Keratinase và ứng dụng trong công nghiệp

TIỂU LUẬN
SẢN XUẤT KERATINASE VÀ ỨNG DỤNG

1


MỤC LỤC
CHƯƠNG 1: KERATINASE VÀ ỨNG DỤNG........................................................4
1.1

Đặc tính Keratinase.........................................................................................4

1.2 Nguồn gốc của Keratinase....................................................................................4
1.3

Ứng dụng sinh học và công nghiệp của keratinase.........................................5

1.3.1 Xử lý và làm sạch da sống - ngành da...........................................................6
1.3.2 Chất tẩy rửa và ngành dệt may......................................................................7
1.3.3 Khử nhiễm prion bằng keratinase.................................................................8
1.3.4 Ứng dụng trong y tế và dược phẩm...............................................................8
1.3.5 Chuyển hóa chất thải sừng hóa thành năng lượng sinh học và các sản phẩm
giá trị gia tăng..............................................................................................................9
1.3.6 Sản xuất bột lông vũ cho ngành thức ăn chăn nuôi, sản xuất năng lượng
sinh học và nông nghiệp..............................................................................................9
1.3.7 Các ứng dụng khác......................................................................................10
CHƯƠNG 2: SẢN XUẤT KERATINASE..............................................................11
2.1 Sản xuất keratinase.............................................................................................11
2.2 Chế phẩm keratinase..........................................................................................13
2.3 Tinh sạch keratinase...........................................................................................14
2.3.1 Kết tủa bằng axeton.....................................................................................15

2.3.2 Kết tủa bằng amoni sulfat............................................................................15
2.3.3 Sắc ký trao đổi ion.......................................................................................15
2.3.4 Lọc gel.........................................................................................................16
2.3.5 Xác định nồng độ protein hòa tan...............................................................16
2.3.6 Độ tinh khiết của Enzyme...........................................................................17
2.4 Đặc điểm sinh hóa của keratinase......................................................................17
2


2.4.1 Nhiệt độ và pH tối ưu..................................................................................17
2.4.2 pH và độ ổn định nhiệt................................................................................18
2.4.3 Ảnh hưởng của các ion kim loại, chất ức chế và chất tẩy rửa.....................18
Tài Liệu Tham Khảo..................................................................................................20

3


CHƯƠNG 1: KERATINASE VÀ ỨNG DỤNG
1.1 Đặc tính Keratinase
Keratinase (EC 3.4.21 / 24 / 99.11) thường là protease serine hoặc metalloprotease
thủy phân keratins. Chúng khác biệt với các protease thông thường vì chúng có các đặc
tính cơ chất rộng đối với nhiều loại protein kháng proteinase K [1].
Keratinase là những enzym mạnh mẽ với các đặc tính sinh hóa đa dạng. Hầu hết
chúng là đơn phân, mặc dù có mơ tả về một số enzym đa phân tử. Khối lượng phân tử
của keratinase vi khuẩn nằm trong khoảng từ 18 (enzym SK1-02 từ Streptomyces
albidoflavus) đến 200 kDa (enzym từ Kocuria rosea và Fervidobacterium islandicum),
trong khi enzym của nấm gây bệnh có thể lên tới 440 kDa (ví dụ keratinase II của
Trichophyton mentagrophytes ). Khối lượng phân tử cao hơn thường là đặc trưng của
metalloprotease và có nguồn gốc từ vi sinh vật ưa nhiệt. [2]
1.2 Nguồn gốc của Keratinase

Keratinase được báo cáo từ các quần thể vi sinh vật đa dạng như vi khuẩn, xạ khuẩn
và nấm. Trong tất cả các nguồn keratinase, nguồn vi khuẩn có số lượng lớn hơn nhiều so
với nấm và xạ khuẩn. Các loài vi khuẩn thuộc Bacillus, đặc biệt là B. licheniformis và
Bacillus subtilis, là những vi sinh vật tạo sừng hiệu quả nhất. Tất cả các chế phẩm thương
mại hiện có chỉ dựa trên KerA từ B. licheniformis. Tuy nhiên, keratinase cũng đã được
báo cáo từ các chủng vi khuẩn khác, Pseudomonas, Chryseobacterium, Lysobacter,
Nesterenkonia, Kocuria, Microbacterium, Stenotrophomonas, Serratia, và Meiothermus.
Ngoài ra, một số loài thuộc các chi Fervidobacterium, Clostridium, và
Thermoanaerobacter cũng đã được báo cáo. Xạ khuẩn từ các chi Streptomyces và
Thermoactinomyces và Actinomadura keratinilytica cũng được báo cáo là những nhà sản
xuất keratinase tiềm năng [1].
Lồi ưa nhiệt có đặc điểm sản xuất keratinase vượt trội so với loài ưa nhiệt do tốc độ
tăng trưởng cao hơn, quá trình phản ứng được đẩy nhanh, giảm nguy cơ nhiễm bẩn và độ
ổn định của enzym cao hơn. Ở nấm, một số lượng lớn các chủng sản xuất keratinase đã
được báo cáo, Trichophyton và Microsporum. Nấm da gây nhiễm trùng bề ngồi da, tóc
và móng tay do khả năng sử dụng chất sừng của chúng. Tuy nhiên, người ta đã chú ý
nhiều đến các chủng, Aspergillus, Doratomyces, Myceliophthora thermophila,
Myrothecium, và Paecilomyces để sản xuất keratinase. Các vi sinh vật sản xuất keratinase
4


