Bước đầu áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen theo phương pháp sanger để xác định đột biến exon 2 của gen kras và mối liên quan với một số đặc điểm cận lâm sàng trên bệnh nhân ung thư đại

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

TRƯƠNG THỊ BÍCH TRANG

BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN
THEO PHƯƠNG PHÁP SANGER ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN EXON 2
CỦA GEN KRAS VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM
CẬN LÂM SÀNG TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI-TRỰC TRÀNG
TẠI BỆNH VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NĂM 2021-2022

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CẦN THƠ - 2022


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

TRƯƠNG THỊ BÍCH TRANG

BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN
THEO PHƯƠNG PHÁP SANGER ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN EXON 2
CỦA GEN KRAS VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM
CẬN LÂM SÀNG TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI-TRỰC TRÀNG

TẠI BỆNH VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NĂM 2021-2022
Chuyên ngành: Kỹ Thuật Xét Nghiệm Y học
Mã số: 8720601

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
TS. PHẠM THỊ NGỌC NGA

CẦN THƠ - 2022


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết
quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và
chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào.
Tác giả luận văn

Trương Thị Bích Trang


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu, tôi đã nhận được rất nhiều
sự quan tâm, giúp đỡ từ Thầy, Cô giáo, Bạn bè đồng nghiệp và Gia đình.
Trước tiên tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu; Khoa
Điều Dưỡng-Kỹ Thuật Y Học; Khoa Giải Phẫu Bệnh; Phòng Sinh Học Phân
Tử và các Thầy, Cô giáo tại Trường Đại học Y Dược Cần Thơ đã truyền đạt
kiến thức chuyên môn và tạo điều kiện thuận tiện nhất cho tơi trong suốt q
trình học tập và nghiên cứu tại Trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Gíam Đốc và các bạn Đồng nghiệp tại

Trung Tâm Y Sinh Học Phân Tử Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí
Minh.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn đến người hướng dẫn khoa học cho đề tài
nghiên cứu của tôi: TS. Phạm Thị Ngọc Nga.
Cuối cùng là lời cảm ơn đặc biệt đến gia đình, nơi là chỗ dựa tinh thần
và là nguồn động viên cho tôi vượt mọi trở ngại để hoàn thành luận văn này.

Tác giả luận văn

Trương Thị Bích Trang


MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các biểu đồ
Danh mục các sơ đồ, hình
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 3
1.1. Tổng quan về bệnh ung thư đại-trực tràng ............................................... 3
1.2. Một số đặc điểm cận lâm sàng của bệnh ung thư đại-trực tràng ............... 5
1.3. Tổng quan về exon 2 của gen KRAS trong ung thư đại-trực tràng ............ 9
1.4. Mối liên quan giữa đột biến exon 2 của gen KRAS với một số đặc điểm
cận lâm sàng trên bệnh nhân ung thư đại-trực tràng ............................. 15
1.5. Tình hình nghiên cứu đột biến exon 2 của gen KRAS trong bệnh ung thư
đại- trực tràng ....................................................................................... 17
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 19

2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 20
2.3. Đạo đức trong nghiên cứu...................................................................... 36
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...................................................... 37
3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu ............................................ 37
3.2. Một số đặc điểm cận lâm sàng của bệnh nhân UTĐTT .......................... 39
3.3. Tỷ lệ và các kiểu đột biến exon 2 của gen KRAS .................................... 42
3.4. Mối liên quan giữa đột biến exon 2 gen KRAS với một số đặc điểm cận
lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại-trực tràng ..................................... 47


Chương 4. BÀN LUẬN .............................................................................. 52
MỤC
LỤC
4.1. Đặc điểm chung của đối tượng
nghiên
cứu ............................................ 52
4.2. Một số đặc điểm cận lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại- trực tràng .... 53
4.3. Tỷ lệ và các kiểu đột biến exon 2 của gen KRAS ở bệnh nhân UTĐTT .. 57
4.4. Mối liên quan giữa đột biến exon 2 gen KRAS với một số đặc điểm cận
lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại-trực tràng ..................................... 64
KẾT LUẬN ................................................................................................. 68
KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt
CDC

ĐBSCL
EGFR

FAP

FDA
GDP
GEFs
GTP

Ý nghĩa
Centers for Disease Control and Prevention
(Trung tâm kiểm sốt và phịng ngừa dịch bệnh )
Đồng bằng sông Cửu Long
Epidermal Growth Factor Receptor
(Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì)
Familial Adenomatous Polyposis
(Bệnh đa polyp đại trực- tràng mang tính gia đình)
Food and Drug Administration
(Cục Quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ)
Guanosine DiPhosphate
Guanine nucleotide Exchange Factors
(Yếu tố trao đổi nucleotide Guanine)
Guanosine TriPhosphate

