cách soi tinh trung , kiem tra tinh trung

TÀI LIỆU HỌC PHẦN
THỰC HÀNH SINH SẢN GIA SÚC 1
GIÀNH CHO SINH VIÊN NGÀNH THÚ Y
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
Số tiết thực hành: 15 tiết
Số buổi thực hành: 3 buổi
Số bài thực hành: 3 bài
Thời lượng: 5 tiết/buổi


BÀI 1. GIỚI THIỆU PHỊNG THÍ NGHIỆM NGHIÊN CỨU SINH SẢN GIA
SÚC VÀ THỰC HÀNH PHA MÔI TRƯỜNG BẢO QUẢN TINH GIA SÚC
1. Mục tiêu
- Nắm được an toàn sinh học trong phịng thí nghiệm nghiên cứu về sinh sản động vật
- Nắm được nguyên lý và sử dụng được một số máy móc, thiết bị, dụng cụ sử dụng
trong nghiên cứu sinh sản vật nuôi ở mức độ in vitro và in vivo
- Nắm được nguyên lý của các loại dung dịch pha và bảo quản tinh trùng, thực hiện
được cân, đong các loại hoá chất kết hợp sử dụng các dụng cụ cần thiết để pha chế
được môi trường pha lỗng tinh vật ni theo các cơng thức khác nhau
2. Chuẩn bị máy móc, thiết bị, dụng cụ, hố chất
- Cân phân tích (sai số 0,0001g)
- Cân kỹ thuật (sai số 0,01g)
- Thìa xúc hố chất
- Giấy cân hoá chất
- Găng tay
- Khẩu trang
- Glucose.H2O
- Trisodium citrate
- Disodium-EDTA
- Sodium bicarbonate
- KCl

- Nước cất hoặc nước deionized
- Ống đong 1 lít
- Ống đong 250ml
- Ống đong 100ml
- Máy khuấy từ
- Cục từ
- Tuýp nhựa 50ml
- Máy dập tuýp
- Tủ lạnh 2-8 độ
- Bình xịt đựng cồn 70 độ
3. Tiến hành
- Chia lớp thực hành thành các tốp 5 sinh viên


- Phân công mỗi tốp một loại công thức môi trường pha tinh lợn
- Mỗi sinh viên cân ít nhất một loại hố chất
- Mỗi nhóm pha 100ml mơi trường pha tinh lợn theo công thức được phân công
- Chia mơi trường vào 2 tp nhựa dung tích 50ml, dập kín miệng tp, ghi nhãn theo
quy định sau: THSS1_LỚP LT....__NHĨM TH...._TỐP ....._NGÀY TH....._GIỜ KẾT
THÚC
*CÔNG THỨC PHA 100ML MÔI TRƯỜNG BTS
- Glucose.H2O: 3,7g
- Trisodium citrate: 0,6g
- Disodium-EDTA: 0,17g
- Sodium bicarbonate: 0,13g
- KCl: 0,08g
*CÔNG THỨC PHA 100ML MÔI TRƯỜNG KIEV
- Glucose.H2O: 6g
- Trisodium citrate: 0,37g
- Disodium-EDTA: 0,37g

- Sodium bicarbonate: 0,12g
*CÔNG THỨC PHA 100ML MÔI TRƯỜNG IVT
- Glucose.H2O: 0,3g
- Trisodium citrate: 0,24g
- Sodium bicarbonate: 0,24g
- KCl: 0,04g
* Một số điểm cần lưu ý
- Sinh viên thực hiện nghiêm ngặt theo hướng dẫn và phân công của giảng viên và cán
bộ hỗ trợ
- Sinh viên mặc áo blouse, đeo găng tay và khẩu trang trong suốt q trình thực hành
- Xúc hố chất từng ít một, tuyệt đối không xúc thừa, nếu xúc thừa thì khơng được đổ
trở lại hộp đựng hố chất
- Sinh viên phải học cách rửa dụng cụ và thực hiện rửa dụng cụ theo đúng ngun tắc
của phịng thí nghiệm
- Nếu rơi vỡ hoặc làm hỏng thiết bị dụng cụ thì phải đền bù theo giá trị của tài sản bị
hư hỏng
- Lau chùi máy móc, thiết bị, mặt bàn, ghế ngồi, xếp ngay ngắn bàn ghế trở về vị trí cũ


- Đưa máy móc thiết bị về đúng vị trí ban đầu trước khi thực hành
- Trưởng nhóm báo cáo tình trạng của buổi thực hành với Giảng viên hướng dẫn và
Cán bộ hỗ trợ trước khi ra về
- Toàn bộ sinh viên chỉ được ra về sau khi mọi việc đã hoàn tất và được sự đồng ý của
Giảng viên và Cán bộ hỗ trợ


BÀI 2. THỰC HÀNH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG TINH VÀ PHA LOÃNG,
BẢO QUẢN TINH GIA SÚC
1. Mục tiêu
- Thực hiện được các kỹ thuật, thao tác và đánh giá chất lượng tinh dịch của vật ni

