, u điểm là đơn giản, dễ thao tác,
cho kết quả nhanh (chỉ trong vòng 1 giờ); tuy nhiên độ chính xác không
thật cao, để khẳng định kết quả vẫn phải sử dụng kết hợp với phơng pháp
khác.
- Phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), về nguyên tắc, kỹ thuật
tách bằng HPLC giống với sắc ký cột truyền thống, tuy nhiên HPLC dùng
bơm cao áp, cột nhồi nhỏ; các cấu tử phát hiện bằng các detector có độ
nhậy cao. ứng dụng phơng pháp này, có thể sử dụng detector UV hoặc
detector điện hoá, khối phổ (LC-MS) để phát hiện Clenbuterol; các cột tách
có thể là C8 hoặc C18 với kích thớc: 250 x 4,5mm, 5um hoặc 150 x 3,9
mm, 5um; 150 x 2,1mm, 5um; 150 x 2,1mm, 3um; 50 x 2,1mm, 1,7um.
- Phơng pháp sắc ký khí (GC): Phơng pháp này liên quan đến sự tơng tác
giữa pha hơi và pha lỏng nên khó phát hiện các chất không bay hơi. Có hai loại
sắc ký khí là sắc ký khí lỏng (pha tĩnh là chất lỏng) và sắc ký khí rắn (pha
tĩnh là chất rắn). Mẫu đợc bơm vào buồng bơm mẫu có nhiệt độ cao đủ để
mẫu có thể hoá hơi, khí mang sẽ kéo các cấu tử phân tích qua cột. Tại đây sẽ

có sự tơng tác với pha tĩnh dẫn đến thời gian lu của các cấu tử sẽ khác nhau.
Các cấu tử sẽ lần lợt ra khỏi cột và đi vào detector. Detector sẽ cho tín hiệu
khi có mặt một chất hoặc một nhóm chức nào đó. Tín hiệu của detector sẽ làm
biến đổi tín hiệu điện tỷ lệ với lợng cấu tử.
Tín hiệu đợc khuyếch đại và ghi lại thành sắc ký đồ. Việc phát hiện
đợc sử dụng nhiều với việc kết hợp quang phổ hồng ngoại (gas
chromatography fourier transform infrared spectrometry), hay khối phổ
(MS) [22].


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008




14
Phần II : Thực nghiệm
2.1 Phơng pháp nghiên cứu.
2.1.1 Kỹ thuật chuẩn bị mẫu phân tích.
1.Nguyên tắc chung
Tuỳ đối tợng phân tích, mục đích phân tích, phơng pháp phân tích mà qui
trình phân tích có các bớc cụ thể khác nhau. Tuy nhiên, nhìn chung các bớc
cơ bản của quá trình phân tích một mẫu bao gồm các bớc sau:
Nghiền nhỏ mẫu


Đồng hoá


Chiết tách

Làm sạch


Làm giầu mẫu

Phân tích.
2. Xử lý và chiết tách mẫu:
+ Sản phẩm từ động vật: (Cần phá vỡ các biểu bì động vật)
- Thuỷ phân bằng enzim
- Nghiền nhỏ, đồng hoá
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008




15
- Chiết bằng dung môi
- Sử dụng các chất hoạt động bề mặt.
+ Sản phẩm dầu lipit ( bơ, phomat, dầu béo ) Cần phá vỡ màng polypeptit
trong chất béo và dầu mỡ
- Dùng dung môi phân cực.
- Dung dịch axit, kiềm, chất hoạt động bề mặt.
+ Sản phẩm rau quả: Cần phá vỡ tế bào thực vật bằng nghiền, đồng hoá sau
đó chiết bằng dung môi thích hợp
3.Làm sạch, làm giầu mẫu
- Loại bỏ các tạp chất gây nhiễu.
- Nâng cao độ tinh khiết, độ đậm đặc của chất cần phân tích.
- Đảm bảo an toàn cho cột phân tích ( HPLC,GC)

4. Các phơng pháp chiết tách mẫu
Chiết lỏng- lỏng:
Nguyên tắc: dựa trên cơ sở sự hoà tan ( hoặc phân bố ) khác nhau của
chất trong hai dung môi không trộn lẫn vào nhau.
Ví dụ: Chất X khi chiết đợc phân bố vào hai dung môi A, B không trộn lẫn
vào nhau, hệ số phân bố K
pb
đợc xác định:
K
pb
= C
x
( A )/ C
x
( B )
Trong đó: C
x
( A ) là nồng độ chất X trong A
C
x
( B ) là nồng độ chất X trong B
Nếu K > 99/1 thì coi nh chất X đã chuyển hết vào A
Các điều kiện để chiết:
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008




16
- Dung môi chiết phải có độ tinh khiết cao.

