xây dựng quy trình cải tiến kỹ thuật giải trình tự dna phù hợp việc tiến hành tự động và phân tích bằng phần mềm từ phương pháp sanger kinh điển

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hơn hai thập kỷ qua, nhân loại phải đương đầu với đại dịch HIV/AIDS
nguy hiểm, có tốc độ lây truyền cao, chưa có vắc xin phịng bệnh và chưa có
thuốc điều trị đặc hiệu. HIV/AIDS khơng chỉ là nguyên nhân cướp đi hàng
triệu sinh mạng người trên thế giới mà còn là hiểm họa tác động nghiêm trọng
đến mọi khía cạnh của đời sống xã hội, làm ảnh hưởng tới kinh tế, văn hóa, xã
hội và nịi giống của mỗi quốc gia.
Đại dịch HIV/AIDS đang tiếp tục lan rộng trên toàn cầu với tốc độ
13.000 ca nhiễm mới mỗi ngày. Theo báo cáo của Tổ chức phòng chống
AIDS của Liên Hợp Quốc (UNAIDS) và của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO),
trên tồn thế giới có khoảng 40,3 (36,7- 45,3) triệu người đang sống với
HIV/AIDS và khoảng 25 triệu bệnh nhân đã tử vong (UNAIDS/WHO, 2010).
Như vậy, kể từ khi bắt đầu đại dịch đến nay, trên thế giới đã có tới gần 65
triệu người nhiễm HIV. Trong năm 2008, đã có 2,7 (2,4- 3,0) triệu trường hợp
nhiễm mới và 2,0 (1,7-2,4) triệu bệnh nhân AIDS đã chết (UNAIDS/WHO,
2009), điều đó cũng có nghĩa là cứ mỗi phút có 5,1 trường hợp nhiễm mới và
3,8 trường hợp chết vì AIDS hoặc cứ 6-7 giây có một trường hợp nhiễm mới
và cứ 14-16 giây có một người chết vì AIDS trên thế giới.
Đông Nam Á và Đông Âu là những khu vực có tốc độ lây nhiễm HIV
cao thơng qua con đường tiêm chích ma túy. Việt Nam hiện đang được xếp vào
danh sách các nước có tỷ lệ nhiễm HIV cao trên thế giới cũng như trong khu
vực. Theo Bộ Y tế, Việt Nam đang là nước có số lượng người nhiễm HIV cao
thứ 6 ở Châu Á. Ở Việt Nam hiện nay cứ 15 phút lại có một người bị nhiễm
HIV. Số lượng người nhiễm HIV/AIDS gia tăng kéo theo nhu cầu chăm sóc và
hỗ trợ ngày càng tăng. Theo đánh giá mới đây của Tổ chức Y tế thế giới,


2

HIV/AIDS đang được xếp hàng thứ 3 trong các nguyên nhân gây tử vong
(chiếm 7,5%) ở các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam (Bao, 2009).
Sự đa dạng của các chủng HIV là một con số khó thống kê vì HIV có
khả năng biến đổi rất lớn và tùy thuộc vào các vùng địa lý khác nhau. Quá
trình xâm nhiễm của HIV vào cơ thể vật chủ diễn ra khá phức tạp do HIV tấn
công trực tiếp vào hệ thống miễn dịch của cơ thể. Hiện nay, việc sử dụng
vaccine phịng lây nhiễm HIV rất khó khăn vì các vaccine phòng chống HIV
vẫn trong giai đoạn nghiên cứu hoặc ứng dụng thử nghiệm và giá thành rất
cao. Vì vậy kiểm sốt và ngăn chặn q trình lây nhiễm HIV chủ yếu dựa vào
việc phát hiện nguồn bệnh lây lan trong giai đoạn sớm. Chẩn đoán sự lây
nhiễm HIV là mối quan tâm toàn cầu. Nắm bắt được cơ chế lây nhiễm của
HIV và quá trình đáp ứng miễn dịch theo từng giai đoạn của cơ thể đối với
việc tấn công của HIV là điều rất quan trọng để ứng dụng trong nghiên cứu
chẩn đoán. Các phương pháp chẩn đốn HIV ngày càng phát triển, địi hỏi sự
chuẩn xác và độ nhạy cao để có thể phát hiện sớm HIV ngay sau khi HIV
xâm nhiễm vào cơ thể người. Vì vậy, chuyên đề này nhằm "Xây dựng quy
trình cải tiến kỹ thuật giải trình tự DNA phù hợp việc tiến hành tự động và
phân tích bằng phần mềm từ phương pháp Sanger kinh điển"


3

1. HIV VÀ HỆ MIỄN DỊCH
1.1. Các loại tế bào bị nhiễm bởi HIV.
HIV có khả năng xâm nhập vào nhiều loại tế bào như tế bào máu, tế
bào não, tế bào da... nhưng chủ yếu tấn công vào tế bào TCD4 và đại thực bào
(Alimonti JB, Ball TB, Fowke KR, 2003). Các loại tế bào chính bị nhiễm
HIV được chỉ ra trong hình 1.

Hình 1: Các tế bào bị nhiễm HIV
Những tế bào bị nhiễm HIV có thể chết thậm chí là sớm hơn những gì
mà người ta nghĩ cho đến nay. Nếu các tế bào nhiễm có chu kỳ sống ngắn hơn
thì điều này làm tăng các khả năng trốn thoát của virus khỏi sự kiểm soát của
hệ thống miễn dịch (Christian L. Althaus et al 2009).
1.2. Các giai đoạn và dấu hiệu của người nhiễm HIV
Nhiễm trùng khởi phát Chuyển đổi huyết thanh Nhiễm trùng tiềm tàng

