NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KERATINASE TRONG TẾ BÀO ESCHERICHIACOLI VÀ BACILLUS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

HOÀNG THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
KERATINASE TRONG TẾ BÀO
ESCHERICHIACOLI VÀ BACILLUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2014

1


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

HOÀNG THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
KERATINASE TRONG TẾ BÀO
ESCHERICHIA COLI VÀ BACILLUS
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60420122

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn chính: TS. Nguyễn Huy Hoàng
Người hướng dẫn phụ: PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân

Hà Nội – Năm 2014

2


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 11
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12
1.1.Keratin ................................................................................................................ 12
1.2. Keratinase .......................................................................................................... 14
1.3.Một số chủng biểu hiện ...................................................................................... 18
1.3.1. Chủng chủ E. coli

18

1.3.2. Chủng chủ Bacillus subtilis Error! Bookmark not defined.
1.4. Ứng dụng của keratinase ................................... Error! Bookmark not defined.
1.4.2. Ứng dụng trong công nghiệp

Error! Bookmark not defined.

1.4.3. Đối với môi trường sinh thái

Error! Bookmark not defined.

1.4.4.Ứng dụng trong y, dược học Error! Bookmark not defined.

1.5. Tình hình nghiên cứu ......................................... Error! Bookmark not defined.
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Error! Bookmark not defined.
1.5.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Error! Bookmark not defined.

PHầN II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ERROR! BOOKMARK NOT
DEFINED.
2.1. Nguyên liệu ........................................................ Error! Bookmark not defined.
2.2.Phương pháp ...................................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số của chủng vi khuẩn

Error! Bookmark not defined.

2.2.2.Phản ứng PCR Error! Bookmark not defined.
2.2.3. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn

Error! Bookmark not defined.

2.2.4. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose

Error! Bookmark not defined.

3


2.2.5. Điện di protein trên gel Polyacrylamide (SDS-PAGE)
defined.
2.2.6. Thiết kế vector biểu hiện trong E. Coli

Error! Bookmark not

Error! Bookmark not defined.

2.2.7. Biến nạp vào tế bào E.coli Error! Bookmark not defined.
2.2.8. Biểu hiện keratinase tái tổ hợp trong E.coli BL21 (DE3) Error! Bookmark not
defined.
2.2.9. Tổ hợp gen ker bằng phương pháp Megaprimer Error! Bookmark not defined.
2.2.10. Thiết kế vector biểu hiện keratinase trong B.subtilis 168M
not defined.

Error! Bookmark

2.2.11. Biến nạp vectormang gen keratinase tái tổ hợp trong B.subtilis 168M
Error! Bookmark not defined.
2.2.12. Biểu hiện keratinase tái hợp trong B.subtilis 168M
defined.

Error! Bookmark not

2.2.13. Thử hoạt tính keratinase Error! Bookmark not defined.

PHầN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
DEFINED.

ERROR! BOOKMARK NOT

3.1. Kết quả tách ADN tổng số .................................. Error! Bookmark not defined.
3.2. Nhân gen keratinase bằng PCR.......................... Error! Bookmark not defined.
3.3.Biểu hiện gen keratinase trong E.coli ................. Error! Bookmark not defined.
3.3.1. Tách dòng gen KerE trong vector pJET1.2 để biểu hiện trong E.coli
Bookmark not defined.

3.3.2. Kết quả phân tích trình tự gen

Error!

Error! Bookmark not defined.

3.3.3. Thiết kế vector biểu hiện trong E.coli

Error! Bookmark not defined.

3.3.4. Biểu hiện gen Ker trong E.coli BL21Error! Bookmark not defined.
3.4. Biểu hiện gen kerB trong tế bào B.subtilis 168MError! Bookmark not defined.
3.4.1 Tái tổ hợp gen KerB bằng phương pháp Megaprimer
defined.

Error! Bookmark not

4


3.4.2. Tách dòng tổ hợp gen keratinase bằng vector pTZ57RT trong E.coli TOP10F’
Error! Bookmark not defined.
3.4.3. Thiết kế vector biểu hiện trong Bacillus subtilis Error! Bookmark not defined.
3.4.4 Biểu hiện keratinase trong tế bào Bacillus subtilis 168M Error! Bookmark not
defined.
3.5. Xác định hoạt tính keratinase tái tổ hợp từ E.coli BL21 và B.subtilis 168MError!
Bookmark not defined.

PHầN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
DEFINED.