- Dung môi hoà tan tốt chất chiết nhng không tốt với các chất khác
trong mẫu.
- Hệ số phân bố lớn.
- Cân bằng chiết đạt nhanh
- Sự phân lớp khi chiết phải rõ ràng.
Chiết lỏng - rắn:
- Dùng tách các chất phân tích ra khỏi mẫu rắn bằng dung môi thích
hợp.
- Chất phân tích thờng nằm ở thành nang nhỏ hoặc phân tán trong
mẫu.
- Dung môi chiết phải lựa chon phù hợp.
Vi chiết pha rắn
Dựa trên sự cân bằng hấp phụ của chất phân tích trên bề mặt một sợi
nhỏ đặc biệt phủ pha tĩnh. Các pha tĩnh có thể đợc pha trộn với các chất háp
phụ sau đó cho nhúng vào dung dịch hoặc không gian hơi để hấp lu các chất
cần phân tích.
Ưu điểm:
- Đơn giản.
- Lợng mẫu ít.
- Tiết kiệm thời gian.
- Không dung môi
Vi chiết pha lỏng
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008




17
Dựa trên sự cân bằng phân bố của chất phân tích trong môi trờng và giọt
dung môi chiết. Có hai phơng pháp:

- Vi chiết pha lỏng tĩnh.
- Vi chiết pha lỏng động.
Chiết pha rắn
- Chiết pha rắn là kỹ thuật chuẩn bị mẫu nhằm làm sạch và làm giàu
mẫu trớc khi phân tích.
- Tiện ích: Tốn ít dung môi, tiết kiệm thời gian, loại các chất gây nhiễu
tốt hơn, cho độ thu hồi chất phân tích cao và sạch.
Ngời ta chia ra:
+ Dạng hấp phụ:
ở dạng này không có sự liên kết pha nhng dựa vào các nhóm chức
năng có mặt trong chất nhồi cột. Điển hình của dạng này là dùng pha thờng.
+ Dạng phân bố có liên kết pha:
Tơng tác ở đây có sự hấp phụ bề mặt cùng với liên kết cộng kết của
các nhóm chức năng hoá học ( đây là tơng tác chính). Có thể chia ra:
- Pha thờng:
Pha tĩnh phân cực, cho phép các chất tạp nhiễm không phân cực đi qua
và giữ lại các cấu tử cần phân tích phân cực
Dùng tách các chất từ dung môi không phân cực lên bề mặt chất phân
cực. ( Silica pha thờng, Florisil pha thờng )
- Pha ngợc:
Pha tĩnh không phân cực, sẽ giữ lại chất phân tích không phân cực, cho
phép chất phân cực đi qua.
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008




18
Dùng tách các chất phân tích khỏi một pha động phân cực vào một chất không
phân cực ( chất hấp phụ ). ( C8- C18 )

- Cặp đôi ion:
Pha tĩnh không phân cực, việc lu giữ và rửa giải các chất gần theo kiểu
cơ chế pha ngợc.
- Trao đổi ion:
Trên bề mặt chất hấp phụ có chứa nhóm ion chức năng. Có thể dùng
chúng nh kiểu pha thờng hoặc pha ngợc, các chất phân tích trao đổi ion với
chất nhồi cột và đợc tách giữ trên cột.
Lựa chọn kích cỡ và khối lợng chất nhồi cột: Việc lựa chọn này ảnh
hởng trực tiếp đến việc tách, làm sạch và hiệu suất thu hồi mẫu. Khả năng thu
hồi mẫu kém thờng xẩy ra khi kích thớc và khối lợng chất nhồi trong ống
không thích hợp. Sự quá lớn của lớp chất nhồi sẽ dẫn đến sự rửa giải không
hoàn toàn, ngợc lại lớp chất nhồi quá nhỏ sẽ khiến cho việc lu giữ mẫu
không tốt.
Trờng hợp cha biết chắc chắn có thể áp dụng phơng pháp lựa chọn
tối u: bắt đầu bằng một lợng chất nhồi trung bình ( 200mg hoặc 500 mg).
Nếu quan sát thấy khả năng lu giữ mẫu hoàn toàn thì có thể giam bớt lợng
chất nhồi và dung dịch rửa giải. Ngợc lại, nếu quá trình lu mẫu không hoàn
toàn thì phải tăng lợng chất nhồi và dung dịch rửa giải.
2.1.2 Xác định khả năng thu hồi mẫu, LOD và LOQ.
Nghiên cứu khả năng thu hồi mẫu bằng cách bổ sung một lợng mẫu
chuẩn biết trớc vào mẫu sau đó tiến hành các điều kiện phân tích đã lựa chọn
để đánh giá
Xác định hiệu suất thu hồi
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008