được phân lập từ các điều kiện môi trường và sinh thái khác nhau bao gồm mơi trường
hiếu khí cũng như kỵ khí, Chất thải gia cầm, đất Nam Cực, mơi trường Amazonia, đất
rhizospheric, suối nước nóng, và bùn solfataric [1].
Các đặc tính sinh hóa và sinh lý của keratinase rất khác nhau giữa các vi sinh vật được
phân lập từ các điều kiện mơi trường khác nhau. Do đó, sự đa dạng của vi sinh vật có thể
tương quan trực tiếp với việc chiết xuất các keratinase mới với phạm vi pH rộng và độ ổn
định nhiệt [1].
1.3 Ứng dụng sinh học và cơng nghiệp của keratinase
Phân bón

Phụ gia thức
ăn chăn ni

Sản xuất khí
sinh học

Sử lý chất thải
sừng
Tẩy trắng
ngọc trai

Sử dụng thương
mại

Ứng dụng khác
Chế biến
tổ chim

Ngành dệt may

Ứng dụng của
keratinase

Ngành Da

Làm sạch da sống
của động vật

Khử nhiễm prion

Chất tẩy rửa
Ứng dụng trong y
học và mỹ phẩm

Loại bỏ mô
sẹo

Chuyển máy
gia tốc

Điều trị mụn
trứng cá

Sản phẩm vệ
sinh cá nhân

Loại bỏ ráy
tai

5


Hình 1. Các ứng dụng cơng nghệ sinh học và công nghiệp của keratinase [2]
Enzyme vi sinh vật chiếm một thị phần đáng kể trong các chất xúc tác công nghiệp,
hydrolase chiếm khoảng 65% thị trường. Trong số đó, protease là một nhóm enzym cực
kỳ quan trọng do phạm vi ứng dụng rộng rãi của chúng. Ngồi tính đặc hiệu cơ chất rộng,
keratinase còn nổi bật so với các protease khác do độ bền chung, có lợi trong nhiều ứng
dụng cơng nghiệp. Hình 1 cho thấy các ứng dụng (tiềm năng) khác nhau của keratinase,
trong khi các sản phẩm thương mại phổ biến nhất đã có trên thị trường được trình bày

trong Bảng 1.
Bảng 1: Các sản phẩm keratinase bán sẵn trên thị trường [2]
Ứng dụng

Mô tả sản phẩm
Sản phẩm thương mại
Lấy ráy tai ra khỏi ống tai ngoài thành cơng, an tồn
Loại bỏ ráy tai
Zymox
và hiệu quả
Keratinase có mặt thay thế tự nhiên cho việc sử dụng Keratoclean® Hydra PB,
Chai và loại bỏ mô sẹo
axit để loại bỏ mô sẹo và chai chân
PURE 100 Keratinase
Mụn trứng cá là do tắc nghẽn các tuyến bã nhờn với
Keratoclean® Sensitive
Điều trị mụn trứng cá
sự hiện diện của một lượng lớn keratin, do đó có thể
PB, Keratopeel® PB
sử dụng keratinase để điều trị thành công
Sử dụng thương mại Sản phẩm Keratinase cải thiện tỷ lệ thức ăn và có tác
Versazyme®
(thức ăn gia cầm)
động tích cực đến khối lượng cơ thể gà
Sản phẩm Enzyme làm giảm chi phí nấu nướng và
Sử dụng thương mại
xử lý nhiệt độ của lơng, do đó làm tăng tỷ lệ tiêu hóa
Valkerase®
(thức ăn gia cầm)
và giá trị dinh dưỡng của thức ăn

Khử nhiễm prion hiệu quả cho các dụng cụ y tế. Nó
Khử nhiễm prion
chứa protease được thiết kế để tăng hoạt tính, độ đặc
Prionzyme
hiệu rộng hơn và tính ổn định nhiệt
Sản phẩm keratinase được cho là điều chỉnh nồng độ
keratin trong lỗ chân lơng, do đó giúp loại bỏ mụn
Y sinh, dược phẩm và nước, da dày sừng, nó có thể được sử dụng để điều
PURE100 Keratinase
mỹ phẩm
trị các bệnh da liễu và móng, sẹo và tái tạo biểu mô
Làm sạch đường ống và bể chứa bằng các enzym
khác nhau, bao gồm cả keratinase
Làm sạch đường ống và bể chứa bằng các enzym
Đại lý làm sạch
Bioguard Plus
khác nhau, bao gồm keratinase
1.3.1 Xử lý và làm sạch da sống - ngành da
Ngành công nghiệp da là một trong những ngành công nghiệp lâu đời nhất, đang phát
triển nhanh trên thế giới và đóng một vai trị quan trọng trong nền kinh tế ngày nay. Đồng
6


thời, nó được coi là một trong những nguồn ơ nhiễm lớn nhất thế giới, vì chế biến da bao
gồm việc sử dụng các chất độc hại, gây ra các tác động nguy hiểm cho môi trường và
công nhân trong các nhà máy công nghiệp [2].
Việc xử lý da sống bao gồm một loạt các quy trình, trong đó việc xử lý da trước được
coi là một nguồn ô nhiễm chính. Các hóa chất như natri sunfua, vơi và chất thải rắn, phát
sinh do xử lý da sơ bộ, là ngun nhân chính làm tăng nhu cầu oxy sinh hóa (BOD), nhu
cầu oxy hóa học (COD) và tổng lượng chất rắn hòa tan (TDS) trong nước thải sản xuất tại

