Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng vi rút beijing 1 để ứng dụng sản xuất vắc xin viêm não nhật bản bất hoạt trên tế bào vero tại việt nam

LỜI CẢM ƠN
Với tất cả sự kính trọng, lịng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới:
Tôi xin trân trọng cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và Học
viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
hỗ trợ tơi rất nhiều trong suốt q trình làm nghiên cứu sinh tại Viện.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tới các thầy cô, anh chị Cơ sở đào tạo là Viện Công
nghệ sinh học và Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng
nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn và giúp đỡ tơi rất nhiều trong suốt
q trình làm nghiên cứu sinh tại Viện.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và
Sinh phẩm Y tế, TS. Đoàn Hữu Thiển đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện nghiên cứu
và tham gia khóa đào tạo này;
Tơi xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Huỳnh Thị Phương Liên, PGS.TS.
Đinh Duy Kháng, những người thầy đã tận tình hướng dẫn tơi trong suốt quá trình
học tập, nghiên cứu và viết luận án;
Tôi xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp tại Khoa Kiểm định vắc xin Vi rút,
Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã tạo điều kiện hỗ trợ và giúp
đỡ tơi trong suốt q trình học tập;
Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình tơi, nơi đã cho tơi thêm sức
mạnh vượt qua những khó khăn trong suốt q trình học tập và nghiên cứu.

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Lý

i


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu do chính tơi thực hiện.
Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực. Các số liệu này

chưa được ai công bố trong bất kỳ cơng trình nghiên cứu khoa học nào khác
Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Lý

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ i
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... ii
MỤC LỤC ................................................................................................................ iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. vi
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỜ THỊ ..................................................................x
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU .........................................................4
1.1. Vi rút Viêm não Nhật Bản .................................................................................4
1.1.1. Đặc điểm cấu trúc..............................................................................................4
1.1.2. Kháng nguyên và các yếu tố độc lực của vi rút ................................................4
1.1.3. Sự nhân lên của vi rút trên tế bào ......................................................................7
1.1.4. Dịch tễ học phân tử của vi rút Viêm não Nhật Bản ..........................................8
1.2. Vắc xin Viêm não Nhật Bản ..............................................................................9
1.2.1. Lịch sử phát triển vắc xin VNNB .....................................................................9
1.2.2. Sự phát triển của vắc xin Viêm não Nhật Bản trên tế bào ..............................13
1.2.3. Các biến thể di truyền và kháng nguyên trong vi rút VNNB và việc tiêm
phòng[34] ..................................................................................................................15
1.2.4. Đánh giá chất lượng an tồn và tính sinh miễn dịch của vắc xin....................16
1.3. Chủng vi rút sản xuất vắc xin Viên não Nhật Bản ........................................20
1.3.1. Chủng vi rút Nakayama-NIH ..........................................................................20

1.3.2. Chủng vi rút Beijing-1 ....................................................................................20
1.3.3. Chủng SA14-14-2 ...........................................................................................22
1.3.4. Chủng Beijing-3 ..............................................................................................24
1.3.5. Dịng tế bào ni cấy (nhân) vi rút .................................................................26
1.4. Các khuyến cáo của TCYTTG cho sản xuất và kiểm định chủng sản xuất
vắc xin VNNB bất hoạt[22].....................................................................................27
1.4.1. Yêu cầu chung trong sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt ..................................27
1.4.2. Yêu cầu đối với nguồn nguyên liệu đầu vào: ..................................................28
1.5. Tóm tắt quy trình thiết lập ngân hàng chủng (Beijing-1) để sản xuất vắc xin
viêm não Nhật Bản bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam ...............................31
iii


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....35
2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................35
2.2. Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................................36
2.2.1. Sinh phẩm, hóa chất, thiết bị ...........................................................................36
2.2.2. Động vật thí nghiệm ........................................................................................38
2.3. Thiết kế nghiên cứu ..........................................................................................38
2.4. Biến số và nội dung nghiên cứu ......................................................................39
2.5. Phương pháp nghiên cứu (chi tiết xem phụ lục 5) ........................................41
2.5.1. Kiểm định vi rút ngoại lai ...............................................................................41
2.5.2. Kiểm định vô khuẩn ........................................................................................42
2.5.3. Nhận dạng .......................................................................................................42
2.5.4. Đánh giá ổn định di truyền ..............................................................................42
2.5.5. Hiệu giá vi rút..................................................................................................45
2.5.6. Thử nghiệm công hiệu của vắc xin .................................................................47
2.5.7. An toàn chung .................................................................................................48
2.5.8. An toàn đặc hiệu..............................................................................................49
2.5.9. Chất gây sốt .....................................................................................................49

2.5.10. Hàm lượng Thimerosal .................................................................................50
2.5.11. Hàm lượng Formaldehyde ............................................................................50
2.5.12. Hàm lượng DNA tồn dư ................................................................................50
2.5.13. Hàm lượng protein tổng số............................................................................52
2.5.14. pH ..................................................................................................................52
2.5.15. Cảm quan ......................................................................................................52
2.6. Xử lý và phân tích số liệu ................................................................................53
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................54
3.1. Kết quả nghiên cứu ..........................................................................................54
3.1.1. Tính ổn định về hiệu giá và di truyền của chủng Beijing-1 ............................54
3.1.2. Tính an tồn và sinh miễn dịch bảo vệ của chủng trên các lô vắc xin thành phẩm
sản xuất từ chủng BV-WSV-0310 ở quy mơ phịng thí nghiệm ...............................66
3.1.3. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của chủng sử dụng để sản xuất vắc xin VNNB
bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam .....................................................................72
3.2. Bàn luận ............................................................................................................74
iv


3.2.1. Tính ổn định về hiệu giá, di truyền của chủng vi rút Viêm não Nhật Bản sau
sản xuất và điều kiện bảo quản .................................................................................74
3.2.2. Sự tương đồng kháng nguyên của chủng sản xuất vắc xin VNNB so với các
chủng Viêm não Nhật bản lưu hành tại Việt Nam ....................................................81
3.2.3. Tính an tồn và tính sinh miễn dịch của JECEVAX sản xuất từ chủng BVWSV-0310 ở quy mơ phịng thí nghiệm ...................................................................88
3.2.4. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của chủng để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt
trên tế bào Vero (JECEVAX) ...................................................................................93
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................103
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ..........................................105
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................106
PHỤ LỤC

v


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AE

Adverse events (biến cố bất lợi)

BYT

Bộ Y tế

BHK-21

Baby Hamster Kidney – 21 (Tế bào thận chuột Hamter sơ
sinh)

BR209

Beijing reference (Vắc xin mẫu chuẩn Beijing-1)

CF

Complement Fixation (Cố định bổ thể)

CPE

Cytopathic effect (hiệu quả gây độc/hủy hoại trên tế bào)

CV

Challenge virus (vi rút thử thách)

E

Envelope protein (Protein vỏ)

FTM

Fluid Thioglycollate Medium (môi trường nuôi cấy vi
khuẩn)

HA

Haemagglutinin Assay (thử nghiệm ngưng kết hồng cầu)