19
100(%)

0
21
x
m
mm
R

=

Trong đó : m
1

: lợng chất xác định đợc trong mẫu tự tạo (àg).
m
2

:
Lợng chất xác định đợc trong mẫu trắng (àg).
m
0

: Lợng chất chuẩn trong hỗn hợp dùng để cho vào mẫu
tự tạo (àg) .
R : Độ thu hồi (%).
Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn xác định (LOD).
Giới hạn phát hiện LOD (Limit of detection) là lợng nhỏ nhất của chất
phân tích có thể phát hiện đợc đảm bảo sự khác biệt với mẫu trắng tới 95%;
thông thờng lấy gấp 3 lần độ lệch chuẩn của tín hiệu nhiễu.
Giá trị LOD đợc tính :
LOD = 3 (N/S)xC

Trong đó : N : Độ nhiễu trung bình đờng nền
S : Chiều cao pic của chất cần phân tích
C: Nồng độ chất
Giới hạn xác định LOQ (Limit of quantification) là lợng nỏ nhất của
chất cần phân tích có trong mẫu thử có thể định lợng đợc trong điều kiện
tiến hành phép thử. Thông thờng LOQ đợc lấy từ 3 đến 5 lần LOD.
2.1.3. Tạo sự ổn định, phù hợp cho chất phân tích
Để đảm bảo tính ổn định và phù hợp cho điều kiện phân tích, chất cần
phân tích sẽ đợc chuyển đổi nhờ tạo dẫn xuất. Nguyên tắc chung, phơng
pháp sắc ký khí làm việc dựa vào việc mẫu phải đợc chuyển thành dạng hơi
trong điều kiện thực nghiệm. Một số chất ở dạng bình thờng có thể không
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008




20
phân tích đợc bằng phơng pháp sắc ký khí.Tuy nhiên, các hợp chất này có
thể sử dụng phơng pháp sắc ký khí để phân tích nếu chúng đợc chuyển hoá
thành các dẫn xuất tơng ứng dễ bay hơi. Dẫn xuất hoá, ngoài việc làm tăng
khả năng bay hơi của các cấu tử cần phân tích, còn làm chuyển hoá những
nhóm phân cực của các cấu tử thành những nhóm không phân cực tơng ứng,
nh vậy hạn chế khả năng hấp phụ mạnh trong quá trình sắc ký do tơng tác
của các nhóm phân cực gây ra.
2.1.4 Phơng pháp ngoại chuẩn.
Phơng pháp này tiến hành bằng cách lập đờng chuẩn với các nồng
độ mẫu khác nhau và diện tích pic tơng ứng của các nồng độ cấu tử cần xác
định.
2.1.5 Phơng pháp nội chuẩn.
Ngời ta thêm vào mẫu một lợng xác định của chất đợc chọn làm nội

chuẩn. Chất nội chuẩn có thể là chất lạ, cũng có thể là một cấu tử nào đó có
sẵn trên sắc đồ. Nếu là chất lạ thì thời gian lu của nó phải gắn với thời gian
lu của cấu tử cần phân tích.
2.1.6 Phơng pháp tự nội chuẩn.
Phơng pháp tự nội chuẩn là phơng pháp sử dụng chính cấu tử cần
phân tích bổ sung thêm vào mẫu. Sau đó so sánh sắc ký đồ của mẫu trớc và
sau khi bổ sung mẫu chuẩn.
2.2 Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu chính
Thiết bị, dụng cụ
- Sắc ký khí khố phổ GCMS Agilent
Gas Chromatograph Mass Spectrometer Agilent 6890
- Bộ cô quay chân không IKA- HB4
Rotary Evaporators IKA-HB4
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008