Nhiễm trùng cấp


4

1.2.1. Giai đoạn nhiễm trùng khởi phát (Primary infection)
Đây là giai đoạn đầu tiên, khi virus bắt đầu thâm nhập vào cơ thể
( Sau đó từ hai đến bốn tuần trên 87%
người nhiễm HIV trải qua những dấu hiệu giống cúm trong vài ngày, đó cũng
là biểu hiện của hệ miễn dịch cơ thể bắt đầu chiến đấu với sự lây nhiễm mới
của HIV. Những dấu hiệu bệnh bao gồm: sốt, ớn lạnh, đau đầu, đổ mồ hôi...
(Bradley Hare, 2004). Thông thường từ 6-12 tuần hệ miễn dịch bắt đầu sản
xuất kháng thể để chống lại virus. Nghĩa là trong máu của một người mới
nhiễm HIV sẽ khơng thể có kháng thể kháng HIV trong vài tuần đầu tiên.
Người nhiễm mới thì khả năng lây nhiễm trong giai đoạn này rất cao bởi vì số
lượng lớn của HIV trong dịch của cơ quan sinh dục (NIAID, 2003). Ở giai
đoạn này kháng nguyên p24 xuất hiện.
1.2.2. Giai đoạn chuyển đổi huyết thanh
Giai đoạn chuyển đổi huyết thanh được miêu tả là thời gian khi cơ thể
bắt đầu sản xuất kháng thể kháng lại virus. Đây cũng là giai đoạn khó chẩn
đốn nhất vì lượng kháng nguyên p24 giảm dần thay thế là sự xuất hiện của
kháng thể kháng p24 nhưng còn quá ít. Hầu hết mọi người phát triển kháng

thể trong vịng 3 tháng. Một vài người có thể trên 6 tháng mới phát triển
kháng thể kháng HIV( />1.2.3. Thời kỳ nhiễm trùng tiềm tàng (clinical latency)
Đây là thời kỳ khơng có dấu hiệu của bệnh hay cịn gọi là khơng triệu
chứng. Phải mất bao lâu để một người bị nhiễm HIV mới phát triển những
dấu hiệu của bệnh? Đây là câu hỏi khơng có câu trả lời bởi vì nó có thể kéo
dài từ 3 tháng đến 10 năm thậm chí có thể kéo dài lâu hơn nữa tuỳ thuộc sức
khỏe và chức năng của hệ miễn dịch cơ thể. Mặc dù khơng có dấu hiệu của
bệnh nhưng virus vẫn tiếp tục nhân lên và tấn công những tế bào của hệ miễn


5

dịch (NIAID, 2003). Ở giai đoạn này nồng độ IgM anti-HIV giảm dần để
thay thế bằng sự hình thành IgG anti-HIV. Ngồi ra, trong giai đoạn này ta có
thể tìm thấy kháng nguyên gp120 trong máu người bệnh.
Mức độ HIV trong cơ thể ngưòi nhiễm HIV tương quan với sự suy
giảm của tế bào CD4(sự suy giảm của hệ miễn dịch). Mức độ HIV càng tăng,
số lượng tế bào CD4 càng giảm thì càng nhanh tiến đến giai đoạn AISD và
chết (NIAID, 2003)
Khi hệ miễn dịch bị phá hủy một số người sẽ bắt đầu xuất hiện một số
những dấu hiệu nhẹ, khơng đặc hiệu đối với q trình nhiễm HIV, bao gồm:
- Nổi hạch trong vòng hơn 3 tháng
- Mệt mỏi
- Giảm cân
- Thường xuyên sốt và đổ mồ hôi
- Liên tục nhiễm nấm (miệng và âm đạo)
- Liên tục phát ban và bong da
- Khung chậu dễ bị viêm và không đáp ứng với thuốc điều trị
- Mất trí nhớ trong thời gian ngắn
- Thường xun hoặc đơi khi nhiễm herpes ở miệng, bộ phận sinh dục

hoặc đau hậu môn.
- Bệnh zona
1.2.4. Giai đoạn nhiễm trùng cấp (Acute infection)
Giai đoạn này có sự xuất hiện của hội chứng AIDS. Thời kỳ đầu có
biểu hiện suy giảm miễn dịch do sự giảm sút tế bào TCD4 cũng như sự rối
loạn miễn dịch của tế bào lympho B và đại thực bào nên lâm sàng có hạch


6

sưng ở nhiều nơi kéo dài 2-4 tháng nhưng điều trị viêm khơng tác dụng. Sau
đó, hệ miễn dịch suy giảm trầm trọng, hội chứng AIDS xuất hiện toàn diện,
người bệnh suy mòn và dẫn đến tử vong. Trong huyết thanh bệnh nhân thấy
sự xuất hiện trở lại của kháng nguyên p24 và có thể thấy sự xuất hiện của
kháng nguyên gp41, kháng thể kháng gp41, kháng thể kháng gp120.

Hình 2: Sự thay đổi số lượng TCD4+ và biểu hiện lâm sàng
trên bệnh nhân nhiễm HIV chưa điều trị
1.3. Suy giảm miễn dịch do HIV
Khi HIV xâm nhập vào cơ thể, nó khơng chỉ làm giảm về số lượng mà
cịn làm suy giảm chức năng của các tế bào miễn dịch đặc biệt là tế bào
lympho T, lympho B và đại thực bào. Tuy nhiên, do HIV có ái tính đặc biệt
với phân tử CD4 nằm trên bề mặt của tế bào lympho T (tế bào đóng vai trị
nhạc trưởng quan trọng chỉ huy và điều hịa q trình đáp ứng miễn dịch) làm


7

ly giải hoặc bất hoạt chức năng của tế bào này dẫn đến suy giảm tất cả các
loại đáp ứng miễn dịch.