KRAS

Kirsten Rat Sarcoma

MAPK

Mitogen – activated protein kinase

PCR
UTĐTT

Polymerase Chain Reaction
(Phản ứng chuỗi trùng hợp)
Ung thư đại-trực tràng


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Các kiểu đột biến gen KRAS phổ biến ở codon 12 và 13 và vị trí
nucleotid bị thay đổi ............................................................................. 10
Bảng 2.1. Tiêu chuẩn chẩn đoán thiếu máu của WHO (2011) ....................... 21
Bảng 2.2. Mức độ thiếu máu phân loại theo WHO (2011) ............................ 22
Bảng 2.3. Trình tự các đoạn đoạn mồi khuếch đại exon 2 gen KRAS ............ 29
Bảng 2.4 Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR.............................................. 29
Bảng 2.5. Chu kỳ luân nhiệt theo kỹ thuật COLD-PCR ................................ 32
Bảng 3.1. Đặc điểm về tuổi của đối tượng nghiên cứu .................................. 37
Bảng 3.2. Đặc điểm về nhóm tuổi của đối tượng nghiên cứu ........................ 37
Bảng 3.3. Vị trí u của bệnh nhân trên nội soi ................................................ 39
Bảng 3.4. Dạng tổn thương của u trên nội soi ............................................... 39
Bảng 3.5. Xét nghiệm định lượng nồng độ CEA........................................... 40
Bảng 3.6. Xét nghiệm định lượng nồng độ Hb trước phẫu thuật ................... 40
Bảng 3.7. Xét nghiệm định lượng nồng độ Hb sau phẫu thuật ...................... 41
Bảng 3.8. Các loại mô bệnh học ................................................................... 41
Bảng 3.9. Mức độ biệt hố mơ dựa vào xét nghiệm mơ bệnh học ................. 42
Bảng 3.10. Các kiểu đột biến exon 2 của gen KRAS ..................................... 44

Bảng 3.11. Phân bố kiểu đột biến trên exon 2 gen KRAS theo vị trí biến đổi 44
Bảng 3.12. Mối liên quan giữa đột biến exon 2 gen KRAS với nhóm tuổi ..... 47
Bảng 3.13. Mối liên quan giữa đột biến exon 2 gen KRAS với giới tính ........ 47
Bảng 3.14. Mối liên quan giữa đột biến exon 2 gen KRAS với nơi cư trú...... 48
Bảng 3.15. Mối liên quan giữa đột biến exon 2 gen KRAS với vị trí u .......... 48
Bảng 3.16. Mối liên quan giữa đột biến exon 2 gen KRAS với dạng tổn thương
của u trên nội soi .................................................................................. 49


Bảng 3.17. Mối liên quan giữa đột biến exon 2 của gen KRAS với nồng độ
CEA ..................................................................................................... 49
Bảng 3.18. Mối liên quan giữa đột biến exon 2 của gen KRAS với nồng độ Hb
trước phẫu thuật .................................................................................... 50
Bảng 3.19. Mối liên quan giữa đột biến exon 2 của gen KRAS với nồng độ Hb
sau phẫu thuật ....................................................................................... 50
Bảng 3.20. Mối liên quan giữa đột biến exon 2 của gen KRAS với các loại mô
bệnh học ............................................................................................... 51
Bảng 3.21.Mối liên quan giữa đột biến exon 2 của gen KRAS với mức độ .... 51
Bảng 4.1. Tỷ lệ đột biến exon 2 gen KRAS trong một số nghiên cứu ............ 62


DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 3.1. Đặc điểm về giới tính của đối tượng nghiên cứu ........................... 38
Biểu đồ 3.2. Đặc điểm về nơi cư trú của đối tượng nghiên cứu ......................... 38
Biểu đồ 3.3. Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến exon 2 của gen KRAS ........................ 43


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH
Trang

Hình 1.1. Tổn thương ung thư đại-trực tràng trên nội soi từ type 1-type 4 .......... 6
Hình 1.2. Hình ảnh nhuộm màu nhằm bộc lộ tổn thương khó phát hiện khi nội
soi thơng thường ......................................................................................... 6
Hình 1.3. Vị trí gen KRAS trên nhiễm sắc thể số 12 ............................................ 9
Hình 1.4. Chu trình sequencing sử dụng Dye Terminators ............................... 12
Hình 1.5. Bước 1 chu trình của Pyrosequencing ............................................... 13
Hình 1.6. Bước 2 chu trình của Pyrosequencing ............................................... 13
Hình 1.7. Bước 3 chu trình của Pyrosequencing ............................................... 13
Hình 1.8. Bước 4 chu trình của Pyrosequencing ............................................... 14
Hình 1.9. Bước 5 chu trình của Pyrosequencing ............................................... 14
Hình 3.1. Kết quả giải trình tự theo phương pháp Sanger với kiểu đột biến
c.34G>C (p.Gly12Arg) trên exon 2 của gen KRAS ................................... 45
Hình 3.2. Kết quả giải trình tự theo phương pháp Sanger với kiểu đột biến
c.35G>A (p.Gly12Asp) trên exon 2 của gen KRAS ................................... 45
Hình 3.3. Kết quả giải trình tự theo phương pháp Sanger với kiểu đột biến
c.35G>T (p.Gly12Val) trên exon 2 của gen KRAS .................................... 46
Hình 3.4. Kết quả giải trình tự theo phương pháp Sanger với kiểu đột biến
c.38G>A (p.Gly13Asp) trên exon 2 của gen KRAS ................................... 46
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ trong nghiên cứu .................................................................... 35
Sơ đồ 4.1. Sơ đồ kỹ thuật trong nghiên cứu ...................................................... 59


