Luận văn : Phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon) bằng kỹ thuật Real - time PCR part 2 doc

32

Ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt

Tinh sạch bằng Instagene Matrix


Chuẩn bị hỗn hợp Real - time PCR

Mẫu tôm

Sơ đồ 3.1 Quy trình thực hiện Real - time PCR

Chạy Real - time PCR

i
i
Q
Q


Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa
nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ

Phân tích kết quả



33

3.4.4. Thực hiện Non Stop Nested PCR
3.4.4.1. Chuẩn bị hỗn hợp để thực hiện phản ứng Non Stop PCR
- Sử dụng micropipette hút 2 µl dung dịch tách chiết ADN của mẫu cần phân tích
cho vào ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Non Stop Nested PCR để đạt thể
tích phản ứng sau cùng là 50 l.
- Đối chứng âm: cho 2 µl đối chứng âm vào ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn
hợp Non Stop Nested PCR.
- Đối chứng dương: cho 2 µl đối chứng dương vào ống eppendorf có chứa sẵn 48
µl hỗn hợp Non Stop Nested PCR.
3.4.4.2. Thiết lập chƣơng trình thực hiện Non Stop Nested PCR trên phần
mềm của máy iCycler
Chương trình luân nhiệt như sau:
Chu kỳ 1: lặp lại 1 lần
Bước 1: 40
o
C 10 phút
Chu kỳ 2: lặp lại 1 lần
Bước 1: 95
o
C 5 phút
Chu kỳ 3: lặp lại 20 lần
Bước 1: 94
o
C 30 giây
Bước 2: 58
o
C 30 giây
Bước 3: 72
o
C 1 phút

Chu kỳ 4: lặp lại 40 lần
Bước 1: 94
o
C 30 giây
Bước 2: 51
o
C 30 giây
Bước 3: 72
o
C 1 phút
Chu kỳ 5: lặp lại 1 lần
Bước 1: 72
o
C 7 phút
Giữ ở 4
o
C cho đến khi phân tích
3.4.4.3. Chạy Non Stop Nested PCR
Kiểm tra lại các thông số đã thiết lập trên máy iCycler, sau đó thực hiện Non Stop
Nested PCR.



34
3.4.4.4. Điện di và phân tích kết quả
Sản phẩm sau khi khuếch đại xong được điện di ngay trên thạch agarose 2% có
chứa ethidium bromide.
- Nguyên tắc của điện di: nguyên tắc này dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic
acid. Các đại phân tử này tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác
động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Dựa vào

kích thước các đoạn khuếch đại, các đoạn ADN khác nhau tách nhau ra sau khi điện
di. Đoạn khuếch đại càng dài, băng thể hiện trên bản điện di càng gần vị trí giếng nạp
mẫu.
- Chuẩn bị gel agarose 2%: cho 4 gram agarose vào 200 ml dung dịch TBE 0,5X,
đun chảy hoàn toàn, để nguội khoảng 60
0
C rồi thêm 10 µl ethidium bromide (10 mg/ ml),
trộn đều, đổ khuôn, để gel nguội trong khoảng 30 phút. Sau đó đưa vào khay điện di
có chứa dung dịch TBE 0,5X để tiến hành điện di.
- Nạp (load) mẫu: chuẩn bị mẫu thử bằng cách cho 12 µl dung dịch nạp mẫu
(loading buffer) (có glycerol và bromophenol blue) vào trong mỗi mẫu thử. Dùng
micropipette cho 15 µl mẫu và 15 µl thang ADN chuẩn vào giếng theo thứ tự.
- Điện di trên gel agarose: điện di trong thời gian 30 phút ở 100 V và 50 mA.
Sau khi điện di hoàn tất (khi thấy vệt màu xanh cách mép gel agarose khoảng 2 –
2,5 cm) lấy khuôn ra khỏi máng và đẩy nhẹ gel lên bàn đọc UV. Xem các băng ADN
dưới tia sáng của đèn UV hay bằng máy phân tích điện di GelDoc iQ của Bio – Rad.
Phân tích kết quả điện di dựa trên kích thước đoạn ADN đặc hiệu được xác định dựa
trên thang ADN chuẩn (chi tiết ở mục 3.4.5.2).
Quy trình thực hiện Non Stop Nested PCR được tóm tắt qua Sơ đồ 3.2.










35

Chạy Non Stop Nested PCR

Sơ đồ 3.2 Quy trình thực hiện Non Stop Nested PCR


Chuẩn bị hỗn hợp Non Stop Nested PCR
Chạy điện di

Mẫu tôm

Ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt

Tinh sạch bằng Instagene Matrix


633bp
221bp
Phân tích kết quả

36
3.4.5. Cách đọc kết quả
3.4.5.1. Real - time PCR
Kết quả sau khi thực hiện Real - time PCR được xử lý trên phần mềm iQ version
3.1 của máy iCycler iQ và phần mềm excel.
Kết quả kiểm tra mẫu qua Real - time PCR được phân tích qua đồ thị biểu diễn mối
quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ, đồ thị biểu diễn đường chuẩn, bảng
kết quả chạy mẫu.
Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ

Trong suốt thời gian chạy chương trình Real - time PCR, ta có thể nhận biết sự
biểu hiện nồng độ ADN của WSSV trong các mẫu thử bằng cách quan sát các đường
biểu diễn nồng độ huỳnh quang trên màn hình vi tính. Sau khi kết thúc chương trình,
phân tích trên biểu đồ biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ
để biết mẫu dương tính và mẫu âm tính.

