Cơ chế giảm tế bào TCD4 do tác động trực tiếp của HIV (Bộ Y tế, 2004):
-

Tế bào TCD4 bị phá hủy do HIV xâm nhập và nhân lên

làm tăng tính thấm màng tế bào, gây ứ đọng calci và nước.
-

Khi virus nhân lên sẽ giải phóng một lượng lớn cDNA,

RNA tự do trong bào tương tế bào, gây độc cho tế bào.
-

Dưới tác động của HIV làm tế bào TCD4 chết theo

chương trình nhanh hơn bình thường.
-

Các phân tử CD4 mới hình thành trong bào tương chưa

hiện diện trên bề mặt tế bào đã bị liên kết với gp120 và sản phẩm
gp120-CD4 trong bào tương sẽ làm chết tế bào.
Cơ chế suy yếu của tế bào TCD4 dưới tác động gián tiếp bởi HIV.
-

HIV phong bế quá trình chín của TCD4 chưa bị nhiễm

thơng qua
cytokine của tế bào bị nhiễm.
-

Do KN gp120 trên bề mặt tế bào TCD4 đã bị nhiễm lại

tiếp tục gắn với CD4 của TCD4 chưa bị nhiễm tạo thành hợp bào là tế
bào khổng lồ nhiều nhân có đời sống ngắn khơng q 48 giờ.
-

Do cơ chế tự miễn, gp120 của virus bong ra từ tế bào

TCD4 đã bị nhiễm HIV lại gắn với phân tử CD4 của tế bào chưa bị
nhiễm nên trong máu xuất hiện KT kháng gp120 của virus làm huỷ
hoại tế bào T có cấu trúc bề mặt tương tự gp120 theo cơ chế gây độc tế
bào (ADCC) hoặc theo cơ chế kết hợp bổ thể.
-

Do HIV phá hủy cả tế bào nguồn, tế bào non để biệt hoá

thành tế bào lympho.


8

Do TCD4 giảm cả về số lượng và chất lượng, các cytokine của TCD4
bị thiếu hụt làm giảm khả năng hỗ trợ hoạt hoá với các tế bào lympho B, đại
thực bào và tế bào lympho T khác dẫn dến hệ thống miễn dịch của cơ thể suy
giảm về cả miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào.
1.4. Chẩn đốn sinh học có suy giảm miễn dịch và có rối loạn miễn dịch
- Dấu hiệu tin cậy và trực tiếp nhất là giảm TCD4+ (bình thường 4501280/ mm3) và giảm số lượng TCD8+ (bình thường 258- 800/mm3).
- Dấu hiệu tin cậy gián tiếp là tỷ lệ TCD4+/ T CD8+ giảm (bình
thường: 1,4- 2,2).

- Qui định : Nếu T CD4+ < 400/mm 3 là tiên lượng xấu, chứng tỏ đã suy
giảm miễn dịch đáng kể. Nếu T CD4+ < 200 /mm 3 là suy giảm miễn dịch
nghiêm trọng, giảm lympho B, bình thường 25- 280/mm3.
- Theo dõi kháng nguyên p24:
+ Vừa có giá trị phát hiện sớm bệnh 50-70% (+) ở giai đoạn sơ nhiễm.
+ Khi có hội chứng AIDS đầy đủ 50-70% (+) trở lại.
+ Bệnh tiến triển trầm lặng thì kháng nguyên p24 giảm dần theo thời gian.
- Dấu hiệu gián tiếp suy giảm miễn dịch (Bùi Đại et al, 2000, Nguyễn
Triệu Vân et al, 1999).
2. Chẩn đoán phát hiện HIV
Chẩn đốn sự nhiễm HIV thơng thường phát hiện một cách gián tiếp
thông qua kháng thể đặc hiệu kháng virus (Gurtler 1996). Đây là dấu hiệu của
đáp ứng miễn dịch dịch thể, chống lại những tác nhân được tìm thấy gần như
100% những người nhiễm HIV.
Chẩn đốn trực tiếp sự lây nhiễm HIV cũng có thể tiến hành nhờ việc
xác định virus truyền nhiễm (sử dụng nuôi cấy tế bào chỉ có thể thực hiện
trong phịng thí nghiệm an toàn sinh học cấp 3), kháng nguyên virus (ELISA


9

phát hiên kháng nguyên p24) hoặc axit nucleic của virus (tức là bộ gen của
virus; NAT = phát hiện axit nucleic). Để xác định tình trạng nhiễm trùng của
bệnh nhân, phát hiện virus trực tiếp chỉ cần thiết trong những trường hợp nhất
định, chẳng hạn như nhiễm trùng nguyên phát hoặc nhiễm trùng theo đường
từ mẹ sang con (mô tả chi tiết ở dưới). Bên cạnh xét nghiệm định tính ( trả lời
câu hỏi "có hoặc khơng có"), xét nghiệm đính lượng để phát hiện số lượng
virus đã trở nên rất quan trọng: Nồng độ của virus trong huyết thanh, được gọi
là "lượng virus", đã trở thành một công cụ không thể thiếu cho việc định
hướng liệu pháp kháng retrovirus (Berger 2001). Thuật ngữ "xét nghiệm

HIV" (vẫn thường được hiểu khơng chính xác là "xét nghiệm AIDS”), tuy
nhiên hầu như thuật ngữ này luôn luôn đề cập đến việc phát hiện kháng thể
đặc hiệu kháng HIV, dấu ấn của nhiễm trùng HIV.
* Tiêu chuẩn đánh giá
Để đánh giá chất lượng của bộ kit, người ta căn cứ vào hai tiêu chuẩn
quan trọng nhất là độ nhạy và độ đặc hiệu của chúng.
+ Độ nhạy
-

Độ nhạy = số trường hợp dương tính thật/ số trường hợp dương tính
thật + số trường hợp âm tính giả.
PA

- Độ nhạy (SE %) =

X 100

N+

PA: Tổng số mẫu cho kết quả dương tính thật
ND: Số mẫu cho kết quả âm tính giả
N+: ND + PA
+ Độ đặc hiệu
-

Độ đặc hiệu = số trường hợp âm tính thật/ số trường hợp âm tính thật +
số trường hợp dương tính giả.
NA
N-

