Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong xác định đột biến trên gen KRAS Đích nhắm phân tử gián tiếp trong điều trị ung thư đại trực tràng


I HC M THÀNH PH H CHÍ MINH

oOo


NG DNG K THUT SINH HC PHÂN T
NH T BIN TRÊN GEN K-RAS:
M PHÂN T GIÁN TIU
TR UNI TRC TRÀNG






MSSV: 1053012873
 2014
 






gian 



-







.
              








DANH MC HÌNH:
Hình 1.1. Th hin t l mc bnh và t l t vong trên toàn th gii [13] 04
 05
Hình 1.3. T l mc các b bii trc
tràng (màu vàng)  nam gii trên th gii [13] 06
Hình 1.4. T l mc các b bii trc
tràng (màu vàng)  n gii trên th gii [13] 06
Hình 1.5. T l mc các b bii trc
tràng (màu vàng)  nam gii ti Vit Nam [13] 07
Hình 1.6. T l mc các b bii trc
tràng (màu vàng)  n gii ti Vit Nam [13] 07

Hình 1.7. Các loi thuu tr nh th EGFR [20]  12
Hình 1.8. EGFR  13
Hình 1.9. Cu trúc th th EGFR [37] 14
Hình 1.10. V trí gen K-Ras trên NST s 12 15
Hình 1.11. [4] 17
Hình 3.1. T l t bin ca by v trí ph bin trên gen K-ras
ng s 34
Hình 3.2.K-rast bin
trên gen (B) 36
Hình 3.3. V trí cp mi phn ng PCR khui exon 1 gen K-ras 42
Hình 3.4. V trí bt cp ca các mi (trong phn ng AS-PCR) và các mi/mu
dò (trong phn ng AS Real-time PCR) 42
 Kt qu PCR vi cp mi K-ras trên 2 mu bnh
phm 9 và 16. Thang chun 100 bp 46
Hình 3.6. Kt qu DNA
và n mi K-ras. Thang chun 100 bp. 47




Hình 3.7. Kt qup mi K-ras.
Thang chun 100 bp. 48
Hình 3.8. Mt st bin phát hic bi
trình t 49
Hình 3.9. Kt qu gii trình t codon 12 và 13 trên các mu 51
Hình 3.10. Mu 33 vi tín hiu nn b nhiu 51
Hình 3.11. Kt qu-PCR trên ba mu 18, 20 và 16. 55
Hình 3.12. Kt qu-PCR trên ba mn
ng 75 V, thi gian 30 phút) 56
Hình 3.13. Kt qu-PCR trên ba mn

dng 75 V, thi gian 50 phút) 56
Hình 3.14. Kt qu AS Real-time PCR phát hit bin G12A âm tính trên tt
c các mu th nghim 57
Hình 3.15. Kt qu AS Real-u 1 và 16 57





DANH MC BNG:
Bng 2.1. Thành phn phn ng PCR vi K-ras 24
Bng 2.2. Chu k nhit cho phn ng PCR vi K-ras 25
Bng 2.3. Thành phn phn ng Real time PCR vi mt bin 27
Bng 2.4. Chu k nhit cho phn ng Real time PCR vi mt bin 27
Bng 3.1. T l t bin gen K-ras trên i trc tràng 28
Bng 3.2. T l t bin gen EGFR trên các lo 30
Bng 3.3. Các loi mc s dng trong các tài liu tham kho 31
Bng 3.4. T l t bin by v trí ph bin trên gen K-ras 31
Bng 3.5. S c gch i)  codon 12 và 13 dt
bin 34
Bng 3.6.
 trên gen K-ras 35
Bng 3.7. Trình t và các thông s i ca IDT cho phn ng PCR
khui exon 1 gen K-ras 39
Bng 3.8. Trình t và các thông s i ca IDT cho phn ng AS-
PCR và AS Real-time PCR phát hit bin ni tri trên exon 1 gen K-ras 40
Bng 3.9. Ch s OD ca 3 mu 5, 16, 17 43
Bng 3.10.
 45
Bng 3.11. Ký hit bin phát hic 51