1
MỞ ĐẦU
Ung thư đại-trực tràng là một trong những bệnh ung thư phổ biến trên thế
giới, đứng thứ 3 ở nam, thứ 2 ở nữ và là nguyên nhân gây tử vong cao thứ 4
trong các bệnh ung thư [41]. Theo thống kê của tổ chức ung thư toàn cầu
GLOBOCAN-IARC năm 2020, Việt Nam xếp thứ 91/185 về tỷ suất mắc mới và
thứ 50/185 về tỷ suất tử vong trên 100.000 người. Cũng theo thống kê này, ước
tính, Việt Nam, có 182.563 ca mắc mới và 122.690 ca tử vong do ung thư, trong đó

ung thư đại-trực tràng xếp hàng thứ 4 sau gan, phổi và dạ dày. Ở Cần Thơ,
Huỳnh Quyết Thắng và cộng sự [11] ghi nhận ung thư đại-trực tràng có xuất
độ mắc mới đứng thứ 2 ở nam và thứ 4 ở nữ.
Các nghiên cứu về phân tử cho thấy ung thư đại-trực tràng là kết quả sự
tích luỹ các đột biến gen. Các đột biến gen xuất hiện làm suy giảm hoặc tăng
cường quá mức các tín hiệu tế bào gây rối loạn các quá trình phát triển, phân
chia, biệt hố, chết theo chương trình (apotosis) dẫn đến phát sinh ung thư.
Nhiều đột biến gen đã được phát hiện trong ung thư đại-trực tràng và chúng
chia làm 3 nhóm chính: đột biến các gen gây ung thư: KRAS, NRAS, BRAF và
PI3K; đột biến các gen ức chế khối u: APC, TP53, STK11 (LKB1), PTEN,
BMPR1A, SMAD4 và đột biến các gen sửa chữa: MLH1, MSH2, MSH6,
PMS2, EPCAM, MYH, POLD1 và POLE [56].
Trong điều trị, đối với ung thư đại-trực tràng giai đoạn sớm, phẫu thuật
có thể kết hợp với hố trị, xạ trị có thể điều trị triệt căn nguồn bệnh. Tuy
nhiên, trên thực tế có khoảng 60% bệnh nhân được chẩn đoán ở giai đoạn
muộn, khi đó, điều trị tồn thân bao gồm hố trị và điều trị đích là phương
pháp chủ đạo [36], [42], [54]. So với nhóm bệnh nhân chỉ hóa trị đơn thuần
thì liệu pháp nhắm trúng đích phân tử EGFR (Epidermal Growth Factor
Receptor), yếu tố giữ vai trò quan trọng trong việc kiểm soát tăng sinh tế bào
bằng các kháng thể đơn dòng như cetuximab hoặc panitumumab khi được sử


2
dụng phối hợp với các phác đồ hóa trị chuẩn như FOLFOX hay FOLFIRI
trong điều trị ung thư đại-trực tràng di căn đã được chứng minh giúp cải thiện
rõ rệt thời gian sống còn cho bệnh nhân [20], [25], [68].
Tuy nhiên, thuốc điều trị đích EGFR chỉ mang lại lợi ích cho những
bệnh nhân khơng có đột biến gen KRAS và gen BRAF [34]. Từ đó, xác định
tình trạng đột biến gen KRAS, BRAF đã trở thành một chỉ định cần thiết trước
khi điều trị thuốc nhắm đích EGFR cho bệnh nhân ung thư đại- trực tràng.