gốm: thể tích tinh dịch (V-ml), nồng độ tinh trùng (C-triệu tinh trùng/ml), chỉ tiêu vận
động của tinh trùng (tỷ lệ tinh trùng vận động tiến thẳng, tỷ lệ tinh trùng vận động tại
chỗ và tỷ lệ tinh trùng không vận động - %), tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K-%), sức kháng
của tinh trùng (R-đơn vị sức kháng)
- Đối với tinh nguyên: Xác định được bội số pha loãng tinh, Thực hiện được việc pha
lỗng và bảo quản tinh trùng sử dụng mơi trường pha loãng tinh do sinh viên tự pha
chế
- Đối với tinh bảo quản (đã chia liều): Thực hiện được việc ly tâm loại bỏ tinh thanh và
môi trường cũ và tái pha lỗng mẫu tinh bằng mơi trường do sinh viên tự pha chế
- Thực hiện được việc đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của mẫu tinh do sinh viên thực
hiện bảo quản (đánh giá hoạt lực tinh trùng của tinh pha lỗng sau 60 phút pha lỗng
trong mơi trường mới và chỉ tiêu hoạt lực tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của mẫu
tinh sau khi bảo quản từ 3-7ngày), thơng qua đó đánh giá và so sánh được hiệu quả
bảo quản tinh của các loại môi trường do sinh viên thực hiện, kiểm tra được kỹ năng,
thao tác của sinh viên
2. Chuẩn bị dụng cụ, máy móc, hố chất và ngun vật liệu
- Mẫu tinh ngun của lợn hoặc các liều tinh lợn đã pha loãng
- Kính hiển vi quang học có độ phóng đại 100x, 400x và 900x
- Lam kính
- Lamen
- Giấy lau kính
- Buồng đếm hồng cầu (Neu Bauer chamber)
- Ống đong hoặc cốc đong nhựa/thủy tinh dung tích 500ml
- Ống eppendof dung tích 250, 500, 1000 microlit
- Ống falcon dung tích 15ml
- Máy ly tâm ống falcon 15ml (12 vị trí, tốc độ tối đa 4000 vòng/phút, nhiệt độ phòng)
- Bể ổn nhiệt
- Pipet 100 -1000 microlit, 10-200 microlit, 1-10 microlit
- Hộp đựng đầu cơn dung tích 1000 microlit
- Hộp đựng đầu cơn dung tích 100 microlit

- Hộp đựng đầu cơn dung tích 10 microlit


- Đầu cơn dung tích 1000 microlit
- Đầu cơn dung tích 100 microlit
- Đầu cơn dung tích 10 microlit
- Dung dịch NaCl 1%
- Dung dich NaCl 3%
- Dung dịch Formol - citrate 4%
- Nước cất
- Đũa thủy tinh
- Các loại môi trường pha tinh
3. Tiến hành
3.1. Đánh giá chất lượng và pha loãng tinh nguyên của lợn:
3.1.1. Đánh giá chất lượng tinh nguyên của lợn
* Đánh giá chỉ tiêu thể tích tinh dịch:
- Nghiêng cốc đong (ống đong), rót tồn bộ mẫu tinh nguyên một cách nhẹ nhàng, từ
từ lên thành của cốc đong, để cốc đong lên mặt phẳng nằm ngang vng góc tuyệt đối
với mặt đất, đặt mắt nhìn ngang bằng với mặt phẳng của mặt lớp tinh, ghi lại chỉ số thể
tích của mẫu tinh
- Chuẩn bị sẵn sàng kính hiển vi, đưa vật kính 10 vào vị trí soi mẫu, bật đèn và điều
chỉnh cho độ sáng đèn cao nhất, đóng tụ quang về gần vị trí mà tụ quang có độ mở hẹp
nhất
* Đánh giá chỉ tiêu vận động của tinh trùng:
- Dùng đũa thủy tinh đảo cốc tinh một cách nhẹ nhàng cho đều từ 3-5 lần, dùng pipet
và đầu côn 10 microlit, hút và bơm 3 giọt tinh nguyên mỗi giọt 3 microlit lên lam kính
(hút ở độ sâu sâu nhất có thể của đầu cơn và tránh khơng để tinh dính vào đầu pipet).
Thao tác nhanh và chính xác để tránh sự chênh lệch thời gian giữa 3 giọt tinh
- Mắt nhìn vào thị kính đồng thời điều chỉnh ốc sơ cấp và vi cấp để nhìn rõ tinh trùng
- Dịch chuyển lam kính để quan sát và đánh giá tỷ lệ phần trăm tinh trùng tiến thẳng,

tinh trùng vận động tại chỗ và tinh trùng không hoạt động của mỗi giọt tinh. Tính giá
trị trung bình của các chỉ tiêu để làm kết quả đánh giá cho mẫu tinh nguyên
* Đánh giá chỉ tiêu nồng độ tinh trùng:
- Dùng pipet 1000 microlit hút chính xác 10ml dung dịch NaCl 3% bơm vào ống
falcon dung tích 15ml
- Dùng pipet dung tích 200 microlit, sử dụng đầu cơn dung tích 200 microlit hút bỏ 50
microlit dung dịch NaCl 3% ra khỏi ống falcon 15ml


- Tháo bỏ đầu cơn dung tích 200 microlit thứ nhất, lắp đầu côn thứ hai (vô trùng) vào
pipet, dùng đũa thuỷ tinh đảo nhẹ và đều cốc đựng tinh, hút 50 microlit ở lớp tinh sâu
nhất có thể so với chiều dài của đầu cơn mà khơng để dính vào pipet, hút lên hút
xuống 3 lần trước khi chính thức hút ra, dùng giấy thấm vô trùng lau tinh dính ở mặt
ngồi đầu cơn rồi nhúng đầu cơn vào dung dịch NaCl 3%, hút đẩy 3-5 lần để đảm bảo
toàn bộ lượng tinh được bơm vào nước muối
- Đảo đều ít nhất 10 lần ống nước muối đựng tinh. Hệ số pha loãng tinh ở bước này là
10000:50 = 200 lần
- Hà hơi lên bề mặt của buồng đếm hồng cầu rồi đậy lamen lên bề mặt buồng đếm
- Hút 8 microlit dung dịch NaCl 3% chứa tinh ở vị trí sâu nhất có thể của đầu cơn dung
tích 10 microlit rồi tra vào khe của buồng đếm, đảm bảo khơng có bọt khí trong buồng
tra mẫu, thực hiện bước này lặp lại hai lần tương ứng hai phía của buồng đếm
- Quan sát trên kính hiển vi bắt đầu từ độ phóng đại 100x rồi lên độ phóng đại 400x để
thực hiện việc đếm tinh trùng, ghi lại số liệu N1 và N2 là số tinh trùng đếm được (theo
ngun tắc mơ tả ở dưới) ở mỗi phía của buồng đếm
- Nguyên tắc đếm tinh trùng trên buồng đếm Neu Bauer Chamber
+ Mỗi phía buồng đếm có vùng đếm hình vng gồm 25 ơ vng to (5 ơ theo chiều
ngang và 5 ô theo chiều dọc), mỗi ô to gồm 16 ô vuông nhỏ (4x4 ô)
+ Việc xác định nồng độ dựa trên số tinh trùng đếm được trong thể tích (V) được tính
bằng tổng diện tích (S) của 80 ô vuông nhỏ của một vùng đếm (với diện tích
0,0025mm²/ơ nhỏ x 80 ơ) nhân với chiều cao (h) của cột dung dịch (tương ứng với