Có hai cách thể hiện đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số
chu kỳ: dạng log (log view) – đơn vị huỳnh quang ở trục Y được tính ở dạng log và
▲: các chuẩn
: mẫu dương tính
: mẫu âm tính
: đối chứng âm

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang
và số chu kỳ


Đường biểu
diễn tín hiệu
huỳnh
quang
Baseline
subtracted
(đường đã
trừ đi tín
hiệu nền)
Chu kỳ
ngưỡng (Ct)

37
dạng biểu diễn thường (normal view) – đơn vị huỳnh quang ở trục Y được tính ở dạng
số thường, không quy đổi ra log. Trong đề tài này tôi chọn cách phân tích kết quả ở
dạng log (Hình 3.5). Đồ thị thể hiện các mẫu dương tính là các mẫu có đường biểu
diễn tín hiệu huỳnh quang vượt qua đường baseline subtracted (đường đã trừ đi tín
hiệu nền). Các mẫu âm tính là các mẫu có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang nằm
dưới đường baseline subtracted. Đồ thị ở Hình 3.5 sẽ giúp người phân tích xác định
được chu kỳ ngưỡng. Chu kỳ ngưỡng được xác định khi đường baseline subtracted cắt
tất cả các đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang của mẫu kiểm tra trong giai đoạn
tuyến tính giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ (pha log).
Sau đó phân tích đường chuẩn và bảng kết quả để biết được hàm lượng WSSV có
ban đầu trong 2 µl mẫu thử.
Đồ thị biểu diễn đường chuẩn

Đường chuẩn được dựng nên từ 5 chuẩn ở Hình 3.6 với trục tung: chu kỳ ngưỡng -
Ct (threshold cycle) và trục hoành: giá trị logarit của số lượng bản sao ban đầu (Log
Starting Quantity) có đơn vị là số bản sao (copy number). Đường chuẩn thể hiện mối
quan hệ giữa log số bản sao ban đầu (X) và chu kỳ ngưỡng (Y). Thông qua chu kỳ
ngưỡng được thể hiện qua Hình 3.5, giá trị log số bản sao ban đầu được xác định theo
phương trình Y = a.X + b. Đồ thị này còn thể hiện các mẫu dương tính qua các
unknown (mẫu cần kiểm tra) - các hiển thị tương ứng với chu kỳ ngưỡng và log số bản
sao ban đầu trên đường chuẩn. Theo Too H. P. (2001), số bản sao trình tự đích ban đầu
càng nhiều tương ứng với số chu kỳ ngưỡng càng thấp.
Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn



38
Các thông số cần phân tích thể hiện trên đường chuẩn bao gồm: hệ số tương quan
(r
2
) (correlation coefficient), hiệu quả phản ứng (PCR efficiency) và độ nghiêng
(slope).
 Hệ số tương quan (correlation coefficient)
Hệ số tương quan càng cao tương ứng với các thông số thí nghiệm càng chính xác
và phù hợp với giá trị mong đợi. Hệ số tương quan có giá trị giữa 0 và 1. Nếu không

có sự tương quan giữa giá trị dự đoán (predicted values) và giá trị thực sự, hệ số tương
quan là 0 hay rất thấp. Sự tương quan giữa giá trị dự đoán và giá trị thực sự cao thì hệ
số tương quan tiến gần đến 1. Sự phù hợp hoàn hảo tương ứng với hệ số tương quan
bằng 1 (Bio – Rad, 2004).
 Hiệu quả phản ứng và độ nghiêng
Độ nghiêng của đường chuẩn tương quan chặt chẽ với hiệu quả phản ứng. Hiệu quả
phản ứng sẽ cho biết các thông tin có giá trị về hóa chất phản ứng. Độ nghiêng của
đường chuẩn tương quan với hiệu quả phản ứng qua phương trình sau:
Hiệu quả (efficiency) = [10
(-1/slope)
] – 1 (slope: độ nghiêng) (3.1)
Độ nghiêng – 3,322 cho hiệu quả 100%. Khi đó số lượng mạch khuôn mẫu
(template) tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ khi sự khuếch đại tăng theo cấp số
(exponential amplification). Độ nghiêng thấp hơn – 3,322 cho thấy hiệu quả phản ứng
thấp hơn 100%. Hầu hết các phản ứng đều không đạt tới 100% do các giới hạn thí
nghiệm. Độ nghiêng cao hơn – 3,322 cho hiệu quả phản ứng Real - time PCR cao hơn
100%. Điều này do các giá trị được đo ở giai đoạn không có sự tuyến tính giữa nồng
độ huỳnh quang và số chu kỳ hay do sự hiện diện của các chất ức chế trong phản ứng
(Qiagen, 2004).
Bảng kết quả chạy mẫu
Bảng kết quả xuất ra từ máy có dạng như sau:








39

Kết quả kiểm tra mẫu qua Real - time PCR sẽ được phân tích chủ yếu dựa trên: số
bản sao ban đầu (SQ), giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct). Nếu có sự lặp lại các mẫu, kết quả
còn được phân tích qua số bản sao trung bình (SQ Mean), giá trị chu kỳ ngưỡng trung
bình (Ct Mean), độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu (SQ SD), độ lệch chuẩn của chu
kỳ ngưỡng (Ct SD). Các cột còn lại ở Bảng 3.1 nhằm thể hiện vị trí đặt mẫu, loại
mẫu,…giúp người phân tích biết rõ thông tin về mẫu cần kiểm tra.
3.4.5.2. Non Stop Nested PCR
Kết quả sau khi thực hiện Non Stop Nested PCR được phân tích dựa trên kích thước
đoạn khuếch đại đặc hiệu và thang ADN chuẩn qua quan sát các băng ADN dưới tia
sáng của đèn UV hay bằng máy phân tích điện di GelDoc iQ của Bio – Rad.
Sản phẩm khuếch đại đặc hiệu của WSSV khi chạy Non Stop Nested PCR là đoạn
có kích thước 633 bp và 221 bp. Dựa vào thang ADN chuẩn, xác định sự hiện diện
băng điện di của đoạn 633 và 221 bp ở đối chứng dương. Sau đó so sánh băng điện di
của mẫu với hai băng đặc hiệu trên để xác định mẫu dương tính hay âm tính với
WSSV.

