Xây dựng quy trình định lượng đồng thời tenofovir alafenamid và tenofovir trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ

.

NGUYỄN HỒ NHẬT NGUYÊN - KHÓA 2019 – 2021 NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN HỒ NHẬT NGUYÊN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
TENOFOVIR ALAFENAMID VÀ TENOFOVIR
TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI
BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

.


.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN HỒ NHẬT NGUYÊN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
TENOFOVIR ALAFENAMID VÀ TENOFOVIR
TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI
BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ

NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. CHƯƠNG NGỌC NÃI
2. GS.TS. NGUYỄN ĐỨC TUẤN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

.


.

LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được
ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Nguyễn Hồ Nhật Nguyên

.


.

Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2019 – 2021
Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất – Mã số: 8720210
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI TENOFOVIR ALAFENAMID
VÀ TENOFOVIR TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI
BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ
Nguyễn Hồ Nhật Nguyên
Người hướng dẫn khoa học: TS. Chương Ngọc Nãi, GS.TS. Nguyễn Đức Tuấn
Từ khóa: Tenofovir alafenamid, tenofovir, huyết tương người, LC-MS/MS.
Mở đầu: Tenofovir alafenamid (TAF), một tiền chất của tenofovir (TFV), là chất ức chế enzym
polymerase của ADN virus viêm gan B, hiện đang được khuyến cáo là thuốc được lựa chọn đầu
tiên trong điều trị bệnh viêm gan B mạn tính. Hiện nay, thị trường Việt Nam đang lưu hành thuốc
generic tenofovir alafenamid với giá thành thấp hơn nhiều so với thuốc gốc. Tuy nhiên, các chế
phẩm này chưa được đánh giá tương đương sinh học so với thuốc gốc. TAF hiện diện trong huyết
tương ở nồng độ rất thấp sau khi uống vì được chuyển hóa thành chất có hoạt tính là TFV. Tại Việt
Nam, cho đến nay chưa có cơng trình định lượng đồng thời tenofovir alafenamid và chất chuyển
hóa trong huyết tương người được cơng bố. Vì vậy, đề tài này được thực hiện với mục tiêu xây
dựng quy trình định lượng đồng thời tenofovir alafenamid và chất chuyển hóa tenofovir trong huyết
tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS, góp phần vào việc đánh giá tương đương sinh học của các
chế phẩm chứa tenofovir alafenamid trên thị trường Việt Nam.
Đối tượng & Phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Các mẫu huyết tương người giả lập chứa TAF và TFV.
Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát điều kiện khối phổ, chuẩn nội và điều kiện sắc ký; Khảo sát
quy trình xử lý mẫu huyết tương giả lập chứa các chất phân tích và chuẩn nội bằng phương pháp
tủa protein; Thẩm định quy trình định lượng TAF và TFV trong huyết tương người theo hướng dẫn
của US-FDA và EMA.

Kết quả: TAF, TFV và chuẩn nội được ion hóa ở chế độ ESI và được ghi phổ với kỹ thuật MRM
để phát hiện các ion tựa phân tử và ion phân mảnh của TAF và TFV dùng cho định lượng lần lượt
là m/z 477,10 → 176,00; 288,10 → 176,00 và 409,20 → 148,10. Với dung môi tủa protein là
acetonitril, các chất phân tích được chiết có hiệu suất ổn định trên 70% với CV < 15%. Điều kiện
sắc ký thích hợp bao gồm cột Agilent Poroshell-C6 Phenyl (150 ì 4,6 mm; 4,0 àm); Nhit ct
40 oC; Nhiệt độ buồng tiêm mẫu 10 oC; Tốc độ dòng 0,7 mL/phút; Thể tích tiêm mẫu 5 µL; Pha
động bao gồm acetonitril - dung dịch đệm acid formic 0,5% với chương trình dung mơi như sau:
0’(5:95), 3’(5:95), 6’(95:5), 8’(5:95), 10’(5:95). Khoảng tuyến tính của TAF và TFV lần lượt là 4
– 500 ng/ml và 0,4 – 50 ng/ml. Giới hạn định lượng dưới của phương pháp là 4 ng/ml với TAF và
0,4 ng/ mL với TFV. Các chỉ tiêu thẩm định như tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác, ảnh hưởng
của nền mẫu, lượng mẫu tồn dư, độ pha loãng và độ ổn định đều cho kết quả nằm trong giới hạn
cho phép.
Kết luận: Đã xây dựng được quy trình định lượng đồng thời TAF và chất chuyển hóa TFV trong
huyết tương người bằng kỹ thuật LC–MS/MS với độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác và độ đúng
cao. Quy trình có thể được ứng dụng để theo dõi nồng độ thuốc trong huyết tương người trong các
nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học.

.


.