ERROR! BOOKMARK NOT

4.1. Kết luận .............................................................. Error! Bookmark not defined.
4.2. Kiến nghị ............................................................ Error! Bookmark not defined.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

18

5


LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tri ân và sâu sắc tới TS. Nguyễn Huy Hoàng – Phó viện
trưởng, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện KH&CN Việt Nam, là người thầy_người anh đã
tận tình hướng dẫn, dìu dắt, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ và chia sẻ những khó
khăn cùng em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn tới PGS. TS Nguyễn Thị Hồng Vân – cô giáo đã tận
tình hướng dẫn em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn.
Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, em đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo tận
tình của các cán bộ Phòng Hệ gen học chức năng, viện Nghiên cứu hệ gen. Đặc biệt là
Th.S. Nguyễn Thu Hiền đã giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và tiến hành thí
nghiệm.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo nghiên cứu giảng dạy tại Khoa
Sinh, Khoa đào tạo sau đại học – Trường Đại học KHTN đã truyền đạt cho em những
kiến thức bổ ích trong suốt 2 năm qua.
Cuối cùng, em xin gửi tới bố, mẹ và những người thân trong gia đình lòng biết ơn
sâu sắc, cảm ơn những người bạn đã chia sẻ khó khăn thử thách trong cuộc sống và công
việc để em có được kết quả này.

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 08 năm 2014

6


BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
B.subtilis

Bacillus subtilis

bp

Base pair(c

DNA

Deoxyribonucleic acid

E.coli Escherichia coli
EtBr

Ethidium Bromide

IPTGIsopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Ker

Keratinase

LB

Luria-Bertani

µl

Microlit

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phvà B.sem nhis 168M chia

Primer-F

MPolymer

Primer-R

MMPolymer

rARN

Ribosomal ribonucleic acid

VK

Vi khul

DANH MỤC CÁC BẢNG
7

Tên bảng

Số hiệu

Trang

Bảng 1

Trình tư các cặp mồi

21

Bảng 2

Thành phần một phản ứng PCR

23

Bảng 3

Thành phần gel cô 5% và gel tách 10% polyacrymide

25

Bảng 4

Thành phần phản ứng cắt với enzymeXhoI và BamHI

26

Bảng 5

Thành phần và điều kiện phản ứng PCR1a

29

Bảng 6.

Thành phần và điều kiện phản ứng PCR2

30

Bảng 7

Hoạt tính của keratinase từ các chủng nghiên cứu

48

8


DANH MỤC CÁC HÌNH

Tên hình

Số hiệu

Trang

Hình 1

Một số sản phẩm chứa keratin

3

Hình 2

Cấu trúc xoắnα và gấp nếp β của keratin

4

Hình 3

Cấu tạo phân tử của keratinase

6

Hình 4

Vi khuẩn E.coli

9

Hình 5

Vi khuẩn B. subtilis

10

Hình 6

Vector biểu hiện

19

Hình 7

Sơ đồ nghiên cứu biểu hiện gen Ker trong E.coli và
B.subtilis

22

Hình 8

Sơ đồ tái tổ hợp gen Ker và promoter của gen α-amylase
của chủng B. subtilis 168M bằng phương pháp
Megarprimer

28

Hình 9

Ảnh điện di DNA tổng số

33

Hình 10

Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen Keratinase

34

Hình 11

Điện di sản phẩm cắt bằng 2 enzyme giới hạn XhoI và
BamHI

36

Hình 12

Trình tự được đọc bằng mồi vector (T7 promoter và T7
terminator)

37

Hình 13

Cắt kiểm tra sản phẩm tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới
hạn

39

Hình 14

Điện di protein trên gel polyacrylamide –SDS ở nồng độ
12,5%

40

Hình 15

Điện di đồ sản phẩm PCR

42

Hình 16

Điện di đồ sản phẩm cắt kiểm tra vector tách dòng bằng
enzyme giới hạn

43

9


Hình 17

Plasmid pHT43 mang tổ hợp [Bspr.Ker] được cắt kiểm
tra bằng SmaI và KpnI

45

Hinh 18

Kết quả kiểm tra hoạt tính các tế bào B. subtilis 168M tái
tổ hợp mang vector tái tổ hợp pHT43[Bspr.Ker]

46

Hình 19

Điện di dịch enzyme thô trên gel SDS-PGE

47

10


MỞ ĐẦU
Ngày nay, ngành công nghệ sinh học chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế
nước ta. Trong đó, công nghệ DNA tái tổ hợp đang được chú trọng đầu tư và là công
nghệ then chốt của lĩnh vực công nghệ sinh học. Công nghệ DNA tái tổ hợp ra đời dựa
trên cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử. Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA cho phép
phân lập và khuếch đại một gen từ genome của một sinh vật để có thể nghiên cứu, biến
đổi và chuyển nó vào trong một cơ thể sinh vật khác. Việc nâng cao hoạt tính và khả
năng tổng hợp enzyme bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA hiện đang được ứng dụng rộng rãi.
Trong đó có tạo dòng và sản xuất keratinase.
Keratinase là enzyme có khả năng thủy phân các protein cứng, các cấu trúc phức
tạp trong lông, tóc, móng, sừng...Nhiều nghiên cứu ghi nhận rằng keratinase là thành viên
của nhóm protease serine. Đây là nhóm enzyme thương ma ̣i , có nhiều ứng dụng quan
trọng trong các ngành công nghiê ̣p, trong các quá trình công nghệ sinh học liên quan đến
chất thải có chứa keratin, các ngành công nghiệp gia cầm và công nghê ̣da.
Với sự bùng nổ của ngành công nghiệp gia cầm, hàng năm tồn đọng hàng tấn lông
gà trong tự nhiên, điều này gây nên tình trạng ô nhiễm môi trường. Trong khi đó, lông gà
chiếm khoảng 90% là keratin, việc thủy phân keratin đem lại được những ứng dụng to
lớn, có thể làm phân bón , keo, tạo ra các axit amin hiếm như serin , cystein và prolin, đặc
biệt là tạo ra thức ăn chăn nuôi. Tuy nhiên, nếu xử lý lông vũ bằng các loại hóa chất như
những phương pháp trước đây sẽ làm mất hàm lượng axit amin của thức ăn và rất tốn