HI

Haemagglutinin inhibition (ức chế ngưng kết hồng cầu)

HT

Huyết thanh

HLKN

Hàm lượng kháng nguyên

HGKTTH

Hiệu giá kháng thể trung hòa

IC51

Vắc xin VNNB trên tế bào vero của Intercell – Áo

JEVAX

Vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất từ não chuột tại Việt
Nam

JECEVAX

Vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất trên tế bào vero tại Việt
Nam

JE-MB

Vắc xin VNNB sản xuất trên não chuột của Nhật Bản

KT

Kháng thể

MRC5

Tế bào phôi phổi bào thai người

NICVB

Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin và sinh phẩm Y tế

(National Institute for Control of Vaccines and Biologicals).
NS

Non structural Protein (Protein không cấu trúc)

NSX

Nhà sản xuất
vi


NT

Neutralization test (thử nghiệm trung hòa)

PHK

Primary Hamster kidney (thận chuột Hamster tiên phát)

PreM

Premium membrane (Protein tiền màng)

PRNT50

Plaque reduction neutralization test (Trung hòa giảm
50% đám hoại tử)

TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở

TCYTTG/WHO

Word Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

THGĐHT

Trung hòa giảm đám hoại tử

TNLS

Thử nghiệm lâm sàng

TNMD

Thử nghiệm miễn dịch

VNNB

Viêm não Nhật Bản

VABIOTECH

Công ty TNHH MTV vắc xin và sinh phẩm số 1

VERO

Verda Reno (Tế bào thường trực thận khỉ xanh châu Phi)

VX

Vắc xin

vii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1. Các loại vắc xin VNNB và công nghệ sản xuất hiện nay.........................12
Bảng 1. 2. Tỷ lệ mắc VNNB ở bệnh nhân VNVR năm 1991-2019 .......................13
Bảng 2.1. Cỡ mẫu sử dụng trong nghiên cứu ........................................................35
Bảng 2. 2. Sinh phẩm sử dụng trong nghiên cứu ....................................................36
Bảng 2.3. Mơi trường, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ...................................37
Bảng 2.4. Trang thiết bị, vật tư tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu ......................37
Bảng 2.5. Trang thiết bị, vật tư tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu ......................38
Bảng 2.6. Chỉ tiêu nghiên cứu trên lô chủng gốc BV-MSV-0210 và lô chủng sản
xuất BV-WSV-0310 ..............................................................................39
Bảng 2.7. Chỉ tiêu nghiên cứu trên vắc xin JECEVAX .........................................40
Bảng 2.8.

Thơng tin về trình tự vùng gen E của các chủng vi rút VNNB phân lập ở Việt
Nam trong các năm khác nhau và từ các vật chủ khác nhau sử dụng trong
nghiên cứu ..............................................................................................45

Bảng 3.1. Kết quả nhận dạng của chủng gốc và chủng sản xuất bằng phương pháp
ELISA ....................................................................................................54
Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra LD50 trên não chuột Swiss của chủng gốc BVMSV-0210 ............................................................................................56
Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra LD50trên não chuột Swiss của chủng sản xuất BVWSV-0310 .............................................................................................56

Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra hiệu giá chủng gốc BV-MSV-0210bằng thử nghiệm tạo
đám hoại tử (PFU) trên tế bào BHK21 ..................................................57
Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra hiệu giá chủng sản xuất BV-WSV-0310 bằng thử
nghiệm tạo đám hoại tử (PFU) trên tế bào BHK21 ...............................57
Bảng 3.6. Tỷ lệ tương đồng về nucleotide và protein gen mã hóa kháng nguyên E
của chủng gốc (BV-MSV-0210) và chủng sản xuất (BV-WSV-0310) so
với trình tự vùng gen E của các chủng virút VNNB phân lập ở Việt Nam
trong các năm khác nhau và từ các vật chủ khác nhau ..........................61
Bảng 3.7. Vị trí các epitope và vị trí của các axit amin quyết định tính kháng nguyên
thuộc epitope protein E của chủng sản xuất (BV-WSV-0310), chủng
tham chiếu (Beijing-1 Kanonji), chủng vi rút VNNB phân lập ở người
năm 2014 và chủng vắc xin SA14-14-2. ...............................................62
viii


Bảng 3.8. Tính ổn định hiệu giá chủng gốcBV-MSV-0210 và chủng sản xuất BVWSV-0310 khi bảo quản trong nitrogen lỏng .......................................63
Bảng 3.9. Hiệu giá chủng sản xuất BV-WSV-0310 khi bảo quản ở -20oC ...........63
Bảng 3.10. Hiệu giá chủng sản xuất BV-WSV-0310 khi bảo quản ở 2-8oC ...........64
Bảng 3.11. Kết quả thử nghiệm vô trùng .................................................................64
Bảng 3.12. Kết quả kiểm tra Mycoplasma chủng gốc và chủng sản xuất ...............65
Bảng 3.13. Kết quả kiểm tra vi rút ngoại lai trên động vật thử nghiệm của chủng gốc
và chủng sản xuất ..................................................................................65
Bảng 3.14. Kết quả kiểm tra vi rút ngoại lai trên tế bào của chủng gốc và chủng sản xuất ..66
Bảng 3.15. Kết quả kiểm tra an toàn chung trên chuột nhắt và chuột lang thí nghiệm
của 10 lơ vắc xin JECEVAX .................................................................67
Bảng 3.16. Kết quả kiểm tra chất gây sốt trên thỏ của 10 lô vắc xin JECEVAX....68
Bảng 3.17. Kết quả đánh giá cảm quan, tỷ trọng và vô trùng của 10 lô vắc xin
JECEVAX .............................................................................................69
Bảng 3.18. Kết quả kiểm định các chỉ số hóa học của 10 lơ vắc xin JECEVAX ....69
Bảng 3.19. Kết quả đánh giá tính sinh miễn dịch (cơng hiệu/hiệu giá kháng thể

trung hịa (HGKTTH)) của các lô vắc xin JECEVAX trên động vật
thực nghiệm ..........................................................................................70
Bảng 3.20. Kết quả nghiên cứu tiêu chuẩn chất lượng của chủng sử dụng để sản xuất
vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam .........................72
Bảng 3.21. Xây dựng tiêu chuẩn về số đời cấy chuyển, tế bào cấy chuyển và nhiệt
độ bảo quản chủng gốc và chủng sản xuất ............................................73
Bảng 3.22. Xây dựng tiêu chuẩn về tính ổn định di truyền và hiệu giá vi rút chủng
gốc và chủng sản xuất............................................................................74

ix


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỜ THỊ
Hình 1.1.

Cấu trúc bộ gen của vi rút VNNB ..........................................................5

Hình 1.2.

Các tác nhân gây sốt ..............................................................................17

Hình 1.3.

Một số vắc xin VNNB sản xuất từ chủng Beijing-1 .............................22

Hình 1.4.

Hình ảnh 1 số vắc xin VNNB sản xuất từ chủng SA14-14-2 ...............24

Hình 1.5.

Vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất từ chủng 821564-XY .......................26

Hình 1.6.