khoảng cách từ bề mặt của vùng đếm đến mặt dưới của lamen) là 0,1mm. Ta có V =
0,0025 x 80 x 0,1 = 2,5 x 10-³ x 8 x 10¹ x 10-¹ = 20 x 10-³ (mm³) = 20 x 10-⁶ (cm³) = 20
x 10-⁶ (ml)
+ 80 ô vuông nhỏ được đếm tương ứng với 5 ô vuông to, theo nguyên tắc lấy mẫu đảm
bảo độ đồng đều thì gồm 4 ơ vuông to theo cạnh huyền của tam giác vuông và 1 ô
vuông to ở đỉnh của tam giác vuông
+ Trong mỗi ô vuông to khi đếm tinh trùng chỉ đếm đầu tinh trùng mà khơng đếm
đi, đếm theo hình zích zắc từ ô vuông nhỏ đầu tiên bên trái di sang bên phải đến ô
vuông thứ tư của hàng thứ nhất sau đó dịch xuống ơ thứ tư của hàng thứ hai và dịch
sang bên trái về ô đầu tiên của hàng thứ hai, tiếp tục dịch ô đầu tiên của hàng thứ ba
rồi dịch sang bên phải đến ô thứ tư của hàng thứ ba, tiếp tục dịch xuống ô thứ 4 của
hàng thứ 4 rồi dịch sang ô đầu tiên của hàng thứ tư. Kết thúc việc đếm tinh trong một ơ
vng to
+ Để đảm bảo độ chính xác: chỉ đếm đầu tinh trùng có trong lịng của ô to và những
đầu tinh trùng đè lên cạnh trên và cạnh bên phải của ô to, không đếm những đầu tinh
trùng ở cạnh phía dưới và cạnh bên trái của ô to
+ Đếm lần lượt 2 vùng đếm ở 2 phía của buồng đếm ta được N1 và N2 là tổng số tinh
trùng đếm được trong 5 ô to của mỗi phía. Đối với tinh lợn, nếu N1 khác N2 lớn hơn 5
tinh trùng thì chứng tỏ thao tác sai, làm lại từ đầu


+ Nếu N1, N2 chênh nhau khơng q 5 thì chấp nhận kết quả và nồng độ tinh trùng có
trong dung dịch muối NaCl 3% là: [(N1 + N2)/2] / (20 x 10-⁶) = [(N1 + N2)/40] x 10⁶
(tinh trùng/ml)
+ Cuối cùng, với tỷ lệ pha loãng của tinh nguyên vào nước muối NaCl 3% là 200 lần,
ta có nồng độ tinh trùng của mẫu tinh nguyên = [(N1 + N2)/40] x 10⁶ x 200 = 5 x (N1
+ N2) x 10⁶ (tinh trùng/ml) = 5 x (N1 + N2) (triệu tinh trùng/ml)

Hình minh hoạ buồng đếm hồng cầu (Neu Bauer chamber) và quy ước các ô đếm và
cách đếm tinh trùng

* Đánh giá chỉ tiêu tỷ lệ tinh trùng kỳ hình:
- Dùng pipet dung tích 1000µl hút 1ml dung dịch formol citrate 4% cho vào ống
eppendorf dung tích 1,5ml, dùng pipet dung tích 200µl hút bỏ 20µl dung dịch formol
citrate 4%
- Thay đầu cơn mới của pipet dung tích 200µl hút 20µl tinh nguyên trộn đều vào dung
dịch formol trong ống eppendorf, đảo đều (nếu không soi được ngay thì có thể lưu trữ
trong tủ lạnh 2-8 độ trong vịng 1 tuần mà vẫn đảm bảo kết quả chính xác)
- Dùng pipet dung tích 10 µl hút 10 µl hỗn hợp nhỏ lên lam kính, đậy lamen và tránh
bọt khí, quan sát trên kính hiển vi ở độ phóng đại lần lượt là 100, 400 và 900x. Ở độ
phóng đại 900x, phải nhỏ dầu soi kính. Khi quan sát thấy tinh trùng khơng cịn trơi
trên vi trường thì bắt đầu xác định tỷ lệ tinh trùng kỳ hình. Di chuyển khay mẫu để cho
góc bên trái trên cùng của lamen tới vị trí soi kính, quan sát, đếm số tinh trùng, tích số


tinh trùng của mỗi dạng kỳ hình. Di chuyển theo hình zíc zắc (từ góc trên cùng bên trái
di chuyển sang ngang đến góc trên cùng bên phải sau đó dịch lui xuống một hàng tinh
trùng rồi di chuyển sang trái rồi sau đó lại dịch xuống một hang rồi di chuyển sang
phải và cứ thế cho đến khi đếm đủ 200 tinh trùng tổng số). Việc di chuyển theo hình
zíc zắc là để tránh trùng lặp tinh trùng đã đếm và xác định hình dạng.
- Tổng hợp số tinh trùng kỳ hình của mỗi dạng và số tinh trùng kỳ hình tổng số từ đó
xác định tỷ lệ phần trăm tinh trùng kỳ hình
* Đánh giá chỉ tiêu sức kháng của tinh trùng
- Thường chỉ xác định đối với tinh nguyên, đối với tinh lợn ngoại áp dụng phương
pháp 3 lọ.
- Dùng pipet dung tích 1000 µl hút 5ml dung dịch NaCl 1% cho vào ống falcon dung
tích 15ml (lọ 1)
- Dùng pipet dung tích 1000 µl hút 1ml NaCl 1% cho vào ống falcon dung tích 15ml
(lọ 2)
- Dùng pipet dung tích 1000 µl hút 0,5ml NaCl 1% cho vào ống falcon dung tích 15ml
(lọ 3)