So với đột biến gen BRAF được phát hiện từ 5% đến 15% các trường hợp ung
thư đại-trực tràng thì đột biến gen KRAS được phát hiện nhiều hơn từ 30% đến
50% [67], [68]. Do đó, chúng tơi tiến hành đề tài: “Bước đầu ứng dụng kỹ
thuật giải trình tự gen theo phương pháp Sanger để xác định đột biến
exon 2 của gen KRAS và mối liên quan với một số đặc điểm cận lâm sàng
trên bệnh nhân ung thư đại-trực tràng tại Bệnh viện Trường Đại học Y
Dược Cần Thơ năm 2021-2022” với các mục tiêu sau:
1. Mô tả một số đặc điểm cận lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại-trực
tràng tại Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ năm 2021-2022.
2. Xác định tỷ lệ và các kiểu đột biến exon 2 của gen KRAS trên bệnh
nhân ung thư đại-trực tràng tại Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ
năm 2021-2022.
3. Tìm hiểu mối liên quan giữa đột biến exon 2 của gen KRAS với một
số đặc điểm cận lâm sàng trên bệnh nhân ung thư đại-trực tràng tại Bệnh viện
Trường Đại học Y Dược Cần Thơ năm 2021-2022.


3
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về bệnh ung thư đại-trực tràng
1.1.1. Khái niệm và dịch tễ học ung thư đại-trực tràng
Ung thư đại-trực tràng (UTĐTT) là loại ung thư có nguồn ngun phát
từ đại tràng (phần chính của ruột già) hoặc trực tràng (đoạn nối giữa đại tràng
và hậu môn) và được gọi tên tùy thuộc vào vị trí xuất hiện của ung thư.
UTĐTT được gây ra bởi sự phát triển bất thường của các tế bào và tùy vào vị
trí khối u trên khung đại tràng hay trực tràng cùng mức độ lan rộng của khối u
sang các tạng hay các cơ quan khác (di căn) mà bệnh sẽ biểu hiện những triệu
chứng khác nhau.
Các triệu chứng thường gặp nhất là có máu trong phân, thay đổi thói

quen đại tiện, thay đổi khn phân, đau vùng hạ vị, cảm giác đi ngồi khơng
hết phân, mệt mỏi, sút cân, … Các vị trí UTĐTT thường gặp bao gồm: ung
thư ống hậu môn, ung thư trực tràng hoặc ung thư đại tràng sigma, ung thư đại
tràng trái, ung thư đại tràng ngang, ung thư đại tràng phải, ung thư manh
tràng.
Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), UTĐTT là loại ung thư phổ biến thứ
hai trên thế giới, chỉ sau ung thư phổi và ước tính mỗi năm có khoảng 11 triệu
trường hợp mắc mới và gần 7 triệu người tử vong do UTĐTT. Theo tổ chức
nghiên cứu ung thư tồn cầu [41], UTĐTT ln có tỷ lệ nam mắc cao hơn nữ,
khoảng 55% trường hợp ng thư đại-trực tràng xảy ra ở các nước phát triển,
ước tính năm 2018, tại Việt Nam có 14 nghìn người mắc ung thư đại- trực
tràng và hơn 7 nghìn trường hợp tử vong vì bệnh này, tỷ lệ mắc đối với nữ là
13,7/100.000 dân và với nam là 17,1/100.000 dân. Xuất độ mắc UTĐTT tăng
theo tuổi và hiếm khi xuất hiện trước 40 tuổi, ngoại trừ các trường hợp cơ địa
có tích luỹ các bất thường về di truyền liên quan hoặc bệnh viêm đại tràng


4
mạn ở các vùng dịch tễ có xuất độ mắc cao.
1.1.2. Các yếu tố nguy cơ của ung thư đại-trực tràng
Theo kết luận của các nhà khoa học có 3 yếu tố nguy cơ chính là: dinh
dưỡng, các thương tổn tiền ung thư và yếu tố di truyền có liên quan chặt chẽ
đến sinh bệnh học UTĐTT [1], [28], [54].
- Yếu tố dinh dưỡng: chế độ ăn nhiều thịt, mỡ động vật làm tăng
lượng acid mật, làm thay đổi và thúc đẩy sự phát triển của các vi khuẩn trong
ruột nhất là những vi khuẩn yếm khí, chúng có thể biến đổi các acid mật
thành các chất chuyển hố có khả năng tác động tới sự sinh sản của các tế
bào biểu mô ruột dẫn đến nguy cơ cao cho UTĐTT [43]. Các chế độ ăn ít
chất xơ, uống nhiều rượu, nghiện thuốc lá đều là những yếu to thuận lợi cho
ung thư xuất hiện [37].

- Các thương tổn tiền ung thư:
+ Viêm đại trực tràng xuất huyết: nhiều nghiên cứu cho thấy những
bệnh nhân viêm đại-trực tràng chảy máu nguy cơ tiến triển tới ung thư là 2025% sau 10 năm [35], [46].
+ Polyp đại tràng: có nhiều loại polyp như polyp tuyến, polyp tăng sản
và polyp loạn sản phôi. Các Polyp này thường được xem là những thương tổn
tiền ung thư. Nguy cơ ung thư hoá của các polyp này phụ thuộc vào kích thước
và loại mơ học, ví dụ: polyp nhung mao có nguy cơ ung thư hố từ 25 đến
40%; những polyp có kích thước > 2cm có nguy cơ ung thư cao [49], [58].
- Yếu tố di truyền: đóng vai trị quan trọng trong sinh bệnh UTĐTT
bao gồm các gen sinh ung thư và các hội chứng di truyền.
+ Hội chứng UTĐTT di truyền không polyp (hội chứng Lynch) [42].
+ Bệnh đa polyp đại trực tràng mang tính gia đình (Familial
Adenomatous Polyposis: FAP) [61].
+ Hội chứng Turcot: Bệnh di truyền gen lặn trên NST thường [53].