kém. Trong khi đó, nếu sử dụng keratinase trong quá trình thủy phân lông vũ để sản xuất
thức ăn chăn nuôi sẽ không làm mất hàm lượng dinh dưỡng của nó mà giá thành rẻ và
làm giảm ô nhiễm môi trường.
Hiê ̣n nay , keratinase đươ ̣c thu từ nhiề u nguồ n khác nhau như nấ m

, xạ khuẩn , vi

khuẩ n. Trong đó, nhóm vi khuẩn có kh ả năng sinh keratinase cao, hoạt tin
́ h keratinase đã
được ghi nhận rộng rãi đối với các chủng từ chi Bacillus và Streptomyces. Tuy nhiên, khả
năng sinh tổng hợp keratinase từ các chủng hoang dại còn hạn chế, hoạt tính của enzyme
thấp và thường lẫn tạp chất. Do đó để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của keratinase thì
trọng tâm là nâng cao trình độ sản xuất keratinase tái tổ hợp thông qua tách dònggenvà

11


biểu hiện gen. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu tách dòng và hiện gen keratinase
từ vi khuẩn Gram dương, xạ khuẩn hay nấm men trong hệ biểu hiện E.coli, B.subtilis
hoặcP.pastoris...Ở Việt Nam hiện nay việc nghiên cứu keratinase còn hạn chế, chưa có
cơ sở nào sản xuất keraitnase ở quy mô công nghiệp. Vì vậy với mục đích tìm ra được
chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng sinh karatinase cao để có thể đưa vào sản xuất với
qui mô lớn, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự biểu hiện gen mã hóa
keratinase trong tế bào Escherichiacoli và Bacillus”.
 Mục tiêu đề tài
Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩntái tổ hợp có khả năng sinh keratinase cao nhằm
ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp
 Nội dung nghiên cứu
-

Chọn dòng gen biểu hiện keratinase từ chủng vi khuẩn hoang dại

-

Thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện trong E.coli và B.subtilis.

-

Biểu hiện gen mã hóa keratinase trong E.coli và B.subtilis.

-

Đánh giá mức độ biểu hiện của chủng tái tổ hợp so với chủng hoang dại.

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Keratin
Keratin là một hợp chất sừng, thành phần chính trong da, tóc, lông, móng tay,
móng guốc, sừng, răng và len (Hình 1).Đây là protein có cấu trúc bền vững, khó hòa tan,
chứamột lượng lớn sulfua, các axitamin, đặc biệt là cystein (chiếm 24%), ngoài ra có các
axit amin khác như: glycin, alanin, serin và valin. Ngoài các liên kết hydro nội phân tử và
liên phân tử, keratin còn có hàm lượng lớn lưu huỳnh trong cystein. Chính các cystein có
thể tạo thành cầu disulfide.Những cầu nối này được tạo từ các nguyên tử lưu huỳnhliên
kết với nhau, do đó nó không dễ dàng hòa tan, không dễ dàng bị phân hủy bởi các
enzyme thông thường như: trypsin, pepsin, và papain… Tùy thuộc số lượng liên kết

12


cysteindisulfide chứa trong keratin, có thể chia thành 2 loại: keratin cứng được tìm thấy
trong móng guốc và keratin mềm tìm thấy trong mô linh hoạt như tóc và da (Hình 1).

Hình 1. Một số sản phẩm chứa keratin
Keratin chiếm khoảng 30% phần biểu bì của các tế bào sống và 85% protein của
các tế bào chết (lớp vảy hoặc sừng đã chết ở bên ngoài da). Trong tóc, keratin chiếm 6595% và ở lông vũchiếmgần90% theotrọng lượng.Mỗi phân tử keratin là rất nhỏ khoảng
10 nm, chúng liên kết với nhau qua cầu disulfide, hydro với các muối cũng như các liên
kết khác.Từ các sợi keratin có chứa hàm lượng lưu huỳnh lớn đã được ép thành các bó
keratin lớn hơn.
Keratin có 2 dạng cấu trúc xoắn α và gấp nếp β[50],α-keratin chủ yếu được tìm
thấy trong động vật có vú còn β-keratin tạo thành các chuỗi polypeptide dạng mảnh có
chủ yếu trong da các loài bò sát và các loài chim. Cấu trúc của α và β-keratin trong tóc và
lông có thể thấy khi chiếu xạ tia bằng tia X.
Anpha- keratin (α-keratin): có trong tóc (kể cả lông cừu), sừng, móng tay, móng chân, và
móng guốc của động vật có vú. Cấu tạo là các sợi đơn protein liên kết với nhau bằng liên
kết hydro.
Beta keratin (β-keratin): Cótrong móng tay và móng vuốt của loài bò sát, họ vỏ
chelonians (ba ba, rùa, …), và trong lông, mỏ, móng vuốt của chim và nhím, được hình
thành chủ yếu trong các tấmβ. Cấu trúc β cứng, chắc hơn cấu trúc α do các tấm β được
nối với nhau bằng các cầu nối disulfide (Hình 2).