Master’s Thesis – Academic course: 2019- 2021
Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210
DEVELOPMENT OF LIQUID CHROMATOGRAPHY - TANDEM MASS
SPECTROMETRY METHOD FOR SIMULTANEOUS DETERMINATION OF
TENOFOVIR ALAFENAMIDE AND TENOFOVIR IN HUMAN PLASMA
Nguyen Ho Nhat Nguyen
Supervisor: Dr. Chuong Ngoc Nai, Prof. Dr. Nguyen Duc Tuan
Keywords: Tenofovir alafenamide, tenofovir, human plasma, LC-MS/MS.

Introduction: Tenofovir alafenamide (TAF), a prodrug of tenofovir (TFV), is a potent nucleotide
analogue inhibitor of HBV polymerase/reverse transcriptase, currently recommended as first line
treatment for chronic hepatitis B. The Vietnamese market is currently circulating a tenofovir
alafenamide generic with a selling price which is cheaper than the one of brand-name product.
However, this formulation has not been assessed for in vivo bioequivalence to the reference product.
Tenofovir alafenamide is present in plasma at very low concentration after oral administration due
to it is converted to an active metabolite, tenofovir. To the best of our knowledge, no study has been
published in Vietnam for simultaneous quantification of tenofovir alafenamide and its metabolite
in human plasma so far. Therefore, this study has been performed with the aim of development and
validation of the simultaneous quantitative procedure for TAF and TFV in human plasma by liquid
chromatography - tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) in accordance with the guidelines of
US-FDA and EMA, contributing to the in vivo bioequivalence study of pharmaceuticals containing
tenofovir alafenamide.
Materials and methods
Objective of study: Human plasma samples containing TAF and TFV.
Methods of study: Mass spectrometry, internal standard (IS), and chromatographic conditions were
investigated to find out the suitable IS and conditions; Human plasma samples containing TAF,
TFV and IS were investigated by using protein precipitation (PPT). And finally, the assay was
validated in compliance with US-FDA and EMA guidelines on bioanalytical method validation.
Results: TAF, TFV, and IS were ionized using ion electrospray ionization (ESI) and detected by
multi-reaction monitoring (MRM) mode to obtain molecular and fragment ions for quantification.
The transition of m/z is 477.00 → 176.00, 288.10 → 176.00, and 409.20 → 148.10 for TAF, TFV,
and IS, respectively. The human plasma samples were treated by PPT using acetonitrile which gave
the stable recovery above 70% with CV below 15% for all analytes. The suitable chromatographic
conditions were performed on an Agilent Poroshell C6-Phenyl column (150 x 4.6 mm; 4.0 µm) at
40 ºC. The mobile phase comprising of acetonitrile and 0.5% formic acid was delivered 0' (5:95),
3' (5:95), 6' (95:5), 8'(5:95), 10' (5:95) at a flow rate of 0.7 mL/min. The autosampler was kept at
10 oC and an aliquot of 5 µL was injected into the LC-MS/MS system. The linearity range is 4 500 ng/mL, and 0.4 - 50 ng/mL for TAF, and TFV, respectively. The lower limit of quantitation of
TAF, and TFV is 4 ng/mL and 0.4 ng/mL, respectively. The validation results showed that the
specificity, intra- and inter-day precision and accuracy, matrix effect, carry over, dilution and

stability of all the analytes were in the acceptable range.
Conclusion: A highly sensitive, specific, precise, and accurate LC-MS/MS method for
simultaneous quantification of TAF and TFV in human plasma was successfully developed and
validated. This method can be applied for quantification of these compounds in human plasma for
in vivo bioavailability (BA) and bioequivalence (BE) studies.

.


.

LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian học tập và thực hiện luận văn với nhiều cố gắng, thời điểm hoàn thành
luận văn là lúc tơi xin phép bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới những người Thầy đã dạy dỗ,
hướng dẫn và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian qua.
Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Thầy GS.TS. Nguyễn Đức Tuấn và Cô
TS. Chương Ngọc Nãi – là hai người thầy đã tận tình giúp đỡ tơi trong suốt thời gian nghiên
cứu và hồn thành luận văn Thạc sĩ này.
Tơi xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cơ Bộ mơn Phân tích – Kiểm nghiệm đã tận tình truyền
đạt kiến thức và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi trong q trình nghiên cứu.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể Trung tâm Đánh giá Tương đương sinh học, Viện
Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM đã tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn này.
Và cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp
– những người luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện nghiên
cứu.

.


.

MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................ ..i
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ........................................................ ....v
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................24

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..............................................................34

.


.

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .......................................................................................63

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .........................................................68

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

.