Well Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct
SQ Mean SD Mean SD
A01
A03
A05
A07
A09
Bảng 3.1 Bảng kết quả kiểm tra mẫu qua Real - time PCR
Well: vị trí giếng
Type: loại mẫu
Identifier: định tên mẫu
Rep: vị trí mẫu trên 96 giếng
Ct: chu kỳ ngưỡng
SQ: starting quantity: số bản sao ban dầu
SD: standard deviation: độ lệch chuẩn
Mean: trung bình


40

3.5. Bố trí thí nghiệm
3.5.1. Thí nghiệm 1: thử nghiệm hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc
nhiệt và ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix
Để ly trích ADN, có hai quy trình đã được thử nghiệm:
- Quy trình 1: ly trích ADN sử dụng SDS, NaOH, và sốc nhiệt.
- Quy trình 2: ly trích ADN sử dụng Instagene Matrix sau khi đã ly trích bằng SDS,
NaOH, và sốc nhiệt.
Mục đích
Khảo sát hai quy trình ly trích nhằm tìm ra quy trình ly trích tối ưu.
Tiến hành
Sử dụng mẫu tôm nhiễm WSSV với mức độ nặng (đã qua xét nghiệm) được lưu trữ
tại công ty Nam Khoa để tiến hành tách chiết ADN theo hai quy trình ly trích (chi tiết
ở mục 3.4.2). Sau khi ly trích xong, dịch tách chiết ADN được pha loãng theo hệ số
pha loãng bậc 10. Dùng micropipette hút 5 µl dịch tách chiết ADN cho vào 45 µl dung
dịch TE 1X (Tris EDTA), tiến hành trộn mẫu trên máy vortex, sau đó hút 5 µl mẫu từ
ống eppendorf vừa vortex ở trên chuyển sang ống eppendorf thứ hai có chứa sẵn 45 µl
TE 1X, trộn đều. Quá trình cứ lặp lại, cuối cùng ta thu được một dãy các nồng độ
ADN theo chiều giảm dần từ 10
0
đến 10
-6
(Hình 3.8). Tiến hành thực hiện phản ứng
Real - time PCR cho tất cả các nồng độ từ 10
-1
đến 10
-6
của cả hai quy trình ly trích.

633bp
221bp

Hình 3.7 Kết quả điện di qua Non Stop Nested PCR
MK: thang ADN chuẩn

41












Dựa vào kết quả so sánh chu kỳ ngưỡng của mẫu ở từng nồng độ pha loãng theo
hai quy trình ly trích để xác định mẫu ly trích theo quy trình nào sẽ có ADN đích nhiều
và tinh sạch hơn (mẫu có ADN đích nhiều và tinh sạch hơn sẽ có chu kỳ ngưỡng thấp
hơn).
3.5.2. Thí nghiệm 2: sử dụng phƣơng pháp Real - time PCR kiểm tra phát hiện
và định lƣợng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dƣơng
tính, âm tính với WSSV
Mục đích

Thử nghiệm khả năng phát hiện và định lượng WSSV bằng phương pháp Real - time
PCR.
Tiến hành
15 mẫu tôm (8 mẫu dương tính và 7 mẫu âm tính với WSSV) đã qua kiểm tra PCR
và Semi – Nested PCR được tiến hành ly trích theo quy trình xác định từ thí nghiệm 1.
Các mẫu này được thử nghiệm lặp lại hai lần qua Real - time PCR và đồng thời một
lần qua Non Stop Nested PCR. Các mẫu tôm sau khi ly trích này được chạy kèm với 5
chuẩn. Sau khi ly trích xong, dùng micropipette hút 2 µl dịch tách chiết chứa ADN của
WSSV cho vào từng hỗn hợp 48 µl Real - time PCR và hỗn hợp 48 µl Non Stop
Nested PCR. Đối với chuẩn, hút 2 µl mỗi chuẩn cho vào 48 µl hỗn hợp Real - time
PCR. Tiến hành thực hiện phản ứng Real - time PCR và Non Stop Nested PCR (chi
tiết ở mục 3.4.3 và 3.4.4).
Mẫu nào có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang vượt qua đường baseline
subtracted được xác định là dương tính với WSSV. Mẫu nào có đường biểu diễn tín
hiệu huỳnh quang nằm dưới đường baseline subtracted được xác định là âm tính với

5 µl mẫu







45 µl
TE
10
0
10
-2

10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-1
5 µl
5 µl
5 µl
5 µl
5 µl
5 µl
Hình 3.7 : Cách pha loãng mẫu theo hệ số pha loãng bậc 10