13


Hình 2. Cấu trúc xoắnα và gấp nếp β của keratin
Dựa vào số lượng sulfur, keratin có thể được chia thành 2 dạng keratin “mềm” và
keratin “cứng”[45]. Keratin mềm có thể tìm thấy trong da, có ít cầu nối disulfur và mềm
dẻo hơn và có thể dễ dàng phá vỡ còn keratin cứng tìm thấy ở lông vũ, tóc, móng guốc,
có nhiều cầu nối disulfur và không thể kéo dài ra, keratin cứng không hòa tan trong nước,
và khó phân hủy hơn. Trong tóc chủ yếu được cấu tạo bởi keratin cứng. Keratin tồn tại
phổ biến nhất hiện nay trong da động vật, sừng, tóc, lông với thành phần là các axit
aminnhư: glutamic, lysin, cystein, alanin và tyrosinđây hầu hết là những axit amin cần

thiết mà cơ thể không tự tổng hợp được,đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì và phát
triển cơ thể. Mặc dù rất khó phân hủy bởi những enzyme thông thường nhưng các chất
thải keratin có thể bị phân hủy bởi vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm do chúng tạo ra các
protease – keratinase.
Thủy phân keratin từ vi sinh vật đã được nghiên cứu từ năm 1959[28], tuy nhiên
cơ chế thủy phân từ vi khuẩn vẫn chưa được nghiên cứu nhiều.Việc giảm cầu nối disulfur
có thể có ảnh hưởng đáng kể đến sự phân hủy keratin[9],[40]Keratinase là enzyme, có
khả năng phân hủy cấu trúc protein keratin khó tan. Các keratinase tham gia thủy phân
các chất thải keratin từ lông vũ trong công nghiệp chăn nuôi gia cầm đã tạo ra các sản
phẩm có giá trị như thức ăn chăn nuôi, phân bón, các polymer và các axit amin hiếm như
serin, cystein và prolin.
1.2. Keratinase
Keratinasethuộcnhómcácprotease

kiềm

cókhả

năng

hoạt

động

mạnh

trênkeratinkhông hòa tan. Enzyme này đóng vai tròquan trọngtrongviệc thủy phân cấu

14

trúc phức tạp của keratin có tronglông vũ, tóc, lông cừu, collagenvàcasein,trong việc loại
bỏcác rác tắc nghẽntrong cáchệ thốngxử lý nước thải. Keratinase ở vi sinh vật chủ yếu
enzyme ngoại bào khi sinh trưởng trên môi trường có chứa cơ chất keratin và đôi khi
cũng có keratinase nội bào, chúng giúp cho enzyme thủy phân cầu disulfit, sulfite hoặc
thiosulfate có trong các cơ chất. Keratinase ngoại bào thủy phân cấu trúc keratin trong
sừng, lông, móng bằng cách giảm các cầu disulfide của keratin, quá trình này có sự hiện
diện của các chất khử như natri sulfit, DTT (dithiothreitol), mercaptoethanol, glutathion,
cysteinvà thioglycolate.
Keratinase được tạo ra từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau vi khuẩn, xạ khuẩn và
nấm. Các enzyme này được tạo ra trong quá trình phân hủy các cơ chất như keratin trong
tóc, lông, sừng, …Các đặc tính về hóa sinh và lý sinh của keratinase là rất đa dạng. Phần
lớn keratinase hoạt động ở điều kiện tối ưu là pH trung tính tới kiềm và nhiệt độ từ 300C
đến 600C. Hơn nữa kerainase có tiềm năng ứng dụng lớn trong nông nghiệp, dược học và
các lĩnh vực y sinh học, được ứng dụngtrong cáchệ thốngnước thải, thực phẩm, dệt may,
dược phẩm,mỹ phẩm, keratinasecũngđượcsử dụng trong ngành công nghiệpthuộc
datrongquá trìnhtẩy lôngcủadađộng vậtthay vìxử lýchúngvớisodium sulfide. Ngoài ra, sử
dụng keratinase trong sinh khối sinh học có thể giải quyết một phần nào đó về chuyển đổi
năng lượng và tái sử dụng các nhiên liệu.
Keratinase là enzyme thương mại do hình dạng cấu tạo có tới 97% giống với
protease kiềm(Hình 3) và nó cũng bị ức chế bởi các thuốc ức chế giống như ức chế
protease serine[5].Khối lượng phân tử tùy theo từng loại sinh vật có thể dao động từ 18
đến 35 kDa đối với protease serine có khối lượng phân tử nhỏ hoặc lớn hơn 90 kDa đối
với protease serine có khối lượng lớn.