.

i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu,

Từ nguyên

Nghĩa tiếng Việt

chữ viết tắt
ADN

Acid deoxyribonucleic

APCI

Atmospheric Pressure Chemical

Ion hóa hóa học tại áp suất khí

Ionization

quyển

AUC

Area under the cuvre

Diện tích dưới đường cong

AUC0-∞

Area under the curve from time 0

Diện tích dưới đường cong nồng

extrapolated to infinite time

độ - thời gian từ thời điểm 0 đến
vô cực

AUC0-t

Area under the curve from time 0

Diện tích dưới đường cong nồng

to the last measurable

độ - thời gian từ thời điểm 0 đến

concentration

thời điểm t

CatA

Cathepsin A enzyme

CES1

Carboxylesterase 1 enzyme

Cmax

The maximum concentration

Nồng độ đỉnh trong huyết tương

CV

Coefficient of variation

Hệ số phân tán

EMA

European Medicines Agency

Cơ quan Quản lý thuốc Châu Âu

ESI

Electrospray Ionization

Ion hóa tia điện

FAB

Fast atom bombardment

Ion hóa bằng sự bắn phá nhanh
nguyên tử

HBV

Hepatitis B virus

Virus viêm gan B

HIV

Human Immunodeficiency Virus

Virus suy giảm miễn dịch ở
người

HQC

High Quality Control

Mẫu kiểm tra nồng độ cao

IS

Internal standard

Chuẩn nội

.

.

i

Ký hiệu,

Từ nguyên

Nghĩa tiếng Việt

chữ viết tắt
International Union of Pure and

Hiệp hội Quốc tế về Hóa học

Applied Chemistry

thuần túy và ứng dụng

LC

Liquid Chromatography

Sắc ký lỏng

LC-MS/MS

Liquid chromatography - Tandem

Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ

IUPAC

mass spectrometry
LLE

Liquid-Liquid Extraction

Chiết lỏng – lỏng

LLOQ

Lower Limit of Quantification

Giới hạn định lượng dưới

LQC

Low Quality Control

Mẫu kiểm tra nồng độ thấp

MQC

Medium Quality Control

Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình

MS

Mass Spectrometry

Khối phổ

PPT

Protein Precipitation

Tủa protein

RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SPE

Solid phase extraction

Chiết pha rắn
Thời gian bán thải

T1/2
TAF

Tenofovir alafenamid

TAM

Tamsulosin

TDF

Tenofovir disoproxil fumarat

TFV

Tenofovir

TFV-DP

Tenofovir diphosphat
Thời gian đạt nồng độ đỉnh

Tmax
ULOQ

Upper Limit of Quantitation

Giới hạn định lượng trên

US-FDA

Food and Drug Administration

Cơ quan Quản lý thuốc và Thực
phẩm Hoa Kỳ

.


.

ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. So sánh ba phương pháp xử lý mẫu PPT, LLE và SPE ...........................19
Bảng 1.2. So sánh hướng dẫn của US-FDA và EMA ..............................................19
Bảng 1.3. Tóm tắt một số cơng trình nghiên cứu định lượng tenofovir alafenamid và
chất chuyển hóa tenofovir trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC – MS/MS ...21
Bảng 1.4. Các thông số dược động học của tenofovir alafenamid (TAF) và tenofovir
khi dùng liều đơn TAF 25 mg (n = 8) .......................................................................23
Bảng 2.1. Chất chuẩn và chuẩn nội dự kiến sử dụng trong nghiên cứu ...................24
Bảng 2.2. Dung mơi và hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu ...........................24
Bảng 2.3. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu ..................................................25
Bảng 2.4. Các lô huyết tương trắng đã sử dụng trong nghiên cứu ...........................25
Bảng 2.5. Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc .................................................................26
Bảng 2.6. Cách pha hỗn hợp chuẩn ..........................................................................26
Bảng 2.7. Nồng độ lý thuyết của các mẫu đường chuẩn trong huyết tương người
(ng/mL)......................................................................................................................30
Bảng 3.1. Thông số thế phân mảnh và năng lượng va đập tối ưu của chất phân tích
và chuẩn nội ..............................................................................................................34
Bảng 3.2. Các hệ pha động khảo sát theo chương trình rửa giải gradient ................40
Bảng 3.3. Hiệu suất chiết các chất phân tích và chuẩn nội từ huyết tương ứng với hai
dung môi tủa protein (n = 6) .....................................................................................45
Bảng 3.4. Độ ổn định của mẫu giả lập ở mức nồng độ HQC ở nhiệt độ 20 oC trong

24 giờ (n= 6) ..............................................................................................................46
Bảng 3.5. Hiệu suất chiết các chất phân tích và chuẩn nội từ huyết tương ứng với các
nồng độ acid formic khảo sát (n = 6) ........................................................................47
Bảng 3.6. Hiệu suất chiết các chất phân tích và chuẩn nội từ huyết tương ứng với các
thể tích acid formic khảo sát (n = 6) .........................................................................48

.