Hình 3.8 Cách pha loãng mẫu theo hệ số pha loãng bậc 10

10
0
10
-1
10
-4
10
-3
10

-2
10
-5
10
-6

42
WSSV. Kết quả chạy Real - time PCR được đối chiếu với kết quả chạy Non Stop
Nested PCR và so sánh với kết quả đã xét nghiệm trước đó bằng phương pháp PCR và
Semi – Nested PCR. Số bản sao ban đầu của WSSV được định lượng dựa trên đường
chuẩn và cho kết quả ở bảng số liệu xuất kết quả sau khi chạy mẫu.
3.5.3. Thí nghiệm 3: khảo sát tính định lƣợng của phƣơng pháp Real - time
PCR
Mục đích
Khảo sát tính tuyến tính và độ lặp lại về khả năng định lượng của phương pháp
Real - time PCR.
Tiến hành
Chọn ngẫu nhiên hai mẫu nhiễm virus gây bệnh đốm trắng ở mức độ nặng từ thí
nghiệm 2, tiến hành ly trích theo quy trình xác định từ thí nghiệm 1. Sau khi ly trích
xong, pha loãng dịch tách chiết ADN của hai mẫu này theo hệ số pha loãng bậc 10
(giống như tiến hành pha loãng mẫu ở thí nghiệm 1) được một dãy các nồng độ ADN
theo chiều giảm dần từ 10
0
đến 10
-3
. Thực hiện phản ứng Real - time PCR ở các nồng
độ pha loãng của cả hai mẫu: ở nồng độ bắt đầu pha loãng (10
0
) và ở mỗi nồng độ pha
loãng (10

-1
, 10
-2
, 10
-3
) tiến hành lặp lại 3 lần. Khi thực hiện Real - time PCR, 5 chuẩn
được chạy kèm để định lượng số bản sao của WSSV theo từng nồng độ pha loãng. Ở
từng nồng độ pha loãng, 2 µl mẫu đã vortex được cho vào 48 µl hỗn hợp Real - time
PCR. Đối với chuẩn, 2 µl mỗi chuẩn được cho vào từng 48 µl hỗn hợp Real - time
PCR.
Dựa vào các đường biễu diễn nồng độ huỳnh quang ở từng nồng độ trên đồ thị biểu
diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ, độ sai khác của các giá trị
chu kỳ ngưỡng ở các nồng độ, độ lệch chu kỳ ngưỡng trung bình và độ lệch giữa các
số bản sao trung bình ở các nồng độ pha loãng qua 3 lần lặp lại để xác định tính tuyến
tính về khả năng định lượng của Real - time PCR. Căn cứ vào đường biểu diễn nồng
độ huỳnh quang ở 3 lần lặp lại của từng nồng độ mẫu pha loãng, log số lượng bản sao
ban đầu của mẫu ở từng nồng độ pha loãng trên đồ thị biểu diễn đường chuẩn, độ sai
khác chu kỳ ngưỡng của 3 lần lặp lại ở cùng nồng độ pha loãng, độ lệch chuẩn của số
bản sao ban đầu qua 3 lần lặp lại để xác định độ lặp lại về khả năng định lượng của
Real - time PCR.

43
3.5.4. Thí nghiệm 4: khảo sát độ nhạy giữa phƣơng pháp Real - time PCR và
Non Stop Nested PCR
Mục đích
So sánh độ nhạy giữa hai phương pháp để khẳng định tính vượt trội về độ nhạy của
phương pháp Real - time PCR nhằm sử dụng để kiểm tra phát hiện WSSV trên các
mẫu thu từ thực tế.
Tiến hành
Sử dụng mẫu tôm nhiễm WSSV nặng lưu trữ tại công ty Nam Khoa và tiến hành ly

trích theo quy trình xác định từ thí nghiệm 1. Sau khi ly trích xong, dịch tách chiết
ADN được tiến hành pha loãng theo hệ số pha loãng bậc 10, được một dãy các nồng
độ ADN bản mẫu theo chiều giảm dần từ 10
0
đến 10
-8
. Sau đó thực hiện phản ứng
Real - time PCR và Non Stop Nested PCR ở các nồng độ 10
-1
đến 10
-8
. Thí nghiệm
được lặp lại 2 lần với cả hai phương pháp trên cùng một mẫu ở tất cả các nồng độ pha
loãng. 2 µl dịch tách chiết ADN WSSV ở từng nồng độ pha loãng được cho vào đồng
thời từng hỗn hợp 48 µl Real - time PCR và hỗn hợp 48 µl Non Stop Nested PCR. Sản
phẩm khuếch đại của hai phương pháp được phân tích trên phần mềm iQ version 3.1
và trên gel agarose 2%.
Dựa vào đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ xem
khả năng phát hiện WSSV của phương pháp Real - time PCR đến nồng độ pha loãng
nào. Căn cứ vào hình điện di sản phẩm qua Non Stop Nested PCR để xác định khả
năng phát hiện WSSV của Non Stop Nested PCR đến nồng độ pha loãng nào. Qua đó
so sánh khả năng phát hiện WSSV đến nồng độ mẫu pha loãng nào của hai phương
pháp để xác định độ nhạy giữa Real - time PCR và Non Stop Nested PCR. Phương
pháp nào có độ nhạy cao hơn sẽ có khả năng phát hiện WSSV đến nồng độ pha loãng
thấp hơn.
3.5.5. Thí nghiệm 5: ứng dụng phƣơng pháp Real - time PCR để kiểm tra mầm
bệnh WSSV trên 30 mẫu tôm thu từ thực tế
Mục đích
Ứng dụng phương pháp Real - time PCR để kiểm tra sơ khởi tỷ lệ nhiễm WSSV
trên tôm sú giống, và kiểm tra mức độ nhiễm WSSV trên tôm nuôi thương phẩm và

tôm bố mẹ.