các nhà máy này. Sử dụng enzyme là một giải pháp thay thế xanh giúp giảm ô nhiễm môi
trường và cải thiện làn da. Các enzym phân giải protein ngày nay ngày càng được sử
dụng nhiều để làm mềm da sống nhằm cải thiện độ mềm dẻo của da và chuẩn bị cho quá
trình làm sạch da. Các chế phẩm enzym tiêu sừng khác nhau để loại bỏ lông động vật mà
không làm tổn thương da (collagen) cũng đang được sử dụng. Chúng phân hủy một cách
có chọn lọc các mơ sừng mềm trong nang lơng, do đó kéo ra lơng nguyên vẹn mà không
ảnh hưởng đến độ bền kéo của da. Các enzym, chủ yếu có nguồn gốc từ Bacillus sp,
Pseudomonas stutzeri, Caldicoprobacter algeriensis, Acinetobacter sp., Paenibacillus
woosongensis, Vibrio metschnikovii và các loại nấm khác nhau từ các loài Aspergillus
tamarii, Penicillium chrysogenum và Trichoderma harzianum đã được báo cáo là được
sử dụng trong ngành da. Việc ứng dụng keratinase trong ngành da giúp cải thiện chất
lượng của sản phẩm cuối cùng và giảm ơ nhiễm mơi trường do hóa chất, mang lại một
mơi trường làm việc an tồn hơn [2].
1.3.2 Chất tẩy rửa và ngành dệt may
Protease kiềm đại diện cho 89% các enzym phân giải protein được sử dụng trong
công nghiệp chất tẩy rửa. Các enzym thích hợp để sử dụng trong chất tẩy rửa cần phải
tương thích với các thành phần khác của chất giặt rửa, đồng thời thể hiện hoạt tính và độ
ổn định ở các giá trị và nhiệt độ pH cao hơn. Keratinase kiềm từ Paenibacillus
woosongensis TKB2 là một trong những enzym có tiềm năng ứng dụng trong ngành giặt
là để loại bỏ các vết bẩn tổng hợp mà không ảnh hưởng đến kết cấu vải, sợi và độ bền của
quần áo [2].
Ngành công nghiệp dệt sử dụng keratinase để xử lý sợi len. Các lựa chọn thay thế an
tồn về mặt mơi trường cho các hóa chất được sử dụng trong q trình này là các chế
phẩm enzyme, thường bao gồm protease và lipase. Vai trị của các proteases là loại bỏ
một lớp sợi thơ bên ngồi, làm giảm cảm giác thơ ráp của len. Cần phải định lượng các
7


enzym một cách cẩn thận, vì một số protease xâm nhập sâu vào sợi, gây hư hỏng, mất
khối lượng và độ bền kéo của chúng. Đây cũng là lý do tại sao hiện nay khơng có quy

trình nào hồn tồn dựa trên enzyme. Ở một mức độ nào đó, sự xâm nhập có thể bị hạn
chế bằng cách tăng khối lượng phân tử của protease nhằm mục đích ứng dụng này bằng
cách liên kết chéo hóa học, gắn các polyme tổng hợp, v.v. Một giải pháp thay thế tốt hơn
là sử dụng các keratinase cụ thể chỉ hoạt động có chọn lọc trên các lớp sừng của len mà
khơng có tác dụng phụ lên các phần sợi khác [2].
1.3.3 Khử nhiễm prion bằng keratinase
Prion là những protein nhỏ gọn rất mạnh gây ra các bệnh thối hóa thần kinh seri ous,
chẳng hạn như TSEs (bệnh não thể xốp có thể truyền nhiễm). Do sự gia tăng số lượng
truyền prion theo chiều ngang từ động vật sang người (bao gồm cả lây truyền qua đường
sắt qua các dụng cụ y tế bị ô nhiễm), các phương pháp hiệu quả để khử nhiễm vật chất bị
nhiễm prion là vô cùng quan trọng. Vì các phương pháp liên tục dựa trên các quá trình
tích cực và địi hỏi nhiều năng lượng, sự phân hủy của các prion bằng enzym có thể là
một cách tiếp cận đầy hứa hẹn để phá hủy các protein có độ bền cao này có cấu trúc
tương tự như keratin. Cho đến nay đã có báo cáo về việc chỉ có hai keratinase được sử
dụng cho mục đích khử nhiễm prion - một được phân lập từ B. licheniformis PWD-1 và
một từ Streptomyces sp. Nev ertheless, ngoài việc xử lý bằng enzym, cần phải xử lý thêm
phần vật liệu bị nhiễm bằng thuốc thử kiềm, chất tẩy rửa và nhiệt độ cao [2].
1.3.4 Ứng dụng trong y tế và dược phẩm
Keratinase cũng được sử dụng trong ngành công nghiệp mỹ phẩm để điều trị mụn
trứng cá, vết chai, loại bỏ da sừng và khô, điều trị bệnh vẩy nến, v.v.. Các ứng dụng của
keratinase trong ngành dược phẩm chủ yếu liên quan đến việc đưa thuốc diệt nấm vào bề
mặt móng sừng. Các rối loạn về móng, chủ yếu liên quan đến nấm ở các bộ phận, từ
tương đối vơ hại (sắc tố), đến các tình trạng đau đớn như chứng loạn dưỡng móng. Điều
trị nhiễm nấm móng tay (nấm móng) là một cơng việc cực kỳ khó khăn và theo truyền
thống bao gồm việc uống thuốc chống nấm trong thời gian dài và tiêm corticosteroid lặp
đi lặp lại hàng tháng, gây ra nhiều tác dụng phụ, chẳng hạn như phát ban và tổn thương
gan. Một hình thức điều trị thay thế là bôi thuốc chống co rút trực tiếp lên vùng bị bỏng.
Hạn chế chính của phương pháp này là khả năng khơng thấm của bề mặt móng tay, ảnh
hưởng đến sự thẩm thấu của thuốc và hiệu quả điều trị. Một loạt các phương pháp cơ học
(mài mịn và tách móng), vật lý (khắc, điều trị bằng laser, hydrat hóa và đóng móng