.

v

Bảng 3.7. Nồng độ lý thuyết của các chất phân tích và chuẩn nội trong huyết tương
...................................................................................................................................50
Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra tính phù hợp của hệ thống (n=6) ..................................50
Bảng 3.9. Kết quả thẩm định tính đặc hiệu ..............................................................51
Bảng 3.10. Kết quả xác định giới hạn đinh lượng dưới ...........................................52
Bảng 3.11. Sự tương quan giữa nồng độ TAF và TFV và tỷ số diện tích pic chất phân
tích với chuẩn nội (TAM) trong huyết tương ...........................................................53
Bảng 3.12. Kết quả đánh giá tính tương thích của phương trình hồi qui và ý nghĩa
của các hệ số của phương trình hồi qui .....................................................................54
Bảng 3.13. Kết quả thẩm định độ đúng và độ chính xác trong ngày và giữa các ngày
...................................................................................................................................54
Bảng 3.14. Hiệu suất chiết của TAF, TFV và chuẩn nội (n = 6) ..............................55
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ ổn định của các chất phân tích trong huyết tương
(n=6) ..........................................................................................................................56
Bảng 3.16. Kết quả khảo sát độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc các chất phân tích
và dung dịch chuẩn nội (n=6) ...................................................................................56
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu ...............................................57

Bảng 3.18. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của lượng mẫu tồn dư (n=6) ......................58
Bảng 3.19. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của sự pha loãng .......................................58
Bảng 3.20. Chất chuẩn và chuẩn nội sử dụng trong quy trình .................................59

.


.

v

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của tenofovir alafenamid. ...............................................3
Hình 1.2. Cơ chế tác dụng của tenofovir alafenamid trên tế bào gan . ......................4
Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của tenofovir alafenamid trên tế bào nhiễm HIV ...........5
Hình 1.4. So sánh hiệu quả của việc vận chuyển đến tế bào nhiễm HIV sau khi uống
các sản phẩm tenofovir ...............................................................................................5
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của tenofovir...................................................................6
Hình 1.6. Sơ đồ giản lược của một khối phổ kế .........................................................9
Hình 1.7. Độ nhạy và khoảng khối lượng giới hạn cho các kiểu ion hóa ..................9
Hình 1.8. Bộ phận tách khối hai tứ cực. ...................................................................11
Hình 1.9. Cấu trúc hóa học của adefovir. .................................................................14
Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của lamivudin. ............................................................14
Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của acyclovir. .............................................................15
Hình 1.12. Cấu trúc hóa học của tamsulosin. ...........................................................15
Hình 3.1. Phổ khối (full scan) của tenofovir alafenamid (A), tenofovir (B), adefovir
(C), lamivudin (D), acyclovir (E), tamsulosin (F) ở nồng độ mỗi chất là 1 µg/mL .35
Hình 3.2. Phổ khối (ion phân mảnh) của tenofovir alafenamid (A’), tenofovir (B’),
adefovir (C’), lamivudin (D’), acyclovir (E’), tamsulosin (F’) ở nồng độ mỗi chất là

1 µg/mL. ...................................................................................................................36
Hình 3.3. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với hệ pha động (1) acetonitril – dung
dịch acid formic 0,5 % với các tỷ lệ 5:95 (A), 15:85 (B), ........................................38
Hình 3.4. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với hệ pha động (2) acetonitril – dung
dịch amoni format 5 mM với các tỷ lệ 5:95 (A’), 15:85 (B’), ..................................38
Hình 3.5. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với hệ pha động (3) acetonitril – dung
dịch đệm amoni format 5 mM pH 4,5 với các tỷ lệ 5:95 (A”), 15:85 (B”), 30:70 (C”),
45:55 (D”), 60:40 (E”) ..............................................................................................39
Hình 3.6. Sắc ký đồ mẫu giả lập tương ứng với hệ pha động (4), (5) và (6). ..........40

.


.

i

Hình 3.7. Sắc ký đồ mẫu giả lập tương ứng với các nồng độ dung dịch acid formic
khảo sát. .....................................................................................................................41
Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu giả lập tương ứng với các nhiệt độ cột sắc ký khảo sát. ..42
Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu giả lập tương ứng với các tốc độ dịng khảo sát. .............43
Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu giả lập tương ứng với các thể tích tiêm mẫu khảo sát. ..44
Hình 3.11. Sắc ký đồ mẫu giả lập tương ứng với dung môi tủa protein khảo sát ....45
Hình 3.12. Sắc ký đồ mẫu giả lập tương ứng với loại acid được thêm vào huyết tương
...................................................................................................................................46
Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu giả lập tương ứng với các nồng độ acid formic khảo sát.
...................................................................................................................................48
Hình 3.14. Sắc ký đồ mẫu giả lập tương ứng với các thể tích acid formic khảo sát.
...................................................................................................................................49
Hình 3.15. Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng (A) và mẫu giả lập chứa chất phân tích

ở nồng độ LLOQ (B) .................................................................................................52

.


.