44
Tiến hành
30 mẫu tôm thu thực tế từ vùng nuôi tôm ở Bến Tre và Bạc Liêu được tách chiết
ADN qua quy trình ly trích xác định từ thí nghiệm 1. Các mẫu này được chạy kèm với
5 chuẩn để định lượng số bản sao ban đầu của virus gây bệnh đốm trắng. Thí nghiệm
này được lặp lại 2 lần qua Real - time PCR. Sau khi ly trích xong, 2 µl mẫu được cho
vào 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. Đối với chuẩn, 2 µl mỗi chuẩn được cho vào từng
hỗn hợp 48 µl Real - time PCR. Tiến hành thực hiện phản ứng Real - time PCR.
Dựa vào đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang của các mẫu trên đồ thị biểu diễn
mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ và các hiển thị của mẫu trên đồ
thị biểu diễn đường chuẩn để xác định là mẫu dương tính hay âm tính với WSSV và số
lượng bản sao ban đầu của WSSV.
3.5.6. Thí nghiệm 6: theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi tôm đã đƣợc
thu mẫu kiểm tra
Mục đích
Theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi có thu mẫu tôm kiểm tra để có
những khuyến cáo phù hợp cho người nuôi tôm.
Tiến hành
Ghi nhận lại kết quả thu hoạch của các ao tôm thả nuôi tôm giống hoặc đang nuôi
tôm thương phẩm, sản xuất giống bằng tôm bố mẹ được xét nghiệm bằng phương pháp
Real - time PCR cho kết quả âm tính và dương tính với WSSV. Qua đó đánh giá khả
năng thành công của các ao thả nuôi tôm bị nhiễm WSSV.

45
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả thử nghiệm hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt và
ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix

Đối với quy trình ly trích 2, tín hiệu huỳnh quang thu được ở chu kỳ ngưỡng lần
lượt là: 16,9; 20,6; 23,7; 27,1; 30,6; 34,8 tương ứng với nồng độ mẫu pha loãng từ 10
-1

đến 10
-6
. Quy trình ly trích 1 cho kết quả tín hiệu huỳnh quang thu được ở chu kỳ
ngưỡng: 20,6; 23,8; 27,5; 31,6; 34,9; 37,8 tương ứng với nồng độ pha loãng từ 10
-1

đến 10
-6
. Kết quả cho thấy, số chu kỳ ngưỡng tăng dần theo chiều giảm dần của nồng
độ pha loãng. Ở nồng độ 10
-1
đến 10
-6
của mẫu qua quy trình ly trích 2 có chu kỳ
ngưỡng thấp hơn so với chu kỳ ngưỡng của mẫu qua quy trình ly trích 1 ở các nồng độ
Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ
của mẫu ly trích theo quy trình 1 và 2


: mẫu ly trích theo quy trình 1
: mẫu ly trích theo quy trình 2
: đối chứng âm
, : 10
-1

, : 10
-2

, : 10
-3

, : 10
-4

, : 10
-5

, : 10
-6



46
từ 10
-1
đến 10
-6
. Điều này cho thấy chu kỳ ngưỡng của mẫu ly trích qua quy trình 2 lên

sớm hơn rất nhiều so với chu kỳ ngưỡng của mẫu ly trích qua quy trình 1.
Với kết quả thu được cho thấy dịch tách chiết qua quy trình ly trích 2 có ADN của
WSSV tinh sạch và nhiều hơn dịch tách chiết qua quy trình ly trích 1.
Từ kết quả thu nhận được qua hai quy trình ly trích trên, tôi chọn quy trình ly trích
2 cho các bố trí thí nghiệm sau.
4.2. Kết quả sử dụng phƣơng pháp Real - time PCR kiểm tra phát hiện và định
lƣợng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dƣơng tính,
âm tính với WSSV
Kết quả thử nghiệm Real - time PCR trên 12 mẫu dương tính và âm tính thể hiện
qua các đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang trên đồ thị ở Hình 4.2.

Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang
và số chu kỳ của 12 mẫu tôm sú


: 8
: 9
: 10

: 11

: 12

: đối chứng âm
▲: các chuẩn




: 1

: 2
: 3
: 4
: 5

: 6

: 7

47
Hình 4.2 thể hiện rõ các đường cong biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh
quang và số chu kỳ của 12 mẫu đều vượt qua đường baseline subtracted (đường đã trừ
đi tín hiệu nền), điều này cho thấy các mẫu tôm đều bị nhiễm virus gây bệnh đốm
trắng. Các mẫu: 1, 5, 6, 7, 8 nhiễm WSSV nặng thể hiện qua chu kỳ ngưỡng lên rất
sớm từ chu kỳ 17 đến 21. Các mẫu còn lại nhiễm WSSV nhẹ đến trung bình thể hiện
qua chu kỳ ngưỡng lên khá muộn từ chu kỳ 33 đến 39.
Kết quả thử nghiệm Real – time PCR lần thứ 2 cho kết quả tương tự, cả 12 mẫu
đều cho kết quả dương tính với WSSV. Kết quả này hoàn toàn tương thích với kết quả
kiểm tra qua Non Stop Nested PCR.