10

Độ đặc hiệu (SP %): SP =

X 100%

NA: Tổng số mẫu cho kết quả âm thật
PD: Số mẫu cho kết quả dương tính giả
N-: NA + PD
2.1. Những vấn đề về chẩn đoán trong giai đoạn cửa sổ
Sau khi nhiễm HIV phải mất vài tuần trước khi kháng thể được phát
hiện. Hiện tượng này gọi là chẩn đoán cửa sổ và được xác định bởi giai đoạn
cơ thể đòi hỏi sản phẩm phát hiện mức độ của kháng thể (Busch 1997). Sự
chuyển đổi kháng thể từ âm tính sang dương tính gọi là q trình chuyển đổi
huyết thanh. Những xét nghiệm sàng lọc gần đây được sử dụng trong chẩn
đoán đã được ghi nhận có thể phát hiện được HIV sau sáu tuần của giai đoạn
tiền lây nhiễm vào khoảng 80% và sau tuần thứ 12 là 100%; duy nhất vài
trường hợp chỉ phát hiện được sau 6 tháng.
Kỹ thuật sàng lọc thế hệ thứ 4 đã cố gắng để rút ngắn thời gian của q
trình chẩn đốn giai đoạn cửa sổ bằng cách phát hiện đồng thời kháng thể HIV
và kháng nguyên p24 (Gurtler 1998, Ly 2001). Mặc dù các kỹ thuật phát hiện
thế hệ thứ 4 này có thể phát hiện sớm hơn ở giai đoạn tiền nhiễm, nhưng ở giai
đoạn cửa sổ lại phát hiện muộn hơn do nhiều lý do về mặt kỹ thuật. Thậm chí
trong giai đoạn này có thể lại khơng thể phát hiện được (Meier 2001).
Trong giai đoạn sớm của quá trình chuyển đổi huyết thanh, những kỹ
thuật kiểm tra sàng lọc bằng kháng thể sẽ cho phản ứng rất yếu. Sử dụng kỹ
thuật Western blot để khẳng định trong giai đoạn này sẽ không xuất hiện một
băng nào hoặc xuất hiện không đầy đủ, thường thì băng p24 xuất hiện đầu
tiên và có thể nhìn thấy. Trong những trường hợp như vậy thường rất khó

phân biệt với những nguời khơng bị lây nhiễm nhưng vẫn xảy ra phản ứng
không đặc hiệu. Đây cũng là một thông tin hết sức quan trọng cho các phòng
xét nghiệm thấy hết tầm quan trọng thế nào trong quá trình tiến hành kiểm tra.


11

Trong những trường hợp như vậy sẽ kiểm tra lại trong vòng một thời
gian ngắn. Nếu thực sự lây nhiễm HIV và đang ở trong giai đoạn chuyển đổi
huyết thanh thì lượng kháng thể sẽ được tăng đáng kể trong vài ngày sau, và
trong vịng vài tuần thì sẽ thấy sự xuất hiện đầy đủ của các băng thông qua
phản ứng western-blot. Nó phụ thuộc It depends on the individual
circumstances whether direct virus detection e.g. by means of PCR is
advisable at the outset. Note: antiretroviral post-exposure prophylaxis may
make direct virus detection more

difficult and potentially delay

seroconversion.
2.2. Các kỹ thuật phát hiện HIV trong cơ thể
2.2.1. Phát hiện trực tiếp sự có mặt của HIV
Các phương pháp phát hiện trực tiếp sự có mặt của HIV có thể là phát
hiện bản thân virus ở dạng hoàn chỉnh, RNA/cDNA virus hoặc phát hiện
những KN đặc trưng của virus (Bộ Y tế, 2005c).
2.2.1.1. Phân lập virus hồn chỉnh
Bệnh phẩm có thể là: máu, dịch não tuỷ, dịch sinh dục, sữa mẹ, mảnh
cắt tổ chức nhưng phổ biến nhất là sử dụng bạch cầu đơn nhân trong máu
ngoại vi.
Sau khi phân lập, bạch cầu đơn nhân của người bệnh được nuôi cấy
trong môi trường nhân tạo có thêm những bạch cầu của người lành (có CD4)

để virus thâm nhiễm, nhân lên đạt đủ mật độ để phát hiện ra bằng các kỹ thuật
riêng như tìm KN hay enzyme đặc trưng của virus.
Đây là một kỹ thuật có giá trị nhưng cho kết quả chậm sau khoảng 15
ngày nuôi cấy, trang bị hiện đại tốn kém nên chỉ sử dụng trong nghiên cứu,
xác định chủng virus được phân lập, đánh giá tính kháng lại thuốc chống
Retrovirus của HIV, chẩn đoán HIV ở trẻ sơ sinh và ở những bệnh nhân có
biểu hiện lâm sàng bất thường. Độ nhạy của xét nghiệm chẩn đoán HIV ở trẻ


12

sơ sinh khi mới sinh khoảng 43% và khi trẻ trên 3 tháng có thể đạt 90-95%
(Đỗ Trung Phấn, 1999).
2.2.1.2. Phát hiện virus bằng kính hiển vi điện tử kết hợp với phương pháp
miễn dịch
Kỹ thuật:
-

Bệnh phẩm cần phát hiện virus (KN) được ủ với KT đặc

hiệu kháng HIV (IgG anti-HIV).
-

Sau đó, ủ tiếp với KT đơn dịng của chuột chống IgG

người có gắn vàng Au (ký hiệu là α-IgG-Au).
Kết quả: Nếu phản ứng dương tính, ta có phức hợp KN-IgG-α-IgG-Au
và khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử sẽ nhìn rõ các hạt vàng và nơi HIV
khư trú.
Giá trị: Phát hiện được vị trí khư trú của HIV nhưng đòi hỏi trang thiết

bị hiện đại đắt tiền.
2.2.2. Phát hiện KN của HIV
Kháng nguyên HIV, đặc biệt kháng nguyên vỏ nhân p24 có trong huyết
thanh, huyết tương, dịch não tuỷ có thể được phát hiện bằng phương pháp
ELISA tóm bắt kháng nguyên (Capture ELISA) hoặc bằng kỹ thuật RIA.
Nguyên lý chung của các kỹ thuật này là dùng kháng thể đa dòng
(polyclonal antibody) kháng HIV cố định trong các giếng nhựa hoặc trên các
viên bi polystyrene tiếp xúc với bệnh phẩm cần thử, sau đó, ủ tiếp phức hợp
này với kháng thể kháng HIV có gắn enzym hoặc chất phóng xạ. Enzym sẽ
làm biến đổi màu cơ chất. Khi đo màu cơ chất hoặc đo hoạt tính phóng xạ có
thể định tính và định lượng kháng ngun.