5
1.2. Một số đặc điểm cận lâm sàng của bệnh ung thư đại-trực tràng
1.2.1. Chẩn đốn hình ảnh
- Chụp X quang đại-trực tràng có cản quang: phương pháp an tồn,
hiệu quả và có độ đặc hiệu cao trong chẩn đốn các polyp và khối ung thư có
đường kính trên 1cm, khả năng phát hiện là 90-95% các trường hợp [48].
- Chụp cắt lớp đại-trực tràng (CT-Computed Tomography): khi người
bệnh có biến chứng tắc ruột, không chấp nhận hoặc chống chỉ định nội soi
đại- trực tràng thì chụp cắt lớp đại trực tràng rất có giá trị chẩn đốn giúp
phát hiện được tổn thương ung thư hoặc polyp lớn trên 10mm với độ nhạy từ
90 đến 96% [43], phát hiện xâm lấn tại chỗ, di căn hạch, di căn gan của
UTĐTT [33], [45].
- Chụp cộng hưởng từ (MRI): giúp đánh giá tình trạng xâm lấn và di
căn trong chẩn đốn giai đoạn của UTĐTT và theo dõi sự tái phát của khối u

sau phẫu thuật [19].
- Chụp cắt lớp phát xạ PET/CT (Positron Emissio Tomography/
Computed Tomography): cho biết được một vùng bất thường trên hình ảnh
có phải là ung thư hay không mà kỹ thuật CT hoặc MRI không khẳng định
được, giúp phát hiện sự di căn của khối u trên phạm vi tồn cơ thể. Trong
UTĐTT, PET scan rất có giá trị để theo dõi sự tái phát khi các xét nghiệm
hố sinh ở giới hạn bình thường [62].
1.2.2. Nội soi đại-trực tràng
Nội soi đại-trực tràng là kỹ thuật quan trọng trong chẩn đoán và điều trị
các bệnh lý của đại-trực tràng trong đó có ung thư. Nội soi được sử dụng để
chẩn đoán, điều trị và theo dõi tái phát của UTĐTT. Kỹ thuật nội soi có độ
nhạy rất cao từ 94,7% đến 98,08% [23], [26], [59] và cho thấy hình ảnh tổn
thương UTĐTT được chia làm 6 loại theo phân loại Paris 2002 [72]:
- Type 0: tổn thương ung thư dạng nhú lồi, phẳng


6
- Type 1: tổn thương ung thư dạng sùi
- Type 2: tổn thương ung thư dạng loét
- Type 3: tổn thương ung thư dạng loét và sùi kết hợp
- Type 4: tổn thương ung thư dạng thâm nhiễm
- Type 5: tổn thương ung thư dạng không thể phân loại

Type 1

Type 2

Type 3

Type 4

Hình 1.1. Tổn thương ung thư đại trực tràng trên nội soi từ type 1-type 4
(Nguồn: Hiroyuki K, 2012) [44]
Trong q trình nội soi có thể sử dụng các chất nhuộm màu nhằm bộc
lộ những vùng tổn thương giúp sinh thiết được chính xác góp phần chẩn đốn
sớm để điều trị kịp thời.

Hình 1.2. Hình ảnh nhuộm màu nhằm bộc lộ tổn thương khó phát hiện khi
nội soi thông thường
(Nguồn: Hiroyuki K, 2012) [44]


7
1.2.3. Xét nghiệm
- Xét nghiệm định lượng CEA (Carcinoma Embryonic Antigen):
CEA là một kháng nguyên có ở tế bào ruột của thai nhi và khi trưởng
thành thì có nồng độ rất thấp ở trong máu. CEA tăng trong các bênh ung thư
đặc biệt là bệnh ung thư tế bào biểu mơ, trong đó có UTĐTT, là chỉ số thường
gặp nhất ở những bệnh nhân tái phát không triệu chứng và hiện nay là chỉ số
hữu ích nhất để phát hiện sớm di căn gan ở những bệnh nhân sau phẫu thuật
[32], [33]. Những bệnh nhân mà nồng độ CEA huyết thanh ban đầu cao có tỷ
lệ tái phát cao hơn hoặc thời gian tái phát ngắn hơn so với bệnh nhân có nồng
độ CEA huyết thanh ban đầu bình thường [39], [52].
- Xét nghiệm định lượng hemoglobin:
Định nghĩa thiếu máu theo tổ chức Y tế thế giới (WHO 2011): thiếu
máu là hiện tượng (tình trạng) giảm lượng huyết sắc tố và số lượng hồng cầu
trong máu ngoại vi, dẫn đến thiếu oxy cung cấp cho các mô tế bào trong cơ
thể. Thiếu máu khi nồng độ hemoglobin thấp hơn 13 g/dL (130 g/L) ở nam
giới ≥ 15 tuổi và thấp hơn 12 g/dL (120 g/L) ở phụ nữ ≥ 15 tuổi không mang
thai. Trong bệnh lý UTĐTT, theo dõi chỉ số hemoglobin để phát hiện tình