8


nhanh) và phương pháp hóa học (tác nhân tiêu sừng, chẳng hạn như urê, axit thioglycolic,
axit salicylic, N-acetyl cysteine, mercaptoethanol) là được sử dụng để cải thiện việc
chuyển thuốc đến vị trí tác dụng. Tuy nhiên, những hóa chất này chỉ có hiệu quả ở nồng
độ cao và có thể có mùi hăng. Mặt khác, keratinase có thể rất hiệu quả trong việc nới lỏng
các mảng móng đã có ở nồng độ thấp, điều này lần đầu tiên được chứng minh bằng
keratinase từ Paecilomyces marquandii [2].
1.3.5 Chuyển hóa chất thải sừng hóa thành năng lượng sinh học và các sản phẩm
giá trị gia tăng
Theo quy định (EC) 1774/2002 của quốc hội Châu Âu, chất thải sừng được phân loại
là loại thứ ba của các sản phẩm động vật, có nghĩa là: (i) được lấy từ vỏ động vật, (ii)
không dùng cho người , và (iii) không được truyền bệnh cho người hoặc động vật. Một
lượng lớn chất thải do các nhà máy chế biến động vật tạo ra có thể được sử dụng làm chất
nền cho năng lượng sinh học và các sản phẩm giá trị gia tăng nếu được xử lý thích hợp
trước khi sử dụng. Xử lý truyền thống đối với chất thải sừng hóa bao gồm sử dụng
phương pháp thủy phân có tính kiềm và axit, xử lý ở áp suất cao và nhiệt độ cao (lên đến
150 ° C). Mặc dù có những ưu điểm đã nói ở trên, nhưng các phương pháp này rất tốn
kém, tiêu tốn một lượng lớn năng lượng và dẫn đến mất một số axit amin thiết yếu quan
trọng cho quá trình sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng hoặc năng lượng sinh học sau
này [2].
1.3.6 Sản xuất bột lông vũ cho ngành thức ăn chăn nuôi, sản xuất năng lượng
sinh học và nơng nghiệp
Chất thải chính trong ngành chăn nuôi gia cầm là lông, chiếm 7– 10% khối lượng gà.
Trong năm 2012, khoảng 8,5 tỷ tấn lông gia cầm được tạo ra trên tồn thế giới. Lơng bao
gồm khoảng 90% keratin (phần lớn là β-keratin) và chứa một lượng lớn serine, axit
glutamic, proline và một lượng nhỏ methionine, histidine và lysine. Vài triệu tấn lông vũ
mỗi năm là một trong những phụ phẩm phế thải lớn nhất của ngành chăn nuôi gia cầm và
là nguồn ô nhiễm môi trường quan trọng. Một trong những lựa chọn để định giá chất thải

lông vũ liên quan đến việc chuyển đổi chúng thành bột lơng vũ, có thể được sử dụng làm
nguyên liệu thô trong sản xuất dầu diesel sinh học, một thành phần trong bioplastics hoặc
làm thức ăn chăn nuôi. Quá trình chế biến truyền thống đối với cá chết bao gồm nhiệt độ
và áp suất cao, là nguyên nhân gây ra chi phí cao và phá hủy một số axit amino thiết yếu
(methionine, lysine và tryptophan). Do đó, các sản phẩm cuối cùng có thể được tiêu hóa
9


kém và có giá trị dinh dưỡng thay đổi. Những thiếu sót như vậy có thể tránh được bằng
cách thủy phân bằng enzym keratinase lông vũ, dẫn đến sản xuất các axit amin chất
lượng cao hơn có thể được sử dụng trong thức ăn gia cầm, lợn, động vật nhai lại và cá
[2].
Lơng vũ thủy phân cũng có thể được chuyển đổi thành gen sinh học, hoặc được sử
dụng làm phân bón cho nơng nghiệp hữu cơ cho phép giải phóng nitơ chậm, cải thiện sự
phát triển của thực vật, thúc đẩy hoạt động của vi sinh vật trong đất, cấu trúc đất và tăng
khả năng giữ nước của nó [2].
1.3.7 Các ứng dụng khác
Keratinase cũng được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác nhau, bao gồm để phân hủy
sinh học để ủ chất thải giàu keratin, để sửa đổi cấu trúc cơ bản của sợi trong len hoặc lụa,
trong các sản phẩm mỹ phẩm khác nhau và chế biến yến sào ăn được. . Một trong những
ứng dụng độc đáo là tẩy trắng ngọc trai. Tại thời điểm hình thành hạt, các tạp chất hữu cơ
như tế bào tự do, tế bào chất nhầy và mơ hoại tử có thể có trong lớp gắn kết. Do đó, điều
cần thiết là phải cải thiện chất lượng của các hạt trước khi bán. Ngọc trai được xử lý theo
cách truyền thống bằng chất tẩy trắng nhẹ nhàng (hydrogen perox Ide) có thể làm sáng
mềm, mặc dù chúng có thể bù lại màu sắc của chúng và có thể ảnh hưởng đến sự không
đều màu. Zhang và cộng sự. đã báo cáo sử dụng keratinase như một giải pháp thay thế
cho quy trình tẩy trắng kiểu tra [2].