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, virus viêm gan B vẫn là mối đe dọa lớn đến sức khỏe tồn cầu. Tính đến
năm 2010, ước tính trên tồn thế giới có khoảng 2 tỉ người bị nhiễm virus viêm gan
B và khoảng 248 triệu người bị viêm gan B mạn tính [16]. Viêm gan siêu vi B mạn
tính là nguyên nhân hàng đầu dẫn tới suy gan, xơ gan và ung thư gan [16]. Khoảng
15 % đến 25% số người bị nhiễm virus viêm gan B mạn tính chết vì xơ gan hoặc ung
thư gan. Một nghiên cứu về bệnh tật toàn cầu đã ước tính rằng có 686.000 ca tử vong
do viêm gan B vào năm 2013 [16]. Các thuốc thuộc nhóm có cấu trúc tương đồng với
acid nucleic, một nhóm thuốc điều trị kháng virus, đã cho thấy sự hiệu quả trong quá
trình ức chế sự nhân lên của virus, ngăn chặn sự tiến triển của virus viêm gan B, thậm
chí là xơ gan và cải thiện khả năng sống sót của bệnh nhân [31]. Trong đó, tenofovir
alafenamid (TAF, trước đây được gọi là là GS-7340), một tiền chất của tenofovir
(TFV), sẽ được chuyển hóa thành tenofovir diphosphat (TFV-DP) do được
phosphoryl hóa trong tế bào, chất này ức chế enzym polymerase của ADN virus viêm
gan B và ức chế enzym phiên mã ngược của virus HIV-1, sau khi gắn vào ADN sẽ
chấm dứt kéo dài thêm chuỗi ADN [2]. Hiện nay, thuốc đang được khuyến cáo đầu
tiên trong phác đồ điều trị bệnh nhân viêm gan B mạn tính, hoặc dùng phối hợp với
các thuốc kháng virus khác (ít nhất là 1 thuốc) trong điều trị nhiễm HIV-1 ở người
trưởng thành [2],[31]. Trước đây, tenofovir disoproxil fumarat được sử dụng phổ biến
hơn trong điều trị nhưng có một tỷ lệ nhất định gây tác dụng phụ trên thận và xương
[28].

Trong thử nghiệm lâm sàng, tenofovir alafenamid có tác dụng kháng retrovirus tương
đương với tenovovir disoproxil fumarat với liều thấp hơn 30 lần (10 mg so với 300
mg) và đã được chứng minh làm giảm đáng kể các tác dụng phụ gây suy thận, giảm
mật độ xương và loãng xương do sự khác biệt trong đặc tính dược lý. Hiện tại FDA
đã phê duyệt một số thuốc chứa tenofovir alafenamid bao gồm Vemlidy®, Descovy®,
Biktarvy®, Genvoya® trong điều trị nhiễm HIV và HBV [18],[31].

.


.

2

Trên thế giới hiện nay đã có một số cơng trình nghiên cứu định lượng đồng thời
tenofovir alafenamid và chất chuyển hóa tenofovir trong dịch sinh học, hầu hết bằng
kỹ thuật LC-MS/MS, góp phần quan trọng trong nghiên cứu về dược động học, tác
dụng dược lý cũng như đánh giá tương đương sinh học của thuốc
[5],[12],[17],[19],[20],[30],[31].
Thị trường Việt Nam hiện nay đang lưu hành dạng chế phẩm chứa tenofovir
alafenamid (dưới dạng muối tenofovir alafenamid fumarat). Tuy nhiên, chế phẩm này
chưa được đánh giá tương đương sinh học so với thuốc gốc. Trong nước, vẫn chưa
có cơng trình cơng bố về phương pháp định lượng đồng thời tenofovir alafenamid và
chất chuyển hóa tenofovir trong huyết tương người.
Xuất phát từ những lý do trên, đề tài: “XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI TENOFOVIR ALAFENAMID VÀ TENOFOVIR TRONG
HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI
PHỔ” được thực hiện để góp phần vào việc đánh giá tương đương sinh học của các
chế phẩm chứa tenofovir alafenamid đang lưu hành ở Việt Nam. Mục tiêu của đề tài
là:

- Xác định chuẩn nội, điều kiện sắc ký và điều kiện khối phổ thích hợp.
- Xây dựng quy trình chiết tenofovir alafenamid và chất chuyển hóa tenofovir trong
huyết tương người.
- Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời tenofovir alafenamid và
chất chuyển hóa tenofovir trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS.
Việc thẩm định được thực hiện theo tài liệu hướng dẫn của US-FDA và EMA về
thẩm định phương pháp phân tích mẫu sinh học.

.