trạng thiếu máu dẫn đến suy nhược cơ thể của người bệnh ảnh hưởng đến
hiệu quả điều trị và thời gian phục hồi của bênh nhân đặc biệt là bênh nhân
ung thư có di căn phải điều trị phẫu thuật.
1.2.4. Xét nghiệm mô bệnh học
Xét nghiệm mô bệnh học là công tác kiểm tra mẫu sinh thiết hoặc tiêu
bản phẫu thuật do một bác sĩ giải phẫu bệnh học thực hiện, sau khi đã xử lý
mẫu bệnh phẩm này và đặt trên các phiến kính được soi qua kính hiển vi.
Chẩn đốn ung thư bằng mô bệnh học là phương pháp rất quan trọng
cho phép chẩn đoán xác định lành hay ác, định hướng cho điều trị cũng như
tiên lượng bệnh.


8
- Phân loại mô học: theo phân loại WHO (2010), UTĐTT gồm các
type u biểu mô bệnh học như sau [71]:
+ Ung thư biểu mô tuyến
+ Ung thư biểu mô tủy
+ Ung thư biểu mô tuyến nhú
+ Ung thư biểu mô tuyến nhày
+ Ung thư biểu mô tuyến “răng cưa” (Seratted Adenocarcinoma)
+ Ung thư biểu mô tế bào nhẫn
+ Ung thư biểu mô tuyến vảy
+ Ung thư biểu mô tế bào hình thoi
+ Ung thư biểu mơ tế bào vảy
+ Ung thư biểu mơ khơng biệt hóa.
- Phân độ mơ học: dựa trên sự hình thành cấu trúc tuyến của tổ chức
ung thư, xét nghiệm mô bệnh học của UTĐTT thường được chia làm 04 mức
độ: biệt hóa cao, biệt hóa vừa, biệt hóa thấp và khơng biệt hóa [38].
+ Biệt hóa cao: trên 95% có cấu trúc tuyến.
+ Biệt hóa vừa: từ 50% đến 95% có cấu trúc tuyến.

+ Biệt hóa kém: dưới 50% có cấu trúc tuyến.
+ Khơng biệt hóa: khơng thấy cấu trúc tuyến.
Ung thư biểu mơ tuyến đại trực tràng chiếm 95% đến 97% các loại
UTĐTT. Thể biệt hóa vừa và biệt hóa cao có tỷ lệ cao hơn thể biệt hóa kém
và khơng biệt hóa [20], [64]. Trong một số nghiên cứu hệ thống phân loại
chia làm hai mức độ: mức độ ác tính cao (gồm thể biệt hóa kém và khơng
biệt hóa) và mức độ ác tính thấp (gồm thể biệt hóa cao và biệt hóa vừa) có
giá trị tiên lượng tốt [31], [32].


9
1.3. Tổng quan về exon 2 của gen KRAS trong ung thư đại-trực tràng
1.3.1. Đột biến exon 2 của gen KRAS trong ung thư đại-trực tràng
Gen KRAS thuộc họ gen ung thư RAS, gen gồm 06 exon, có
45.691 bp nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 12, tại vị trí p12.1 và
từ cặp base 25.204.789 đến cặp base 25.250.936 [29], [60].

Hình 1.3. Vị trí gen KRAS trên nhiễm sắc thể số 12
(Nguồn: Popescu., 1985) [60]
Gen KRAS mã hoá cho các protein GTPase K-ras có 189 acid amin,
đóng vai trị truyền tín hiệu nội bào xi dịng từ EGFR từ các thụ thể bề mặt
tế bào tới các mục tiêu nội bào thông qua con đường RAS-MAPK [13].
Trong tế bào protein Ras được giữ cân bằng thơng qua sự hình thành
hai phức hợp tương ứng với các trạng thái hoạt hóa và ức chế của protein
Ras: phức hợp Ras-GTP (protein Ras được hoạt hóa) và phức hợp Ras-GDP
(protein Ras bị bất hoạt). Protein Ras được hoạt hóa nhờ yếu tố chuyển
nucleotid guanine (guanine nucleotid exchange factors-GEFs). Việc truyền
tín hiệu của proteine Ras bị ức chế khi phức hợp Ras-GTP bị thủy phân thành
phức hợp Ras-GDP nhờ một loại protein có chức năng hoạt hóa GTPase
(GAPs). Trong điều kiện sinh lý bình thường, nồng độ Ras-GTP trong cơ thể

được kiểm sốt chặt chẽ nhờ sự hoạt động nhịp nhàng của 2 yếu tố GEFs và
GAPs [47], [51], [52].