Bng 3.12. Tng s t bin trên các mu 52




DANH MC CH VIT TT
A : Adenine
ANOVA : Analysis of value
AS-PCR : Allele-specific Polymerase Chain Reaction
AS-Real-Time PCR : Allele-specific Real Time Polymerase Chain Reaction
ATP : Adenosine triphosphate
ADP : Adenosine diphosphate
BCR : Breakpoint cluster region
BLAST : Basic Local Alignment Search Tool
bp : base pair
C : Cytosine
COLD-PCR : Coamplification at Lower Denaturation temp PCR
DNA : Deoxyribonucleic acid
EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid
EGF : Epidermal Growth Factor
EGFR : Epidermal Growth Factor Receptor
ErbB : V-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene hom-
olog
FISH : Fluorescent in situ hybridization
G : Guanidine
Grb2 : Growth factor receptor-bound protein 2
HRM : High Resolution Melting
K-ras : Kirsten-ras/ V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral
oncogene homolog
LNA-PCR : Locked nucleic acid PCR

MAPK : Mitogen Activated Protein kinase
MEK : Mitogen Activated Protein kinase kinase
NCBI : National Center for Biotechnology Information
OD : Optical Density




PCR : Polymerase Chain Reaction
PI3K : Phosphoinositide 3-Kinase
RNA : Ribonucleic acid
SDS : Sodium dodecyl sulfat
SNP : Single-nucleotide polymorphism
SSCP : Single-strand conformation polymorphism
TE : Tris 0,1M - EDTA 0001M
TGF- : Transforming Growth Factor-
TKIs : Tyrosine Kinase Inhibitors
Tm : Nhi nóng chy
UTR : Untranlated region
UV : Ultraviolet
WHO : World Health Organization





 
65
 67


 46






 1


1.  3
2.         
CANCER): 4
3.  8
4.  .
9
4.1.V  ca liu pháp nh 9
4.2.V thuu tr: 10
5. N: 12
6. EGFR: 12
7. K-ras: 15
8. --REAL-TIME PCR: 18


1. VT LIU 19
2. U 19
2.1.Khai thác d liu và kho sát in silico 19
2.2.Kho sát in vitro 21
PH
1. KT QU KHAI THÁC D LIU VÀ KHO SÁT IN SILICO 28

1.1 Khai thác d liu - Các lot bin trên gen K-ras 28
1.2.Kt qu kho sát in silico 36
2. KT QU THC NGHIM: 42
2.1.Tách chit DNA và kim tra DNA b gen sau tách chit: 42
u kin phn  46
2.3.Kt qu-gii trình t phát hit bin trên gen K-ras
  48




2.4.Kt quAlelle-Specific PCR (AS-PCR) phát hit bin trên
gen K-ras 54


1. KT LUN 59
2.  59
TÀI LIU THAM KHO 60


PH LM LÂM SÀNG VÀ GII PHU BNH CA 19 MU
I TRC TRÀNG 65
PH LC 2: PHÂN TÍCH KT QU GII TRÌNH T CA 19 MI
TRC TRÀNG VÀ 1 MU VÚ 67

1


i trc tràng (colorectal cancer  nh có s i
cht ph bin th  gii, d dày và gan. CRC có th
c cha khi nc phát hin sm. i trc tràng khi
chuy    i là nguyên nhân chính gây t vong  các bnh nhân
CRC.
, mng 7,6 trii ch
trên toàn th ging 70 % các ca t vong xy ra  c
có thu nhp th
n.
Nhi s phát trin mnh m ca sinh hc phân t, các
b      c cha tr b    u tr
truyn thu thut, hóa tr liu hoc x tr li h ng
du tr theo mt liu pháp mi hiu qu c h u
u pháp mi cho thy có nhim,
c bit khi bu tr bng hóa hc tr liu tht bi thì có th dùng liu
pháp này, tác dng ph ít (ch ni ban trên da), khi s dng kt hp liu pháp
mi vi pc tr liu s giúp kéo dài s snh
nhân.
K-ras là thành viên cRas mã hoá cho protein G vi hot
ng GTPase ni bào. K-ras nng truyn tín hiu ca EGFR.
Protein K-ras hot công tc phân t ng truyn tín
hiu ni bào nh các chng cho s tin trin ca
t bào, bao gm c s bit hóa, s phát trin và cht theo chu trình. t
bin trên gen K-ras t bim) dn hong GTPase ca
protein K-ras b suy gim, GTP không b ct thành GDP    ng