.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
TENOFOVIR ALAFENAMID
1.1.1. Cấu trúc

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của tenofovir alafenamid.
Danh pháp IUPAC: propan-2-yl (2S)-2-[[[(2R)-1-(6-aminopurin-9-yl)propan-2yl]oxymethyl-phenoxyphosphoryl]amino]propanoate [27],[32].
Công thức phân tử: C21H29N6O5P [27],[32].
Khối lượng phân tử: 476,474 g/mol [27],[32].
1.1.2. Tính chất lý hóa
Tenofovir alafenamid là chất bột kết tinh màu trắng [27],[32].
Độ tan: 4,86 mg/mL ở 20 oC (trong nước) [27],[32].
Giá trị pKa: 3,96 [27],[32].
1.1.3. Cơ chế tác dụng
Tenofovir alafenamid (TAF) là tiền chất của tenofovir (TFV), việc gắn nhóm
alafenamid giúp hạn chế tác dụng của các enzym esterase, giúp thuốc trở nên ổn định

hơn khi lưu thông trong cơ thể. TAF chỉ nhạy với một số enzym đặc hiệu trong tế bào
đích như cathepsin A (CatA) trong tế bào máu ngoại vi và carboxylesterase 1 (CES1)
trong tế bào gan. Điều này cho thấy sự bền vững của TAF so với TDF, chất dễ dàng
phân hủy thành TFV khi chưa được vận chuyển đến tế bào đích làm nồng độ TFV
tăng cao trong cơ thể là nguyên nhân dẫn đến nhiều độc tính trên thận và xương. Khi

.


.

4

hấp thụ vào cơ thể, TAF đi vào tế bào gan thơng qua q trình khuếch tán thụ động
và qua các kênh vận chuyển hấp thu ở gan OATP1B1 và OATP1B3 [6],[7],[15],[23].
Huyết tương

Tế bào gan

Khuếch tán thụ động

Đào thải qua thận

Hình 1.2. Cơ chế tác dụng của tenofovir alafenamid trên tế bào gan [15].
TAF đã được chứng minh khả năng kháng virus cao ở liều thấp hơn mười lần so với
liều TDF vì tính ổn định hơn trong huyết tương và khả năng được vận chuyển hiệu
quả đến tế bào đích, nơi mà sau đó được phosphoryl hóa thành chất chuyển hóa hoạt
động TFV-DP. Sau khi dùng thuốc TAF, nồng độ TFV trong huyết tương thấp hơn
90% so với trường hợp dùng TDF. TAF không phải là chất nền của OAT1 hoặc OAT3
(là các kênh vận chuyển anion trên tế bào ống thận), cùng với nồng độ TFV trong

huyết tương thấp, do đó, TAF khơng thể tích lũy trong các tế bào ống thận, góp phần
giảm nguy cơ độc tính trên thận so với TDF [22].

.


.

5

Huyết tương

Tế bào nhiễm HIV

Đào thải qua thận

Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của tenofovir alafenamid trên tế bào nhiễm HIV [22].
Với liều đường uống TAF 25 mg tương đương với liều uống TDF 300 mg, nồng độ
TFV trong huyết tương thấp hơn 90% trong khi vẫn duy trì được nồng độ cao chất
chuyển hóa có hoạt tính TFV-DP trong tế bào đích [4].
Tế bào ống

Đường tiêu hóa

thận

Huyết tương

Tế bào lympho

T1/2 ngắn
T1/2 dài, ổn định trong huyết tương
Nồng độ TFV trong huyết tương thấp hơn 90%

Tế bào ống
thận

Hình 1.4. So sánh hiệu quả của việc vận chuyển đến tế bào nhiễm HIV sau khi
uống các sản phẩm tenofovir [4].

.


.

6

1.1.4. Dược động học
Hấp thu: Sau khi uống, TAF hấp thu nhanh, thời gian đạt nồng độ đỉnh (Tmax) khoảng
0,48 giờ, bữa ăn giàu chất béo làm tăng sinh khả dụng của thuốc (khoảng 65%), là
chất nền cho P-glycoprotein, nên các thuốc như carbamazepin, oxcarbazepin,
phenobarbital, phenytoin, rifabutin, rifampin, rifapentin sẽ làm giảm sự hấp thu của
TAF [27].
Phân bố: TAF liên kết cao với protein huyết tương (khoảng 80%) [27].
Chuyển hóa: TAF chuyển hóa nhờ enzym carboxylesterase 1 (CES 1) ở gan và
enzym cathepsin A (CatA) trong tế bào máu ngoại vi, ngồi ra cịn một lượng nhỏ
chuyển hóa qua cytochrom CYP3A [11],[27].
Thải trừ: chủ yếu qua phân (31,7%), một lượng nhỏ qua nước tiểu (< 1%), t1/2 = 0,51
giờ [27].

TENOFOVIR
Tenofovir là chất chuyển hóa của tenofovir alafenamid.
1.2.1. Cấu trúc

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của tenofovir.
Danh pháp IUPAC: ({[(2R)-1-(6-amino-9H-purin-9-yl) propan-2-yl] oxy} methyl)
phosphonic acid [33].
Công thức phân tử: C9H14N5O4P [33].
Khối lượng phân tử: 287,212 g/mol [33].
1.2.2. Tính chất lý hóa
Tenofovir là chất bột kết tinh màu trắng [33].

.


.