10
Khi gen KRAS bị đột biến sẽ tạo ra những protein Ras mới có khả
năng chống lại hoạt tính GTPase của GAPs. Protein Ras đột biến có thể gắn
kết với GAP nhưng không thể thuỷ phân GTP đã tạo ra cho protein Ras đột
biến duy trì được tình trạng hoạt hố trong một thời gian dài. Protein Ras đột
biến kích hoạt vĩnh viễn các con đường tín hiệu nằm xi dịng nó bất kể có
sự hoạt hóa của thụ thể EGFR hay khơng. Đây chính là cơ sở giải thích cho
việc liệu pháp trúng đích EGFR bị thất bại khi gen KRAS có đột biến bởi lúc
này protein Ras khơng cịn phụ thuộc vào sự hoạt hóa từ EGFR [20], [47].
Bảng 1.1. Các kiểu đột biến gen KRAS phổ biến ở codon 12 và 13 và vị trí
nucleotid bị thay đổi [57]
Codon

12

13

Dạng đột biến

Vị trí nucleotid biến đổi

G12D (Gly12Asp)

35G>A

G12V (Gly12Val)

35G>T

G12C (Gly12Cys)

34G>T

G12S (Gly12Ser)

34G>A

G12A (Gly12Ala)

35G>C

G12R (Gly12Arg)

34G>C

G12F (Gly12Phe)

34G>T, 35G>T

G12I (Gly12Iso)

34G>A, 35G>T

G13D (Gly13Asp)

38G>A

G13C (Gly13Cys)

37G>T

G13R (Gly13Arg)

37G>C

Theo thống kê, tỷ lệ đột biến gen KRAS gặp ở hơn 30% các trường hợp
UTĐTT. Đến nay có hơn 3000 đột biến điểm gen đã được báo cáo, trong đó
đột biến hay gặp nhất là đột biến thay thế nucleotid ở codon 12 (chiếm 82%)
và codon 13 (chiếm 17%) ở exon 2 trên gen KRAS [22]. Đột biến gen KRAS
tại codon 12 và codon 13 đã được chứng minh đóng một vai trị quan trọng


11
trong quá trình tiến triển ung thư và nguy cơ kháng thuốc ức chế EGFR của
khối u [20]. Đột biến gen KRAS tại các vị trí khác như tại codon 61 và codon
146 cũng đã được báo cáo nhưng thường chiếm tỷ lệ nhỏ và ảnh hưởng của
những dạng đột biến này trên lâm sàng chưa được làm sáng tỏ [21], [27].
1.3.2. Một số kỹ thuật xét nghiệm tìm đột biến exon 2 của gen KRAS
Các kỹ thuật xét nghiệm sử dụng phổ biến hiện nay được xếp vào hai
nhóm chính: giải trình tự gen và PCR với alen đặc hiệu [69].
1.3.2.1. Kỹ thuật giải trình tự gen
* Phương pháp Sanger
Kỹ thuật này dùng một sợi DNA làm khuôn để tổng hợp sợi DNA bổ
sung. Quá trình tổng hợp sợi DNA bổ sung dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật
PCR (mỗi chu kỳ có 3 giai đoạn: biến tính, gắn mồi và tổng hợp mạch mới),
kèm theo sự hiện diện của những dideoxynucleotid được đánh dấu bên cạnh

các deoxynucleotid bình thường. Mỗi ddNTP được đánh dấu với một màu
fluorochrome khác nhau và sự phân biệt các màu dựa trên độ dài bước sóng
của các fluorochrome tương ứng. Enzyme DNA polymerase xúc tác gắn các
deoxynucleotide trên mạch đơn DNA đang tổng hợp vào đầu 3’-OH, khi gặp
dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang khơng có nhóm 3’-OH phản ứng
tổng hợp sẽ dừng lại. Sự gắn kết các ddNTP vào DNA đang kéo dài một cách
ngẫu nhiên sẽ tạo ra các chuỗi DNA với độ dài hơn kém nhau 1 nucleotid, kết
quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kích thước khác nhau. Nồng độ của
mỗi dideoxynucleotide được xác định thận trọng trong mỗi phản ứng để đảm
bảo sự gắn hỗn hợp các chuỗi đang tổng hợp tại mỗi vị trí có thể và khơng
gắn ở vị trí đầu tiên của nucleotide bổ trợ của khuôn [40]. Cuối cùng các sản
phẩm sau khuếch đại trên sẽ chuyển sang ống điện di mao quản để nhận biết.
Dye Terminators: Dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4
loại ddNTP nhờ vậy phản ứng giải trình tự được thực hiện chỉ trong 1 ống


12
nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện di trên một hàng. Đây là dye được
dùng phổ biến nhất cho các máy giải trình tự hiện nay như: ABI PRISM
3730xl, ABI 3500.

