Xây dựng quy trình phát hiện nấm candida spp, bằng phương pháp multiplex pcr

.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN HIẾU

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NẤM
CANDIDA SPP. BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

.


.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN HIẾU

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NẤM

CANDIDA SPP. BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR
NGÀNH: DƯỢC LÝ VÀ DƯỢC LÂM SÀNG
MÃ SỐ: 8720205

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. NGUYỄN TÚ ANH
TS. TRẦN QUỐC VIỆT

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

.


.

LỜI CAM ĐOAN
Tơi tên là Nguyễn Hiếu, học viên khóa 2019 – 2021 Trường Đại học Y Dược
Thành phố Hồ Chí Minh, chuyên ngành Dược lý và Dược lâm sàng, xin cam đoan:
1.

Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện tại Bộ môn Vi Ký Sinh dưới

sự hướng dẫn của PGS. TS. Nguyễn Tú Anh và TS. Trần Quốc Việt.
2.

Các số liệu, hình ảnh, kết quả trong nghiên cứu là chính xác, trung thực và

khách quan.

Tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những cam kết này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 03 tháng 12 năm 2021
Người viết cam đoan
(Ký và ghi rõ họ tên)

.


.

i

MỤC LỤC
MỤC LỤC ............................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ iv
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ v
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. vii
DANH MỤC SƠ ĐỒ............................................................................................ viii
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3
1.1. Candida spp. ............................................................................................... 3
1.1.1. Tổng quan ............................................................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm chung....................................................................................... 4
1.2. Khả năng gây bệnh ...................................................................................... 6
1.2.1 Nhiễm nấm Candida không xâm lấn ........................................................ 6
1.2.2. Nhiễm nấm Candida xâm lấn .................................................................. 7
1.3. Yếu tố độc lực ............................................................................................. 9
1.4. Các điều kiện thuận lợi để vi nấm Candida spp. gây bệnh ......................... 11
1.5. Dịch tễ học ................................................................................................ 13
1.6. Dịch tễ và tình hình đề kháng thuốc kháng nấm ở Việt Nam...................... 15
1.7. Xét nghiệm chẩn đoán, kháng nấm đồ và điều trị nhiễm Candida spp. ...... 16

1.7.1. Xét nghiệm chẩn đoán ........................................................................... 16
1.7.2. Kháng nấm đồ ....................................................................................... 18
1.7.3. Điều trị theo kinh nghiệm ...................................................................... 19
1.7.4. Điều trị theo tác nhân gây bệnh ............................................................. 20
1.8. Các phương pháp định danh Candida spp. ................................................. 21
1.9. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm Candida spp. ...................................... 22

.


.

ii

1.9.1. Quan sát hình thái.................................................................................. 22
1.9.2. Phản ứng sinh hóa ................................................................................. 24
1.9.3. Phương pháp sinh học phân tử ............................................................... 24
1.10. PCR và multiplex PCR ............................................................................ 24
1.11. Tin sinh học ............................................................................................. 27
1.12. Các nghiên cứu trong và ngoài nước ........................................................ 28
2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 30
2.2. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 30
2.2.1. Dụng cụ ................................................................................................. 30
2.2.3. Hóa chất ................................................................................................ 31
2.2.4. Môi trường nuôi cấy và phân lập vi nấm................................................ 32
2.3. Phương pháp nghiên cứu........................................................................... 32
2.3.1. Pháp phát hiện Candida spp. theo phương pháp truyền thống ................ 33
2.3.2. Phát hiện Candida spp. bằng PCR và multiplex PCR ............................ 34
2.3.4. Giải trình tự ........................................................................................... 39
2.3.3. Biện giải kết quả .................................................................................... 39

2.4. Y đức......................................................................................................... 39
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................. 41
3.1. Thu nhận mẫu ............................................................................................ 41
3.2. Phân lập mẫu nấm trên môi trường CHROMagar Candida ........................ 44
3.3. Kết quả thử nghiệm tạo ống mầm .............................................................. 47
3.4. Thực hiện PCR trên các chủng Candida chuẩn .......................................... 48
3.5. Multiplex PCR........................................................................................... 51
3.6. Phân tích trình tự các đoạn gen được khuếch đại ....................................... 58

.


.

iii

3.7. So sánh kết quả phát hiện Candida spp. giữa các phương pháp.................. 59
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ................................................................................... 62
4.1. Mẫu bệnh phẩm nhiễm Candida spp. ......................................................... 62
4.2. Phân lập Candida spp. trên môi trường CHROMagar Candida .................. 62
4.3. Thử nghiệm tạo ống mầm .......................................................................... 63
4.4. PCR trên các chủng Candida spp. chuẩn ................................................... 64
4.5. Multiplex PCR phát hiện 04 loài Candida spp. .......................................... 64
4.6. Phân tích trình tự gen khuếch đại ............................................................... 65
4.7. So sánh phát hiện Candida spp. bằng 3 phương pháp ................................ 65
4.8. Bàn luận chung .......................................................................................... 70
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................. 73
5.1. Kết luận ..................................................................................................... 73
5.2. Kiến nghị ................................................................................................... 75
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 76

.


.

iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Từ nguyên

Tiếng Việt

Centers for Disease Control

Trung tâm kiểm sốt và phịng

and Prevention

ngừa dịch bệnh Mỹ

DNA

Deoxyribonucleic Acid

Acid deoxyribonucleic

ICU

Intensive Care Unit

Đơn vị Chăm sóc tích cực

Infectious diseases society of

Hiệp hội bệnh truyền nhiễm

America

Mỹ

CDC

IDSA
IGS

Intergenic spacer

ITS

Internal transcribed spacer

NAC

Non-albicans Candida

Các lồi Candida khơng phải
Candida albicans

National Center for

Trung tâm Thông tin Công

Biotechnology Information

nghệ sinh học Quốc gia Mỹ

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi Polymerase

RNA

Ribonucleic Acid

Acid ribonucleic

VVC

Vulvovaginal Candidiasis

Bệnh nấm Candida âm đạo

NCBI

.