- Dùng pipet dung tích 10 µl hút 10 µl (0,01ml) tinh ngun cho vào lọ 1, đảo đều
(tinh được pha loãng 500 lần trong lọ 1)
- Dùng pipet dung tích 1000 µl hút 1000 µl hỗn hợp trong lọ 1 cho vào lọ 2, đảo đều
(tinh nguyên đã được pha loãng 1000 lần trong lọ 2)
- Dùng pipet dung tích 1000 µl hút 500 µl hỗn hợp trong lọ 2 chuyển sang lọ 3 (tinh
nguyên đã được pha loãng 2000 lần trong lọ 3)
- Dùng pipet dung tích 10 µl hút 10 µl tinh trong lọ 3 nhỏ lên lam kính và soi trên kính
hiển vi độ phóng đại 100x, nếu thấy tinh trùng vẫn hoạt động thì dùng pipet dung tích
200 µl hút 100 µl dung dịch NaCl 1% thêm vào lọ 3, đảo đều rồi lặp lại việc kiểm tra
sự hoạt động của tinh trùng. Cứ tiếp tục cho thêm 100 µl dung dịch NaCl 1% vào lọ 3
và soi kiểm tra cho đến khi tinh trùng không hoạt động nữa thì dừng lại
- Sức kháng của tinh trùng được tính theo cơng thức:
R = ro + r x n
Trong đó: R là sức kháng tinh trùng của mẫu tinh, r o là độ pha loãng ban đầu trước khi
thêm NaCl 1% (ro = 2000), r là mức pha loãng sau mỗi lần thêm dung dịch NaCl 1% (r
= 200), n là số lần thêm 100 µl dung dịch NaCl 1%


3.1.2. Pha loãng và bảo quản tinh lợn (đối với mẫu tinh nguyên)
- Chuẩn bị mỗi tốp 5 người 1 ống falcon dung tích 15 ml đựng dung dịch NaCl 3% (để
xác định nồng độ đối với tinh nguyên, cách làm như mô tả trong phần 3.1.1.)
- Chuẩn bị mỗi nhóm thực hành 1 ống tp đựng tinh dung tích 100ml.
- Bật bể ổn nhiệt, cài đặt nhiệt độ để nước trong bể ổn nhiệt đạt 34oC.
- Mỗi tốp 5 sinh viên tự chuẩn bị môi trường pah tinh do tốp mình thực hiện trong bài
1 và ủ trong bể ổn nhiệt
- Ủ tồn bộ lượng mơi trường pha tinh của mỗi tốp đã chuẩn bị từ buổi 1 trong bể ổn
nhiệt, đảm bảo tan hoàn toàn toàn bộ đá nước nếu có trong mơi trường và mơi trường
phải đạt nhiệt độ 34oC trước khi pha với tinh nguyên.
- Mỗi nhóm được cấp 10 ml tinh nguyên của lợn (đựng trong tp tinh dung tích 100
ml, đóng kín, loại bỏ bọt khí, bọc trong túi nilon màu đen để tránh ánh sáng, bảo quản

trong thùng xốp có đặt miếng đá khô làm mát mẫu tinh).
- Chuẩn bị 1 ống đong hoặc cốc thuỷ tinh dung tích 100 ml.
- Đảo đều tuýp tinh nguyên một cách nhẹ nhàng 5 đến 10 lần.
- Cắt đầu tuýp tinh nguyên, chia đều vào 5 ống đong một cách nhẹ nhàng, mỗi ống 10
ml.
- Nhanh chóng dùng pipet dung tích 200 µl hút 50 ml tinh nguyên cho vào ống NaCl
3%.
- Pha 10 ml môi trường đã ủ trong bể ổn nhiệt và đạt 34 oC vào cốc đựng tinh (tỷ lệ 1
thể tích tinh : 1 thể tích mơi trường pha tinh).
- Đảo đều ống dung dịch NaCl 3% chứa tinh, xác định nồng độ tinh trùng của mẫu tinh
nguyên một cách nhanh chóng và chính xác.
- Xác định bội số pha lỗng (thể tích tinh ngun : thể tích mơi trường pha tinh) sao
cho trong thể tích liều tinh là 100 ml, tổng số tinh trùng trong liều tinh là 2,5 tỷ tinh
trùng (nồng độ tinh trùng trong liều tinh là 25 triệu tinh trùng/ml). Sinh viên trình bày
cách tính và kết quả bội số pha loãng tinh xác định được dựa trên nồng độ tinh trùng
của mẫu tinh nguyên xác định được ra giấy và nộp cho giảng viên hoặc cán bộ hỗ trợ.


- Chia 10 ml tinh nguyên thành 5 phần, mỗi phần 2 ml cho 5 tốp, mỗi tốp 5 sinh viên,
chia vào 5 tuýp đựng tinh dung tích 100 ml.
- Tiến hành pha loãng tinh theo bội số pha loãng tinh xác định được theo nguyên tắc:
(i) chỉ pha môi trường vào tinh, không pha tinh vào môi trường, (ii) thêm mơi trường
vào tinh theo tỷ lệ 1 thể tích mơi trường : 1 thể tích tinh sao cho lần rót mơi trường
cuối cùng có thể tích ít hơn so với thể tích mẫu tinh pha lúc đó, (iii) rót môi trường nhẹ
nhàng, từ từ theo thành ống đong hoặc cốc thuỷ tinh pha tinh, không đổ trực tiếp lên
mặt mẫu tinh.
- Đảo nhẹ mẫu tinh rồi đổ nhẹ nhàng tồn bộ lượng tinh pha vào tp đựng tinh dung
tích 100 ml.
- Dập tp tinh sao cho kín hồn tồn, đẩy tồn bộ bọt khí đảm bảo khơng có bọt khí
bên trong tuýp tinh.

- Đặt tuýp tinh nằm ngang so với mặt đất, trên mặt bàn phẳng, để chỗ mát, quấn khăn
và bọc trong túi nilon màu đen để tránh ánh sáng.
- Cân bằng mẫu tinh ở nhiệt độ phòng trong 90 phút trước khi cho vào bảo quản trong
tủ bảo ôn
- Đặt tuýp tinh nằm ngang trong tủ bảo ôn 17oC, đảo đều tuýp tinh 1-2 lần/ngày (đảo
trong tủ để tránh thay đổi nhiệt độ)
- Tuỳ năng lực môi trường bảo quản, tinh có thể được bảo quản từ 3 đến 10 ngày vẫn
còn khả năng thụ tinh cho hiệu quả tốt.