Kết quả kiểm tra được tóm tắt qua Bảng 4.1 như sau:

Hình 4.3 Kết quả kiểm tra WSSV qua Non Stop Nested PCR của 12 mẫu tôm sú


633bp
221bp

48













Bảng 4.1 cho thấy kết quả kiểm tra mầm bệnh đốm trắng ở các mẫu 9, 10, 11, 12
bằng phương pháp Real - time PCR và Non Stop Nested PCR có sự khác biệt với kết
quả kiểm tra bằng các phương pháp PCR và Semi – Nested PCR. Hai mẫu 9, 10 đã
qua kiểm tra PCR và hai mẫu 11, 12 đã qua kiểm tra Semi – Nested PCR đều cho kết
quả âm tính nhưng lại cho kết quả dương tính khi tôi tiến hành kiểm tra bằng Real -

time PCR và Non Stop Nested PCR với mức độ nhiễm rất nhẹ (chỉ xuất hiện một băng
221 bp ở Non Stop Nested PCR và chỉ vài bản sao ở Real - time PCR). Sai lệch này có
thể do độ nhạy của Real - time PCR và Non Stop Nested PCR cao hơn PCR thông
thường và Semi – Nested PCR. Vì vậy tôi tiến hành kiểm tra tiếp 3 mẫu âm tính đã
được xác định bằng PCR, kết quả thu được qua Hình 4.4.









Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra WSSV trên 12 mẫu tôm sú

Mẫu
Kết quả đã qua kiểm tra
PCR và Semi-Nested
PCR
Non Stop Nested PCR
Real - time PCR
1
+ (PCR)
+
+
2
+ (PCR)
+
+

3
+ (PCR)
+
+
4
+ (PCR)
+
+
5
+ (Semi-Nested PCR)
+
+
6
+ (Semi-Nested PCR)
+
+
7
+ (Semi-Nested PCR)
+
+
8
+ (Semi-Nested PCR)
+
+
9
- (PCR)
+
+
10
- (PCR)

+
+
11
- (Semi-Nested PCR)
+
+
12
- (Semi-Nested PCR)
+
+


49
















Hình 4.4 cho thấy đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của mẫu 13 nằm dưới

đường baseline subtracted cho kết quả âm tính. Hai mẫu 14 và 15 có tín hiệu huỳnh
quang vượt qua đường baseline subtracted ở chu kỳ ngưỡng rất muộn: 41,73 và 40,64,
chứng tỏ các mẫu này nhiễm WSSV ở mức độ rất nhẹ.
Kết quả kiểm tra 3 mẫu tôm sú qua Non Stop Nested PCR như sau:












Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang
và số chu kỳ của 3 mẫu tôm sú

▲: các chuẩn
: đối chứng âm


: mẫu 13
: mẫu 14
: mẫu 15

Hình 4.5 Kết quả Non Stop Nested PCR của 3 mẫu tôm sú

MK
(+)
(-)
13
15
14
633 bp
221 bp

50
Kết quả kiểm tra 3 mẫu tôm sú được tóm tắt ở Bảng 4.2 như sau:






Mẫu 13 được kiểm tra qua Real - time PCR cho kết quả tương thích với kết quả
kiểm tra của phương pháp PCR và Non Stop Nested PCR. Hai mẫu 14 và 15 còn lại
kiểm tra qua Real - time PCR cho kết quả khác biệt so với kết quả kiểm tra của
phương pháp PCR và ngay cả Non Stop Nested PCR. Như vậy, trong 7 mẫu đã xác
định âm tính qua PCR và Semi – Nested PCR, phương pháp Real – time PCR cho kết
quả 6 mẫu dương tính và 1 mẫu âm tính; kết quả kiểm tra qua Non Stop Nested PCR
cho thấy có 4 trong 7 mẫu trên là dương tính và 3 mẫu âm tính. Điều này chứng tỏ
phương pháp Non Stop Nested PCR mà tôi sử dụng có khả năng phát hiện những mẫu
nhiễm WSSV rất nhẹ mà không thể phát hiện bằng phương pháp PCR và Semi –
Nested PCR mà các phòng xét nghiệm khác đang sử dụng, đồng thời phương pháp
Real – time PCR có khả năng phát hiện các mẫu nhiễm WSSV mà các phương pháp
khác không có khả năng phát hiện. Như vậy, phương pháp Real – time PCR có thể sử
dụng để kiểm tra phát hiện WSSV trên tôm sú nuôi và thậm chí cho kết quả phát hiện

mầm bệnh còn tốt hơn so với các phương pháp khác.
Để định lượng số bản sao ban đầu của virus gây bệnh đốm trắng trên 12 mẫu tôm,
tôi tiến hành định lượng dựa trên 5 chuẩn, kết quả thu được qua Hình 4.6.








Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn của 12 mẫu tôm sú


Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra 3 mẫu tôm sú

Mẫu
Kết quả đã xét
nghiệm bằng
PCR
Non Stop Nested
PCR
Real - time PCR
13
-
-
-
14
-
-

+
15
-
-
+


51
Hiệu quả của phản ứng Real - time PCR trung bình qua 2 lần lặp lại đạt khá cao
97,95%, cho thấy phản ứng Real - time PCR này hoạt động tốt. Hệ số tương quan thu
được rất cao (r
2
= 1) chứng tỏ mối tương quan tuyến tính giữa log số bản sao ban đầu
và số chu kỳ ngưỡng rất chặt.
Số bản sao trung bình của WSSV trên 12 mẫu sau 2 lần lặp lại được tóm tắt ở Bảng
4.3.