.

v

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Phân loại Candida spp. ............................................................................ 3
Hình 1.2. Hình thái nấm Candida spp. ..................................................................... 4
Hình 1.3. Hình thái khóm nấm Candida spp. trên mơi trường SDA ......................... 5
Hình 1.4. Trình tự đoạn ITS, IGS ở tế bào nhân thật .............................................. 21
Hình 1.5. Ống mầm quan sát dưới kính hiển vi X100 ............................................ 22
Hình 1.6. Bào tử bao dày ở C. albicans ................................................................. 23
Hình 1.7. Khóm nấm Candida spp. trên CHROMagar Candida ............................. 23
Hình 1.8. Các bước của một chu kỳ PCR ............................................................... 25
Hình 1.9. Multiplex PCR ....................................................................................... 26
Hình 3.1. Khóm nấm màu xanh lá trên CHROMagar Candida ............................... 45
Hình 3.2. Khóm nấm màu trắng trên CHROMagar Candida .................................. 45
Hình 3.3. Khóm nấm màu tím trên CHROMagar Candida ..................................... 46
Hình 3.4. Khóm nấm màu xanh kim loại trên CHROMagar Candida ..................... 46
Hình 3.5. Khóm nấm mẫu 09, 27, 38 trên CHROMagar Candida........................... 46
Hình 3.6. Ống mầm quan sát dưới kính hiển vi X100 của một số mẫu nấm ........... 47
Hình 3.7. Ống mầm giả quan sát dưới kính hiển vi X100 của một số mẫu ............. 48
Hình 3.8. Sản phẩm PCR ở nhiệt độ gắn mồi 55 oC sau khi điện di........................ 49
Hình 3.9. Sản phẩm PCR ở nồng độ MgSO4 2,2 mM sau khi điện di ..................... 49
Hình 3.10. Sản phẩm PCR ở nồng độ Taq 1,25 UI sau khi điện di ......................... 50
Hình 3.11. Sản phẩm PCR ở nồng độ dNTP 0,2 mM sau khi điện di ..................... 50
Hình 3.12. Sản phẩm PCR ở nồng độ mồi 0,12 pmol sau khi điện di ..................... 50
Hình 3.13. Sản phẩm multiplex PCR ở nhiệt độ gắn mồi ở 59 oC sau khi điện di ... 52
Hình 3.14. Sản phẩm multiplex PCR ở nồng độ MgSO4 2,8 mM sau khi điện di... 52

Hình 3.15. Sản phẩm multiplex PCR ở nồng Taq polymerase 1,5 UI sau khi điện di
.............................................................................................................................. 53
Hình 3.16. Sản phẩm multiplex PCR với nồng độ dNTP 0,2 mM sau khi điện di .. 53
Hình 3.17. Sản phẩm multiplex PCR với nồng độ mồi tối ưu sau khi điện di ......... 54
Hình 3.18. Sản phẩm multiplex PCR từ các mẫu nấm 01 - 08 sau khi điện di ........ 56

.


.

vi

Hình 3.19. Sản phẩm multiplex PCR từ các mẫu nấm 09 - 16 sau khi điện di ........ 56
Hình 3.20. Sản phẩm multiplex PCR từ các mẫu nấm 17 - 24 sau khi điện di ........ 57
Hình 3.21. Sản phẩm multiplex PCR từ các mẫu nấm 25 - 32 sau khi điện di ........ 57
Hình 3.22. Sản phẩm multiplex PCR từ các mẫu nấm 33 - 40 sau khi điện di ........ 57

.


.

vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Màu sắc khóm nấm Candida spp. trên CHROMgar Candida ................... 6
Bảng 1.2. Một số đặc điểm gây bệnh của Candida................................................. 13
Bảng 1.3. Dịch tễ của các loài Candida spp. gây bệnh giai đoạn 1997 - 2016 ....... 14
Bảng 1.4. Dịch tễ các loài Candida spp. gây bệnh theo vùng địa lý ....................... 14

Bảng 1.5. Phân bố Candida spp. phân lập từ mẫu bệnh phẩm ................................ 15
Bảng 1.6. So sánh các xét nghiệm chẩn đoán Candida spp .................................... 17
Bảng 1.7. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của một số thuốc kháng nấm................ 18
Bảng 1.8. Phổ tác dụng của một số thuốc kháng nấm............................................. 20
Bảng 1.9. Một số giải pháp tối ưu hóa multiplex PCR ........................................... 27
Bảng 2.1. Thiết bị .................................................................................................. 30
Bảng 2.2. Hóa chất ................................................................................................ 31
Bảng 2.3. Thành phần dung dịch chiết DNA.......................................................... 34
Bảng 2.4. Thành phần dung dịch phân tán DNA .................................................... 35
Bảng 2.5. Các cặp mồi đặc hiệu của Candida spp. ................................................. 36
Bảng 2.6. Thành phần PCR ................................................................................... 36
Bảng 2.7. Thành phần multiplex PCR .................................................................... 37
Bảng 3.1. Mẫu nấm thu nhận tại Bệnh viện Quân Y 175 ....................................... 41
Bảng 3.2. Mẫu nấm thu nhận tại Bệnh viện Đại học Y Dược TP.HCM.................. 42
Bảng 3.3. Mẫu nấm thu nhận tại Bệnh viện Lê Văn Thịnh ..................................... 43
Bảng 3.4. Thành phần PCR đơn............................................................................. 51
Bảng 3.5. Điều kiện PCR đơn ................................................................................ 51
Bảng 3.6. Thành phần multiplex PCR phát hiện 04 lồi Candida .......................... 54
Bảng 3.7. Chương trình multiplex PCR phát hiện 04 loài Candida ........................ 55
Bảng 3.8. Kết quả phân tích trình tự nucleotide của các sản phẩm PCR ................. 58
Bảng 3.9. Kết quả phát hiện Candida spp. bằng phân lập trên CHROMagar Candida,
thử nghiệm ống mầm và multiplex PCR ................................................................ 59

.