15


Hình 3: Cấu tạo phân tử của enzyme Keratinase
Ðến nay, keratinase được nghiên cứu chủ yếu có nguồn gốc từ vi khuẩn, trong đó

Bacillus được nghiên cứu nhiều nhất. Nhiều chủng B. licheniformis và B. subtilis được
mô tả có khả năng thủy phân keratin, những loài khác như B. pumilus và B. cereus cũng
có khả năng tổng hợp keratinase. Sinh tổng hợp keratinase cũng được nghiên cứu ở xạ
khuẩn, chủ yếu là từ các chi Streptomyces. Nhóm vi khuẩn này được phân lập từ các
vùng đất khác nhau, có khả năng thủy phân một loạt các chất chứa keratin như tóc, len và
lông.
Tính chất:
Keratinase thuỷ phân thành các axit amin:
Với tính chất thuỷ phân của keratinase, nó phá vỡ cầu nối disunfua của keratin làm
đứt liên kết của vòng xoắn. Như vậy, sau khi thuỷ phân hợp chất keratin trong lông vũ đã
được phân huỷ và chia nhỏ thành các axit amin và peptit ngắn. Khi đó protein keratin
mang đầy đủ các tính chất của protein tan như là: Tính hoà tan, kết tủa, điện ly lưỡng
tính, thuỷ phân và phản ứng màu đặc trưng. Keratinase chủ yếu tấn công vào các liên kết
disulfide (S-S), làm suy giảm các protein dạng sợi fibrin, elastin, collagen và sợi protein
khác.
pH và nhiệt độ:
Keratinase hoạt động được ở nhiệt độ từ 30oC - 80oC nhưng nhiệt độ tối ưu là: 50oC
và enzyme này được ổn định khi bảo quản ở -20oC[60]. Keratinase bền vững trong
khoảng pH từ 6,0 - 9,0 nhưng pH tối ưu là 7,5 [51].;

16


Chất kìm hãm:
Khi bổ sung đường sucrose và lactose làm ức chế sự tổng hợp keratinase[51]. Chất
nền có nồng độ và lượng cơ chất quá cao cũng sẽ làm ức chế sự tổng hợp keratinase[51].
Khi bổ sung các chất có chứa các ion kim loại nặng hoá trị hai như: Cu2+, Ag2+, Hg2+ và
Pb2+ thì cũng làm ức chế sự hoạt động của keratinase. Một số hoá chất khác cũng ức chế
phản ứng enzyme keratinase như: EDTA,…[30].
Chất hoạt hoá:

Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới thì khi bổ sung các chất có chứa các ion kim loại
hoá trị hai như: Ca2+, Mg2+, Mn2+ thì kích thích sự hoạt động của keratinase[30].
Đặc tính hóa sinh của keratinase
Các đặc tính của enzyme được tạo ra từ vi khuẩn là rất đa dạng, tùy thuộc vào loại vi
sinh vật sản xuất ra keratinase. Các enzyme này chủ yếu là enzyme ngoại bào được tiết ra
từ vi sinh vật. Phần lớn các keratinase được tiết ra từ vi khuẩn có pH là kiềm hoặc trung
tính, pH tối ưu từ 7,5-9,0. Tuy nhiên, một số keratinase khác được tối ưu hoạt động ngoài
phạm vi này, pH hoạt động ở kiềm hóa[10] hoặc pH là axít[21],[41]. Một số keratinase
ổn định trên một khoảng pH rộng,như keratinase của chủng Nocardiopsis TOA-1, được
ổn định trong khoảng pH từ 1,5-12, trong 24h ở 30°C[37].
Trọng lượng phân tử keratinase đã được xác định. Mặc dù trọng lượng phân tử các
enzyme từ 18 kDa[43] đến 240 kDa [13][11] nhưng đa số keratinase có trọng lượng phân
tử thấp hơn 50 kDa. Phần lớn các keratinase là các đơn enzyme, tuy nhiên phân lớp đa
enzyme cũng đã được ghi nhận[18][52].Keratinase có trọng lượng phân tử cao thường kết
hợp với các keratinase có đặc tính của metalloprotease hoặc chúng có nguồn gốc từ chịu
nhiệt.
Ảnh hưởng của các ion kim loại và các bất hoạt hoạt tính keratinase đã và đang được
nghiên cứu. Gần đây các nghiên cứu của Gupta và Ramnani [24]cho thấy các ion kim loại
hóa trị 2 như Ca2+, Mg2+ và Mn2+ có xu hướng kích thích hoạt tính enzyme keratinase.
Ảnh hưởng này có thể liên quan tới việc duy trì hoạt tính của enzyme và tạo ra sự ổn định
phức hợp giữa cơ chất và enzyme. Ngoài ra các ion kim loại có thể bảo vệ cho enzyme