Bảng 4.3 cho thấy mẫu 1, 5, 6, 7, 8 nhiễm virus gây bệnh đốm trắng khá cao tương
ứng với số bản sao ban đầu: 2,98.10
6
; 2,57.10
5
; 4,25.10
5
; 6,95.10
5
; 6,97.10
5
bản sao.
Các mẫu 2, 3 nhiễm WSSV nhẹ tương ứng với số bản sao ban đầu: 2,47.10
1
; 4,77.10
1
bản sao. Các mẫu 4, 9, 10, 11, 12 nhiễm virus gây bệnh đốm trắng rất nhẹ thể hiện qua
số bản sao ban đầu thấp: 2; 5; 2; 6; 4 bản sao. Điều này cho thấy phương pháp Real –
time PCR có thể phát hiện các mẫu nhiễm WSSV với số lượng bản sao ban đầu rất
thấp (2 bản sao) cho nên có thể phát hiện được các mẫu nhiễm WSSV rất nhẹ mà
phương pháp PCR và Semi – Nested PCR cho kết quả là âm tính.
Kết quả kiểm tra bằng Non Stop Nested PCR cũng cho kết quả là cả 12 mẫu đều
dương tính với WSSV với số bản sao ban đầu rất thấp (theo kết quả định lượng của
Real – time PCR) chứng tỏ rằng phương pháp Non Stop Nested PCR mà tôi sử dụng
Mẫu
Chu kỳ ngưỡng trung bình
Số bản sao ban đầu trung bình
1
16,67

2,98.10
6

2
33,82
2,47.10
1

3
32,84
4,77.10
1

4
37,69
1,74
5
20,28
2,57.10
5

6
19,53
4,25.10
5

7
18,83
6,95.10
5

8
18,81
6,97.10
5

9
36,68
4,64
10
38,20
1,23
11
35,99
5,69
12
37,79
3,45

Bảng 4.3 Số bản sao ban đầu trung bình của 12 mẫu tôm sú sau hai lần lặp lại


52
có độ nhạy rất cao (2 bản sao), có thể dùng để kiểm tra virus gây bệnh đốm trắng trên
tôm sú.
Số bản sao ban đầu của 3 mẫu tôm được định lượng qua Real – time PCR dựa trên
đồ thị biểu diễn đường chuẩn (Hình 4.7).

Hiệu quả của phản ứng Real - time PCR trung bình qua 2 lần lặp lại đạt khá cao
99,4%, chứng tỏ phản ứng Real - time PCR hoạt động tốt. Hệ số tương quan (r
2
= 1)
giữa log số bản sao ban đầu và số chu kỳ rất chặt.
Kết quả sau 2 lần lặp lại được tóm tắt ở Bảng 4.4






Hai mẫu 14 và 15 nhiễm WSSV rất nhẹ, chỉ được phát hiện qua Real – time PCR
với 1 bản sao ban đầu, trong khi đó PCR và ngay cả Non Stop Nested PCR cũng
không thể phát hiện được. Mẫu 13 cho kết quả âm tính với tất cả các phương pháp xét
nghiệm cho thấy là mẫu không bị nhiễm virus gây bệnh đốm trắng.
Từ các kết quả thử nghiệm trên cho thấy phương pháp Real - time PCR có khả
năng phát hiện được mầm bệnh WSSV mà các phương pháp khác có thể phát hiện.
Ngoài ra Real - time PCR còn có khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV ngay cả ở mức
độ nhiễm rất nhẹ (1 bản sao) mà các phương pháp khác không có khả năng phát hiện.


Hình 4.7 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn của 3 mẫu tôm sú

Mẫu
Chu kỳ ngưỡng trung bình
Số bản sao ban đầu trung bình
13
N/A
N/A
14
41,73
1,54.10
-1

15
40,64
3,27.10
-1


Bảng 4.4 Số bản sao ban đầu trung bình của 3 mẫu tôm sú
sau hai lần lặp lại


53
4.3. Kết quả khảo sát tính định lƣợng của phƣơng pháp Real - time PCR
Kết quả thử nghiệm tính định lượng của phương pháp Real - time PCR ở các nồng
độ pha loãng của mẫu 1 sau các lần lặp lại thể hiện qua Hình 4.8.

Hình 4.8 thể hiện rõ các đường cong tuyến tính giữa nồng độ huỳnh quang và số
chu kỳ ở các nồng độ pha loãng của mẫu 1. Khoảng cách độ lệch giữa các chu kỳ
ngưỡng ở các nồng độ pha loãng rất đều thể hiện tính tuyến tính cao, tính tuyến tính
càng cao thì khả năng định lượng số bản sao ban đầu càng chính xác. Ở nồng độ pha
loãng 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
, chu kỳ ngưỡng ở từng lần lặp lại sai lệch rất thấp. Điều này
chứng tỏ độ lặp lại thể hiện khá cao. Ở nồng độ bắt đầu pha loãng 10
0
, tín hiệu huỳnh
quang thu được của mẫu có chu kỳ ngưỡng lên rất sớm: 16,34, chu kỳ ngưỡng của 3

lần lặp lại cũng khá đồng đều. Trong 3 lần lặp lại có một chu kỳ ngưỡng lên sớm hơn,
tách biệt khỏi chu kỳ ngưỡng của hai lần lặp lại còn lại, tuy nhiên sự sai lệch này rất
nhỏ: 0,39 chu kỳ, có thể chấp nhận được. Sự sai lệch này có thể do sai số pipet, thao
tác người thực hiện,…
Log số bản sao ban đầu của WSSV ở các nồng độ pha loãng sau 3 lần lặp lại thu
được qua Hình 4.9.

Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang
và số chu kỳ ở từng nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần của mẫu 1

: 10
0
: 10
-1
: 10
-2
: 10
-3


▲: các chuẩn
: các mẫu
: đối chứng âm

54

Số bản sao ban đầu ở các nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần của mẫu 1 được định
lượng dựa trên đường chuẩn ở Hình 4.9. Hình 4.9 thể hiện rõ mối quan hệ tuyến tính
giữa log số bản sao ban đầu và số chu kỳ ngưỡng qua hệ số tương quan rất cao: r
2
bằng
1. Hiệu quả phản ứng Real - time PCR này đạt cao (99,6%) chứng tỏ phản ứng này
hoạt động tốt. Đường chuẩn thể hiện rõ các giá trị tương ứng với các chu kỳ ngưỡng
và log số bản sao ban đầu ở từng nồng độ pha loãng của mẫu gần như trùng nhau.
Từ Hình 4.9 ta có được độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình ở các nồng
độ pha loãng của mẫu 1 sau 3 lần lặp lại thể hiện ở Bảng 4.5 như sau:









Bảng 4.5 thể hiện rõ số chu kỳ ngưỡng trung bình tăng và số bản sao trung bình
giảm theo từng nồng độ pha loãng. Chu kỳ ngưỡng trung bình càng cao tương ứng với
số bản sao trung bình càng thấp. Sai lệch giữa các chu kỳ ngưỡng trung bình tương đối
đều nhau và nằm trong khoảng từ 3,2 đến 3,71. Sai lệch đều thể hiện tính tuyến tính về

Hình 4.9 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn ở từng nồng độ pha loãng

lặp lại 3 lần của mẫu 1

Bảng 4.5 Độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình ở các nồng độ
pha loãng của mẫu 1 sau 3 lần lặp lại

Nồng độ
mẫu 1
Chu kỳ ngưỡng trung
bình
Số bản sao ban đầu
trung bình
Độ lệch chuẩn của
số bản sao ban đầu
10
0

16,77
4,89.10
6
1,38.10
6
10
-1
19,97
5,25.10
5

0,63.10
5

10
-2
23,37
5,02.10
4

0,84.10
4

10
-3
27,08
3,87.10
3

0,53.10
3



55
khả năng định lượng cao của Real - time PCR. Sau 3 lần lặp lại, độ lệch chuẩn của số
bản sao ban đầu tương đối thấp, cho thấy độ lặp lại về khả năng định lượng cao.
Qua kết quả khảo sát tính tuyến tính và độ lặp lại về khả năng định lượng của
Real - time PCR trên các nồng độ pha loãng của mẫu 1 sau 3 lần lặp lại cho thấy
phương pháp Real - time cho kết quả định lượng chính xác số bản sao ban đầu của
virus gây bệnh đốm trắng với độ lặp lại cao.
Tính định lượng của phương pháp Real - time PCR còn được khảo sát qua mẫu 7,
kết quả thu được qua Hình 4.10 và Hình 4.11.

Ở các nồng độ pha loãng, đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang
và số chu kỳ thể hiện tuyến tính (Hình 4.10). Khoảng cách độ lệch giữa các chu kỳ
ngưỡng ở các nồng độ pha loãng của mẫu 7 đều nhau thể hiện tính tuyến tính cao. Ở
nồng độ 10
0
từng đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu
kỳ ở các lần lặp lại hơi tách biệt nhau với độ lệch 0,43 chu kỳ. Ở nồng độ 10
-1

, đường
biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ ở một lần lặp lại tách
biệt so với hai lần lặp lại còn lại với sai lệch 0,2 chu kỳ. Sai lệch nhỏ này có thể do sai
Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ
ở từng nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần của mẫu 7


: 10
0
: 10
-1
: 10
-2
: 10
-3



▲: các chuẩn
: các mẫu
: đối chứng âm


56
số pipet và các tác động khác như thao tác người thực hiện,… Ở nồng độ 10
-2
, 10
-3
,
đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ ở cả 3 lần lặp lại

gần như trùng nhau. Điều này chứng tỏ độ lặp lại về khả năng định lượng của hệ thống
cao.
Log số bản sao ban đầu của WSSV ở các nồng độ pha loãng sau 3 lần lặp lại thu
được qua Hình 4.11.










Số bản sao ban đầu ở từng nồng độ pha loãng sau khi lặp lại 3 lần của mẫu 7 được
định lượng dựa trên đường chuẩn ở Hình 4.11. Hình 4.11 cho thấy hiệu quả của phản
ứng Real - time PCR đạt rất cao: 99,6%. Log số bản sao ban đầu và số chu kỳ ngưỡng
có quan hệ rất tuyến tính qua hệ số tương quan r
2
bằng 1. Đồ thị biểu diễn đường
chuẩn thể hiện rõ các giá trị tương ứng với các chu kỳ ngưỡng và log số bản sao ban
đầu ở từng nồng độ pha loãng của mẫu qua 3 lần lặp lại trùng nhau hoàn toàn và gần
trùng nhau, cho thấy hệ thống có khả năng cho kết quả định lượng chính xác với độ
lặp lại cao.
Độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình ở các nồng độ pha loãng mẫu 7 sau
3 lần lặp lại thể hiện ở Bảng 4.6 như sau:

Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn ở từng nồng độ pha loãng
lặp lại 3 lần của mẫu 7