2 pcr

PCR
(POLYMERASE CHAIN REACTION)
ThS. Nguyễn Kim Thạch
BM. Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử
Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch

E-mail:
1


Kary Mullis 1985
Đạt giải Nobel 1993


• PCR: phản ứng chuỗi DNA trùng hợp
• Là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn DNA với
tốc độ nhanh, có độ chính xác cao, khơng cần sự
hiện diện của tế bào
• Phản ứng PCR cho phép khuyếch đại một đoạn
DNA nằm giữa 2 mồi chuyên biệt, nhờ DNA
polymerase


Nguyên tắc
• Dựa trên sự hoạt động của emzyme
• Sự hiện diện của mồi chuyên biệt

• Khả năng nối dài mồi của taq polymerase
• Các Nu tự do trong mơi trường

Máy PCR


Các bước phản ứng
• Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ mỗi chu kỳ gồm 3 bước
– Bước 1: Biến tính (denaturation)
• 94-98oC
• 2-5 phút
– Bước 2: Gắn mồi (anneealing)
• 30-65oC
• 20s-2’

– Bước 3: kéo dài (extending)
• 68-72oC
• 20s-5’


Các bước phản ứng


Các chu kỳ của kỹ thuật PCR


Sơ đồ phản ứng chuỗi Polymerase


Mồi (primers)
- Oligonucleotide đơn mạch (18-24 b) bổ sung với 2
vùng trên trình tự DNA
- Mồi xi (sense primer hoặc Forward) bắt cặp với

mạch khuôn của DNA và sẽ kéo dài theo chiều phiên mã
- Mồi ngược (anti sense primer hoặc Reverse) bắt cặp với
mạch mã của DNA và sẽ kéo dài ngược theo chiều phiên
mã
3’
5’

5’
3’
3’

5’

5’

3’


Nguyên tắc thiết kế mồi
– Trình tự của mồi được thiết kế sao cho khơng có sự
bắt cặp giữa mồi xi và mồi ngược, kể cả cấu trúc
kẹp tóc
– Nhiệt độ gắn mồi của mồi xuôi và mồi ngược không
được chênh lệch quá xa (Không nên quá nhiều G hoặc
C nối tiếp nhau thường tỷ lệ G, C nằm trong khoảng
30%< G+C<70%))
– Không nên nhiều bắt cặp sai với DNA khn
– Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA
cần khuyếch đại khơng trùng với các trình tự lặp lại
trên DNA

– Trình tự nằm giữa mồi xi và mồi ngược không quá
lớn (<3000 tốt nhất là dưới 1000)


Ngun tắc thiết kế mồi
Cách thiết kế mồi:
• Mồi xi: cùng trình tự với mạch mã
• Mồi ngược: là trình tự ngược và bổ sung với
mạch mã
• Cách tính Tm (nhiệt độ gắn mồi)
Tm = 4(G+C) + 2(A+T)


Polymerase chịu nhiệt
Taq-polymerase: từ Thermus aquaticus
Nhiệt độ tối ưu: 72C
Có hoạt tính 5'->3' polymerase
Có hoạt tính terminal transferase: thêm 1 Adenosine ở đầu 3’
của mạch DNA mới.
Khơng có khả năng sửa sai (2x10-5 , 0.25% sai sau 30 chu kỳ)
Sao chép ~ 2000b/min. Không sao chép được trên 3kb
Pfu-polymerase: từ Pyrococcus furiosus
Nhiệt độ tối ưu: 72C
Có hoạt tính 5'->3' polymerase và 3’-> 5’ exonuclease
Tỷ lệ chép sai thấp (1.5x10-6)
Sao chép ~ 500b/min


Dung dịch đệm (Buffers)
•

•
•

Có nhiều loại buffer sử dụng riêng cho từng
loại enzyme.
Một số buffer chứa chất hoạt động bề mặt có
thể ảnh hưởng đến các phản ứng
Nhiều loại buffer đã có sẵn ion Mg2+


Nồng độ Mg2+ và dNTP
• Nồng độ ion Mg2+ cao: xuất hiện thêm các sản phẩm khơng
đặc hiệu.
• Nồng độ ion Mg2+ thấp: lượng sản phẩm PCR thấp.
• Nồng độ ion Mg2+ phụ thuộc vào loại DNA polymerase,
DNA mẫu và thành phần buffer
• gradien nồng độ từ 0.5 đến 2 mM với các khoảng cách mỗi
bước là 0.2 mM.
• dNTPs là loại hóa chất kém bền
• Lượng dNTP tối ưu là 200 µM of mỗi loại dNTP. Việc tăng
dNTP khơng làm tăng đáng kể lượng sản phẩm PCR so với
việc hiệu chỉnh các yếu tố khác


Chất bổ sung khác
• Đối với các DNA template lớn, giàu GC thì
có thể sử dụng các chất biến tính như
DMSO, formamide, glycerol, and betaine
trong thành phần PCR.
• Tăng lượng DMSO trong PCR sẽ cần giảm

nhiệt bắt mồi xuống.
• Dầu khoáng


Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
1. DNA mẫu: (100ng-1g)

2. Enzyme
3. Mồi và nhiệt độ gắn mồi (nhiệt độ lai)
4. dNTP: 20-200M/ mỗi lọai Nu
5. Nồng độ Mg++
6. Số lượng chu kỳ phản ứng
7. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng


Một số vấn đề thường gặp
• Vệt smear kích thước lớn hơn sản phẩm mong
muốn
– Giảm DNA, thời gian kéo dài, số chu kỳ
– Tăng nhiệt độ gắn mồi
– Thay đổi nồng độ Mg2+
– Tăng thời gian kéo dài nếu sp mear có kt nhỏ


Một số vấn đề thường gặp
Băng sản phẩm phụ rõ nét với kích thước thấp hơn sản
phẩm mong muốn
–
–
–

–
–
–
–

Tăng nhiệt độ bắt mồi 2°C và/hoặc tăng thời gian bắt mồi
Tăng thời gian kéo dài thêm 30s.
Giảm nồng độ DNA polymerase.
Tối ưu hóa nồng độ Mg2+.
Tinh sạch DNA template
Giảm nồng độ primer.
Thiết kế cặp primer mới.


Tóm tắt qui trình thực hiện một phản ứng PCR
Thiết kế mồi
Chuẩn bị mẫu DNA
Pha mix với các thành phần theo thứ tự sau:
– H2O tiệt trùng
– Buffer
– dNTP tổng số
– mồi xuôi
– mồi ngược
– Taq polymerase
– DNA mẫu
4. Cho vào máy lập chương trình chạy phù hợp
5. Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose với sự có mặt của
thang chuẩn
6. Phân tích kết quả
1.

2.
3.