17


chống lại biến tính về nhiệt độ[6],[40]. Ngược lại, sự chuyển trạng thái và các kim loại
nặng khác như Cu2+, Ag+, Hg2+ và Pb2+ là nguyên nhân của sự bất hoạt các enzyme
keratinase. Các keratinase thường ổn định trong sự hiện diện của dung môi hữu cơ như
DMSO, Triton X-100.
1.3.Một số chủng biểu hiện

1.3.1. Chủng chủ E. coli
E. coli là vi khuẩn Gram âm, có thể hiếu khí hoặc kị khí, không sinh bào tử. Chúng
có bộ máy di truyền tương đối đơn giản, thành phần di truyền sơ cấp chỉ là một nhiễm sắc
thể đơn với khoảng 5 triệu cặp bazơ. Tế bào E. coli có khả năng sinh sản với tốc độ
nhanh trên môi trường nuôi cấy đơn giản, trung bình 20 phút chúng lại phân chia một lần.
Đặc biệt, E. coli có khả năng thu nhận rất nhiều yếu tố di truyền từ môi trường ngoài như
plasmid, phage... với khả năng sao chép DNA rất lớn. Chính vì vậy, chúng đã được cải
biến để sử dụng như một vật chủ hữu hiệu trong kỹ thuật tách dòng cùng như biểu hiện
gen, có rất nhiều chủng được sử dụng như: E. coli BL21(DE3), E. coli DH5...

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt

1.

2.

3.
4.

5.
6.

Nguyễn Văn Hiếu Phí Quyết Chiến, Nghiêm Ngọc Minh, Lê Gia Hy (2010), "Tách
dòng và biểu hiện gen mã hóa protease serin của chủng Bacillus subtilis HT 24
trong Escherichia coli", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3A), pp. 841-846.
Văn Thị Hạnh Trần Tích Cảnh (1993), "Tạo protein hoà tan từ kazetine lông vũ
phế liệu.", Khoa học và công nghệ., 2, pp. 1-6.", Khoa học và công nghệ, 2, pp. 16.
Nguyễn Đình Kim (2001), "Giáo trình vi sinh vật đất", pp.
Nguyễn Đình Quyến Trần Thị Lan Phương (2001), "Phân lập và tuyển chọn các

chủng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin dùng để chuyển hóa sinh học lông
gia cầm", Sinh học, 23(2), pp. 27-30.
Tiếng anh
A. Brandelli (2005.), " Production of an extracellular keratinase from
Chryseobacterium sp. growing on raw feathers", J Biotechnol;, pp. 35-37.
A. Gessesse., R. Hatti-Kaul., B.A. Gashe., Mattiasson. B. (2003), "Novel alkaline
proteases from alkaliphilic bacteria grown on chicken feather Enzyme and
Microbial Technology", 32, pp. 519-524.
18


7.

8.
9.

10.

11.

12.
13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

Anbu P., Hilda A., Sur H. W., Hur B. K., Jayanthi S. ( 2008), "Extracellular
keratinase from Trichophyton sp. HA-2 isolated from feather dumping soil.", Int
Biodeterior Biodegrad., 62, pp. 287-292.
B Zhang, Z Sun, D Jiang, Niu T (2009), "Isolation and purification of alkaline
keratinase from Bacillus sp. 50-3", African Journal of Biotechnology, 8, pp.
B. Bockle., Muller. R. (1997), "Reduction of Disulfide Bonds by Streptomyces
pactum during Growth on Chicken Feathers Appl Environ Microbiol", 63, pp. 790792.
Balaji S., Kumar M. S., Karthikeyan R., Kumar R., Kirubanandan S., Sridhar R.,
Sehgal P. K. (2008), "Purification and characterization of an extracellular
keratinase from a hornmeal-degrading Bacillus subtilis MTCC (9102).", World J
Microbiol Biotechnol., 24, pp. 2741-2745.
Bernal C., Diaz I., Coello N. (2006), "Response surface methodology for the
optimization of keratinase production in culture medium containing feathers
produced by Kocuria rosea", Can J Microbiol., 52(5), pp. 445-50.
Brandelli A. (2008 ), "Bacterial keratinases: useful enzymes for bioprocessing
agroindustrial wastes and beyond.", Food Bioprocess Technol 1, pp. 105-116.
Cai C. G., Chen J. S., Qi J. J., Yin Y., Zheng X. D. (2008), "Purification and
characterization of keratinase from a new Bacillus subtilis strain", J Zhejiang Univ
Sci B., 9(9), pp. 713-20.
Chao Y. P., Xie F. H., Yang J., Lu J. H., Qian S. J. (2007), "Screening for a new
Streptomyces strain capable of efficient keratin degradation", J Environ Sci
(China). 19(9), pp. 1125-8.
Chitte R. R., Dey S. (2001), "Cloning and expression of an actinokinase gene from