7

Độ tan: 13,4 mg/mL ở 20 oC (trong nước) [33].
Giá trị pKa: 3,8 và 6,7 [33].
Tỷ lệ liên kết với protein huyết tương thấp (khoảng 7,9 %), t1/2 = 32 giờ [33].
1.2.3. Cơ chế tác dụng
Tenofovir alafenamid khi được hấp thu vào cơ thể bị thủy phân bởi enzym
carboxylesterase 1, tạo thành chất chuyển hóa tenofovir, sau đó tenofovir được
phosphoryl hóa thành chất chuyển hóa hoạt động tenofovir diphosphat (TFV-DP),
chất này ức chế enzym polymerase của ADN virus viêm gan B và ức chế enzym
phiên mã ngược của virus HIV-1, do cạnh tranh với chất nền tự nhiên deoxyadenosin
5′-triphosphat, sau khi gắn vào ADN sẽ chấm dứt kéo dài thêm chuỗi AND, có hiệu
quả chống lại cả HBV và HIV-1 [2],[6],[15],[23].

1.2.4. Dược động học
Tenofovir thể hiện sinh khả dụng rất thấp khi dùng đường uống. Sự giảm hấp thụ này
có liên quan đến sự hiện diện của hai điện tích âm trong cấu trúc. Điện tích âm này
hạn chế sự xâm nhập tế bào và sự khuếch tán thụ động TFV qua màng tế bào và niêm
mạc ruột. Do đó, TFV thường được sử dụng dưới hai dạng tiền dược là tenofovir
disoproxil và tenofovir alafenamid với mục đích tăng sự bền vững, tăng sự hấp thu
từ đó tăng sinh khả dụng của thuốc [33].

TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ (LC-MS/MS)
1.3.1. Đại cương
Máy phân tích phổ khối lượng (thường được gọi là máy đo phổ khối – Mass
Spectrometer – MS) dựa trên sự đo lường trực tiếp tỷ lệ khối lượng theo thế điện tích
(ký hiệu là m/z) của những ion trong pha khí của chất phân tích [3].
Những ion của chất phân tích được sinh ra từ nguồn ion của máy được gia tốc và
được tách ra bởi bộ phận phân tích trước khi đến được bộ phận phát hiện. Tất cả quá
trình này xảy ra trong một buồng có hệ thống bơm chân khơng sâu, đạt từ 10-3 đến
10-6 Pa [3].

.


.

8

Phổ khối lượng thu được chỉ ra sự tương quan giữa số lượng các ion có giá trị m/z
(đến bộ phận phát hiện) theo giá trị m/z. Đa số các ion đều mang điện tích dương +1
nên tỷ lệ m/z tương đương với m (do đó thường gọi là phổ khối) [3].
Thông tin từ khối phổ đồ cho phép định tính (dựa vào khối lượng phân tử, cấu trúc
phân mảnh) và định lượng (dùng chất chuẩn nội hay chuẩn ngoại) với giới hạn phát

hiện từ picomol (10-12 M) đến femtomol (10-15 M) [3].
Khối phổ là kỹ thuật phân tích nhạy và có tính chọn lọc tốt bằng cách đo lường trực
tiếp tỷ lệ khối lượng theo điện tích của ion đó (m/z). Tuy nhiên, kỹ thuật này khơng
thể tách một chất phân tích từ những mẫu có hàng ngàn phân tử có khối lượng phân
tử giống nhau, nên cần một kỹ thuật tách trước khi vào máy khối phổ như sắc ký lỏng,
sắc ký khí, điện di mao quản.
Việc ghép máy sắc ký lỏng với máy khối phổ phức tạp hơn nhiều vì nhiều yếu tố
khơng tương thích về kỹ thuật giữa hai máy cần phải giải quyết:
- Máy sắc ký lỏng: hoạt động ở áp suất cao, nhiệt độ thấp, mẫu phân tích ở thể lỏng
trong pha động (đơi khi khó bay hơi như dung dịch đệm), lưu lượng lớn (vài
mL/phút),...
- Máy khối phổ: hoạt động ở áp suất chân khơng sâu, nhiệt độ cao, mẫu phân tích phải
ở thể khí, lưu lượng nhỏ (vài µL/phút) [3].
Do đó cần có những giao diện trung gian (interface) thích hợp như: giao diện đưa
mẫu lỏng trực tiếp, giao diện chùm tia hạt (partical beam), giao diện FAB, giao diện
tia nhiệt (thermospray), giao diện APCI [3].

.


.

9

Nguồn
ion

Đầu vào

Bộ phận

phân tích

Bơm chân
khơng

Mẫu thử

Bộ phận
phát
hiện ion

Mẫu thử
Hệ
thống
thơng
tin

Thơng tin
đầu ra

Nguồn
ion hóa

Bộ phận
phân
tích khối
lượng

Phổ khối
lượng

Bộ phận

phát hiện
ion

Phân tích dữ liệu

Hình 1.6. Sơ đồ giản lược của một khối phổ kế [13]
1.3.2. Các kiểu ion hóa trong LC – MS/MS

Độ nhạy

Khoảng
khối lượng
Khoảng
khối

Hình 1.7. Độ nhạy và khoảng khối lượng giới hạn cho các kiểu ion hóa
trong LC – MS/MS [13]
Có hai kiểu ion hóa thơng dụng cho hệ thống LC-MS/MS là ESI và APCI.
Ion hóa tia điện (Electrospray Ionization – ESI)
Mẫu phân tích được hịa tan trong dung mơi để tạo thành dung dịch điện ly. Dung
dịch điện ly này cùng với khí mang được phun sương ra khỏi ống mao quản bằng
thép không gỉ với vận tốc 1 – 10 µL/phút đi vào vùng điện trường có thế từ 3 – 6 kV
trong áp suất khí quyển ở nhiệt độ phòng. Ra khỏi đầu mao quản, các giọt sương

.