13

Về lý thuyết người ta có thể phát hiện tất cả các kháng nguyên của
virus nhưng trên thực tế, do tính đặc hiệu và ái lực của các kháng thể chủ yếu
hướng tới các protein chính trong vỏ nhân (nucleocapsid) như p24. Vì vậy,
kỹ thuật này thường sử dụng để phát hiện kháng nguyên p24. Dấu hiệu mất
kháng nguyên p24 ở những người đã có phản ứng huyết thanh học HIV
dương tính là dấu hiệu nói lên sự khởi đầu của AIDS lâm sàng (NXB Y học,
1995). Đây là xét nghiệm có độ đặc hiệu cao (98-99%) nhưng độ nhạy chỉ đạt
10-25%

ở

trẻ

sơ

sinh

và

50%

ở

trẻ

lớn

hơn

(http://www.

Dostquangtri.gov.vn).
2.2.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử trong xét nghiệm HIV
Các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng được áp dụng rộng rãi trong
công tác xét nghiệm, theo dõi điều trị và nghiên cứu sinh học di truyền của
virus và là công cụ hữu hiệu trong chẩn đoán sớm nhiễm HIV, theo dõi tiến
triển bệnh, chỉ định và theo dõi hiệu quả điều trị thuốc, nghiên cứu tính kháng
thuốc.
2.2.3.1. Các kỹ thuật định tính
* Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật tổng hợp DNA
nhờ enzym Polymerase do nhà bác học người Mỹ có tên là Kary Mulis phát
minh năm 1983. Kỹ thuật PCR đã đem lại một cuộc cách mạng trong di
truyền học phân tử. Nhờ kỹ thuật PCR mà một đoạn DNA ở một vùng bất kỳ
trong bộ gen được khuếch đại lên rất nhiều bản sao khi trình tự nucleotid ở

hai đầu đoạn đó đã biết. Khi phân lập được từng gen riêng biệt chúng ta có
thể tạo dịng gen hay gây các đột biến và làm thay đổi các gen này; đồng thời
chúng ta có thể ứng dụng các kỹ thuật để chẩn đoán các dạng đột biến gen
hay để xác định các dạng đột biến.


14

Dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính và nguyên lý tổng hợp DNA
nhờ hoạt tính của các DNA polymerase. Với nguyên liệu là bốn loại
nucleotid, enzym DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp một mạch DNA mới
từ DNA khn. Phản ứng này địi hỏi sự có mặt của những mồi xi và mồi
ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khn. Phản ứng
PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm
ba giai đoạn:
- Giai đoạn 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Chuỗi xoắn kép
DNA khn bị biến tính, tách dời nhau thành 2 chuỗi đơn, phân tử DNA được
biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, nhiệt độ
này thường là khoảng 940C – 950 C trong vòng 30 giây.
- Giai đoạn 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing) nhiệt độ được hạ xuống về
nhiệt độ gắn mồi cho phép các đoạn oligonucleotid gắn với sợi DNA khn.
Trong q trình này, enzym DNA polymerase bền với nhiệt sẽ được hoạt hóa
và bắt đầu giai đoạn kéo dài mồi.
- Giai đoạn 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extention ). Nhiệt độ
được nâng lên đến nhiệt độ tối ưu của enzym xúc tác cho quá trình kéo dài
mồi. Ở chu kỳ đầu, mỗi sợi DNA khuôn đơn sẽ tạo ra một chuỗi đơi mới
(hình 1). Số lượng vùng gen đích được sao chép tăng lên gấp đơi. Như vậy,
theo tính tốn nếu hiệu suất của phản ứng là 100% thì chỉ cần sau 20 chu kỳ
có thể thu được một triệu bản sao chép vùng gen đích. Tuy nhiên, thường
phản ứng PCR khơng thể đạt hiệu suất lý thuyết (100%) do nhiều yếu tố tác

động. Do vậy, số lượng bản sao chép thu được thường vào khoảng trên 105.
Phản ứng PCR liên quan đến quá trình tổng hợp DNA trong đó 2 đoạn
olygonucleotid mồi quyết định vị trí khởi đầu cho q trình sao chép của
enzym polymerase và do đó nó quyết định vùng gen nào của DNA khuôn sẽ


15

được sao chép. Các mồi này liên kết bổ sung với vùng gen đích của DNA
khn và đầu 3, (OH) hướng về phía đoạn mồi khác. DNA polymerase cần có
các đoạn mồi olygonucleotid cho hoạt động xúc tác. Quá trình kéo dài mồi
với sự có mặt của 4 loại deoxynucleotid đã được hoạt hóa (dATP,dGTP,dCTP
và dTTP) và dung dịch đệm đặc hiệu cho phép vùng DNA nằm giữa hai vị trí
bám của mồi được nhân lên trong mỗi chu kỳ phản ứng.
Sau mỗi chu kỳ như vậy, các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục
được dùng làm DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp
theo. Sản phầm cuối cùng của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi có chiều dài
bằng khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm
được xác định bởi đầu tận cùng 5’của hai đoạn gen mồi.
Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn
DNA ban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ tùy theo mục đích sử dụng.
Cuối cùng, sản phẩm của phản ứng được làm lạnh về nhiệt độ phịng
hoặc 40C.
PCR thường ít được sử dụng hơn so với chẩn đoán huyết thanh học và
chỉ được sử dụng trong một số trường hợp nghi là mới nhiễm HIV còn đang
trong giai đoạn cửa sổ và chưa thể phát hiện được kháng thể bằng phương
pháp huyết thanh học (CDC, 2001).
* Các kỹ thuật định lượng
Định lượng virus, RNA huyết tương hoặc DNA provirus là thông số
quan trọng để theo dõi mức độ xâm nhập và nhân lên của HIV, chỉ định điều

trị và theo dõi, đánh giá kết quả điều trị.
+ Kỹ thuật AMPLICOR
Kỹ thuật dùng để định lượng RNA HIV trong huyết tương. Nhờ
enzyme RT (Revese Transcriptase), sao chép ngược RNA thành cDNA. Sản
phẩm PCR sẽ được lai ghép với các mẫu dò đặc hiệu với DNA đích đã được