21
- Bể rửa dụng cụ ( pipet ) siêu âm
Untrasonic LC 60H, SIBATA
- Bộ khử ion nớc Barnstead
Compact ultrapur water system LF Bernstead
- Tủ sấy dụng cụ DG-82 Yamato
Drying Oven DG-82
- Cân kỹ thuật BV 320D Shimadzu
Balance BV 320 Shimadzu
- Máy nghiền mẫu IKA MF10
Analytical Mill IKA MF 10
- Máy ly tâm HETTICH- Rotina 35R

Centrifuger HETTICH Rotina 35 R
- Máy lắc đứng SA 300 Yamato
Shaker SA 300 Yamato
- Cân phân tích Precisa
Analytical balance XT 220 A
- Tủ hút khí độc
Fumer hood
- Bộ chiết pha rắn Supel.Co.
- Máy lắc Voxtex, hãng IKA
- Bình định mức: dung tích 5ml, 10ml, 50ml, 100ml hãng Dural, Đức
- Phễu chiết loại 100ml, 200ml,300ml
- Ông nghiệm dung tích 15 ml đã silan hóa.
- Bình cầu cô quay, các loại ống đong, pipet,
Hóa chất
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008




22
- Methanol, loại dùng cho sắc ký, hãng Merk
- Axit chlohydric (HCl) loại dùng cho sắc ký, hãng Merk.
- Axít perchloric (HCl0
4
): loại dùng cho sắc ký, hãng Merk
- Isopropanol, loại dùng cho sắc ký, hãng Merk
- Ethyl acetate, loại dùng cho sắc ký, hãng Merk
- Amonium hydroxyt, loại dùng cho sắc ký, hãng Merk
- Toluen,loại dùng cho sắc ký, hãng Merk
- Amoni acetate, loại dùng cho sắc ký, hãng Wako. Japan.

- N- methyl- N- (trimethylsilyl) trifluoro acetomide (MSTFA) : loại
dùng cho phân tích sắc ký, hãng Sigma, USA.
- Trimethylchlorosilane (TMCS), hãng Nacalai tesque, Japan
- Clenbuterol hydrochloride, hãng Dr. Ehrenstorfer, Germany
- Acebutolol hyhrochloride, hãng Sigma.USA
- Khí Nitơ : Độ tinh khiết 99,99%
- Cột làm sạch: C18, SCX,
-

2.3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận
2.3.1 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện tách, làm sạch và làm giầu mẫu
Việc chiết tách, làm sạch và làm giầu mẫu là khâu rất quan trọng cho
mọi quá trình phân tích, đặc biệt là những chất phân tích có hàm lợng nhỏ
trong mẫu (dạng d lợng). ảnh hởng của giai đoạn này rất lớn, có thể chiếm
tới 70% sai số của cả quá trình phân tích. Trong nội dung nghiên cứu của đề tài
này, để đảm bảo cho việc chiết tách, làm sạch và làm giàu Clenbuterol từ mẫu
chúng tôi tiến hành xử lý mẫu theo các bớc sau:
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008




23
a. Xử lý mẫu sơ bộ: Mẫu nghiên cứu đợc nghiền nhỏ bằng máy nghiền
và máy đồng hoá để phá vỡ tế bào (đối với thịt) và tăng cờng khả năng tiếp
xúc của mẫu với dung môi chiết ở bớc tiếp theo, tạo điều kiện cho quá trình
chiết mẫu đợc triệt để.
b. Chiết tách:
Chiết tách là bớc quan trọng trong quá trình phân tích, mục đích của
bớc này là lựa chọn dung môi để chuyển toàn bộ chất cần phân tích vào dung

môi chiết. Có nhiều loại dung môi có thể sử dụng, tuy nhiên dung môi lựa
chọn cần hoà tan tốt nhất các chất cần chiết và không tạo phản ứng hoá học với
chất chiết. Trên cơ sở tài liệu tham khảo và thực tiễn nghiên cứu, chúng tôi lựa
chọn ba dung môi chiết tách gồm:
- Dung dịch HCl 0,1M.
- Dung dịch HClO
4
0,1M.
- Methanol.
Thí nghiệm đợc tiến hành trên 2g mẫu, lợng dung môi sử dụng là 20 ml
Kết quả nghiên cứu đợc trình bầy ở bảng 1
Bảng 1. Nghiên cứu lựa chọn dung môi chiết tách
STT Dung môi chiết tách Khả năng chiết tách
(Độ thu hồi mẫu (%)
1 Dung dịch HCl 0,1M. 85
2 Dung dịch HClO
4
0,1M 90
3 Methanol. 81