Sơ đồ thiết lập ngân hàng chủng gốc (BV-MSV-0210) và chủng sản xuất
(BV-WSV-0310) ...................................................................................33

Hình 2.1.

Hình ảnh ống chủng Beijing-1 và vắc xin JECEVAX ..........................36

Hình 2.2.

Sơ đồ nghiên cứu ...................................................................................38

Hình 2. 3. Quy trình giải trình tự gen E vi rút Viêm não Nhật Bản .......................44
Hình 3.1. Kết quả giải trình tự gen và xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự
nucleotide (A) và axít amin (B) của chủng gốc và chủng sản xuất với
chủng Beijing chuẩn ............................................................................55
Hình 3.2.

Hình ảnh plaque (đám hoại tử- đốm trắng) của chủng sản xuất BV-WSV0310 ở các độ pha 10-6; 10-7; 10-8 ..........................................................57

Hình 3.3.

Hình ảnh plaque (đám hoại tử- đốm trắng) của chủng sản xuất BV-WSV0310 trên dịng tế bào BHK21 và dịng tế bào Vero. ............................58

Hình 3.4.

Điện di gel agarose 1% kiểm tra sản phẩm RT-PCR khuếch đại gen mã
hóa kháng nguyên E của các chủng: chủng gốc BV-MSV-0210 (đường
chạy số 1); chủng sản xuất BV-WSV-0310 (đường chạy số 2); chủng
chuẩn tham chiếu JEV Beijing-1 Kanonji (đường chạy số 3). M:
Farmentas 1 kb DNA ladder. .................................................................58

Hình 3.5.

Trình tự acid amin kháng nguyên E của vi rút VNNB lô chủng giống gốc
BV-MSV-0210 (A) và sản xuất BV-WSV-0310 (B) ............................59

Hình 3.6.

Trình tự nucleotide gen mã hóa kháng ngun E của vi rút VNNB lô
chủng giống gốc BV-MSV-0210 (A) và lơ chủng sản xuất BV-WSV0310 (B)m ..............................................................................................60

Hình 3.7.

Kết quả kiểm tra an toàn đặc hiệu trên nhắt của 10 lơ vắc xin JECEVAX ...67

Hình 3.8.

Hiệu giá kháng thể trung hòa của vắc xin JECEVAX và vắc xin mẫu
chuẩn BR209 .........................................................................................71

Hình 3.9.

Cơng hiệu tương quan của vắc xin JECEVAX và vắc xin mẫu chuẩn
BR209 ....................................................................................................71
x

1

MỞ ĐẦU
Viêm não Nhật bản (VNNB) là một trong các bệnh gây nhiễm trùng thần kinh
cấp tính với nhiều mức độ khác nhau, đáng ngại hơn cả là bệnh thường để lại di chứng
thần kinh (như điếc, mù, động kinh, yếu liệt cứng toàn thân hoặc liệt tay chân…)và tỷ
lệ tử vong cao. Bệnh lan truyền rộng rãi ở hầu hết các nước ở Châu Á (như Nhật Bản,
Trung Quốc, Triều Tiên, Thái Lan, Philippin, Việt Nam, Ấn Độ…), vùng viễn đông
của Liên bang Nga... Cho đến nay gần 3 tỷ người sống trong vùng có lưu hành dịch và
có khoảng 25.000-50.000 ca bệnh hàng năm, trong số đó 20-30% tử vong, 30-50%
sống sót đã để lại di chứng thần kinh[1,2]. Theo thống kê ở Việt Nam, hàng năm ước
tính có khoảng 2.000-3.000 trường hợp bị hội chứng viêm não cấp nghi ngờ do vi rút;
Trong số này 70-75 % được xác định do vi rút VNNB. Nguồn lây bệnh chủ yếu là do
muỗi đốt truyền vi rút cho người. Cho đến nay chưa có thuốc đặc trị bệnh VNNB, do
vậy biện pháp phòng bệnh hiệu quả nhất là tiêm vắc xin.
Vi rút VNNB có rất nhiều chủng, nhưng hiện nay hầu hết các chủng sử dụng
để sản xuất vắc xin đều thuộc genotype 3 gồm chủng Nakayama; Beijing -1; Beijing3 và SA-14-14-2. Từ các chủng này, bằng các công nghệ sản xuất khác nhau đã tạo
ra rất nhiều loại vắc xin VNNB như vắc xin VNNB sống giảm độc lực (RS-JEV của
Trung Quốc), vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất trên não chuột (Jevax- VabiotechViệt Nam; JE-VAX - Biken - Nhật Bản, JEV-GCC của Hàn Quốc, JE-BM), vắc xin
VNNB bất hoạt sản xuất trên tế bào (IC51 hay IXIARO hay JESPECT; KD-287 của
Nhật Bản); vắc xin VNNB dạng sống giảm độc lực tái tổ hợp (ChimeriVax-JE hay
Imojev – Sanofi Pasteur)… Nhật Bản là nước đầu tiên nghiên cứu, sản xuất thành
công vắc xin VNNB. Việc sử dụng vắc xin VNNB trong cộng đồng đã góp phần giảm
tỷ lệ mắc bệnh VNNB đáng kể[3, 4, 5].
Việt Nam bắt đầu nghiên cứu sản xuất và sử dụng vắc xin VNNB bất hoạt sản
xuất trên não chuột từ năm 1989, đem lại hiệu quả phòng bệnh rất tốt cho cộng đồng.
Dù vậy, theo xu thế chung, từ năm 2006, công ty vắc xin và sinh phẩm số 1 đã nghiên
cứu sản xuất vắc xin bất hoạt trên tế bào Vero, sử dụng chủng Beijing-1 (JECEVAX)

để sớm đưa vào sử dụng tại Việt Nam thay thế cho vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất


2
trên não chuột[6, 7]. Đây là một vắc xin mới, lần đầu nghiên cứu sản xuất tại Việt
Nam. Để sản xuất và đưa vắc xin mới này vào sử dụng là một vấn đề khơng đơn giản,
địi hỏi phải có rất nhiều nghiên cứu chứng minh tính an tồn và hiệu quả bảo vệ theo
các tiêu chuẩn của tổ chức Y tế thế giới (WHO). Do vậy, việc kiểm soát tốt chất lượng
của chủng vi rút trước khi đưa vào sản xuất vắc xin đại trà là yêu cầu cần thiết vì
chủng vi rút là ngun liệu chính, thành phấn chính trong vắc xin sau này và chất
lượng của chủng sẽ ảnh hưởng đến tất cả các cơng đoạn cịn lại của sản xuất vắc xin.
TCYTTG đã đưa ra một số hướng dẫn về việc thiết lập chủng cho sản xuất vắc xin
này (WHO TRS số 963). Tuy vậy, TCYTTG mới chỉ đưa ra tiêu chuẩn cho 1 số chỉ
tiêu cơ bản áp dụng chung cho hầu hết các chủng vi rút để sản xuất vắc xin (như tiêu
chuẩn về vơ trùng, Mycoplasma, vi rút ngoại lai); cịn rất nhiều chỉ tiêu như hiệu giá,
độ ổn định về hiệu giá, độ ổn định về di truyền của chủng, số đời cấy chuyển tối đa
từ chủng gốc sang chủng sản xuất… TCYTTG mới chỉ khuyến cáo NSX kiểm tra
chứ không đưa ra tiêu chuẩn vì nó mang tính đặc thù riêng cho từng sản phẩm.
Chính vì vậy tơi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất
lượng vi rút Beijing-1 để ứng dụng sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản bất hoạt
trên tế bào Vero tại Việt Nam”.
Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng của chủng (chủng gốc và chủng sản xuất)
vi rút Beijing-1 để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu của luận án
Để thực hiện các mục tiêu nghiên cứu nêu trên, đề tài đã thực hiện các nội
dung nghiên cứu dưới đây:
1. Nghiên cứu tính ổn định về hiệu giá, ổn định về di truyền và tính sinh miễn dịch
của chủng vi rút sản xuất vắc xin VNNB theo thời gian (sau sản xuất: 0, 3, 4, 6,
8, 9, 10 năm) ở nhiệt độ Nitrogen lỏng; Ở các nhiệt độ bảo quản khác (-20oC sau