.

viii

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ......................................................................... 32
Sơ đồ 2.2. Các bước chiết tách DNA ..................................................................... 35

.


.

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh lý do nấm Candida spp. gây ra khơng nguy hiểm đến tính mạng nhưng
gây khó chịu, làm ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân nếu không
được chữa trị. Tuy nhiên, nếu nhiễm Candida xâm lấn (invasive candidiasis) sẽ có
nguy cơ tử vong khoảng 60%. Theo Trung tâm kiểm sốt và phịng ngừa dịch bệnh
Mỹ (Centers for Disease Control and Prevention - CDC) và Mạng lưới an tồn chăm
sóc sức khỏe quốc gia của Mỹ, Candida spp. được xếp ở vị trí thứ 5 trong các tác
nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và đứng thứ 4 trong số các tác nhân gây nhiễm
khuẩn máu [51]. Tỉ lệ nhiễm nấm Candida spp. có xu hướng gia tăng rõ rệt trong ba
thập kỷ qua, liên quan đến việc sử dụng thuốc chống ung thư, thuốc ức chế miễn dịch,
các kháng sinh phổ rộng, ghép tạng, dinh dưỡng qua đường tĩnh mạch, các thiết bị
cấy ghép [36, 40]. Khoảng 96% chủng Candida spp. phân lập được từ mẫu bệnh phẩm
tại khoa chăm sóc tích cực (Intensive Care Unit – ICU) và khoa điều trị khác do 5
loài gây ra: C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis và C. krusei [27].
Trong 20 năm qua, tỉ lệ các loài Candida spp. phân lập từ bệnh nhân nhiễm nấm
Candida đã thay đổi. Tỉ lệ nhiễm C. albicans đã giảm, trong khi tỉ lệ nhiễm (nonalbicans Candida - NAC) gia tăng. Hiện nay, tại Việt Nam, khuynh hướng dịch
chuyển này cũng đang xảy ra với tỉ lệ nhiễm cao nhất ở 04 loài C. albicans,
C. glabrata, C. tropicalis và C. parapsilosis [10, 11, 15]. Sự thay đổi tác nhân gây
bệnh đã ảnh hưởng đến chỉ định điều trị. Cụ thể, C. glabrata có mang yếu tố đề kháng

nội sinh đối với các azole và enchinocadin [13], C. tropicalis là loài vốn nhạy cảm
với fluconazole, tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây đã ghi nhận sự xuất hiện của tình
trạng kháng fluconazole của loài này [54, 24]. C. parapsilosis được báo cáo có tính
đề kháng cao đối với echinocandin, một số chủng C. parapsilosis có khả năng kháng
azole [37, 16, 39]. Khả năng đề kháng thuốc dù là đề kháng tự nhiên hay đề kháng
mắc phải đều dẫn đến thất bại điều trị. Hiện nay có nhiều khuyến cáo sử dụng các
thuốc kháng nấm điều trị theo kinh nghiệm đối với các trường hợp nhiễm nấm
Candida xâm lấn khi chưa xác định được lồi gây bệnh, trong đó nhóm echinocandin
thường được sử dụng như liệu pháp đầu tay, mặc dù Candida spp. đáp ứng khác nhau

.


.

2

đối với nhóm thuốc này. Trong một số trường hợp, điều trị thuốc kháng nấm theo
kinh nghiệm sẽ làm trầm trọng hơn tình trạng của bệnh nhân. Việc chẩn đốn và xác
định chính xác lồi Candida spp. gây bệnh sẽ cung cấp bằng chứng trong việc lựa
chọn thuốc kháng nấm phù hợp nhằm gia tăng hiệu quả điều trị, giảm độc tính, giảm
tỉ lệ tử vong và giảm chi phí điều trị cho bệnh nhân. Tuy nhiên, việc chẩn đoán xác
định lồi Candida gây bệnh cịn hạn chế. Cấy máu có thể phát hiện Candida spp.
nhưng cũng chỉ cho kết quả dương tính 50% - 70%. Xét nghiệm phát hiện 1,3 β-Dglucan, đã được Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Mỹ (Food and Drug
Administration - FDA) phê chuẩn nhưng chỉ có độ nhạy 75 - 100% và độ đặc hiệu 88
- 100%. Tuy nhiên, đây là một xét nghiệm phổ rộng, có thể phát hiện cả các
chi Aspergillus, Candida, Fusarium, Acremonium và Saccharomyces. Hiện nay, các
phương pháp chẩn đốn sinh học phân tử có nhiều ưu điểm trong phát hiện, định danh
tác nhân vi sinh vật gây bệnh. Do đó, chúng tơi thực hiện đề tài "Xây dựng quy trình
phát hiện nấm Candida spp. bằng phương pháp Multiplex PCR" với các mục tiêu sau:

1. Xác định và tối ưu hóa điều kiện multiplex PCR phát hiện 04 nấm Candida
albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis và Candida tropicalis.
2. Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời 04 lồi nấm Candida albicans,
Candida glabrata, Candida parapsilosis và Candida tropicalis bằng phương
pháp multiplex PCR.

.


.

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Candida spp.
1.1.1. Tổng quan
Trong “Of the Epidemics”, Hippocrates đã mô tả bệnh nấm Candida ở miệng
(khoảng năm 400 trước Công nguyên) là “miệng bị loét do áp-tơ”. Năm 1839,
Langenbeck lần đầu tiên ghi nhận lồi nấm có liên quan đến bệnh tưa miệng. Năm
1847, nhà nghiên cứu nấm học nổi tiếng người Pháp, Charles Philippe Robin, đã phân
loại nấm là Oidium albicans, bằng cách sử dụng “albicans” (làm trắng) để đặt tên cho
loài nấm gây bệnh tưa miệng. Năm 1923, Christine Berkout phân loại Candida vào
chi Candida. Đến năm 1954, Đại hội thực vật lần thứ 8 chính thức chấp thuận tên
Candida.
Candida spp. thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, phân ngành
Saccharomycotina, lớp Haemiascomycetes, nhóm Candida và Saccharomyces.
Nhánh Candida gồm các loài C. albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis và
C. parapsilosis. Nhánh Saccharomyces có C. glabrata, C. krusei (Hình1.1) [2, 18].