Hình 1.4. Chu trình sequencing sử dụng Dye Terminators [40]
Và trình tự chuỗi DNA thu được này sẽ được chuyển vào máy vi tính
để phân tích và so sánh với dữ liệu được lưu trong các ngân hàng dữ liệu gen.
* Phương pháp Pyrosequencing
Kỹ thuật pyrosequencing được dựa trên nguyên tắc "giải trình tự chuỗi
nucleotide bằng sự tổng hợp" (sequencing by synthesis).
Nguyên lý: Kỹ thuật này phù hợp để phân tích trình tự DNA kích
thước đến 200 bp, dựa vào việc đo các tín hiệu ánh sáng phát quang sinh học
(bioluminescence) được tạo ra bởi sự giải phóng pyrophosphate (PPi), trong

quá trình tổng hợp DNA theo một mẫu trình tự với sự tham gia của: 1.
deoxyribonucleotide triphosphate (dNTPs), 2. primer, 3. sử dụng 4 enzyme
đặc hiệu DNA polymerase I, ATP sulfurylase, luciferase, apyrase và các cơ
chất như adenosine 5’ phosphosulfate (APS), D-luciferin [63].
- Chu trình của Pyrosequencing [63]:
Bước 1: mỗi trình tự primer được bắt cặp vào sợi đơn của đoạn DNA
đích và được ủ với 4 enzyme đặc hiệu DNA polymerase, ATP sulfurylase,


13
luciferase, apyrase và các cơ chất như adenosine 5’ phosphosulfate (APS), Dluciferin.

Hình 1.5. Bước 1 chu trình của Pyrosequencing
Bước 2: một deoxribonucleotide triphosphate (dNTP) đầu tiên được
thêm vào phản ứng. DNA polymerase sẽ xúc tác sự kết hợp của các dNTP
vào sợi đơn của DNA khuôn. Nếu dNTP bổ sung với mạch khn thì một
pyrophosphate (PPi) được giải phóng.

Hình 1.6. Bước 2 chu trình của Pyrosequencing
Bước 3: ATP sulfurylase sẽ chuyển PPi thành ATP nhờ sự xúc tác của
adenosine 5' phosphosulfate (APS). ATP sẽ là cơ chất cho luciferase hoạt
động xúc tác cho phản ứng chuyển hóa luciferin thành oxyluciferin phát
thành ánh sáng và được ghi nhận bằng camera. Cường độ sáng tỉ lệ với số
lượng phân tử ATP được tạo thành.

Hình 1.7. Bước 3 chu trình của Pyrosequencing
Bước 4: Apyrase, một nucleotide-degrading enzyme, liên tục phân hủy
nucleotides và ATP khơng bổ sung. Sau đó nucleotide mới được thêm vào.

14

Hình 1.8. Bước 4 chu trình của Pyrosequencing
Bước 5: Các dNTPs được thêm vào tuần tự, quá trình cứ tiếp tục tạo ra
các sợi DNA bổ sung và được xác định bằng các peaks trong pyrogram.

Hình 1.9. Bước 5 chu trình của Pyrosequencing
Trong các kỹ thuật xét nghiệm tìm đột biến exon 2 của gen KRAS, kỹ
thuật giải trình tự được coi là tiêu chuẩn cơ bản vì kỹ thuật này cho biết trình
tự các nucleotid trên exon 2 của gen KRAS và có thể xác định được tất cả các
dạng đột biến, bao gồm cả các đột biến thay thế, chèn và xóa bỏ các
nucleotid.
1.3.2.2. Phương pháp PCR với alen đặc hiệu
- ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System Polymerase
Chain Reaction)) là sự kết hợp của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến
(ARMS) và công nghệ Scorpions trong phản ứng Real-time PCR để phát hiện
các đột biến gen. Kỹ thuật này cho phép phát hiện được bảy dạng đột biến
hay gặp nhất nằm ở codon 12, 13 trên exon 2 của gen KRAS: G12D, G12A,
G12V, G12S, G12R, G12C, và G13D.
- COLD-PCR (Co-amplification at lower denaturation temperature
based polymerasechain reaction) là đồng khuếch đại ở phản ứng chuỗi
polymerase dựa trên nhiệt độ biến tính thấp hơn là phương pháp khuếch đại
một bước giúp tăng cường cả alen thiểu số đã biết và chưa biết trong quá
trình PCR bất kể loại và vị trí đột biến.