16

cố định trên giá đỡ và được phát hiện với mẫu có gắn các tín hiệu cho phép
đọc được bằng phương pháp so màu.
+ Kỹ thuật Real time PCR
Đây là phương pháp cho phép khuếch đại và xác định số lượng các
chuỗi DNA được tạo ra trong từng chu kỳ nhiệt. Sau mỗi chu kỳ nhiệt, số
lượng các bản sao DNA được tổng hợp tăng lên sẽ cho các tín hiệu phát
quang tăng tỷ lệ thuận. Dựa vào một gam mẫu chuẩn có số lượng DNA đích
xác định tiến hành đồng thời cùng mẫu thử để xây dựng một đường chuẩn dựa
trên số liệu bản sao DNA đích và giá trị Ct của từng mẫu tương ứng (Ct là
thời điểm ở chu kỳ n của PCR cho tín hiệu huỳnh quang tăng vọt so với tín
hiệu nền). Nếu số lượng DNA bản đích càng lớn thì Ct càng nhỏ. Có nhiều
phương pháp sử dụng phép phát quang để xác định số lượng bản sao DNA
được nhân lên.
Các phương pháp PCR thơng thường chỉ đánh giá định tính mà khơng
đánh giá định lượng virus. Phương pháp real-time PCR thực hiện nhanh, phù
hợp, không đắt, và định lượng được sản phẩm DNA và RNA. Real-time PCR
hoặc PCR sao chép ngược (reverse transcriptase-PCR, RT-PCR) có thể phát
hiện mức độ nhân lên của DNA dựa trên mức độ chất chỉ thị mầu được giải
phóng sau khi sản phẩm DNA được khuếch đại. Phương pháp này có thể phát
hiện được 10.000 chuỗi gen sao chép/phản ứng (khoảng 100 tế bào bị nhiễm).
Real time PCR là kỹ thuật PCR mà sản phẩm khuếch đại được hiển thị

ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Chìa khóa chính của kỹ thuật là hóa
chất, thuốc thử có trong type phản ứng có gắn chất huỳnh quang. Ngày nay,
kỹ thuật này ngày càng được ứng dụng rộng rãi và hiệu quả. Có thể nói đây là
kỹ thuật phát hiện " khơng đồng nhất", vì trong kỹ thuật này, một hỗn hợp của


17

sản phẩm PCR được phát hiện, chứ không phải từng thành phần của sản phẩm
được phát hiện như trong kỹ thuật điện di. Quá trình phản ứng đơn giản nhất
là bổ sung ethidium bromid vào hỗn hợp phản ứng. Khi ethidium bromid xen
vào cấu trúc chuỗi đơi DNA, tín hiệu huỳnh quang sẽ được tạo ra, mức độ tín
hiệu phụ thuộc vào lượng DNA chuỗi đôi được tạo ra trong quá trình phản ứng.
Với hướng tiếp cận như vậy, cho đến nay đã có nhiều cải tiến trong các
kỹ thuật phát hiện DNA chuỗi đơi. Các kỹ thuật đó là:
- Real time PCR sử dụng SYBR Green I
- Real time PCR sử dụng đầu dò đặc hiệu (probe).
Với phản ứng real time PCR, kết quả khuyếch đại DNA đích sẽ được
hiển thị ngay sau sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng thông qua biểu đồ
khuyếch đại của phản ứng. Quan sát biểu đồ này ta thấy trục tung (Y) biểu thị
cường độ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích
thích. Trục hồnh (X) là các chu kỳ nhiệt.

Hình 3. Biểu đồ real time PCR định lượng HIV trong huyết thanh
Khi đánh giá hai phương pháp PCR cổ điển và real-time PCR người ta
nhận thấy Real time PCR có nhiều ưu điểm hơn so với PCR cổ điển:


18

- Real-time PCR kiểm sốt lượng huỳnh quang giải phóng ra trong phản
ứng, do vậy ta có thể biết được lượng sản phẩm PCR tại từng thời điểm (chu
kỳ) của phản ứng của quá trình khuếch đại. Trái ngược với PCR cổ điển, chỉ
cho ta biết được lượng sản phẩm khuếch đại tại thời điểm cuối cùng của phản
ứng bằng cách điện di trên gel sau khi phản ứng kết thúc. Mặt khác, gel
agarose có hạn chế là độ phân giải thấp, kỹ thuật điện di của người làm thí
nghiệm... do vậy kết quả thường khơng chính xác.
- Real-time PCR có độ đặc hiệu cao hơn rất nhiều so với PCR cổ điển do
dụng các mẫu dò đặc hiệu để phát hiện sản phẩm khuếch đại .Trong khi đó
PCR cổ điển chỉ phân biệt sản phẩm khuếch đại dựa vào kích thước của các
băng sản phẩm trên gel. Trong khi đó khi tiến hành phản ứng PCR, có nhiều
trường hợp sản phẩm PCR khơng đặc hiệu cũng có kích thước của sản phẩm
bằng kích thước sản phẩm PCR mong muốn nên dễ nhầm lẫn.
- Ở phản ứng Real-time PCR sau khi kết thúc phản ứng chúng ta không
cần phải làm các thao tác như điện di... giúp tiết kiệm thời gian và hóa chất.
- Với phản ứng real-time PCR chỉ mất 1-2 giờ trong khi PCR cổ điển
mất 3-5 giờ.
- Đặc biệt, phản ứng real -time PCR là một hệ thống kín nên ít có nguy cơ tạp
nhiễm.
2.2.4. Phát hiện gián tiếp sự có mặt của HIV (Chẩn đốn kháng thể
kháng HIV)
Kiểm tra kháng thể đối với HIV cần ít nhất hai kỹ thuật:
1. Kỹ thuật sàng lọc
2. Ít nhất một kỹ thuật để khẳng định.
Để loại trừ việc vô ý làm lẫn mẫu xét nghiệm, người ta thường xét
nghiệm thêm một mẫu máu thứ hai của cùng một bệnh nhân. Chỉ khi đó, kết