Hình 1.1. Phân loại Candida spp.

.


.

4

1.1.2. Đặc điểm chung
Nấm Candida spp. sống hoại sinh ở người và các động vật máu nóng. Kích
thước nhỏ, hình bầu dục, đơn bào, sinh sản bằng cách nảy chồi hoặc nảy mầm. Khi
nhuộm gram, cả nấm men và khuẩn ty giả đều bắt màu gram dương. Hình dạng có
thể thay đổi tùy theo điều kiện môi trường, từ tế bào nấm men hình cầu, nảy chồi cho
bào tử chồi, dạng sợi nấm giả ngắn (pseudohyphae) và dài đến sợi nấm thật (hyphae)
[2, 9, 5] (Hình 1.2). Candida spp. sinh sản bằng cách nảy chồi hoặc sinh sợi tơ nấm
giả. Chúng sinh sống chủ yếu ở cơ quan tiêu hóa nhưng cũng có thể sống hoại sinh ở
âm đạo, niệu đạo, da và móng. Khi gặp điều kiện thuận lợi, vi nấm từ dạng hoại sinh
sẽ chuyển sang dạng ký sinh gây bệnh. Đặc trưng của sự chuyển trạng thái này là số
lượng tế bào vi nấm tăng lên nhanh và hình thành những sợi nấm giả (khuẩn ty giả),
nhờ vậy vi nấm có thể xâm nhập vào ký chủ để gây bệnh [5, 4, 2]. Candida spp. dễ
bị tiêu diệt bởi nhiệt độ, mơi trường khơ, có thể tồn tại ở mơi trường ẩm.

Hình 1.2. Hình thái nấm Candida spp. [97]
Candida albicans
Trên mơi trường SDA, khóm nấm nhỏ, màu trắng, bề mặt trơn (Hình 1.3). Tế
bào nấm quan sát dưới kính hiển vi có hình trịn hoặc bầu dục, kích thước 3,5 - 7 x 4
- 8 μm. Trên thạch bột ngô - Tween 80 ở 25 ºC trong 72 giờ, quan sát thấy sợi nấm
giả và một số sợi nấm thật, hình thành với các cụm hình trịn và các bào tử trần nảy
chồi ở các ngăn. Các bào tử dày lớn có hình thái đặc trưng, các bào tử dày bị ức chế
hình thành ở 30 - 37 ºC. C. albicans và C. dubliniensis tạo ống mầm dương tính trong

huyết thanh [46].

.


.

5

Candida tropicalis
Trên mơi trường SDA, khóm nấm màu kem hoặc từ trắng đến xám, bề mặt
mịn mềm hoặc nhăn (Hình 1.3). Tế bào nấm có hình trịn hoặc bầu dục, kích thước
3,5 - 7 x 5,5 - 10 μm. Trên thạch bột ngô - Tween 80 ở 25 ºC trong 72 giờ, C. tropicalis
hình thành bào tử trần nảy chồi đơn lẻ hoặc theo từng cụm dọc theo những sợi nấm
giả dài, một số sợi nấm thật cũng có thể được hình thành, có thể quan sát được một
vài bào tử dày có hình giọt nước [46].
Candida parapsilosis
Trên mơi trường SDA, C. parapsilosis hình thành khóm nấm màu trắng, màu
trắng kem, bóng và nhẵn hoặc nhăn (Hình 1.3). Tế bào nấm men có hình trứng, kích
thước 2,5 - 4 x 3 - 8 μm. Trên thạch bột ngô - Tween 80 ở 25 ºC trong 72 giờ, bào tử
trần nảy chồi đơn lẻ hoặc mọc theo các cụm nhỏ dọc theo các sợi nấm giả. Đặc điểm
nổi bật là sự xuất hiện của các sợi nấm giả thường cong hơn so với C. tropicalis, các
sợi nấm lớn cũng xuất hiện thường xun hơn [46].
Candida glabrata
Trên mơi trường SDA, khón nấm C. glabrata nhỏ màu kem lấp lánh, mịn,
tương tự như các lồi Candida spp. khác (Hình 1.3). Trên thạch bột ngô - Tween 80
ở 25 ºC trong 72 giờ, tế bào nấm hình bầu dục, có kích thước 2 - 3 x 3 - 4 μm với các
chồi nhỏ. C. glabrata khơng hình thành sợi nấm giả [46].

C. albicans

C. parapsilosis

C. tropicalis

C. glabrata

Hình 1.3. Hình thái khóm nấm Candida spp. trên môi trường SDA [95]

.


.

6

Trên mơi trường CHROMagar Candida, các khóm nấm Candida spp. có màu
sắc khác nhau theo lồi (Bảng 1.1) [60].
Bảng 1.1. Màu sắc khóm nấm Candida spp. trên CHROMgar Candida
Candida spp.

Màu sắc khóm nấm

C. albicans

Xanh lá

C. glabrata

Tím đậm

C. tropicalis

Xanh dương với vầng tím, xanh tím

C. parapsilosis

Trắng đến tím

Candida spp. khác

Từ trắng ngà đến hồng đậm, tím

1.2. Khả năng gây bệnh
1.2.1 Nhiễm nấm Candida không xâm lấn
Bệnh nấm Candida miệng
Bệnh nấm miệng hay tưa miệng do C. albicans gây ra, được mô tả lần đầu tiên
vào năm 1838 bởi bác sĩ nhi khoa Francois Veilleux. C. albicans tồn tại trong khoang
miệng ở 30 - 50% người bình thường và 60% ở người trên 60 tuổi. Bệnh có biểu hiện
với các tổn thương màu trắng trên niêm mạc lưỡi, thường không đau. Nhiễm nấm
Candida miệng có thể xảy ra ở người có hệ miễn dịch bình thường hoặc suy giảm
miễn dịch nhưng phổ biến hơn ở người bị suy giảm miễn dịch như bệnh nhân
HIV/AIDS, bệnh nhân sử dụng liệu pháp ức chế miễn dịch, sử dụng glucocorticoid
dạng hít, đái tháo đường, hút thuốc lá, mang răng giả, suy dinh dưỡng, thiếu vitamin
và sử dụng kháng sinh phổ rộng. Bệnh nấm miệng do các loài Candida spp. gây ra,
các thường gặp nhất là C. albicans, nhưng cũng có thể do C. glabrata, C. tropicalis
và C. krusei. Các loài NAC đã được chứng minh thường gây bệnh nấm miệng ở bệnh
nhân trên 80 tuổi [57, 85].
Nấm Candida sinh dục (Genital candidasis)
Nhiễm nấm Candida âm đạo thường do nấm C. albicans - là một phần của hệ