bảo quản: 1, 3, 6 tháng; 2-8oC sau bảo quản: 1, 3, 5, 7 ngày).
2. Nghiên cứu sự tương đồng nucleotide và axít amin Protein E của chủng sản xuất
so với các chủng VNNB lưu hành ở Việt Nam từ 1964-2014.
3. Đánh giá tính an tồn và tính sinh miễn dịch bảo vệ của chủng trong 10 lô vắc xin
JECEVAX được sản xuất từ lơ WSV ở quy mơ phịng thí nghiệm.


3
4. Xây dựng 9 chỉ tiêu, phương pháp & tiêu chuẩn chất lượng của chủng (chủng gốc
và chủng sản xuất) để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt
Nam.
Những đóng góp mới của luận án
Luận án là cơng trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống
về tiêu chuẩn chất lượng cho chủng gốc, chủng sản xuất Beijing-1 để sản xuất vắc
xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam.
1.

Đưa ra được dải nhiệt độ phù hợp giúp chủng Beijing-1 duy trì sự ổn định về hiệu
giá ≥ 6log PFU/ml trong ít nhất 10 năm sau sản xuất là điều kiện bảo quản trong
nitrogen lỏng; ở -20oC trong 3 tháng và ở 2-8oC trong 3 ngày.

2.

Xác định được các tỷ lệ tương đồng về trình tự nucleotide và trình tự axit amin
vùng gen sinh tổng hợp kháng nguyên E của lô chủng gốc BV-MSV-0210, chủng
sản xuất BV-WSV-0310 với chủng chuẩn tham chiếu Reference JEV Beijing-1
Kanonji và các chủng vi rút VNNB trên người, muỗi và lợn tại Việt Nam ở các
giai đoạn khác nhau.

3.

Xây dựng được 9 chỉ tiêu chất lượng và phương pháp kiểm định chủng(chủng
gốc và chủng sản xuất) Beijing-1 để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào
Vero tại Việt Nam.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
Kết quả luận án cung cấp các dữ liệu khoa học giúp nhà sản xuất Vabiotech
trong việc xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng cơ sở của chủng vi rút VNNB Beijing1 sử dụng trong sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero (JECEVAX) tại
Việt Nam và áp dụng các tiêu chuẩn này để quản lý chất lượng của chủng đạt chất
lượng ổn định nhằm tạo ra các lơ vắc xin có tính an tồn và hiệu quả ổn định cho
người sử dụng .
Bố cục của luận án
Luận án gồm 114 trang, trong đó phần mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 30
trang, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 19 trang, kết quả và bàn luận 49 trang, kết
luận và kiến nghị 2 trang, danh mục các cơng trình cơng bố 1 trang, tài liệu tham khảo
9 trang gồm 98 tài liệu. Trong luận án có 18 hình, 32 bảng và 48 trang phụ lục.


4

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.1.

Vi rút Viêm não Nhật Bản

1.1.1. Đặc điểm cấu trúc
Vi rút VNNB là một thành viên của vi rút Arbo (arthropod borne viruses), là
những vi rút do cơn trùng tiết túc truyền cho động vật có xương sống qua đường máu.
Tất cả các vi rút arbo đều có hệ gen (genome) là RNA[8].

Vi rút VNNB thuộc họ Flaviviridae, chi Flavivirus nhóm B và có liên quan
chặt chẽ với virus West Nile và virus viêm não St. Louis… Flavivirus có đường kính
40- 50 nm; bề mặt ngồi là màng lipit kép có nguồn gốc từ tế bào chủ gắn với lớp vỏ
là glycoprotein E và protein màng (M). Vật liệu di truyền là 1 sợi RNA đơn phân cực
dương xoắn, được bao bọc bởi nucleocapsit. Hạt vi rút VNNB tinh khiết bao gồm sợi
RNA chiếm 6%, protein chiếm 66%, lipit 17% và carbohydrate chiếm 9%[1, 8, 9].
Cấu trúc phân tử của sợi RNA gồm 11.000 nucleotide, tương ứng với 3.400 axit amin.
Hệ gen của vi rút VNNB mã hóa cho 10 protein gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein
không cấu trúc trong một khung đọc mở liên tục và trật tự từ đầu 5’ đến đầu 3’ và các
vùng khơng mã hóa [8].Vi rút VNNB có tỷ trọng 1,19-1,2 g/cm3 trong đường và 1,221,24 g/cm3 trong Cesium chlorid, hệ số lắng 200S, trọng lượng phân tử: 60-70 x106
dalton, độ bền vững: Bền với pH=7-9, thích hợp nhất là pH=8.
Vi rút VNNB dễ bị bất hoạt bởi nhiệt độ cao: 50oC trong 50 phút, 37oC trong
vài giờ; nhiệt độ thấp như -80oC, -20oC vi rút tồn tại trong nhiều năm và trong
Nitrogen lỏng (-196oC) vi rút tồn tại lâu dài. Vi rút VNNB rất nhậy với dung mơi hịa
tan lipit như ether, sodium deoxycholate, dễ dàng bị bất hoạt bởi tia cực tím,
formaldehyde...[1], [8].
1.1.2. Kháng nguyên và các yếu tố độc lực của vi rút
Vi rút VNNB có kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu (HA) và hoạt tính
trung hịa là glycoprotein trên preM và E (vỏ và tiền màng của vi rút). Đây cũng chính
là kháng nguyên sinh kháng thể ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) và kết hợp bổ thể
(CF), kháng thể trung hòa (NT) - tức kích thích cơ thể sinh kháng thể bảo vệ [1, 10].