Hình minh hoạ các dạng tinh trùng kỳ hình


3.2. Đánh giá chất lượng và tái pha loãng và bảo quản tinh đã được đóng gói
thành liều tinh phối
3.2.1. Đánh giá chất lượng liều tinh pha lỗng
- Thơng thường một liều tinh phối của lợn ngoại có dung tích 100ml với tổng số tinh
trùng tối thiểu/liều là 2,5 tỷ tinh trùng, tuy nhiên trên thực tế, mỗi lần khai thác tinh
lợn ngoại, người bán tinh thường pha toàn bộ lượng tinh (200-400ml) với 1000ml mơi
trường pha tinh và đóng vào tuýp tới dung tích 80ml/tuýp và bảo quản trong tủ bảo
quản tinh ở 17oC
- Mỗi tốp được phát 1 tuýp tinh, một nhóm thực hành có tối đa 5 tốp tương ứng với 5
liều tinh
* Đánh giá chỉ tiêu tinh trùng vận động của tinh pha loãng
- Bật bể ổn nhiệt trước khi tiến hành và cài đặt để nước trong bể ổn nhiệt đạt nhiệt độ
37oC
- Đảo nhẹ nhàng cho đều tuýp tinh (5-10 lần đảo), cắt một góc ở phần mép hàn của
tuýp tinh, dùng pipet dung tích 1000µl hút chuyển 3000 µl tinh cho vào ống falcon
dung tích 15ml vặn chặt nắp
- Ủ ống tinh vào bể ổn nhiệt 30 phút
- Soi và xác định các chỉ tiêu vận động của tinh trùng tương tự như cách làm đối với

tinh nguyên (dùng pipet và đầu côn 10 microlit, hút và bơm 3 giọt tinh, mỗi giọt 3
microlit lên lam kính (hút ở độ sâu sâu nhất có thể của đầu cơn và tránh khơng để tinh
dính vào đầu pipet). Thao tác nhanh và chính xác để tránh sự chênh lệch thời gian giữa
3 giọt tinh; mắt nhìn vào thị kính đồng thời điều chỉnh ốc sơ cấp và vi cấp để nhìn rõ
tinh trùng; dịch chuyển lam kính để quan sát và đánh giá tỷ lệ phần trăm tinh trùng tiến
thẳng, tinh trùng vận động tại chỗ và tinh trùng không hoạt động của mỗi giọt tinh.
Tính giá trị trung bình của các chỉ tiêu để làm kết quả đánh giá cho mẫu tinh)
* Đánh giá chỉ tiêu nồng độ của mẫu tinh pha:
- Dùng pipet 1000 microlit hút chính xác 10ml dung dịch NaCl 3% bơm vào ống
falcon dung tích 15ml, sau đó hút bỏ đi 300µl
- Tháo bỏ đầu cơn dung tích 1000 microlit cũ, lắp đầu côn mới thứ hai (vô trùng) vào
pipet, hút 300 microlit trong ống falcon sau khi đã ủ trong bể ổn nhiệt để kiểm tra chỉ
tiêu hoạt động của tinh trùng ở vị trí giữa của lớp tinh, hút lên hút xuống 3 lần trước
khi chính thức hút ra, dùng giấy thấm vơ trùng lau tinh dính ở mặt ngồi đầu cơn rồi
nhúng đầu cơn vào dung dịch NaCl 3%, hút đẩy 3-5 lần để đảm bảo toàn bộ lượng tinh
được bơm vào nước muối
- Đảo đều ít nhất 10 lần ống nước muối đựng tinh. Hệ số pha loãng tinh ở bước này là
10000:300 = 10/3 lần
- Hà hơi lên bề mặt của buồng đếm hồng cầu rồi đậy lamen lên bề mặt buồng đếm


- Hút 8 microlit dung dịch NaCl 3% chứa tinh ở vị trí sâu nhất có thể của đầu cơn dung
tích 10 microlit rồi tra vào khe của buồng đếm, đảm bảo khơng có bọt khí trong buồng
tra mẫu, thực hiện bước này lặp lại hai lần tương ứng hai phía của buồng đếm
- Quan sát trên kính hiển vi bắt đầu từ độ phóng đại 100x rồi lên độ phóng đại 400x để
thực hiện việc đếm tinh trùng, ghi lại số liệu N1 và N2 là số tinh trùng đếm được (theo
nguyên tắc mô tả ở dưới) ở mỗi phía của buồng đếm
- Nguyên tắc đếm tinh trùng trên buồng đếm Neu Bauer Chamber
+ Mỗi phía buồng đếm có vùng đếm hình vng gồm 25 ơ vng to (5 ô theo chiều
ngang và 5 ô theo chiều dọc), mỗi ô to gồm 16 ô vuông nhỏ (4x4 ô)