vi sinh vật âm đạo của phụ nữ trong độ tuổi sinh sản. Trong đó, C. albicans chiếm
90%, 70% phụ nữ cho biết đã từng bị viêm âm hộ do nấm Candida spp. tại một thời

.


.

7

điểm nào đó trong đời. Ở Mỹ, Châu Âu và Úc, C. albicans là loài phổ biến nhất được
xác định ở phụ nữ bị viêm âm đạo do Candida (Vulvovaginal Candidasis – VVC) từ
76 đến 89%, tiếp theo là C. glabrata từ 7 đến 16%. Trong khi đó, các lồi NAC, đặc
biệt là C. glabrata là loài phổ biến gây ra VVC ở một số nước Châu Á và Châu Phi.
Khoảng 8% phụ nữ bị viêm âm hộ do nấm Candida tái phát. Các yếu tố nguy cơ gây
nhiễm nấm Candida bao gồm đái tháo đường, mang thai, dùng kháng sinh và dùng
corticosteroid kéo dài, sử dụng thuốc thụt rửa, thuốc xịt âm đạo, chất bôi trơn
hoặc chất diệt tinh trùng, suy giảm miễn dịch. Các triệu chứng thông thường là ngứa,
có hoặc khơng có tiết dịch. Các triệu chứng khác bao gồm khó tiểu và khó thở. Triệu
chứng bệnh thường khơng điển hình và khó phân biệt với dạng viêm âm đạo gây ra
bởi ký sinh trùng Trichomonas vaginalis, bệnh lậu hay bệnh do Chlamydia, nên cần
tiến hành các xét nghiệm như phết ướt, kiểm tra độ ẩm, độ pH, Whiff để đưa ra chẩn
đoán [42, 58]. Nam giới cũng có thể bị nhiễm nấm men sinh dục, nhưng ít phổ biến hơn
và thường xảy ra ở nam giới chưa cắt bao quy đầu, bệnh nhân đái tháo đường. Nấm
Candida spp. là nguyên nhân của 30 đến 35% trường hợp viêm quy đầu [58].
1.2.2. Nhiễm nấm Candida xâm lấn
Nấm Candida máu (Candidemia)
Nấm Candida máu là một trong những tình trạng của nhiễm nấm Candida xâm
lấn. Candida spp. là tác nhân gây nhiễm nấm máu phổ biến thứ tư tại khoa ICU.
Nhiễm Candida máu có tỉ lệ tử vong cao từ 30 - 60%. Candida spp. là một phần của

hệ vi sinh vật đường tiêu hóa bình thường. Cơ chế phổ biến nhất gây nhiễm Candida
máu là do Candida chuyển vị qua niêm mạc ruột sau một số thủ thuật xâm lấn. Các
yếu tố nguy cơ như đặt catheter tĩnh mạch trung tâm, dinh dưỡng toàn phần qua đường
tĩnh mạch, albumin huyết thanh thấp (< 2,5 mg/dl), giới tính nam, sử dụng liệu pháp
ức chế miễn dịch, ung thư, sau phẫu thuật. Biểu hiện lâm sàng của nấm Candida máu
không đặc trưng như ớn lạnh, sốt, nhiễm khuẩn máu và sốc nhiễm khuẩn với các dấu
hiệu tổn thương cơ quan nội tạng. C. albicans là tác nhân gây bệnh thường gặp, tiếp
theo là C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis, C. krusei. Nhiễm C. albicans, C.
tropicalis và C. glabrata máu thường có nguy cơ tử vong cao hơn [56, 70].

.


.

8

Nhiễm nấm đường tiết niệu (Candida Urinary Tract Infections)
Sự hiện diện của C. albicans và NAC trong nước tiểu được chẩn đoán nhiễm
nấm Candida niệu. Nhiễm nấm Candida đường tiết niệu được biết đến như tình trạng
nhiễm nấm bệnh viện thường xun nhất trên tồn thế giới. Các tình trạng nhiễm nấm
Candida niệu bao gồm viêm bàng quang, viêm bể thận, viêm tuyến tiền liệt, viêm
tinh hoàn. C. albicans và C. glabrata là hai loài chủ yếu gây nhiễm nấm đường tiết
niệu tại bệnh viện, trong đó C. glabrata chiếm 19 - 48%. Nhiễm nấm Candida niệu
có thể có triệu chứng hoặc không triệu chứng. Ở người nhiễm nấm Candida niệu có
triệu chứng với các triệu chứng khơng điển hình, khó phân biệt với viêm bàng quang
do vi khuẩn hoặc viêm bể thận. Các yếu tố nguy cơ bao gồm tuổi, giới tính nữ, ghép
thận, nhiễm đồng thời vi khuẩn đường tiết niệu, nhập viện kéo dài, bất thường bẩm
sinh đường tiết niệu, điều trị tại ICU, sử dụng thuốc kháng sinh phổ rộng, rối loạn
chức năng bàng quang, ứ nước tiểu, sỏi thận. Trong các bệnh nhân nhiễm nấm