5

Hình 1.1. Cấu trúc bộ gen của vi rút VNNB
(Nguồn: Bobade S. S, Gade R. M. Zika Virus –A Vector Borne Zoonotic Disease: an
International Public Health Emergency. Biosc.Biotech.Res.Comm. 2016;9(2).
Available from: />Bộ gen RNA gồm: 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc.
Các protein cấu trúc:

Protein C (Capsid): Rất nhỏ, chỉ 9-12 Kda gồm 112-127 axit amin được tạo
thành rất vững chắc gồm 1 số lớn axit amin Lys và Arg. Các axit amin trong protein
C liên kết với nhau rất chặt chẽ, có thể loại trừ khả năng trung hòa của phân tử RNA
của vi rút với các tác nhân liên quan[11].
Protein M (Membrane): có 2 dạng là protein preM chưa trưởng thành trong tế
bào chủ và protein M.
+Protein preM: có 165 axit amin khơng trùng lặp với protein E. Trước khi vi rút
được giải phóng ra ngồi tế bào, preM được phân cắt bởi một phân tử protease để tạo
thành protein M hoàn chỉnh. PreM chưa trưởng thành khơng tự tiến tới tế bào đích nhưng
lại rất cần thiết cho hoạt động duy trì nịi giống của vi rút trưởng thành [1, 11, 12].
+Protein M: Có trong vi rút trưởng thành ngoài tế bào. Hạt vi rút trưởng thành
có khả năng kháng axit kém hơn hạt vi rút chưa trưởng thành khoảng 400 lần, vì vậy
khả năng tiếp cận với vi rút dễ dàng hơn. Sự ly giải preM khi ra ngoài tế bào tạo ra


6
sự sắp xếp lại các cấu trúc Oligo trên bề mặt hạt vi rút, do đó làm tăng khả năng gây
nhiễm của vi rút trưởng thành tới vật chủ [1, 12].
Protein E (Envelope): Có trọng lượng phân tử 55-60 Kda, là một glycoprotein
bao gồm 494-501 axit amin là thành phần cấu tạo chính của vỏ (E). So sánh chuỗi
axit amin tương đồng cho thấy, protein E là một protein cấu trúc có tính bảo tồn cao
trong các vi rút thuộc nhóm Flavivirus. Protein E liên quan chặt chẽ đến chức năng
sinh học của vi rút như chức năng bám dính, cảm thụ, ngưng kết hồng cầu, trung hòa
kháng thể, điều chỉnh pH nội nguyên sinh chất của tế bào chủ [1, 11, 12].
Các protein khơng cấu trúc (NS:nonstructural)
NS1: Có trọng lượng phân tử 42-50 Kda, là một glycoprotein gồm 353-354
axit amin. Chức năng chưa rõ, có thể như một bổ thể hòa tan cố định kháng nguyên
khi bộc lộ trên tế bào cảm nhiễm.
NS3: Có trọng lượng phân tử 67-70 Kda gồm 618-623 axit amin, có tính bảo
tồn cao trong chuỗi nucleotit của nhóm Flavivirus, đóng vai trị mã hóa cho enzym

protease và helicase[1, 13].
NS5: Có trọng lượng phân tử 104-106 Kda gồm 900-905 axit amin, có tính
bảo tồn cao trong chuỗi nucleotit. NS5 gắn liền với sự tạo vỏ capsit của RNA.
NS2A, NS2B, NS4A & NS4B: Đều rất nhỏ, có tính bảo tồn kém trong chuỗi
nucleotit, sự mã hóa của chúng có thể liên quan đến protein M.
Trong quá trình vi rút phóng thích khỏi tế bào, protein PreM được tách ra nhờ
enzym protease để thành protein trưởng thành và đây là thành phần có khả năng gây
nhiễm của vi rút. Bộ gen của vi rút được bọc trong lớp lipit và protein E rồi hoàn
thiện với protein C. Protein E chịu trách nhiệm tấn công đến tế bào đích và hịa màng
tế bào; chính protein E mang các kháng nguyên bề mặt là kháng nguyên ngưng kết
hồng cầu (HA) và hoạt tính trung hịa để tạo kháng thể trung hịa. Đây chính là tiêu
chuẩn để chọn bất kỳ chủng dự tuyển nào cho sản xuất vắc xin VNNB.
Vi rút VNNB được phân thành 5 kiểu gen (I-V) dựa trên cấu trúc gen vỏ
(protein E) nhưng chỉ có 1 type huyết thanh được biết đến[14].


7
Phương pháp phân biệt và nhận dạng kháng nguyên
Theo các nghiên cứu cho thấy kháng nguyên của các Flavivirus có phản ứng
chéo với nhau, 3 nhóm vi rút có kháng ngun quan hệ mật thiết và khăng khít với
nhau đó là các vi rút gây bệnh sốt Tây sông Nile (West Nile fever), viêm não Louis
(Louis encephalitis) và VNNB (Japanese encephalitis), do đó các phản ứng huyết
thanh với kháng thể đa dịng rất khó phân biệt. Vì vậy,để phân biệt và nhận dạng
kháng nguyên của các vi rút này sử dụng phản ứng trung hòa (NT) là nhậy nhất rồi
đến phản ứng kết hợp bổ thể (CF) tiếp đến là phản ứng miễn dịch huỳnh quang (IF).
Do đó việc đánh giá đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm vắc xin bằng kỹ thuật
trung hòa là đặc hiệu nhất, đặc biệt là trung hòa giảm 50% đám hoại tử (PRNT50) trên
tế bào; hoặc dùng kháng thể đơn dòng để định loại Flavivirus và phân biệt với vi rút
VNNB. Hiện nay sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại như PCR, với cặp
mồi đặc hiệu, hoặc dùng phương pháp phân tích trình tự gen... có thể định loại được

type vi rút trong các Flavivirus cũng như phân loại được các chủng vi rút VNNB khác
nhau rất nhanh chóng và chính xác.
1.1.3. Sự nhân lên của vi rút trên tế bào
Chu kỳ nhân lên của vi rút RNA
Khi vi rút gặp tế bào cảm thụ và nhận biết các thụ thể trên màng tế bào, tiến
đến và bám vào thụ thể, màng tế bào bị tác động và tạo khe hở cho vi rút thâm nhập
vào bên trong tế bào gây cảm ứng tổng hợp RNA[1, 15]. Sau đó sợi RNA được bộc
lộ là RNA đơn polymerase để tạo thành RNA phân cực (-) bổ sung thành chuỗi RNA
kép nhờ phiên mã sớm và thông tin trung gian sao chép sợi RNA kép được làm khuôn
để tổng hợp các sợi RNA mới theo cách bán bảo tồn và không đối xứng. Khung đọc
mở được đồng dịch mã bằng cách cắt đoạn protein liên tiếp thành các đoạn protein
cấu trúc và không cấu trúc. RNA và protein của vi rút được tổng hợp trên lưới nội
chất có hạt, vùng quanh nhân trong nguyên sinh chất của tế bào chủ. Sự nhân lên của
vi rút liên quan đến phát triển của lưới nội chất tạo thành các nội bào đặc trưng. Các
sản phẩm tổng hợp được lắp ráp ở màng tế bào chất. Sau đó các hạt virion được giải
phóng qua mạng lưới Golgi bằng ngoại bào xuất tiết và các virion mới tiếp tục xâm
nhập vào tế bào khác và bắt đầu một chu kỳ mới.