10

CHƯƠNG 2: SẢN XUẤT KERATINASE
2.1 Sản xuất keratinase

Chiến lược chung tiếp theo trong sản xuất keratinase [1]
Mặc dù sở hữu tiềm năng công nghệ sinh học to lớn, hạn chế lớn trong việc thương
mại hóa keratinase là mức sản xuất thấp của chúng. Keratinase thường được sản xuất
dưới dạng các enzym cảm ứng ngoại bào. Chúng cũng có thể được bài tiết thành phần mà
khơng có keratins. Một số vi khuẩn và nấm cũng tạo ra các enzym tiêu sừng nội bào [1].
Trong hầu hết các trường hợp, keratin ở dạng lông gà, bột lông vũ, bột keratin, lông
cừu, bột sừng, tóc và lớp sừng đóng vai trị là chất cảm ứng sản xuất keratin. Tuy nhiên,
chất nền không tạo sừng, viz., Bột đậu nành, bột đậu nành, và bột vỏ tôm, cũng đã được
báo cáo là hoạt động như chất cảm ứng sản xuất keratinase. Nói chung, sản xuất
keratinase đi kèm với sự suy thoái chất nền keratin sau đó. Tuy nhiên, động học của q
trình sản xuất keratinase và q trình thối hóa keratin khơng trùng khớp với nhau. Do
đó, q trình phân hủy sừng khơng thể đóng vai trị là điểm đánh dấu cho q trình sản
xuất keratinase và ngược lại. Điều này là do keratinase được tạo ra trong giai đoạn cuối
theo cấp số nhân hoặc giai đoạn tĩnh của sự phát triển vi sinh vật, trong khi sự phân hủy
11


keratinase diễn ra sau đó. Nguyên nhân có thể là do các protease khác được tiết ra cùng
với keratinase, tự phân hoặc ức chế tổng hợp enzym [1].
Điều kiện lên men chìm là lý tưởng để sản xuất keratinase, ngoại trừ một số vi khuẩn
ưa nhiệt và nấm, trong đó quá trình lên men chìm được ưu tiên cho hoạt động phân giải
sừng tối đa. Quá trình lên men ở trạng thái rắn (SSF) cũng đã được sử dụng nhiều hơn
gần đây để thu được các enzym phân giải sừng. SSF là một q trình cơng nghệ sinh học,
trong đó phản ứng lên men được thực hiện trong một chất nền rắn với các thơng số được
kiểm sốt như nhiệt độ, độ ẩm (độ ẩm) và chất nền. Độ ẩm được điều chỉnh tối ưu hóa
hoạt động keratinase của các lồi vi sinh vật thơng qua sự phát triển tối ưu và dòng chảy

trao đổi chất [1].
Việc xử lý các thông số vật lý và dinh dưỡng là cần thiết để tối đa hóa sự phát triển
của vi sinh vật và do đó, sản xuất keratinase. Rất khó so sánh năng suất keratinase vì xét
nghiệm enzyme, phương pháp sản xuất và môi trường tăng trưởng là khác nhau. Sự lựa
chọn nguồn nitơ và cacbon có ảnh hưởng lớn đến sản lượng keratinase. Các chất nền nitơ
phức tạp, viz., Bột đậu nành, bột đậu nành, chiết xuất nấm men, và casein, đã được báo
cáo để tăng cường sản xuất keratinase. Mặt khác, các nguồn nitơ vô cơ như muối amoni
và nitrat ức chế sản xuất keratinase. Việc sản xuất keratinase của vi sinh vật bị ức chế bởi
đường đơn, viz., Glucose, vì ức chế dị hóa. Sự kìm hãm kéo dài quá trình phân hủy sừng
vì quá trình sinh tổng hợp keratinase bị ức chế khi các nguồn cacbon có thể đồng hóa
được sử dụng hết. Các cơ chế kiểm sốt khác nhau của q trình sản xuất keratinase có
thể hoạt động đồng thời ở cấp độ phiên mã, nhằm mục đích sử dụng tốt hơn các nguồn có
sẵn cho dinh dưỡng vi sinh vật [1].

12


Keratinase từ một số nguồn vi sinh vật đã chọn [1]
2.2 Chế phẩm keratinase
Versazyme, Valkerase, Prionzyme và PURE100 là các sản phẩm keratinase thương
mại có sẵn trên thị trường. Tất cả các chế phẩm này đều dựa trên keratinase từ B.
licheniformis PWD-1.
Versazyme là sản phẩm keratinase thương mại đầu tiên được tiếp thị như một chất
phụ gia thức ăn cho gia cầm và lợn, bởi BioResource International, Inc. (BRI) ở Durham,
Bắc Carolina, vào năm 2005. Nó cải thiện khả năng tiêu hóa protein 3,5-10% và tạo điều
kiện giảm hàm lượng protein trong khẩu phần thức ăn giảm 1-2%, do đó làm giảm chi phí
thức ăn cho nơng dân và giảm tác động môi trường của chất thải chăn nuôi. BRI đã chọn
Novus International, một công ty dinh dưỡng và sức khỏe động vật, làm đối tác phân phối
toàn cầu của mình vào năm 2008 [1].
Valkerase là một loại enzyme độc quyền của BRI được phát triển vào năm 2006 để

cải thiện q trình xử lý lơng vũ và chất lượng của bột lông vũ như một nguồn protein và
13