Candida máu tại ICU thì 46 - 80% bệnh nhân kèm nhiễm nấm Candida niệu. Mặc
dù C. albicans và C. glabrata là hai loài phổ biến nhất trong nhiễm nấm Candida
niệu, các loài khác như C. parapsilosis, C. tropicalis và C. dubliniensis cũng được
báo cáo [61, 83].
Các bệnh nhiễm nấm Candida xâm lấn khác
Mắt: viêm màng mạch võng mạc xảy ra ở 2 - 26% bệnh nhân nhiễm Candida
xâm lấn, có thể kèm theo viêm thủy tinh thể.
Nhiễm Candida xâm lấn hệ thần kinh trung ương: có thể nhiễm sau phẫu thuật,
chấn thương, chọc dịch não tuỷ hoặc Candida theo đường máu đến não. Các thể bệnh
bao gồm viêm màng não, viêm u hạt mạch máu, viêm não lan tỏa với nhiều vi áp xe,
phình mạch do nấm.
Candida xâm lấn đường hơ hấp: có thể ở thanh quản, khí - phế quản hoặc phổi.
Viêm phổi do Candida thường nằm trong bệnh cảnh nhiễm Candida máu.
Viêm nội tâm mạc do Candida: chiếm 2 - 4% trường hợp viêm nội tâm mạc,
là thể nặng của nhiễm Candida xâm lấn, gặp ở bệnh nhân phẫu thuật thay van tim
nhân tạo.

.


.

9

Candida xâm lấn ổ bụng: xảy ra ở bệnh nhân viêm phúc mạc thứ phát, áp xe
ổ bụng, nhiễm khuẩn đường mật, viêm tụy cấp và viêm phúc mạc tái phát.
Viêm cơ, áp xe cơ do Candida: gây đau, thăm khám có dấu hiệu sưng, nóng,
đỏ, đau vùng cơ liên quan [1].
1.3. Yếu tố độc lực
Đa hình

Candida spp. là nấm đa hình có thể phát triển ở nhiều hình dạng khác nhau
như dạng trimera, dạng hợp tử, dạng nấm men, sợi nấm giả, sợi nấm. Tuy nhiên, nấm
Candida thường ở dạng hạt men, sợi nấm giả, sợi nấm. Ở điều kiện bình thường, nấm
Candida spp. chủ yếu tồn tại dạng hạt men, nhưng khi điều kiện môi trường thay đổi
như pH, nhiệt độ, lượng CO2, môi trường thiếu chất dinh dưỡng,… nấm men sẽ thay
đổi hình thái. Dạng sợi nấm liên quan đến khả năng gây nhiễm, dạng hạt men gây lây
lan của Candida spp.[68].
Chất kết dính
Candida spp. có hệ thống protein chuyên biệt có tác dụng như chất kết dính
làm trung gian gắn kết màng tế bào Candida spp. với các vi sinh vật khác trên tế bào
vật chủ và bề mặt phi sinh học [48]. Chất kết dính của Candida spp. có trình tự giống
agglutinin (ALS), từ Als1-Als9. Các gen ALS mã hóa glycoprotein bề mặt tế bào là
glycosylphosphatidylinositol (GPI). GPI liên kết với 1-6 glucan trong thành tế bào
nấm, vi nấm bám vào bề mặt của sinh vật, đây là yếu tố độc lực quan trọng của
Candida spp.. Chất kết dính Als5, Als6 và Als7 liên quan đến kết dính với nội mơ
của người, Als3 là thụ thể đặc hiệu của sợi nấm C. albicans liên kết với S. aureus.
Một chất kết dính quan trọng khác của C. albicans là Hwp1. Hwp1 là protein của
thành tế bào. Hwp1 và Als3 đã được chứng minh góp phần vào sự hình thành màng
sinh học, đóng vai trị là chất kết dính bổ sung [34, 26]. Ở C. glabrata, các chất kết
dính biểu mơ Epa có cấu trúc tương đương với protein Als [47, 62].
Hình thành màng sinh học (Biofilm)
Một yếu tố độc lực quan trọng của Candida spp. là khả năng hình thành màng
sinh học trên bề mặt phi sinh học hoặc sinh học [64]. Ống thông, răng giả và bề mặt

.


.

10

tế bào niêm mạc là chất nền phổ biến hình thành màng sinh học. Trong các loài
Candida spp., C. tropicalis có khả năng hình thành màng sinh học cao nhất.
Các lồi Candida spp. có thể kết hợp với nhau để hình thành màng sinh học hoặc giữa
Candida spp. và vi khuẩn. Thông qua thụ thể Als3, S. aureus liên kết với sợi nấm của
C. albicans. C. albicans tạo ra giá thể cho S. aureus bám dính, các tụ cầu thường tập
trung xung quanh các sợi nấm của C. albicans tạo nên một cấu trúc màng sinh học
hoàn chỉnh. Sự xuất hiện của C. albicans làm tăng tỉ lệ sống sót của S. aureus trong
màng sinh học sau khi điều trị bằng vancomycin so với chỉ nhiễm S. aureus đơn
thuần. Màng sinh học gây tình trạng kháng thuốc và tăng phân tán tế bào nấm men
[28, 64, 62, 88].
Tiết ra chất thủy phân
Sau khi bám dính vào bề mặt tế bào chủ, sợi nấm C. albicans có thể tiết ra
hydrolase, là điều kiện cho sự xâm nhập tích cực vào tế bào chủ. C. albicans tiết ra 5
loại hydrolase chính: protease, phospholipase, lipase, esterase và hemolysin [32].
Ở Candida spp., có 10 isoenzyme của proteinase được gọi là Sap (secreted
aspartic proteinase). Nhóm enzym Sap1-6 có nhiệm vụ trong bám dính, gây tổn
thương mô và tránh cơ chế phản ứng của vật chủ. Sap9 và Sap10 làm trung gian hình
thành màng sinh học [72, 81].
Phospholipase là enzyme có vai trị trong gây bệnh ở Candida spp. vì gây ly
giải và tổn thương tế bào vật chủ. Một số nghiên cứu đưa ra mối liên hệ giữa
phospholipase ở Candida spp. với sự đề kháng kháng sinh như fluconazole hay với
sự hình thành màng sinh học [92].
Lipases có vai trị phân giải lipid để thu nhận chất sinh dưỡng và kết dính lên
tế bào vật chủ.
Hemolysin phá hủy hemoglobin, coagulase liên kết với fibrinogen kích hoạt
hàng loạt các phản ứng gây đông máu.
Mặc dù vai trò của esterase chưa rõ, nhưng được cho là liên quan đến khả năng
phân giải mỡ trong quá trình bám dính, xâm nhập vào tế bào biểu mơ vật chủ. Hoạt

.