Từ kết quả trên cho thấy: khả năng chiết tách của cả 3 loại dung môi sử
dụng đều cao, độ thu hồi đều đạt trên 80%, tuy nhiên dung dịch HClO
4
0,1M
cho kết quả tốt nhất. Hơn nữa khi sử dụng dung môi này sẽ kinh tế và không
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008

24
độc hại bằng methanol. Chính vì vậy các nghiên cứu sau này đều sử dụng
HClO
4
0,1M cho quá trình chiết tách.
c. Làm sạch mẫu đã chiết tách.
Làm sạch bằng chiết lỏng - lỏng
Dựa trên các tài liệu tham khảo, việc chiết tách Clenbutarol tốt nhất là
dùng dung môi ethyl acetate isopropanol. Tuy nhiên việc thay đổi tỷ lệ dung
môi sẽ ảnh hởng đến khả năng chiết tách đối tợng phân tích có trong mẫu.
chính vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi thay đổi tỷ lệ hỗn hợp dung môi
để lựa chon hệ dung môi thích hợp nhất.
Kết quả nghiên cứu đợc trình bày tại bảng sau:
Bảng 2. Nghiên cứu lựa chọn dung môi chiết lỏng- lỏng
STT Dung môi chiết tách Khả năng chiết
tách
Ghi chú
1 Ethyl acetate Isopropanol
(1:1), V/V
Tách kém Phân lớp kém
2 Ethyl acetate Isopropanol
(7:3), V/V
Tách không rõ Phân lớp
3 Ethyl acetate Isopropanol
(9:1), V/V
Tách tốt Phân lớp tốt

Kết quả ở bảng 2 cho thấy, khi thay đổi tỷ lệ dung môi chiết thì khả
năng chiết có sự khác biệt rõ rệt. Với dung môi có tỷ lệ 9:1 khả năng chiết tách
là tốt nhất.

Sau khi lựa chọn tỷ lệ dung môi chiết tách phù hợp, chúng tôi xem xét
số lần lặp trong quá trình chiết tách để đảm bảo khả năng chiết tách triệt để
hơn. Thí nghiệm đợc tiến hành bằng cách chuẩn bị các mẫu trắng sau đó bổ
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008




25
sung thêm chuẩn vào; từ các mẫu đã chuẩn bị tiến hành chiết tách để đánh giá
khả năng chiết triệt để của hệ dung môi lựa chọn.
Kết quả nghiên cứu trình bày trong bảng 3.
Bảng 3. Nghiên cứu số lần chiết tách mẫu
STT Điều kiện chiết tách
(lợng dung môi x số lần chiết)
Khả năng chiết tách
(hiệu suất thu hồi)%
1 15 ml x 1 lần 70
2 30 ml x 1 lần 75
3 15 ml x 2 lần 96
4 15 ml x 3 lần 96

Với kết quả trên có thể thấy, khi sử dụng cùng một lợng dung môi 30
ml, nếu đợc chia ra để chiết tách làm hai lần thì hiệu quả cao hơn rất nhiều,
lần chiết tách thứ ba lợng chất chiết thu đợc không đáng kể, vì vậy chúng tôi
lựa chọn lợng dung môi chiết (ethyl acetate isopropanol = 9:1 V/V) 30ml
và chiết làm hai lần, mỗi lần 15 ml.
Làm sạch mẫu bằng chiết pha rắn.
Làm sạch và làm giàu mẫu là khâu hết sức quan trọng trong phân tích,
đặc biệt đối với các phơng pháp sắc ký thì đây là công đoạn không thể thiếu.

Từ các kỹ thuật làm sạch và làm giàu mẫu đã biết, trên cơ sở tham khảo tài
liệu, chúng tôi lựa chọn phơng pháp làm sạch bằng chiết pha rắn (SPE
Cleanup):
- Chiết pha rắn là kỹ thuật chuẩn bị mẫu nhằm làm sạch và làm giàu
mẫu trớc khi phân tích.
- Nguyên tắc của chiết pha rắn: hấp phụ chất cần phân tích lên pha rắn,
sau đó chất phân tích đợc rửa giải bằng dung môi thích hợp.