peptide có thể tiêu hóa bền vững. Việc sử dụng Valkerase làm giảm việc sử dụng năng
lượng và chi phí sản xuất bằng cách hạ nhiệt độ nấu và rút ngắn khoảng thời gian nấu,
giảm sự hình thành các chất kháng dinh dưỡng như lanthionine, và cải thiện khả năng tiêu
hóa của bột lơng vũ. Kể từ năm 2007, BRI đã tăng gấp đôi doanh thu hàng năm khi các
sản phẩm của họ, viz., Versazyme và Valkerase, thâm nhập vào các thị trường toàn cầu
mới nổi như Brazil, Ấn Độ và Trung Quốc. Trong một báo cáo gần đây, BRI tuyên bố
rằng Versazyme và Valkerase có doanh thu 12,7 triệu đô la Mỹ trong năm 2011, đạt tốc
độ tăng trưởng doanh thu 938% từ năm 2008 đến năm 2011 [1].
Genencor International, cùng với Cơ quan Bảo vệ Sức khỏe của Vương quốc Anh,
vào năm 2006 đã cho ra đời loại enzyme đầu tiên, Prionzyme, được thiết kế đặc biệt như
một chất khử trùng prion cho các thiết bị y tế. Prionzyme là một protease được thiết kế để
tăng hoạt tính, độ đặc hiệu rộng hơn và khả năng điều chỉnh nhiệt để hoạt động trong các
điều kiện khác nhau. Nó có thể được sử dụng để khử trùng các dụng cụ y tế được sử dụng
trong các cuộc phẫu thuật xâm lấn, chẳng hạn như các thủ thuật liên quan đến hệ thần
kinh trung ương, mắt và amidan, để giảm sự lây lan của bệnh Creutzfeldte-Jakob biến thể
[1].
PURE100 keratinase là một chế phẩm thương mại khác, một keratinase tái tổ hợp
được Zurko Bioresearch tiếp thị cùng với Proteos Biotech vào năm 2008 cho các ứng
dụng y sinh, dược phẩm và mỹ phẩm. Nó đã được khẳng định là có ứng dụng trong việc
loại bỏ keratin trong bệnh vẩy nến mụn trứng cá, loại bỏ mô sẹo ở người và sự thối hóa
của da sừng, làm rụng lơng, chuẩn bị vắc xin cho liệu pháp điều trị bệnh da liễu, tăng
cường dược phẩm trong điều trị móng và điều trị sẹo, và tái tạo biểu mô [1].
2.3 Tinh sạch keratinase
Tinh sạch enzyme là một bước cần thiết để tạo ra enzyme phù hợp cho các ứng dụng
cơng nghiệp khác nhau. Nó cũng làm tăng hiệu quả của enzym. Keratinase có thể được
làm sạch bằng nhiều phương pháp khác nhau. Chiến lược đơn giản nhất liên quan đến

việc tinh sạch enzyme bằng cách kết tủa, sau đó là sắc ký cột [1].
Keratinase thơ thường được sản xuất bằng q trình lên men chìm bằng cách cấy vi
khuẩn hoặc nấm thuần khiết vào môi trường sản xuất với muối vi lượng và bột lông vũ
(1%) như nguồn cacbon và nitơ cùng với chiết xuất nấm men (0,01%), NaCl ( 0,05%),
KH2PO4 (0,03%), K2HPO4 (0,04%) và MgCl2 (0,01%) [70,91,92]. Các mẫu cấy có thể
14


được ủ ở 30-37oC trong 3-5 ngày, sản phẩm được ly tâm và phần nổi phía trên có thể
được sử dụng làm enzym thơ, có thể được tinh sạch thêm [1].
2.3.1 Kết tủa bằng axeton
Việc tinh chế một phần keratinaza có thể đạt được bằng cách kết tủa axeton [1]:
 Phần nổi phía trên có chứa keratinase được kết tủa với axeton đã được làm lạnh
trước (30-80%).
 Axeton được thêm vào phần nổi phía trên theo tỷ lệ 3: 1 và ủ trong 60 phút ở
20 oC.
 Hỗn hợp được ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng / phút trong 10 phút.
 Phần nổi phía trên được loại bỏ cẩn thận và viên được hòa tan trong dung dịch
đệm Tris-axetat 50 mM, pH=7. Trọng lượng phân tử của keratinase được tinh
chế một phần có thể được xác định bằng cách chạy điện di trên gel natri
dodecyl sulfatepolyacrylamide (SDS-PAGE).
Kết tủa axeton được sử dụng để tinh sạch keratinase từ Aspergillus oryzae NRRL447, cho thấy hoạt tính cụ thể 258,8 U / mg với năng suất gấp 2,3 lần và 52,5%. Tương
tự, keratinase từ B. licheniformis FK 14 sau khi tinh chế cho thấy hoạt tính cụ thể là 218
U / mg với độ tinh khiết gấp 86 lần và độ thu hồi 25%. Một trong những nhược điểm của
kết tủa bằng axeton là protein có thể bị biến tính và viên khó phân giải [1].
2.3.2 Kết tủa bằng amoni sulfat
Keratinase cũng có thể được tinh chế bằng cách kết tủa amoni sulfat. Các keratinase
tinh khiết đã được báo cáo có khối lượng phân tử trong khoảng 27-200 kDa từ các nguồn
vi sinh vật và nấm khác nhau [1].
Enzyme trong phần nổi phía trên được kết tủa bằng cách thêm amoni sulfat rắn với

các dải bão hòa khác nhau: 0-20, 20-40, 40-60, 60-80 và 80-100%. Kết tủa được thu bằng
cách ly tâm ở 8000g trong 30 phút ở 4 oC. Kết tủa enzyme được hịa tan trong dung dịch
đệm Tris-HCl có thể tích tối thiểu là 50 mM, pH 7,5-8. Dung dịch enzyme sau đó được
khử muối bằng cách thẩm tách với cùng một chất đệm [1].
2.3.3 Sắc ký trao đổi ion
Dung dịch enzym thẩm tách thu được sau khi kết tủa amoni sulfat được đưa vào cột
dietylaminoetyl (DEAE)-Sepharose được hiệu chuẩn trước với dung dịch đệm Tris-HCl
15