.

tính

esterase

cao

nhất

được

tìm

11

thấy

ở C.

krusei (75%),

tiếp

theo

là C. albicans (68,2%) và C. glabrata (54,5%) [76, 89].

Thích nghi chuyển hóa
Candida spp. được tìm thấy trong hệ vi sinh vật đường tiêu hóa ở người khỏe
mạnh, là môi trường giàu chất dinh dưỡng. Tuy nhiên, chúng có khả năng thích nghi
nhanh chóng khi mơi trường dinh dưỡng thay đổi bằng các quá trình trao đổi chất phù
hợp như gluconeogenesis (tạo glucose từ nguồn không phải carbohydrate như lactate,
acid amin,...). Khi xâm nhiễm cơ thể, nấm có thể bị thực bào bởi đại thực bào hoặc
bạch cầu trung tính. Khi đó, mơi trường dinh dưỡng của chúng hồn tồn bị thay đổi.
Trong mơi trường thiếu glucose như vậy, C. albicans có thể nhanh chóng chuyển từ
con đường đường phân sang chu trình glyoxylate để tạo ra glucose từ lipid và acid
amin [17].
Thích nghi pH
C. albicans nhạy với sự thay đổi pH mơi trường và có khả năng đáp ứng tốt
với thay đổi này nhờ hệ thống protein ở thành tế bào. C. albicans có thể trung hịa
mơi trường có tính acid hoặc kiềm. Vì vậy, chúng tồn tại được trong mơi trường có
pH khác nhau [49].
1.4. Các điều kiện thuận lợi để vi nấm Candida spp. gây bệnh
Yếu tố sinh lý: 70% phụ nữ trong độ tuổi sinh sản đã từng bị viêm âm hộ do
nấm Candida spp.. Ở phụ nữ có thai, đặc biệt 3 tháng cuối của thai kỳ, sự mất cân
bằng nội tiết tố progesteron, estradiol và glycogen kèm theo tăng pH âm đạo, suy
giảm miễn dịch tạm thời là nguyên nhân để vi nấm có điều kiện phát triển [55].
Yếu tố bệnh lý: ở bệnh nhân đái tháo đường, sự tích lũy sản phẩm glycosyl
hóa ở tế bào biểu mơ miệng làm tăng số lượng thụ thể sẵn có, tạo điều kiện cho
Candida spp. xâm nhập [21]. Các yếu tố chính ảnh hưởng đến nguy cơ nhiễm
Candida ở người đái tháo đường là loại đái tháo đường, mức đường huyết và pH nước
bọt [38]. Nhiễm nấm ở bệnh nhân đái tháo đường cũng là hậu quả của rối loạn chức
năng miễn dịch. Ở bệnh nhân HIV/AIDS, tỉ lệ nhiễm Candida spp. là 48,5% và nguy
cơ nhiễm nấm tăng lên khi số lượng tế bào lympho TCD4 giảm xuống dưới 200 tế

.

.

12

bào/µL. Bệnh nhân suy thận mạn, bệnh nhân viêm tụy cấp, bệnh nhân chạy thận nhân
tạo, bệnh nhân có khối u huyết học ác tính cũng là những đối tượng có nguy cơ cao
nhiễm nấm Candida spp. [53, 14].
Bỏng: vết bỏng là vị trí thuận lợi cho nấm phát triển và gây nhiễm nấm vết
thương [22]. Nguy cơ nhiễm nấm tăng khi diện tích bề mặt bị tổn thương và độ sâu
của vết bỏng tăng [41].
Yếu tố sử dụng thuốc: lạm dụng kháng sinh phổ rộng, thuốc kháng nấm, thuốc
ức chế miễn dịch, glucocorticoid là một trong những nguyên nhân gây nhiễm nấm
Candida xâm lấn [53]. Dùng corticoid liều cao trong thời gian dài sẽ làm giảm khả
năng đáp ứng miễn dịch, liệu pháp glucocorticoid là nguyên nhân quan trọng nhất
của nhiễm nấm xâm lấn, bao gồm nhiễm nấm máu [30]. Ngoài tác dụng ức chế miễn
dịch, các steroid này cũng có thể làm tăng độc lực của cả C. albicans và NAC.
Glucocorticoid đã được chứng minh làm tăng cường sự kết dính của các tế bào nấm
men với tế bào biểu mơ. Bệnh nhân điều trị corticosteroid có nồng độ glucose trong
nước bọt cao hơn, thúc đẩy tăng sinh và bám dính của Candida spp. với các tế bào
niêm mạc miệng [12]. Các thuốc ức chế miễn dịch, điều trị ung thư, hay ức chế thải
ghép trong ghép tạng, các liệu pháp hóa trị và xạ trị làm giảm số lượng bạch cầu trung
tính là nguyên nhân dẫn đến bệnh nhân dễ nhiễm khuẩn và nhiễm nấm.
Bệnh nhân tại khoa ICU: các yếu tố liên quan đến nhiễm nấm Candida spp.
bao gồm sử dụng kháng sinh phổ rộng, dinh dưỡng tĩnh mạch toàn phần, lọc máu,
điểm APACHE II > 20 điểm, đặt catheter tĩnh mạch trung tâm. Ngoài ra, các yếu tố
có nguy cơ thấp hơn như người > 65 tuổi, đái tháo đường, suy thận, phẫu thuật, thời
gian điều trị tại ICU > 7 ngày, truyền máu nhiều lần [19, 27].
Các thiết bị cấy ghép: thiết bị cấy ghép như răng giả, catheter tĩnh mạch trung
tâm là yếu tố nguy cơ gây nhiễm nấm Candida spp. [35]. Người mang răng giả có

nguy cơ bị nhiễm nấm Candida spp. rất cao, khoảng 65% ở những người cao tuổi đeo
răng giả tồn hàm trên. Đeo răng giả tạo ra mơi trường thuận lợi cho sự phát triển của
nấm Candida do lượng oxy thấp, pH thấp và mơi trường yếm khí. Các thiết bị y tế
cấy ghép như ống thông tĩnh mạch trung tâm là một yếu tố nguy cơ cao đối với các

.