+ Việc xác định nồng độ dựa trên số tinh trùng đếm được trong thể tích (V) được tính
bằng tổng diện tích (S) của 80 ô vuông nhỏ của một vùng đếm (với diện tích
0,0025mm²/ơ nhỏ x 80 ơ) nhân với chiều cao (h) của cột dung dịch (tương ứng với
khoảng cách từ bề mặt của vùng đếm đến mặt dưới của lamen) là 0,1mm. Ta có V =
0,0025 x 80 x 0,1 = 2,5 x 10-³ x 8 x 10¹ x 10-¹ = 20 x 10-³ (mm³) = 20 x 10-⁶ (cm³) = 20
x 10-⁶ (ml)
+ 80 ô vuông nhỏ được đếm tương ứng với 5 ô vuông to, theo nguyên tắc lấy mẫu đảm
bảo độ đồng đều thì gồm 4 ô vuông to theo cạnh huyền của tam giác vuông và 1 ô
vuông to ở đỉnh của tam giác vuông
+ Trong mỗi ô vuông to khi đếm tinh trùng chỉ đếm đầu tinh trùng mà khơng đếm
đi, đếm theo hình zích zắc từ ơ vng nhỏ đầu tiên bên trái di sang bên phải đến ô
vuông thứ tư của hàng thứ nhất sau đó dịch xuống ơ thứ tư của hàng thứ hai và dịch
sang bên trái về ô đầu tiên của hàng thứ hai, tiếp tục dịch ô đầu tiên của hàng thứ ba
rồi dịch sang bên phải đến ô thứ tư của hàng thứ ba, tiếp tục dịch xuống ô thứ 4 của
hàng thứ 4 rồi dịch sang ô đầu tiên của hàng thứ tư. Kết thúc việc đếm tinh trong một ô
vuông to
+ Để đảm bảo độ chính xác: chỉ đếm đầu tinh trùng có trong lịng của ô to và những
đầu tinh trùng đè lên cạnh trên và cạnh bên phải của ô to, không đếm những đầu tinh
trùng ở cạnh phía dưới và cạnh bên trái của ô to
+ Đếm lần lượt 2 vùng đếm ở 2 phía của buồng đếm ta được N1 và N2 là tổng số tinh
trùng đếm được trong 5 ô to của mỗi phía. Đối với tinh lợn, nếu N1 khác N2 lớn hơn 5
tinh trùng thì chứng tỏ thao tác sai, làm lại từ đầu
+ Nếu N1, N2 chênh nhau khơng q 5 thì chấp nhận kết quả và nồng độ tinh trùng có
trong dung dịch muối NaCl 3% là: [(N1 + N2)/2] / (20 x 10-⁶) = [(N1 + N2)/40] x 10⁶
(tinh trùng/ml)
+ Cuối cùng, với tỷ lệ pha loãng của tuýp tinh pha vào nước muối NaCl 3% là 10/3
lần, ta có nồng độ tinh trùng của mẫu tinh nguyên = [(N1 + N2)/40] x 10⁶ x 10/3 =
400/3 x (N1 + N2) x 10⁶ (tinh trùng/ml) = 400/3 x (N1 + N2) (triệu tinh trùng/ml)
* Đánh giá chỉ tiêu tỷ lệ tinh trùng kỳ hình:

- Dùng pipet dung tích 1000µl hút 700µl dung dịch formol citrate 4% cho vào ống
eppendorf dung tích 1,5ml
- Thay đầu cơn mới của pipet dung tích 1000µl hút 300µl tinh pha (từ ống xác định chỉ
tiêu vận động của tinh trùng), trộn đều vào dung dịch formol trong ống eppendorf, đảo
đều (nếu khơng soi được ngay thì có thể lưu trữ trong tủ lạnh 2-8 độ trong vòng 1 tuần
mà vẫn đảm bảo kết quả chính xác)
- Dùng pipet dung tích 10 µl hút 10 µl hỗn hợp nhỏ lên lam kính, đậy lamen và tránh
bọt khí, quan sát trên kính hiển vi ở độ phóng đại lần lượt là 100, 400 và 900x. Ở độ
phóng đại 900x, phải nhỏ dầu soi kính. Khi quan sát thấy tinh trùng khơng cịn trơi
trên vi trường thì bắt đầu xác định tỷ lệ tinh trùng kỳ hình. Di chuyển khay mẫu để cho
góc bên trái trên cùng của lamen tới vị trí soi kính, quan sát, đếm số tinh trùng, tích số
tinh trùng của mỗi dạng kỳ hình. Di chuyển theo hình zíc zắc (từ góc trên cùng bên trái
di chuyển sang ngang đến góc trên cùng bên phải sau đó dịch lui xuống một hàng tinh
trùng rồi di chuyển sang trái rồi sau đó lại dịch xuống một hang rồi di chuyển sang
phải và cứ thế cho đến khi đếm đủ 200 tinh trùng tổng số). Việc di chuyển theo hình
zíc zắc là để tránh trùng lặp tinh trùng đã đếm và xác định hình dạng.
- Tổng hợp số tinh trùng kỳ hình của mỗi dạng và số tinh trùng kỳ hình tổng số từ đó
xác định tỷ lệ phần trăm tinh trùng kỳ hình
3.1.2. Pha lỗng và bảo quản tinh lợn (đối với mẫu tinh nguyên)
- Chuẩn bị 1 ống falcon dung tích 15 ml đựng dung dịch NaCl 3% (để xác định nồng
độ đối với tinh pha loãng, cách làm như mô tả trong phần 3.2.1.)
- Chuẩn bị 1 ống tuýp đựng tinh dung tích 100ml.
- Chuẩn bị 10 ống falcon dung tích 15 ml.
- Bật bể ổn nhiệt, cài đặt nhiệt độ để nước trong bể ổn nhiệt đạt 34oC.
- Mỗi tốp 5 sinh viên tự chuẩn bị mơi trường pah tinh do tốp mình thực hiện trong bài
1 và ủ trong bể ổn nhiệt
- Ủ toàn bộ lượng môi trường pha tinh của mỗi tốp đã chuẩn bị từ buổi 1 trong bể ổn
nhiệt, đảm bảo tan hồn tồn tồn bộ đá nước nếu có trong môi trường và môi trường
phải đạt nhiệt độ 34oC trước khi pha với tinh nguyên.

- Mỗi nhóm thực hành được cấp 1 liều tinh lợn dung tích 100 ml chưa xác định được
nồng độ tinh trùng (đựng trong tuýp tinh dung tích 100 ml, đóng kín, loại bỏ bọt khí,
bọc trong túi nilon màu đen để tránh ánh sáng, bảo quản trong thùng xốp có đặt miếng
đá khơ làm mát mẫu tinh).
- Chuẩn bị 1 ống đong hoặc cốc thuỷ tinh dung tích 100 ml.
- Đảo đều tuýp tinh một cách nhẹ nhàng 5 đến 10 lần.
- Cắt đầu nhọn của tuýp tinh, rót nhẹ nhàng vào 10 ống falcon dung tích 15 ml, mỗi
ống 10 ml tinh pha được cấp.
- Dùng pipet dung tích 1000 µl hút 300 µl tinh pha vào ống NaCl 3% đã chuẩn bị