50 mM, pH 7,5-8,0. Protein không liên kết được rửa sạch khỏi cột bằng cách đi qua hai
thể tích đệm. Protein liên kết được rửa giải bằng gradien tuyến tính 0-1,0 M NaCl trong
dung dịch đệm với tốc độ dòng 1,0 mL / phút. Các phần nhỏ của 3,0 mL được thu thập và
sàng lọc hoạt động tiêu sừng. Sau đó, các phần hoạt động mạnh nhất được gộp lại và áp
dụng lại vào cột carboxymethyl hoặc benzamidine Sepharose 6B và protein lại được rửa
giải bằng gradient NaCl (0,5-1,0 M) ở tốc độ dòng 0,5 mL / phút và các phần nhỏ 1,0 mL
được thu thập. Các phần hoạt động được gộp lại và thẩm tách trong dung dịch đệm TrisHCl 50 mM, pH 7,5-8, để sử dụng thêm [1].
2.3.4 Lọc gel
Keratinase đã được tinh chế từ các nguồn vi khuẩn và nấm khác nhau. Tinh chế
keratinase thường bao gồm quy trình ba bước bao gồm kết tủa bằng axeton / amoni sulfat,
tiếp theo là sắc ký trao đổi ion và bước cuối cùng là lọc gel. Các phần hoạt động thu được
sau khi sắc ký trao đổi ion được gộp lại, và các chất khơng hịa tan được loại bỏ bằng
cách ly tâm và lọc [1].
Các dung dịch được đưa vào cột lọc gel có chứa Sephadex G-75 hoặc Sephadex G
100. Cột được cân bằng với dung dịch đệm Tris-HCl 50 mM, pH 7,5-8,0, và các phân
đoạn được thu thập với tốc độ rửa giải 1 mL / phút. Các phân đoạn hoạt động keratinase
được thu thập và cô đặc để sử dụng tiếp. Các phương pháp thông thường như kết tủa và
tách sắc ký là nhiều bước và tốn thời gian. Hơn nữa, chúng bao gồm việc sử dụng các hóa
chất độc hại và đắt tiền [1].
Một keratinase ngoại bào từ nấm Scopulariopsis brevicaulis được tinh chế bằng cách

kết tủa ammonium sulfate và một quy trình liên quan đến kỹ thuật sắc ký
DEAEecellulose và Sephadex G-100. Suntornsuk và cộng sự. đã tinh chế keratinase chất
làm mát nhiệt có khối lượng phân tử 35 kDa từ B. licheniformis. Một keratinase kiềm 27
kDa từ Bacillus sp. đã được thanh lọc. Một keratinase có serine tại vị trí hoạt động đã
được tinh chế khỏi B. megaterium. Một keratinase có thể điều nhiệt có khối lượng phân
tử 28,7 kDa được tinh chế từ Clostridium sporogenes. Tương tự, một keratinase ngoại
bào từ Lysobacter NCIMB 9497 cũng được tinh sạch [1].

16


2.3.5 Xác định nồng độ protein hòa tan
Nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Bradford với albumin huyết thanh
bò (BSA) làm tiêu chuẩn. Nồng độ protein hòa tan được đo bằng phương pháp axit
bicinchoninic (BCA) với BSA là tiêu chuẩn [1].
Một mẫu protein (25 mL) được thêm vào 200 mL thuốc thử BCA và hỗn hợp phản
ứng được ủ ở 37oC trong 30 phút. Độ hấp thụ ở bước sóng 562 nm (A562) được đo [1].
2.3.6 Độ tinh khiết của Enzyme
Độ tinh khiết của enzyme có thể được phân tích bằng SDS-PAGE và zymography.
SDS-PAGE có thể được thực hiện bằng cách sử dụng gel polyacrylamide phân tách
12%. Các mẫu enzym cho SDS-PAGE được chuẩn bị bằng cách trộn với 5 dung dịch
đệm điện di (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2,5% (w/v) SDS, 10% (v/v) glycerol, 5% (v/v) bmercaptoethanol, 0,002% (w/v) bromophenol blue) và sau đó các mẫu được nung ở 98 oC
trong 5 phút trước khi điện di [1].
Zymography được thực hiện bằng cách sử dụng một quy trình tương tự như được sử
dụng cho SDS-PAGE ngoại trừ việc bổ sung 0,2% keratin hòa tan vào gel tách và sử
dụng các mẫu enzyme chưa được làm nóng. Sau khi hồn thành q trình điện di, gel
zymogram được ủ với 2,5% (v/v) Triton X-100 trong 1 giờ và rửa bằng đệm Tris-HCl 50
mM (pH 9,0) ở 40oC. Coomassie Brilliant Blue R-250 được sử dụng làm chất nhuộm
màu cho tất cả các loại gel và quá trình khử được thực hiện bằng dung dịch axit axetic:
metanol: nước (10:20:70). Các vùng rõ ràng trên nền màu xanh lam của gel xác nhận hoạt