.

13

trường hợp nhiễm nấm Candida spp. (chiếm 25% - 94% các trường hợp nhiễm
Candida spp.), đặc biệt là nhiễm Candida máu, do cơ chế hình thành biofilm trên bề
mặt phi sinh học của các loài Candida spp. (Bảng 1.2) [71].
Bệnh nhân COVID-19: nhiễm nấm cơ hội làm tăng tỉ lệ tử vong ở bệnh nhân
COVID-19 điều trị tại ICU. Đặt catheter tĩnh mạch trung tâm, đái tháo đường, chạy
thận nhân tạo, phẫu thuật ổ bụng, đặt ống thông dinh dưỡng qua đường tĩnh mạch,
dùng kháng sinh, thời gian điều trị tại ICU > 7 ngày và nhiễm khuẩn ổ bụng là các
yếu tố nguy cơ nhiễm nấm ở bệnh nhân COVID-19. C. parapsilosis (43,7%) được
phân lập từ hầu hết mẫu máu ở bệnh nhân COVID-19. Bệnh nhân COVID-19 nặng,
điều trị bằng tocilizumab là một nguy cơ gây nhiễm nấm toàn thân. Tỉ lệ tử vong của
bệnh nhân COVID-19 nhiễm Candida là 80% [65].
Bảng 1.2. Một số đặc điểm gây bệnh của Candida [27, 84]
Loài

Đối tượng

C. albicans

Người cao tuổi, sử dụng thuốc ức chế miễn dịch, hóa trị.
Người cao tuổi, bệnh nhân ung thư, bệnh nhân HIV/AIDS, suy

C. glabrata

dinh dưỡng và đặt catheter tĩnh mạch trung tâm, ghép tạng.

C. tropicalis

Giảm bạch cầu trung tính, u ác tính huyết học, đặt catheter.

C. parapsilosis

Có thiết bị cấy ghép, dinh dưỡng tĩnh mạch, trẻ em, hóa trị.

1.5. Dịch tễ học
Theo thời gian
Kết quả xét nghiệm kháng nấm từ Chương trình giám sát kháng khuẩn
SENTRY giai đoạn 1997 - 2016 cho thấy có sự phân bố lại các loài Candida spp. gây
bệnh theo thời gian. Đáng chú ý là tần suất nhiễm C. albicans giảm từ 57,4% trong
những năm 1997 - 2001 xuống 46,4% trong những năm 2015 - 2016. C. glabrata là
loài NAC phổ biến nhất và gia tăng từ 16,0% trong năm 1997 - 2001 lên 19,6% trong
năm 2015 - 2016. Nhiễm C. parapsilosis tăng từ 12,3% trong các năm 1997 - 2001
lên 17,8% trong năm 2009 - 2011. C. tropicalis giảm không đáng kể từ 9,1% trong
giai đoạn 1997 - 2001 xuống còn 8,3% trong giai đoạn 2015 - 2016 (Bảng 1.3) [82].

.


.

14

Bảng 1.3. Dịch tễ của các loài Candida spp. gây bệnh giai đoạn 1997 - 2016 [82]
Loài (%)

Năm

Số lượng

CA

CG

CP

CT

CK

1997 - 2001

5,067

57,4

16,0

12,3

9,1

2,5

2006 - 2008

2,647

51,1

15,9

16,8

10,7

2,1

2009 - 2011

4,080

45,3

18,9

17,6

10,0

2,6

2012 - 2014

4,928

46,3

19,3

15,1

8,6

3,2

2015 - 2016

3,653

46,4

19,6

14,4

8,3

2,8

CA: Candida albicans, CG: Candida glabrata, CP: Candida parapsilosis, CT: Candida
tropicalis, CK: Candida krusei.

Theo vùng địa lý và đặc điểm dân cư
Bảng 1.4. Dịch tễ các loài Candida spp. gây bệnh theo vùng địa lý [82]
Khu vực

Số lượng

Loài (%)
CA

CG

CP

CT

CK

1,314

46,0

17,9

12,9

14,1

1,8

Châu Âu

5,964

52,5

16,0

15,4

7,5

3,0

Châu Mỹ Latinh

1,629

43,9

7,1

24,3

17,0

2,0

Bắc Mỹ

6,401

42,7

24,3

14,8

8,0

2,9

Tổng

15,308

46,7

18,7

15,9

9,3

2,8

Châu Á Thái Bình Dương

CA: Candida albicans, CG: Candida glabrata, CP: Candida parapsilosis, CT: Candida
tropicalis, CK: Candida krusei

Theo chương trình SENTRY 2006 - 2016, tỉ lệ nhiễm các loài Candida spp.
có xu hướng thay đổi trên 4 khu vực tham gia nghiên cứu (Bảng 1.4). Mặc dù
C. albicans vẫn là loài gây bệnh chủ yếu, tuy nhiên tỉ lệ các loài NAC thay đổi giữa
các khu vực trên thế giới trong 10 năm gần đây. C. albicans nhiều nhất ở Châu Âu
(52,5%) và ít nhất ở Bắc Mỹ (Mỹ và Canada; 42,7%). C. glabrata phổ biến nhất ở
Bắc Mỹ (24,3%) và ít nhất ở Châu Mỹ Latinh (7,1%). C. parapsilosis và C. tropicalis
nhiều hơn so với C. glabrata ở Châu Mỹ Latinh (24,3% và 17,0% so với 7,1%). C.

.