8
Sự nhân lên của vi rút trong tế bào
Vi rút VNNB nhân lên trên nhiều loại tế bào cả ở trên tế bào tiên phát và tế
bào thường trực có nguồn gốc từ người, khỉ, gặm nhấm, lợn, chim, gia cầm và muỗi(tế
bào C6/36 muỗi Albobitus).Tế bào tiên phát gồm thận bào thai người, thận khỉ, thận
lợn, tế bào phôi gà...hay các dòng tế bào thường trực như GMK2, Vero (thận khỉ),
BHK21 (thận chuột hamster)[1]. Trong tế bào nuôi vi rút nhân lên gây hủy hoại tế
bào (CPE) nhưng cũng có một số loại tế bào quan sát dưới kính hiển vi quang học,
không thấy hiện tượng CPE. Hiệu giá vi rút đạt được tùy thuộc vào tế bào chủ, loại
cảm ứng và trong điều kiện thích hợp vi rút nhân lên tốc độ nhanh, thời gian tạo CPE
nhanh sau 1-2 ngày gây nhiễm (tế bào C6/36, Vero và BHK21).

Hình ảnh tổn thương tế bào được quan sát trên kính hiển vi quang học cho
thấy: Tế bào phình to, các tiểu thể hạt xuất hiện ở lưới nội chất làm rối loạn chức
năng phân chia tế bào, vỏ màng nội bào tạo thành các không bào căng phồng và các
tiểu thể trong nhân bị méo mó. Có biểu hiện tăng sinh tiểu thể Lysosom và làm loãng
nguyên sinh chất của tế bào. Do đó hoạttính enzym lysosom tăng lên trong tổ chức tế
bào nhiễm.
1.1.4. Dịch tễ học phân tử của vi rút Viêm não Nhật Bản
Dịch tễ sinh học phân tử tập trung khai thác khía cạnh di truyền, dựa trênsự so
sánh trình tự nucleotide của một gen đích hoặc toàn bộ gen của các chủng vi rút
VNNB được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau để dự đốn tình hình lưu hành dịch,
giúp kiểm sốt tốt nguy cơ dịch bệnh,đồng thời là cơ sở cho lựa chọn chủng trong sản
xuất vắc xin… [2].
Hiện nay, dịch tễ học phân tử là phương pháp hiện đại nhất để xác định về đặc
điểm phân tử của tác nhân gây bệnh trên cơ sở đó xác định được nguồn gốc của căn
nguyên gây bệnh, sự lan truyền của tác nhân gây bệnh theo không gian, thời gian ở
cấp độ phân tử; theo dõi được sự thay đổi các chủng gây bệnh ở mức phân tử theo
thời gian và phân vùng địa lý; sự thay đổi trong quá trình cấy chuyển nhân giống, cất
giữ chủng trong sản xuất vắc xin; trong một số trường hợp nó cịn là cơ sở để phân
biệt vi rút vắc xin hay vi rút hoang dại…


9
Nghiên cứu dịch tễ học phân tử vi rút VNNB được thực hiện từ những năm
1990 với những phân tích về sự phát triển, tiến hoá của vi rút VNNB dựa vào cấu trúc
vùng gen PrM do nhóm tác giả nghiên cứu ở Indoneisia[16]. Tuy nhiên đây là đoạn
gen có độ dài khoảng 500 bp và tương đối ổn định, nên khi nghiên cứu về sự tiến hoá
của vi rút VNNB có thể sẽ bị hạn chế nếu sử dụng vùng gen này. Nhờ sự phát triển
của sinh học phân tử, đặc biệt là sự ra đời của máy giải trình tự gen, có thể giúp nghiên
cứu các vùng gen có kích thước lớn hơn. Do vậy, vùng gen E với độ dài 1500 bp, là
vùng có liên quan đến độc lực và tính sinh miễn dịch của vi rút đã được chọn là vùng

gen lý tưởng để nghiên cứu sự tiến hoá, sự phát tán, sự biến đổi, sự khác nhau của
các chủng vi rút VNNB. Cho đến nay có rất nhiều chủng vi rút VNNB đã được phát
hiện nhưng nhờ có sinh học phân tử mà phân ra 5 genotype. Ở Việt Nam có rất nhiều
chủng vi rút VNNB được phát hiện và hầu hết đều thuộc genotype 1 và genotype
3[17, 18, 19].
1.2.

Vắc xin Viêm não Nhật Bản

1.2.1. Lịch sử phát triển vắc xin VNNB
Năm 1938, Takanouchi và cs đã nghiên cứu sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt từ
não chuột. Sau đó thử cơng hiệu của vắc xin này trên chuột, kết quả đã phát hiện có
kháng thể trung hòa ở chuột sau khi tiêm vắc xin. Những nghiên cứu tiếp theo của
Mitamura trên thực địa lâm sàng trên người và nhận xét có đáp ứng miễn dịch ở vùng
không lưu hành dịch và đáp ứng miễn dịch kém hơn ở vùng có lưu hành dịch[3, 20].
Năm 1946-1949, hợp tác nghiên cứuvề miễn dịch của các nhà khoa học Mỹ và
Nhật về công hiệu của vắc xin VNNB do Nhật Bản sản xuất, đã chọn vùng có lưu hành
dịch là Okayama để thử nghiệm tiêm vắc xin. Kết quả thống kê cho thấy tỷ lệ mắc giảm
1/4 đến 1/3. Tuy nhiên vắc xin này gây ra nhiều phản ứng phụ đáng kể và gây viêm
não dị ứng sau khi tiêm vắc xin vì protein của não chuột chưa được loại bỏ hết[6].
Năm 1957, công nghệ sản xuất và chất lượng vắc xin đã được cải thiện một
bước, hàm lượng protein trong vắc xin được quy định là ≤2 mg/ml. Với các tiêu chuẩn
này vắc xin VNNB vẫn chưa đạt độ tinh khiết vì vậy nhiều trường hợp phản ứng phụ
nghiêm trọng đã xảy ra[6].


10
Năm 1962 tại Nhật Bản có 2 nhóm nghiên cứu là “Biken” ở Osaka và
“Nisseiken” ở Tokyo. Họ đã nghiên cứu tinh chế vắc xin bằng siêu ly tâm để loại bỏ
protein tạp và đã giảm được hàm lượng protein trong vắc xin xuống 10 lần (từ 0,2