19

quả chẩn đốn HIV mới có thể cho thơng báo cho bệnh nhân. Hầu hết các kỹ
trhuật kiểm tra sàng lọc đều dựa trên nguyên lý của phản ứng ELISA
(enzyme linked immune sorbent assay) hoặc các xét nghiệm tương tự
(UNAIDS, 1997b). Xét nghiệm sàng lọc phải có độ nhạy rất cao để giảm
thiểu nguy cơ cho kết quả âm tính giả. Điều này có nghĩa rằng các xét
nghiệm này phải có thể phát hiện sự sự có mặt của kháng thể kháng HIV ở
nồng độ rất thấp, ví dụ trong giai đoạn đầu của quá trình nhiễm trùng nguyên
phát. Nếu kết quả của một xét nghiệm sàng lọc là dương tính, kết quả này
phải được khẳng định bởi (ít nhất) một xét nghiệm khẳng định khác. Không
bao giờ được chẩn đốn sự nhiễm HIV dựa trên kết quả dương tính của duy
nhất một kỹ thuật sàng lọc.
Các kỹ thuật phát hiện gián tiếp sự có mặt của HIV thơng qua các thành
phần đặc hiệu kháng lại các thành phần cấu trúc của virus (Phạm Nhật An và
Cs, 1995).
* Kỹ thuật ngưng kết (agglutination)
Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý ngưng kết thụ động, những hạt như
gelatin (SERODIA test), latex hoặc hồng cầu người làm giá đỡ cho các
protein virus. Khi cho tiếp xúc với KT kháng HIV, các hạt này tạo thành một
mạng lưới ngưng kết có thể nhận định bằng mắt thường.
Đây là kỹ thuật đơn giản, nhanh, không địi hỏi trang bị cao có thể tiến
hành hàng loạt nên có ý nghĩa điều tra dịch tễ, sàng lọc máu tuy nhiên có phản
ứng dương tính giả.
* Kỹ thuật miễn dịch enzyme pha rắn ELISA
ELISA là phương pháp cho phép phát hiện hầu hết các mẫu xét nghiệm
có KT kháng HIV. Tuy nhiên, đây là phương pháp có độ nhạy cao, do đó có
thể cho những kết quả dương tính giả. Để hạn chế nguy cơ này, cần phải có
phương pháp kết hợp để khẳng định chẩn đốn của ELISA. Western Blot


20

(WB) là phương pháp hỗ trợ phổ biến nhất để khẳng định kết quả dương tính
của ELISA, IFA cũng được dùng như một phương pháp thay thế cho WB.
ELISA được ứng dụng để phát hiện các KT IgG anti-HIV, IgA antiHIV hoặc IgM anti-HIV bằng 3 kỹ thuật sau:
+ Kỹ thuật ELISA gián tiếp
KT kháng HIV trong máu bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với KN HIV đã
được cố định sẵn trên giá đỡ (ở các giếng phản ứng trên hạt nhựa). Phức hợp
KN-KT được nhận biết bởi một cộng hợp là KT kháng Ig người có gắn
enzyme và sẽ cho phản ứng hiện màu với một cơ chất thích hợp. Giá trị mật
độ quang của phản ứng màu tỷ lệ thuận với lượng KT kháng HIV hiện diện
trong mẫu thử.
Đây là xét nghiệm có độ nhạy cao nhưng độ đặc hiệu khơng cao do
thường bị dương tính giả.
+ Kỹ thuật ELISA Sandwich
KT kháng HIV được cố định trong giếng để tóm bắt các KN virus trong
mẫu thử và được phát hiện bởi kháng thể 2 gắn enzyme. Giá trị mật độ quang
của phản ứng màu tỷ lệ thuận với lượng KN hiện diện trong mẫu thử. ELISA
sandwich thường được sử dụng để phát hiện KN p24 của HIV trong chẩn
đoán sớm HIV.
+Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (IFA)
Nguyên lý của IFA cũng tương tự ELISA nhưng chất gắn đánh dấu là
chất màu huỳnh quang và kết quả được đọc dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Phản ứng dương tính được thể hiện bằng những tế bào bị nhiễm HIV phát
quang ở ngoại vi.
* Kỹ thuật Western Blot (WB)


21

Nguyên tắc: là một kỹ thuật theo nguyên lý ELISA gián tiếp thực hiện

trên băng giấy, cho phép xác định KT kháng các thành phần khác nhau của
protein virus. Có WB riêng cho HIV-1 và HIV-2.
HIV được ly giải và điện di trên gel polyacrilamide để phân tách các
thành phần KN virus theo trọng lượng phân tử, sau đó được chuyển lên màng
nitrocellulose hoặc PVDF (Polyvinylidene Difluoride) và được cắt thành từng
dải băng để sử dụng. Mỗi dải băng dùng cho một mẫu thử nghiệm. Ủ huyết
thanh của mẫu thử với băng giấy. Nếu trong mẫu thử có KT kháng HIV thì
chúng sẽ gắn đặc hiệu lên các protein là KN tương ứng và được phát hiện
bằng cộng hợp là KT kháng Ig người đã được đánh dấu bằng enzyme cho
màu phản ứng với cơ chất. Vị trí các băng màu tương ứng với thành phần
protein virus gắn với KN đặc hiệu.
Giá trị: Xét nghiệm khẳng định WB có độ nhạy và độ đặc hiệu cao,
được thực hiện trong trường hợp các kết quả xét nghiệm phát hiện sàng lọc
không phù hợp và khó biện luận.
3. Các phương pháp giải trình tự DNA
Giải trình tự gen là quá trình xác định trật tự của các nucleotid
(adenine, guanine, cytosine, thymine) trên phân tử DNA.
Hiện nay, trong lĩnh vực sinh học nói chung và sinh học phân tử nói
riêng thì việc giải trình tự nucleotide của một đoạn gen hay của cả bộ gen của
một loài sinh vật là một kỹ thuật hết sức quan trọng. Sự xuất hiện của các
phương pháp giải trình tự gen đã đã đánh dấu bước ngoặt lớn, mang lại một
cuộc cách mạng trong nghiên cứu y sinh học cơ bản và trong nhiều lĩnh vực
ứng dụng như cơng nghệ sinh học, chẩn đốn, sinh học pháp y.