truyn tính hiu ca protein K-ras s din ra liên tc mà không cn ti s có
mt các kích thích cng truyn tính hiu EGFR/th th HE [42]. Vì vy,
bt bin gen K-ras có phn ng kém khi
u tr vi các thuc c
ch cht bin K-ras c cho là mng hp xut hin sm

2

trong CRC và chim khong 30-40 % [4]. Nht bin ph bin nhc
nh trong CRC xy ra trong exon 1. Nhng khi u mà có mt bin 
exon 1 (codon 12 và/hoc 13) ca gen K-ras s   ng v 
 u tr s dng cht c ch EGFR, bao gm cetuximab hoc pani-
tumumab.
Nhng thành tu trong nghiên cu k thut sinh hc phân t  ra kh
i trong chn  nht là ng dng ct
PCR c hiu alen (Allele Specific PCR  AS PCR), PCR kt
hp gii trình t. C c th gii công b qua nhng áp
di trc tràng nhm xác nh các lot bim vi mc
tiêu ng ti áp dng liu pháp ngm u tr bnh này.
, vi mong mun ng tu
tr liu pháp nh    i trc tràng  i
bnh Vic ht c t bin trên gen K-ras
             
 mt cách chi ti t h 
ra m u tr thích hp cho tng bnh nhân c th giúp gim thi
u tr cho bnh nhân.

3

1. T:

 
 



[44].
Ung  phát sinh    bào         bào bình
 thành  bào  u là  quá trình  giai   là   
      ung   các  u ác tính.  thay  này là
     tác  các   di    và các tác nhân bên
ngoài [44], bao 
Tác nhân vt lý, chng hn  bc x t ngoi và bc x ion hóa.
Tác nhân hóa hc, chng hn  amiang, các thành phn ca khói thuc lá,
aflatoxin (cht gây ô nhim thc phm) và thch tín (mt cht gây ô nhim c
ung).
Tác nhân sinh hc, chng hn  nhim trùng virus, vi khun hoc ký sinh
trùng.
 theo WHO, ung  là nguyên nhân hàng  trên     
vong và  7.6  ca  vong  13% trong   các ca  vong)
 2008, và các  ung  chính là:
  (1.370.000    vong)
  dày (736.000    vong)
 Gan (695.000    vong)
   tràng (608.000    vong)
 Vú (458.000    vong)
 C  cung (275.000    vong)

4

Khong 70% ca tt c các ca t vong do ung  xy ra  các c có thu

nhp thp và trung bình. ng hp t vong t bnh ung  trên toàn th gii
c WHO d  s tip tc  lên  13,1 triu vào  2030.

Hình 1.1. T l mc các bnh và t l t vong trên toàn th
gii [13]
2. T       
(COLORECTAL CANCER):
i tràng là phn cui ca ng tiêu hóa (tn cùng là hu môn). Khi
trc tràng phát trin t niêm mc thành i  trc tràng. Nhng khi u lành
c gi là polyp. Khi u ác tính cc gi
trc tràng [17]. Nhng khi u polyp lành tính không th xâm ln vào nhng mô
lân cn và không th  n nh  . Nhng
ng có th ct b d dàng trong tin trình ni tràng và
không nguy hi sng bnh nhân. Nc ct b, nó có
th tr t th Hu ht các ung

5

i tr u xut phát t i tràng và trc
tràng (gi trc tràng) có th xâm ln và gây tn hi mô và
 n nh
th i hay gan). S lan tràng cn nhi là
, tuy nhiên nó vc gi trc tràng mc dù khi u xy
ra  b phn khác c. Mu tr i
trc tràng là rt hn ch [17].