mg/ml xuống 0,02 mg/ml)[21].
Năm 1965, Nhật Bản tiếp tục nghiên cứu nhằm nâng cao tính an tồn và hiệu
quả bảo vệ bằng các phương pháp hóa lý của Takaku.Kết quả đã tạo ra vắc xin đạt độ
tinh khiết rất cao, hàm lượng protein trong vắc xin chỉ cịn10-25 µg/ml. Vắc xin này
có hiệu quả bảo vệ cao và rất an toàn khi tiêm cho trẻ em, các phản ứng phụ không
đáng kể, chúng chỉ xảy ra ở một số cá thể có cơ địaquá mẫncảm[22].
Năm 1959-1981, một trường phái khác ở Trung Quốc đã nghiên cứu sản xuất
vắc xin sống giảm độc lực từ chủng vi rút độc lực. Bằng cách cấy truyền 110 lần trên
tế bào phơi gà sau đó tiếp tục cấy truyền trên tế bào thận chuột đất 100 lần nhưng vắc
xinvẫn còn yếu tố gây độc tế bào thần kinhdo đó chủng vi rútvắc xin tiếp tục được
lựa chọn bằng phương pháp tạo đám hoại tử và sau đócó được chủng 12.1.7 [23, 24].
Năm 1973, Yu và cs sử dụng chủng 2.8 bắt nguồn từ chủng 12.1.7 đượctiếp
tục giảm độc lực bằng tia cực tím[6].
Năm 1974, Chen và Wang chọn lọc chủng vi rút thuần khiết về di truyền bằng
kỹ thuật tạo đám hoại tử để có được 1 chủng cho sản xuất vắc xin. Sau đó đã sử dụng
chủng này đểsản xuất vắc xin thử nghiệm và đánh giá thực địa lâm sàng trên 8000 trẻ
em sống ở vùng khơng có lưu hành dịch. Kết quả cho thấy 50% trẻcó đáp ứng kháng
thể[6].
Năm 1981, Yu và cs lại tiếp tục chuyển chủng 2.8 bằng đường tiêm dưới da
cho chuột ổ và đã đạt được 1 chủng giảm độc lực cao đó là chủng 12.4. Sau đó tác
giả tiếp tục lựa chọn, thuần khiết để cuối cùng có được 1 chủng nhân lên mạnh mẽ
hơn và tính miễn dịch cao hơn trên tế bào so với chủng ban đầu[6].
Song song với việc nghiên cứu vắc xin sống giảm độc lực, Li và cs đã nghiên cứu
vắc xin bất hoạt từ tế bào ni, loại vắc xin này an tồn nhưng khả năng bảo vệ thấp hơn [6].
Từ năm 1968, quy trình cơng nghệ sản xuất vắc xin từ não chuột của Takaku
là công nghệ được coi là công nghệ tiên tiến nhất. Thử nghiệm thực địa được tiến


11
hành ở nhiều nơi, riêng ởThái Lan vắc xin đượcđánh giá rộng rãi trên trẻ em và tỷ lệ

đối tượngcó đáp ứng kháng thể đạt được đến91%. Vắc xin này được tiêm phòng trong
các quần thể dân cư ở một số nơi như Nhật Bản, Đài Loan, Trung Quốc và Thái Lan
đạt hiệu quả cao, đặc biệt khơng có các phản ứng phụ đáng kể cũng như khơng có
trường nào viêm não dị ứng sau khi tiêm vắc xin[6].
Năm 1971, Viện Biken được chỉ đạo của Giáo sư Fukai (nguyên Chủ tịch Hiệp
Hội nghiên cứu vắc xin và Sinh phẩm của Nhật Bản) đã nghiên cứu tinh chế vắc xin
để đạt độ tinh khiết với hàm lượng protein ≤ 80 µg/ml. Đây là hàm lượng tiêu chuẩn
của protein cho phép trong vắc xin VNNB sản xuất từ não chuột theo phương pháp
hóa lý của Takaku. Cho đến nay phương pháp tinh chế này vẫn là tiên tiến nhất được
TCYTTG công nhận. Năm 1989, VN cũng nhận chuyển giao công nghệ sản xuất vắc
xin VNNB từ não chuột (vắc xin JEVAX). Vắc xin thế hệ 2 là vắc xin sản xuất trên
tế bào (Nhật, Áo, Ấn Độ, Pháp, Trung Quốc, Thái Lan, Hàn Quốc, Việt Nam…). Vắc
xin thế hệ 3 bằng phương pháp cơng nghệ gen cho đến nay có rất nhiều tác giả nghiên
cứu nhưng hầu hết cũng chỉ dừng lại ở mức nghiên cứu thử nghiệm ở phịng thí
nghiệm[4,25].
Hiện nay có bốn loại vắc xin đang sản xuất và sử dụng rộng rãi dựa trên các
công nghệ sản xuất vắc xin đã nêu trên bao gồm (1) Công nghệ sản xuất vắc xin bất
hoạt trên não chuột (chủng Nakayama và Beijing -1); (2) Công nghệ sản xuất vắc xin
bất hoạt trên tế bào Vero (chủng Beijing -1, SA14-14-2); (3) Công nghệ sản xuất vắc
xin sống giảm độc lực trên tế bào PHK (chủng SA14-14-2); (4) Sản xuất vắc xin tái
tổ hợp theo công nghệ khảm (chimeric –JE and YF-17D vắc xin, chủng SA14-14-2).
Trong bốn loại này thì trừ loại đầu sản xuất trên não chuột (thực tế có 2 vắc
xin của Việt Nam, Hàn Quốc) còn lại đều là cơng nghệ sản xuất trên tế bào. Điều đó
để thấy xu hướng chung của thế giới hiện nay chính là dần chuyển sang công nghệ
sản xuất vắc xin VNNB trên tế bào.


12
Bảng 1. 1. Các loại vắc xin VNNB và công nghệ sản xuất hiện nay
STT

Tên VX

Chủng vi rút

Công nghệ
SX

Dạng VX

1

JE vaccinee GCCa

Nakayama-NIH

Não chuột

Bất hoạt, dung dịch

2

JEVAXa

Nakayama-NIH

Não chuột

Bất hoạt, dung dịch

3

4

5

6

7

8

Japanese encephalitis
vaccinee

RS.JEVa

SA14-142Inactivated vaccinee

JE-VC
IC51 (hay IXIARO
®hay JESPECT®)
JEEVa

NSX
Green Cross,
Berna-Korea
Vabiotech, Việt
Nam
Beijing, Inst of

Beijing-3

TB PHK

Bất hoạt, dung dịch

Biological
Products

SA-14-14-2.

TB PHK

Sống giảm độc lực,
đông khô

Chengdu, China
Intercell AG

SA-14-14-2.

TB PHK

Bất hoạt, dung dịch

(Biological E,
WRAIR), Áo

Sống giảm độc lực,

Novartis

đông khô

Vaccinees

TB Vero

Bất hoạt, hấp phụ

Novatis

TB Vero

Bất hoạt, hấp phụ

SA-14-14-2

TB Vero

SA-14-14-2

SA-14-14-2

B/E (Biological
E. limited), India

SA-14-14-2
ChimeriVax-JE

9

(chimeric

(marketed as
IMOJEV)a

TB Vero
Vero cell-derived-

Sống giảm độc lực,

Sanofi Pasteur,

đông khô

Pháp

Bharat, India

YF
10

11

JENVAC
ENCEVAC ®/KD287

821564-XY

TB vero

Bất hoạt

Beijing-1

TB Vero

Bất hoạt, đơng khơ

12

BK-VJE

Beijing-1

TB Vero

Bất hoạt, đông khô

13

JECEVAX (*)

Beijing-1

TB Vero

Bất hoạt

Kaketsuken,
Japan
Biken (Japan)
Vabiotech, Việt
Nam

(a): Các vắc xin đã và đang lưu hành ở VN
(*): Vắc xin đã xong các nghiên cứu trên lâm sàng và đang hoàn thiện các thủ tục đăng ký
xin cấp phép lưu hành.