22

3.1. Giải trình tự DNA bằng phương pháp hóa học
Năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh ra phương phương pháp
hóa học giải trình tự DNA .Phương pháp này gồm các bước như sau [Maxam

A., Gilbert W., 1997]:
(1): Đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần phải giải trình tự bằng một
gốc phospho đồng vị phóng xạ, thường đánh dấu tại đầu 5' bằng 32P.
(2): Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu bằng chất hóa học có thể gây
biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotid trên đoạn DNA để. Ví
dụ, dimethylsulphate để biến đổi Guanine bằng cách thêm một gốc methyl ở
vị trí nitrogen thứ 7, hydrazine làm biến đổi Thyamine và Cytosine, hydrazine
và NaCl gây biến đổi Adenine và Cytosine, acid làm biến đổi Guanine và
Adenine, NaOH làm biến đổi Adenine và Cytosine nhưng ưu tiên biến đổi
Adenine hơn Cytosine. Như vậy, trong giai đoạn này phải cần ít nhất 4 ống
nghiệm và mỗi ống nghiệm có một lượng DNA nhất định được xử lý bằng
một trong các chất hóa học nêu trên do đó mỗi ống nghiệm chỉ chứa các đoạn
DNA có một vị trí nucleotid đặc hiệu đã bị biến đổi với chất hóa học.


23

Hình 4: Đánh dấu phóng xạ và biến đổi các nucleotid bằng hóa chất.
(3): Các nucleotide bị biến đổi sẽ được lấy ra khỏi khung mạch RibosePhosphate của đoạn DNA và do đó, đoạn DNA ban đầu sẽ được tách ra thành
các đoạn mạch đơn đã được đánh dấu

32

P và một đầu base nitơ bị lấy ra khỏi

mạch khung. Các mạch đơn này có độ dài khác nhau tùy thuộc vào vị trí base
nitơ bị lấy ra khỏi mạch khung.

32

P

A p G p C p T p T p T p G p A p G p G p A p C p G p A ...

32

P

32

P

32

P

32

P

32

P

Hình 5: Mạch đơn DNA ban đầu và mạch đơn DNA có một đầu đánh dấu
bằng 32P, một đầu Guanine đã được biến đổi bị lấy khỏi khung mạch.


24

(4): Điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghiệm trên 4 hàng của gel
polyacrylamide biến tính để các mạch đơn di chuyển trên gel không bị biến
đổi trong quá trình điện di. Sau điện di, các mạch đơn DNA sẽ có các vị trí
khác nhau theo hàng dọc trên bản gel, tùy thuộc vào vào kích thước mạch
đơn. Chụp bản gel điện di bằng tia X để xác định vị trí dừng lại của mạch đơn
trên gel (vì các mạch đơn đều đã được đánh dấu bằng phóng xạ 32P. Xác định
trình tự các nucleotid từ các vạch trên xạ ký tự (autoradiography).

Hình 6: Xác định trình tự DNA từ các vạch trên xạ ký tự
Phương pháp hóa học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert rất
khó thực hiện vì cần phải xác định nhiều thơng số tối ưu cho thí nghiệm,
trong đó khó nhất là việc xác định nồng độ giới hạn các chất hóa học sao cho
khi xử lý mẫu DNA trên mỗi đoạn DNA chỉ có một base bị biến đổi để ứng
với mỗi vị trí của base biến đổi sẽ có một mạch đơn đã được đánh dấu một
đầu 32P được tách ra. Chính vì sự phức tạp này nên phương pháp MaxamGilbert hiện nay ít được sử dụng mà thay vào đó là những phương pháp
enzyme xác định trình tự DNA với nhiều ưu điểm vượt trội hơn.
3.2. Phương pháp enzyme giải trình tự DNA: Phương pháp Sanger
(Dideoxynucleotid chain termination)


25

Phương pháp Dideoxynucleotid chain termination hay còn gọi là
phương pháp gián đoạn chuỗi (chain-determination method) là một phương
pháp xác định trình tự DNA được Frederick Sanger phát triển vào năm 1977.
Kĩ thuật này dùng phân tách trình tự cụ thể (sequence-specific termination)
của một phản ứng tổng hợp DNA trong ống nghiệm (in vitro) dùng chất nền
nucleotide đã được chỉnh sửa.
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp Dideoxy dựa vào hoạt động của
enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA. Enzyme DNA

polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị
trí 3'có chứa nhóm -OH tự do, khi gặp nucleotide khơng có nhóm 3'-OH thì
phản ứng tổng hợp bị dừng lại. Đặc trưng của phương pháp là sử dụng
dideoxynucleotide để làm ngừng phản ứng tổng hợp DNA một cách ngẫu
nhiên. Trong phản ứng sử dụng đoạn DNA mồi là đoạn DNA mạch đơn có
kích thước 20 nucleotide.
Phương pháp được chia làm 4 phản ứng thực hiện riêng rẽ có DNA
khn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTP (deoxynucleotide), enzyme Taq
polymerase, dung dịch đệm và các điều kiện phản ứng thích hợp đồng thời có
bổ sung thêm khoảng 1% một loại ddNTP (dideoxynucleotide) cho mỗi phản
ứng khác nhau. Các dideoxynucleotide bị mất 2 nguyên tử oxy ở carbon thứ 3
và carbon thứ 4. Do đó khi mạch DNA đang tổng hợp bị gắn 1 ddNTP thì
khơng có nhóm 3'-OH ở nucleotide cuối cùng nên mạch đang tổng hợp không
được kéo dài tiếp tục phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại.
Chính do lượng ddNTP được đưa vào với một lượng nhỏ so với lượng
dNTP nên thỉnh thoảng mới có một ddNTP được sử dụng ngẫu nhiên làm
phản ứng tổng hợp DNA dừng lại. Kết quả sẽ tổng hợp được các đoạn
nucleotide có kích thước dài ngắn khác nhau. Để xác định trình tự, người