a thermophilic Streptomyces in Escherechia coli", Indian J Exp Biol., 39(5), pp.
410-5.
Daroit D. J., Corrêa A. P. F., Brandelli A. (2009), "Keratinolytic potential of a
novel Bacillus sp. P45 isolated from the Amazon basin fish Piaractus
mesopotamicus.", Int Biodeterior Biodegrad., 63, pp. 358-363.
Dubendorff J.W. Studier F.W (1991), " Controlling basal expression in an
inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac
repressor.", J. Mol. Biol 219, pp. 45-59.
F. Xie., Y. Chao., X. Yang., J. Yang., Z. Xue. Y. Luo., Qian. S. (2009), "
Purification and characterization of four keratinases produced by Streptomyces sp.
strain 16 in native human foot skin medium Bioresour Technol", 101, pp. 344-350.
Friedrich A. B., Antranikian G. (1996), "Keratin Degradation by Fervidobacterium
pennavorans, a Novel Thermophilic Anaerobic Species of the Order
Thermotogales", Appl Environ Microbiol., 62(8), pp. 2875-2882.
Ghosh A., Chakrabarti K., Chattopadhyay D. (2008), "Degradation of raw feather
by a novel high molecular weight extracellular protease from newly isolated
Bacillus cereus DCUW", J Ind Microbiol Biotechnol., 35(8), pp. 825-34. Epub
2008 Apr 22.
19


21.

22.

23.

24.

25.

26.

27.

28.
29.

30.

31.

32.

33.

Gupta Rani, Ramnani Priya (2006), "Microbial keratinases and their prospective
applications: an overview", Applied Microbiology and Biotechnology, 70(1), pp.
21-33.
Gushterova A., Vasileva-Tonkova E., Dimova E., Nedkov P., Haertlé T. (2005),
"Keratinase production by newly isolated Antarctic actinomycete strains.", World J
Microbiol Biotechnol., 21, pp. 831-834.
H Shi-Hung Lin, Li-Jung Yin, Jiang. Shann-Tzong (2009), "Cloning, Expression,
and Purification of Pseudomonas aeruginosa Keratinase in Escherichia coli
AD494(DE3)pLysS Expression System", J. Agric. Food Chem, 57, pp. 3506–3511.
H. Gradisar., J. Friedrich., I. Krizaj., Jerala R. (. 2005.), " Similarities and
specificities of fungal keratinolytic proteases: comparison of keratinases of
Paecilomyces marquandii and Doratomyces microsporus to some known proteases
Appl Environ Microbiol; " 71, pp. 3420-3426.
Hiếu Nguyễn Văn, Tiến Phí Quyết, Minh Nghiêm Ngọc, Hy Lê Gia (2010), "Tách

dòng và biểu hiện gen mã hóa protease serin của chủng Bacillus subtilis HT 24
trong Escherichia coli", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3A), pp. 841-846.
Hong Hu, Jun He, Bing Yu, Ping Zheng, Zhiqing Huang, Xiangbing Mao, Jie Yu,
Guoquan Han, Chen Daiwen (2013), "Expression of a keratinase (kerA) gene from
Bacillus licheniformis in Escherichia coli and characterization of the recombinant
enzymes.", Biotechnol Lett, 35(2), pp. 239-44.
Ionata E., Canganella F., Bianconi G., Benno Y., Sakamoto M., Capasso A., Rossi
M., La Cara F. (2008), "A novel keratinase from Clostridium sporogenes bv.
pennavorans bv. nov., a thermotolerant organism isolated from solfataric muds",
Microbiol Res., 163(1), pp. 105-12. Epub 2006 Nov 7.
J.J. Noval., Nickerson. W.J. (1995), "Decomposition of native keratin by
Streptomyces fradiae J Bacteriol", 77, pp. 251-263.
Kumar A. G., Swarnalatha S., Gayathri S., Nagesh N., Sekaran G. (2008),
"Characterization of an alkaline active-thiol forming extracellular serine keratinase
by the newly isolated Bacillus pumilus", J Appl Microbiol., 104(2), pp. 411-9.
Epub 2007 Oct 8.
Lin X. Lee C.G., Casale SE and Shih J.C. (1992), " Purification and
characterization of a keratinase from a feather degrading Bacillus Licheniformis
strain. ", J Appl Environ Ailcrobiol., 58, pp. 3271-3275.
Lin X. Wong S. L., Miller E. S., Shih J. C. (1997), "Expression of the Bacillus
licheniformis PWD-1 keratinase gene in B. subtilis", J Ind Microbiol Biotechnol,
19(2), pp. 134-8., 19(2), pp. 134-138.
Liu B1, Zhang J, Gu L, Du G, Chen J, X. Liao (2014), "Comparative Analysis of
Bacterial Expression Systems for Keratinase Production.", Appl Biochem
Biotechnol., pp.
Liu B, Zhang J, Li B, Liao X, Du G, J Chen (2013), " (2013) Expression and
characterization of extreme alkaline, oxidation-resistant keratinase from Bacillus
licheniformis in recombinant Bacillus subtilis WB600 expression system and its
20

34.

35.

36.

37.

38.
39.

40.

41.

42.

43.