.

0

mang điện tích âm hay dương (tùy thuộc vào điện thế dương hay âm của điện trường)
bị bay hơi dung môi nên càng ở xa đầu phun, giọt sương càng có kích thước nhỏ và
bị hút vào bộ phận phân tích khối lượng [3].
Trong kiểu ion hóa này mẫu thử phải được chuyển hóa thành chất điện ly mà điều
này phụ thuộc vào dung môi, pKa của mẫu thử trong dung môi và pH của dung dịch
điện ly [3].
Các yêu cầu đối với chất phân tích khi áp dụng kỹ thuật ESI [4],[11]:
- Chất phân tích nhất thiết phải tồn tại dạng ion, tan trong dung dịch dùng để phun
sương.
- Chất phân tích khơng cần bay hơi.
- Chất phân tích khơng cần bền với nhiệt.
Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization
– APCI)
Mẫu được hịa tan vào pha động từ máy sắc ký lỏng cho đi ngang qua một ống mao
quan đốt nóng và được phun sương ra khỏi ống mao quan nhờ dịng khí mang nitrogen
với lưu lượng dịng có thể đến 1 mL/phút. Các giọt sương này đi vào vùng điện trường
có điện cực corona ở điện thế vài kV. Sự ion hóa có được do hiệu ứng nhiệt ở áp suất
khí quyển để tạo thành ion tựa phân tử (M+H)+ nếu trao đổi proton, hoặc tạo thành
ion tựa phân tử (M-H)- nếu trao đổi electron. Các ion này bị hút vào bộ phân tích khối
lượng do áp suất chân khơng ở đây [3].
Kiểu ion hóa này có thể tạo ra một số phân mảnh ion và thích hợp cho những phân
tích những hợp chất có phân tử lượng nhỏ, độ phân cực trung bình rửa giải từ máy
HPLC [3].
1.3.3. Bộ phận tách các ion
Các ion tạo thành ở bộ phận ion hóa có m/z khác nhau sẽ được tách theo số khối nhờ
bộ phận từ trường, điện trường. Các bộ phận tách ion chính đang được sử dụng phổ

biến bao gồm:
- Bẫy ion (Ion Trap)
- Từ trường

.


.

1

- Thời gian bay (Time-of-Flight).
- Tứ cực (Quadrupole) [3].
Các bộ phận tách ion này khác nhau về cấu tạo và nguyên lý. Mỗi loại có ưu và nhược
điểm, trong đề tài này, bộ phận tách ion kiểu tứ cực sẽ được sử dụng.
Đây là bộ phận thông dụng, rẻ tiền, việc điều khiển các thanh điện thế trong tứ cực
đạt độ chính xác hơn việc kiểm sốt từ trường trong máy sử dụng từ trường. Sự khác
biệt là ở bộ phận phân tích khối lượng gồm hai cặp thanh hình trụ được đặt song song
một cách chính xác. Một hiệu điện thế gồm vừa điện một chiều U, vừa điện xoay
chiều có tần số rất cao 108 Hz (V.cos.ωt) được áp đặt vào hai thanh kề nhau nên chúng
chịu một hiệu thế chung (U + V.cos.ωt). Với một giá trị cố định (U + V.cos.ωt) chỉ
những ion với động năng đặc trưng nào đó mới có thể đi vượt qua các thanh tứ cực
để đến được bộ phận thu nhận tín hiệu [3].
Bộ phận tách khối ba tứ cực (Triple quadrupole)
Gồm ba bộ tứ cực nối với nhau (Q1Q2Q3) trong đó Q1 và Q3 có cấu trúc giống
nhau như một tứ cực, có tác dụng chọn lọc ion. Tại Q2 (là buồng va chạm có vai trị
tạo ra sự phân ly ion do va chạm), các ion ban đầu sẽ bị va chạm tạo thành các ion
phân mảnh [25].

Hình 1.8. Bộ phận tách khối ba tứ cực [13].

1.3.4. Một số kỹ thuật ghi phổ
Kỹ thuật full scan
Khi thao tác với kỹ thuật full scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho
phổ khối toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thường dùng
để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Mỗi pic trên sắc ký
đồ đều có một phổ khối. Kỹ thuật này có độ nhạy khơng cao, nhiễu đường nền có thể

.