- Xác định nồng độ tinh trùng của mẫu tinh pha được cấp, tính tổng số tinh trùng có
trong liều tinh, xác định bội số tái pha loãng tinh (thể tích tinh : thể tích mơi trường
pha tinh mới) sao cho trong thể tích liều tinh là 100 ml, tổng số tinh trùng trong liều
tinh là 2,5 tỷ tinh trùng (nồng độ tinh trùng trong liều tinh là 25 triệu tinh trùng/ml).
Sinh viên ghi lại các bước tính và kết quả để nộp giảng viên hoặc cán bộ hỗ trợ.
- Ly tâm tinh 10 phút, tốc độ 2500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (đặc biệt lưu ý nguyên
tắc xếp ống trong máy ly tâm đảm bảo tuyệt đối sự cân bằng trong máy)
- Sau khi kết thúc ly tâm, dùng pitpet dung tích 1000 µl hút bỏ lớp dung dịch phía trên
trong mỗi ống tinh, giữ lại chính xác 2 ml cặn tinh cùng với dung dịch cũ
- Dùng pipet dung tích 1000 µl đảo đều cặn tinh trong tất cả các ống ly tâm
- Dùng pipet dung tích 1000 µl hút toàn bộ tinh từ 10 ống ly tâm dồn vào ống hoặc cốc
đong dung tích 100 ml
- Dùng pipet dung tích 1000 µl (thay đầu cơn mới) hút và tra vào mỗi ống ly tâm 2ml
môi trường pha tinh do tốp đó chuẩn bị, hút đảo 5 lần rồi chuyển tinh sang ống hoặc
cốc đong dung tích 100 ml đang chứa tinh (đảm bảo không bị hao tinh trùng trong các
bước chuyển tinh)
- Như vậy, lúc này tổng thể tích tinh pha trong mơi trường mới là 40 ml (2ml x 10 ống
+ 2ml x 10 ống). Chia 40 ml tinh này thành 5 phần, mỗi phần 8 ml, chia cho 5 tốp, mỗi
tốp sinh viên.

- Mỗi tốp 5 sinh viên tự chuẩn bị và ủ môi trường của tốp mình chuẩn bị, pha thêm
mơi trường mới vào 8 ml được chia đến thể tích cuối cùng theo nguyên tắc: (i) chỉ pha
môi trường vào tinh, không pha tinh vào môi trường, (ii) thêm môi trường vào tinh
theo tỷ lệ 1 thể tích mơi trường : 1 thể tích tinh sao cho lần rót mơi trường cuối cùng
có thể tích ít hơn so với thể tích mẫu tinh pha lúc đó, (iii) rót mơi trường nhẹ nhàng, từ
từ theo thành ống đong hoặc cốc thuỷ tinh pha tinh, khơng đổ trực tiếp lên mặt mẫu
tinh.
- Thể tích tinh pha cuối cùng được tính sao cho trong 100 ml tinh pha có 2,5 tỷ tinh
trùng tương ứng 25 triệu tinh trùng/ml.
- Đảo nhẹ mẫu tinh rồi đổ nhẹ nhàng tồn bộ lượng tinh pha vào tp đựng tinh dung
tích 100 ml.
- Dập tp tinh sao cho kín hồn tồn, đẩy tồn bộ bọt khí đảm bảo khơng có bọt khí
bên trong tuýp tinh.
- Đặt tuýp tinh nằm ngang so với mặt đất, trên mặt bàn phẳng, để chỗ mát, quấn khăn
và bọc trong túi nilon màu đen để tránh ánh sáng.
- Cân bằng mẫu tinh ở nhiệt độ phòng trong 90 phút trước khi cho vào bảo quản trong
tủ bảo ôn.
- Đặt tuýp tinh nằm ngang trong tủ bảo ôn 17oC, đảo đều tuýp tinh 1-2 lần/ngày (đảo
trong tủ để tránh thay đổi nhiệt độ)


- Trong điều kiện giờ thực hành môn học, với mục đích để sinh viên thực hiện được
các bước của việc thu hồi tinh từ liều tinh được cấp và tái pha loãng theo yêu cầu của
bài thực hành, đồng thời, kiểm tra chất lượng và năng lực bảo quản tinh của mỗi loại
môi trường do sinh viên tự pha trong bài 1, theo đó, sau khi hồn thành việc đóng tp
tinh mới thì sinh viên đặt tp tinh nằm ngang so với mặt đất, trên mặt bàn phẳng, để
chỗ mát, quấn khăn và bọc trong túi nilon màu đen để tránh ánh sáng. Sau 60 phút, đảo
đều liều tinh (5 đến 10 lần) rồi nhúng vào bể ổn nhiệt đã cài sẵn để nước trong bể ổn
nhiệt đạt 37oC, ủ tinh trong 30 phút, sau đó đảo đều tuýp tinh (5 đến 10 lần) rồi cắt góc
phía dán tp tinh, nhỏ 3 giọt lên lam kính (hoặc dùng pipet dung tích 10µl hút 10 µl

tinh mỗi giọt nhỏ lên lam kính). Soi và ghi lại chỉ tiêu vận động của tinh trùng quan sát
được trong 3 giọt tinh. Nộp kết quả cho giảng viên hoặc cán bộ hỗ trợ.


BÀI 3. THỰC HÀNH KHAI THÁC TINH VÀ THỤ TINH NHÂN TẠO GIA
SÚC
1. Mục tiêu
- Nắm rõ nguyên lý, cấu tạo và cách sử dụng âm đạo giả lấy tinh gia súc
- Thực hiện được việc tháo lắp âm đạo giả khai thác tinh thỏ
- Nắm rõ nguyên lý, cấu tạo và sử dụng súng bắn tinh bò sử dụng tinh đông lạnh dạng
cọng rạ
- Thực hiện được kỹ thuật thụ tinh nhân tạo trên bò trên mẫu vật cơ quan sinh sản thật
của bị cái
2. Chuẩn bị máy móc, thiết bị, dụng cụ, hoá chất và mẫu vật
- 1 âm đạo giả lấy tinh thỏ
- 3 súng bắn tinh đơng lạnh dạng cọng rạ ở bị dung tích 0,25 ml/cọng
- 5 cọng rạ dung tích 0,25 ml
- 10 bao cao su của người
- 6 thây thun
- 3 ống eppendorf dung tích 2 ml
- 3 syring dung tích 6 ml
- 1 kéo sắc
- 5 găng tay sản khoa
- 3 bộ cơ quan sinh sản của bò cái
3. Tiến hành
* Cấu tạo của âm đạo giả lấy tinh thỏ
- Chất liệu bằng nhựa, kèm van bằng nhựa