44.
45.
46.

application in wool fiber processing.", Word J Microbiol Biotechnol 29, pp. 825832.
Longeveld JPM, Wang, JJ, Shih, GC, Garssen, Shih (2003), " Enzymatic
degradation of prion protein from infected cattle and sheep brain stem. EMBO J.
(submitted)", EMBO J. (submitted)pp.
Matsui T., Yamada Y., Mitsuya H., Shigeri Y., Yoshida Y., Saito Y., Matsui H.,
Watanabe K. (2009), "Sustainable and practical degradation of intact chicken

feathers by cultivating a newly isolated thermophilic Meiothermus ruber H328",
Appl Microbiol Biotechnol., 82(5), pp. 941-50. Epub 2009 Feb 5.
Mitsuiki S., Sakai M., Moriyama Y., Goto M., Furukawa K. (2002), "Purification
and some properties of a keratinolytic enzyme from an alkaliphilic Nocardiopsis
sp. TOA-1", Biosci Biotechnol Biochem., 66(1), pp. 164-7.
Nam G. W., Lee D. W., Lee H. S., Lee N. J., Kim B. C., Choe E. A., Hwang J. K.,
Suhartono M. T., Pyun Y. R. (2002), "Native-feather degradation by
Fervidobacterium islandicum AW-1, a newly isolated keratinase-producing
thermophilic anaerobe", Arch Microbiol., 178(6), pp. 538-47. Epub 2002 Oct 16.
Novagen (1998), " pET System Vectors and Hosts. Instruction manual Catalog no.
TB038", pp.
P. Bressollier., F. Letourneau., M. Urdaci., Verneuil B. (1999), "Purification and
characterization of a keratinolytic serine proteinase from Streptomyces
albidoflavus Appl Environ Microbiol.", 65, pp. 2570-2576.
Papadopoulos. . M.C. ( 1986. ), "The effect of enzymatic treatment on amino acid
content and nitrogen characteristics of feather meal.", Anim Feed Sci Technol, 16,
pp. 151-156.
R. Tsuboi., I. Ko., K. Takamori., Ogawa. H. (1989), " Isolation of a keratinolytic
proteinase from Trichophyton mentagrophytes with enzymatic activity at acidic pH
Infect Immun; " 57, pp. 3479-3483.
Radha S., P. Gunasekaran (2009), "Purification and characterization of keratinase
from recombinant Pichia and Bacillus strains.", Protein Expr Purif, 64(1), pp. 2431.
Riessen S., Antranikian G. (2001), "Isolation of Thermoanaerobacter
keratinophilus sp. nov., a novel thermophilic, anaerobic bacterium with
keratinolytic activity", Extremophiles., 5(6), pp. 399-408.
Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989), "Molecular Cloning a Laboratory
Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor, 1, pp.
Suh H. J., Lee H. K. (2001), "Characterization of a keratinolytic serine protease
from Bacillus subtilis KS-1", J Protein Chem., 20(2), pp. 165-9.
Syed D. G., Lee J. C., Li W. J., Kim C. J., Agasar D. (2009), "Production,

characterization and application of keratinase from Streptomyces gulbargensis",
Bioresour Technol., 100(5), pp. 1868-71. Epub 2008 Nov 5.

21


47.

48.
49.

50.

51.

52.

53.

54.

55.

Szabo L., Benedek A., Szabo M. L., Barabas G. (2000), "Feather degradation with
a thermotolerant Streptomyces graminofaciens strain.", World J Microbiol
Biotechnol. , 16, pp. 252-255.
Tec. Mo Bi (2005), "Bacillus subtilis Expression Vectors. Product Information and
Instructions."
Tork SE, Shahein YE, El-Hakim AE, Abdel-Aty AM, MM. Aly (2013),
"Production and characterization of thermostable metallo-keratinase from newly

isolated Bacillus subtilis NRC 3.", Int J Biol Macromol, 55(169-75), pp.
W. Akhtar., Edwards H.G. (1997. ), "Fourier-transform Raman spectroscopy of
mammalian and avian keratotic biopolymers Spectrochim Acta A Mol Biomol
Spectrosc;" 53A, pp. 81-90.
Williams C.M., Richtcr C.S., J.C.I. Mackenzie J.R and Shih (1990. ), "Isolation,
identification and characterization of a feather-degrading bacterium", J Appl
Environ Microbiol, 56, pp. 1509-1515.
Bockle B., Galunsky B., Muller R. (1995), "Characterization of a keratinolytic
serine proteinase from Streptomyces pactum DSM 40530", Appl Environ
Microbiol, 61(10), pp. 3705-10.
Brandelli A., Daroit D. J., Riffel A. (2010), "Biochemical features of microbial
keratinases and their production and applications", Appl Microbiol Biotechnol,
85(6), pp. 1735-50.
Lin H. H., Yin L. J., Jiang S. T. (2009), "Cloning, expression, and purification of
Pseudomonas aeruginosa keratinase in Escherichia coli AD494(DE3)pLysS
expression system", J Agric Food Chem, 57(9), pp. 3506-11.
Yamamura S., Morita Y., Hasan Q., Rao S. R., Murakami Y., Yokoyama K.,
Tamiya E. (2002), "Characterization of a new keratin-degrading bacterium isolated
from deer fur", J Biosci Bioeng, 93(6), pp. 595-600.

22