.2 và 1.3n 60%




Â
-.



6


Hình 1.3. T l mc các bph bii
trc tràng (màu vàng)  nam gii trên th gii [13]

Hình 1.4. T l mc các b bii
trc tràng (màu vàng)  n gii trên th gii [13]

              

,6 
,6 %) (Hình 1.4 và 1.5).

7


Hình 1.5. T l mc T l mc các b bi
i trc tràng (màu vàng)  nam gii ti Vit Nam [13]

Hình 1.6. T l mc các bnh ung th bii
trc tràng (màu vàng)  n gii ti Vit Nam [13]

Các nguyên nhân  

-  
 [33].
-  
  [14]
- Polyp:            
c tính [17, 33].
-              



8

- -70, trong khi cá


- Nhng ph n tng mng tr
c t c bi trc tràng.
- Mt trong nht bing di trt
bin xng gen này biu hin quá
mc [17].
3.        
 [17]:
Xét nghim máu  phân: khi mc bi tràng ng s rò r máu
chng phân và thi ra. Xét nghim máu trong phân có th s phát hin
c mng nh các thành phn máu, liên tc nhiu ln kim tra nu cho thy
kt qu ng t chy máu mãn tính  h thng tiêu hóa, cn phi
kim tra có hay không s tn ti ca các khng tiêu hóa.
Chp X quang: Có th quan sát hình nh ci tràng, có xut hin khi u

hay polyp không.
Ni soi: ng hi tin, kt qu
kim tra trc tràng không thy thông s b ng, nên thc hin ni soi.
Không nhng có th phát hic các loi bi tràng bin chng mà còn
có th thc hin sinh thit các mô.
Vi s phát trin ca ngành sinh hc phân t    
pháp chng dng sinh hc phân t c phát trin. C
th t bin trên các gen liên quan bng PCR [5], gii
trình t [19, 29]m tra phát hin kháng nguyên bng
hóa mô min d  nh chính xác cao
c giúp cho vic phát hin si
trc tràng.

9

4. 
:
S phá v ng ca t
bào là trung tâm ca vic dn b gc tìm hiu
nhi phân t - nguyên nhân dn s phát tri
cng thông tin trin vng v vic u tr p lý và hiu qu 
Mt trong nhu tr  [35].
Thut ng liu pháp nh  cn mt th h mi ca
thuc chc sn xut nhm can thip vào mc tiêu phân t c th
ng là mc cho là có vai trò quan trng trong phát trin g
sinh khi u. Vinh các  da trên mt s hiu bit chi tit v nhng
i phân t , t c các loi thuu tr
phù hp. Sau khi thâm nh thuc s chú ý la chn v trí
kh kt hp phát huy tác dng, khin cho t  tiêu dit mt
cách có m chc t bào khe mnh

xung quanh [35].
Liu pháp nhà lic s dng ru tr
các loi thuc sinh h khóa s ng và lan tràn ca
p vào các phân t c hi sinh ung và s 
ng ca khu. Liu pháp này áp du tr c
FDA công nhnh bch cu ty mn (FDA công nhn t
i tri không
t bào nh tin xa hot bi ít nht mt hóa trn

4.1.  :
Da theo NCI (National Cancer Institute) có th li
- 
- .

10

- .
- .
- Không gâ           

- 
.
- 

4.2. :
Có nhiu loi thu kìm
hãm s phát trin ca khi u.
Tham kho t ngun
vi các thuc
c phát hin và nghiên cn nay, chúng ta có th 

ch tác d:
Nhóm 1: 

liê
       Imatinib, Dasatinib,
Bosutinib, Trastuzumab, Pertuzumab, Panitumumab, Crizotinib


Varinostat, Romidep-
sin, Bexarotene, Alitretioic.

trình apoptosis.

11

           Bortezomib,
Carfizomib, Pralatrexate.
 



ng
           Bevacizumab,
Sorafenib, Ziv-aflibercept, Sunitinib, Pazopanib, Cabozantinib.
    