Hình âm đạo giả lấy tinh thỏ

- Một ống thân chính của âm đạo giả, một đầu miệng rộng hướng về dương vật thỏ
đực, đầu đối diện miệng thu lại để lắp ống hứng tinh
- Một lỗ nhỏ ở gần miệng nhỏ hoặc trên thành ống thân chính có nắp đậy, đây là vị trí
để bơm nước ấm vào trong lòng âm đạo giả và thổi khí để làm căng vách âm đạo giả
tạo độ ấm và độ se khít tương tự như âm đạo thỏ cái.
- Một túi cao su thủng hai đầu để lồng vào trong thành của ống thân chính âm đạo giả
tạo vách âm đạo giả tiếp xúc với dương vật thỏ đực và tạo khoang chứa nước ấm và
bơm căng khí với thành của ống thân chính.
* Thực hành tháo lắp âm đạo giả lấy tinh thỏ
- Lấy bao cao su thứ nhất ra khỏi bao và gỡ hoàn toàn bao cao su ra, dùng kéo cắt phần
đầu nhọn của bao cao su vừa đủ miệng của ống eppendorf dung tích 1,5 ml
- Lồng phần vừa cắt của bao cao su bao ngoài miệng ống eppendorf, dùng dây thun
buộc chặt bao cao su vào rìa miệng của ống eppendorf
- Lấy bao cáo su thứ hai, dùng káo cắt toàn bộ phần đầu nhọn của bao cao su rồi lồng
vào mặt trong của âm đạo giả.
- Lật mở hai đầu của bao cao su để ơm lấy thành ngồi của hai đầu thành âm đạo giả,
dùng dây thun quấn chặt bao cao su vào thành âm đạo giả
- Luồn phần miệng rộng của bao cao su thứ nhất vào trong thành ống thân chính của
âm đạo giả, luồn từ phần miệng hẹp lên phần miệng rộng của ống âm đạo giả.
- Lật mở phần miệng rộng của bao cao su thứ nhất ôm lấy thành ngoài của ống ấm đạo
giả, đảm bảo đủ độ căng để cho miệng của ống eppendorf áp vào miệng hẹp của ống
âm đạo giả
- Dùng syring dung tích 6 ml hút nước rồi bơm vào lịng âm đạo giả thông qua lỗ bơm
nước trên thành âm đạo giả (thực tế khi lấy tinh thỏ đực, nhiệt độ nước phải đạt 50 oC
để đảm bảo kích thích thành cơng phản xạ phóng tinh ở thỏ đực)
- Dùng miệng thổi căng hơi trong lòng âm đạo giả rồi nhanh tay đậy kín nắp để khí
khơng lọt ra
- Trong thực tế lấy tinh thỏ bằng âm đạo giả, ngoài việc đảm bảo độ ấm và độ khít của
thành âm đạo giả thì trước khi lấy tinh, bơi một ít gel bơi trơn (ví dụ như gel KY của

người) để giảm ma sát và tránh gây tổn thương cho dương vật của thỏ đực.
* Cấu tạo của súng bắn tinh bò sử dụng tinh đông lạnh dạng cọng rạ 0,25 ml
- Dụng cụ được làm bằng chất liệu thép không gỉ
- Một ống ghen bằng nhựa, dùng một lần để bao ngoài toàn bộ súng bắn tinh
- Một ống thép bao ngoài của súng bắn tinh để lắp cọng tinh
- Một lõi thép để luồn bên trong ống ngoài của súng bắn tinh đồng thời để đẩy nút
bông trong cọng tinh giúp đẩy tinh ra ngoài


Hình súng bắn tinh bị

Hình ống ghen phối giống cho bò


Hình cọng rạ tinh đơng lạnh vật ni dung tích 0,25ml
* Thực hành nạp cọng tinh vào súng bắn tinh sẵn sàng thụ tinh cho bò
- Giả sử đã rã đơng cọng tinh (lấy cọng tinh ra khỏi bình ni tơ trữ mẫu, nhúng vào
nước ấm 37oC trong 1 phút), lau khô cọng tinh bằng giấy thấm vô trùng
- Cắt phần đầu hàn của cọng tinh
- Nạp cọng tinh vào ống ngồi của súng bắn tinh (đầu có bơng của cọng rạ luồn vào
trong ống súng, đầu mới cắt ở phía ngồi)
- Lồng ống ghen bao ngồi súng
- Lắp lõi trong của súng bắn tinh đến khi thấy kích tay thì dừng lại
* Thực hành thụ tinh nhân tạo cho bò trên mẫu vật sống của bộ cơ quan sinh sản
bị cái bằng sử dụng tinh đơng lạnh dạng cọng rạ
- Đeo găng tay sản khoa bên tay trái
- Quan sát và xác định từng cơ quan sinh sản bò cái
- Sờ khám (khơng nhìn vào mẫu vật) để xác định các vị trí của cơ quan sinh dục bị cái
gồm cổ tử cung, ngã ba sừng tử cung
- Mắt nhìn vào mẫu vật để xác định vị trí của âm môi và âm đạo, tay trái nắm lấy ống

sinh dục cái tại vị trí cổ tử cung, tay phải đưa đầu súng bắn tinh vào âm đạo
- Mắt không nhìn mẫu vật, tiếp tục luồn súng bắn tinh tới cổ tử cung và vượt qua cổ tử
cung (3 vòng cơ), tay trái cảm nhận vị trí của đầu súng bắn tinh, định vị chính xác vị
trí bắn tinh và tiến hành bắn tinh
- Tay trái vẫn giữ nguyên vị trí, tay phải rút súng bắn tinh ra khỏi đường sinh dục
- Rút tay trái ra khỏi đường sinh dục con cái, kết thúc quá trình bắn tinh.