động tiêu sừng của các enzyme [1].
2.4 Đặc điểm sinh hóa của keratinase
Keratinase từ một số vi sinh vật đã được nghiên cứu rộng rãi về các đặc tính sinh hóa
của chúng. Các đặc tính quan trọng bao gồm pH và nhiệt độ và ảnh hưởng của chất ức
chế, ion kim loại, dung môi, chất tẩy rửa không ion và chất khử [1].
2.4.1 Nhiệt độ và pH tối ưu
Phần lớn keratinase của vi sinh vật và nấm là các protease kiềm hoặc trung tính có
hoạt tính tối ưu ở khoảng pH 7,5-10,0. Hầu hết các keratinase thể hiện sự ổn định trong
phạm vi pH rộng và nhiệt độ từ ưa nhiệt đến ưa nhiệt. Một số keratinase cũng đã được
tìm thấy với hoạt tính tối ưu ở pH có tính kiềm cao và ở pH hơi axit. Keratinase từ
17


Streptomyces thermoviolaceus SD8 cho thấy pH tối ưu là 8, trong khi pH tối ưu của
Thermoactinomyces candidus 222 là 8,6. Enzyme phân hủy sừng từ B. licheniformis cho
thấy hoạt động tối đa ở pH 8,5 [1].
Phạm vi nhiệt độ tối ưu là từ 30 đến 80 oC đối với hầu hết các keratinase. Keratinase từ
T. candidus 222 cho thấy nhiệt độ tối ưu là 70°C. Keratinolytic enzymes từ
Chrysosporium keratinophilum và vi khuẩn ưa nhiệt Fervidobacterium islandicum AW-1
cho thấy nhiệt độ đặc biệt cao là 90 và 100 oC, với chu kỳ bán rã tương ứng là 30 và 90
phút. Keratinase từ Lysobacter NCIMB 9497 cho thấy hoạt động tiêu sừng cao nhất của
nó ở nhiệt độ tối ưu là 50oC, trong khi keratinase từ Chryseobacterium sp. kr6 hiển thị
nhiệt độ tối ưu là 55oC. Keratinase từ Chryseobacterium sp. RBT đã được thử nghiệm để
có hoạt tính tối đa ở pH 8,6 và 50 oC. Saccharomonospora viridis SJ-21, được phân lập từ
suối nước ở Gujarat, Ấn Độ, cho thấy hoạt động của enzym tối đa ở 55oC và pH 9,5 [1].
2.4.2 pH và độ ổn định nhiệt
Các nghiên cứu về độ ổn định pH cho thấy rằng keratinase thường hoạt động và ổn
định trong một phạm vi pH rộng từ 5 đến 13. Keratinase tinh khiết từ Streptomyces
pactum DSM 40530 cho thấy sự ổn định trong phạm vi pH từ 7 đến 10 và trong phạm vi
nhiệt độ từ 40 đến 75oC. Keratinase từ F. islandicum AW-1 cho thấy khả năng ổn định

nhiệt trong 90 phút ở 100oC và từ Thermoanaerobacter keratinophilus trong 6 giờ ở
80oC. Các enzym tiêu sừng từ Nesterenkonia sp. AL-20 và Bacillus pseudofirmus AL-89
đã được tinh sạch và đặc trưng. Keratinase từ Nesterenkonia sp. AL-20 ổn định trong
phạm vi pH rộng, hiển thị hơn 90% hoạt tính của nó trong khoảng pH 7,5 đến 11,5.
Enzyme tiêu sừng từ B. pseudofirmus AL-89 giữ lại khoảng 70% hoạt tính ban đầu trở
lên và cho thấy sự ổn định trong phạm vi pH rộng 6,5-11,0 [1].
2.4.3 Ảnh hưởng của các ion kim loại, chất ức chế và chất tẩy rửa
Keratinase là serine hoặc protease kim loại có đặc tính cơ chất rộng. Hầu hết các
keratinase bị ức chế bởi chất ức chế peptidase đặc hiệu của serine là
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) và axit ethylenediaminetetraacetic (EDTA).
Keratinase từ Serratia sp HPC 1383 cho thấy sự ức chế 47% khi có PMSF và cũng bị ức
chế một phần bởi chất khử β -mercaptoethanol (39%) và bởi các ion Zn 2+ (41%) [116].
Tuy nhiên, các ion kim loại hóa trị hai như Ca 2+ và Fe2+ làm tăng hoạt tính của enzym lần
lượt là 15% và 26%. Nói chung, hoạt động keratinase được kích thích bởi sự hiện diện
của các ion kim loại hóa trị hai như Ca 2+, Mg2+, và Mn2+. Một keratinase từ chủng B.
18


subtilis MTCC-9102 hoàn toàn bị ức chế bởi EDTA, 1,10-phenanthroline, Hg 2+ và Cu2+,
trong khi nó vẫn khơng bị ảnh hưởng bởi PMSF. Các ion kim loại như Zn 2+, Ca2+, Mg2+,
Mn2+ và Ni2+ tăng cường hoạt động keratinase. Sự tăng cường hoạt động của enzym
keratinase từ B. licheniformis ER-15 đã được quan sát thấy với β -mercaptoethanol 5 mM.
Hoạt tính của enzyme keratinase ngoại bào từ B. pumilus KS12 được tăng cường gấp tám
lần bởi dithiothreitol hoặc β -mercaptoethanol. Hoạt động của enzym này cũng được tăng
cường bởi các chất hoạt động bề mặt, chất tẩy rửa và chất oxy hóa khác nhau [1].

Tài Liệu Tham Khảo

19

[1]

D. Kothari, A. Rani, A. Goyal, "Keratinases," in Current Developments in
Biotechnology and Bioengineering, 2017, pp. 447-469.

[2]

Beti Vidmar and Maša Vodovnik, "Microbial Keratinases: Enzymes with
Promising Biotechnological Applications," Food Technology & Biotechnology,
pp. 312-328, 2018.

20