.
           Rituximab,
Alemtuzumab, Ofatumumab, Ipilimumab.
Nhóm 6
.

Tositumomab, 131I-
tositumomab, Ibritumomab tiuxetan.
Mt trong nhc nhu tiên trong liu pháp
này là th th EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor  th th yu t 
ng biu mô), mt glycoprotein có hot tính tyrosine kinase, nm trong con
u hòa s t hóa t bào. EGFR c tìm
thy có s biu hin quá mc trong nhiu loi khi
trc tràng, chính vì vy, liu pháp cha tr mhn c ch protein
EGFR [10]. c li gen K-ras li r u tr nh[4].

12


Hình 1.7. Các loi thuu tr nh th EGFR
[20]
5. 
t bin là nhng bii b ng trong vt cht di truyn  c 
phân t (DNA) hoc c t bào (nhim sc th), dn s bit
ngt ca mt hoc mt s tính trng, nhng bii này có tính cht bn vng
và có th di truyi sau [1]. Có hai lot bit bin gen
t bin nhim sc th, tt bin nhim sc th ng làm bii
ln vt cht di truyn, n sc sng ct bin gen thì
làm bii cu trúc ca gen có th dn bii cu trúc ca loi protein
mà nó mã hóa, cui cùng dn bii kiu hình (có th 
Trong các nghiên cu v ng dùng các k thut bin gen
 ct bin nhim sc th [1].
6. EGFR:

gen EGFR 
 Gen EGFR 

13

  
EGFR. n trong t bào trng khong 60
kDa là protein kinase v      y ra phn ng t
phosphoryl hóa ca EGFR [45].

Hình 1.8. EGFR 
Th th yu t phát trin biu mô (EGFR) là nhóm   m nhn
tyrosine kina c phát hi u tiên bi Carpenter và cng s vào 
1978. H protein EGFR bao gm 4 thành viên- EGFR (HER1/ErbB1), HER2
(ErbB2), HER3 (ErbB3) và HER4 (ErbB4). Các protein này có vai trò quan
trng trong viu hòa các quá trình phát trin, bit hóa và các ch
sinh hc ca t bào [11]
Phân t EGFR gm mt vùng gn kt các phi t nm ngoài màng t bào,
mc hiu và mt vùng ni bào [15].

14


Hình 1.9. Cu trúc th th EGFR [37].
Hot tính tyrosine ni bào cc hot hóa khi EGFR liên kt vi
các phi t c hot hóa, vùng ni
bào ca EGFR s t phosphoryl hóa, khu mt dòng thác tín hiu lan ta
khp t bào gây kích hong PI3K/Akt, s 
và c ch quá trình ch      u
      ng dn truyn tín hiu
phiên mã. Trong các t bào khe mng tín hiu nc

15

kim soát mt cách nhp nhàng và cht ch, m bo s phát tring
ca t bào [15].
Trong các t t tính tyrosine kinase ca EGFR b ri lon
b t bin gen EGFR ng
bn sao gen EGFR hoc biu hin quá mc protein EGFR. Vic hot hóa sai
chc l phát sinh, t phát trin,
kh a các t  biu hin quá
mc quan sát thy  nhng khi u cnh nhân
mi không t bào nh ã di cng hng có
ng bnh xu [24]. Chính vì vlâm sàng
trong vic phát trin các liu pháp th h mi ch
7. K-ras:
Tham kho t ngun:
gen K-ras c
mô t Gen K-ras (V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene hom-
olog/ Kirsten-ras) nm trên NST s 12,  v trí 12p12.1, mã hóa cho protein K-
ras [46].

Hình 1.10. V trí gen K-Ras trên NST s 12
Nhiu công trình nghiên cu trên th gic thc hin nhm phân tích
tình trng gen K-ras (mã hóa cho protein RAS)  các bi
tru tr bng cetuximab hoc panitumumab. Theo thng kê gen
K-ras
b t bin t n 45 i trc tràng [7]. Cho n nay
thng kê cho thy t bin hay gp nht bin thay th nucleotit  codon