13
Việt Nam bắt đầu đưa vắc xin VNNB JEVAX vào chương trình tiêm chủng
mở rộng quốc gia (TCMR QG) từ năm 1991 đến nay số ca nhiễm vi rút VNNB giảm
đáng kể.
Bảng 1. 2. Tỷ lệ mắc VNNB ở bệnh nhân VNVR năm 1991-2019
Năm

Số mẫu xét nghiệm

Số mẫu (+) với VNNB

Tỷ lệ (+) VNNB (%)

1991-1995

2.373

1.454

61,3%

1996-2000

1.285

599

46,6%

2001-2005

2.880

1.129

39,2%

2009

697

68

9,7%

2010

1.075

140

13,0%

2011

1.059

126

11,2%

2012

1.846

183

9,9%

2013

2.234

224

10,0%

2014

2.275

421

18,5%

2015

2.744

368

13,4%

2016

3.230

357

11,0%

2017

1.977

203

10,3%

2018

3.125

313

10,0%

2019

2.334

196

8,4%

(Nguồn: TCMRQG trong báo cáo hội nghị TCMRQG 2020)
Qua bảng 1.2 để thấy rõ vai trò của vắc xin trong cơng tác phịng bệnh với vi
rút VNNB của VN.
1.2.2. Sự phát triển của vắc xin Viêm não Nhật Bản trên tế bào
Trung Quốc là nước đầu tiên trên thế giới nghiên cứu sản xuất vắc xin trên tế
bào, hiện nay Nhật Bản cũng đã nghiên cứu thành công công nghệ này.
Sau nhiều năm nghiên cứu, các tác giả Trung Quốc đã tạo được một chủng
VNNB giảm độc lực SA 14-14-2. Chủng này nhân lên tốt trên tế bào PHK và được
sử dụng để sản xuất vắc xin sống giảm độc lực. Trung Quốc đã gây miễn dịch cho
lợn ở các trại chăn nuôi để hạn chế ổ dịch vi rút viêm não gần người. Ngày nay vắc


14
xin sống giảm độc lực trên tế bào PHK đã dùng cho người và thấy có khả năng bảo

vệ gần 70%. Tuy nhiên về mặt an tồn thì cịn phải được chứng minh đầy đủ[6].
Từ năm 1994, Viện sản xuất các chế phẩm sinh học Chengdu, Vũ Hán,
Lanzhou bắt đầu ứng dụng công nghệ sản xuất vắc xin sống giảm độc lực trên tế bào
PHK để sản xuất và đưa ra sử dụng ở một số nơi tại Trung Quốc[6].
Vắc xin bất hoạt được nuôi cấy trên tế bào thận chuột hamster tiên phát,đã sử
dụng chủng Beijing -3 (P3) và được sản xuất tại Viện sản xuất các sản phẩm sinh học
Bắc Kinh, Thượng Hải, Vũ Hán và Thành Đô. Đây là loại vắc xin rất an toàn nhưng
hiệu quả bảo vệ thấp,chỉ đạt dưới70%[24, 26, 27].
Tại Việt Nam, từ thập kỷ 70, tác giả Đỗ Quang Hà cũng đã nghiên cứu sản
xuất thử vắc xin VNNB từ tế bào thận lợn tiên phát, nhưng thử nghiệm thực địa khơng
có đáp ứng miễn dịch.
Những năm cuối thập kỷ 90 của thế kỷ trước, nhiều nhà sản xuất trên thế giới
đã nghiên cứusản xuấtvắc xin VNNB bất hoạt, tinh khiếttrên tế bào Vero như Aventis
(Pháp), Biken (Nhật), Viện vắc xin và huyết thanh Bắc Kinh (Trung Quốc), Intercell
(Áo) và Học viện nghiên cứu Y học quân sự Mỹ… bước đầu cho thấy vắc xin cótỷ lệ
bảo vệ trên thực địa cao >80%. Hiện nay vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero
của Intercell đã chuyển giao công nghệ cho Novatis và được sử dụng tiêm chủng cho
lính Mỹ và khách du lịch đến các vùng có dịch VNNB. Vắc xin VNNB bất hoạt trên
tế bào Vero của Biken (Nhật Bản) đã có mặt trên thị trường quốc tế[5, 8, 21, 28]. Ở
VN từ năm 2006, GS. Huỳnh Thị Phương Liên và cs (Vabiotech) bắt đầu nghiên cứu
sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero dùng chủng Beijing-1 (vắc xin
JECEVAX), đến năm 2020 vắc xin này đã xong thử nghiệm lâm sàng và đang hoàn
thiện các thủ tục để đăng ký lưu hành [6, 29, 30].
Hướng nghiên cứu vắc xin VNNB tái tổ hợp cũng được nhiều nhà Khoa học
rất quan tâm. Tuy nhiên, việc nghiên cứu dùng vi rút Pox, Varicella,
Bacculovirus…làm vector vẫn chưa đạt được kết quả như mong muốn. Các nghiên
cứu trên mới chỉ dừng lại ở phịng thí nghiệm vì hiệu quả rất thấp.Từ cuối những năm
1990, chủng SA 14-14-2 sống giảm độc lực còn được sử dụng để nghiên cứu phát

15
triển vắc xin mới bằng công nghệ DNA tái tổ hợp tạo ra 1 chủng vi rút Chimeric YFJE bằng cách thay thế các gen prM và E của vi rút sốt vàng YFV 17D với các gen
tương ứng của chủng SA 14-14-2 sống giảm độc lực của JEV[31, 32].
Vắc xin tái tổ hợp sống giảm độc lực sản xuất trên TB Vero (được gọi là
ChimeriVax-JE) được đưa ra thị trường với một trong ba tên thương mại IMOJEV,
JE-CV và THAIJEV. Hiệu quả bảo vệ có thể đạt từ 96-99% sau mũi 2. Hiện tại, vắc
xin này đã được lưu hành ở 15 nước trên thế giới như: Úc, Hàn Quốc, Hồng Kông,
Đài Loan, Philippin, Singapo, Malaysia, Thái Lan, Ấn Độ… [33].
Vắc xin sản xuất trên não chuột ổ tinh khiết mặc dù có hiệu lực bảo vệ cao, ổn
định nhưng đòi hỏi nguồn nguyên liệu chuột phải sạch bệnh từ đó kéo theo một hệ
thống chăn ni chuột và kiểm soát chất lượng rất phức tạp, tốn kém. Qui trình sản
xuất bao gồm nhiều cơng đoạn từ sản xuất vắc xin thô đến tinh chế, lượng chất thải
lớn, hệ thống nhà xưởng, trang thiết bị và nhân lực lớn, cồng kềnh, khó mở rộng qui
mơ sản xuất.Thêm vào đó, hiệu suất sản xuất không cao, chỉ đạt 4-5 liều vắc xin/1
não chuột nên sản lượng bị hạn chế.
Vắc xin sản xuất trên tế bào mặc dù hiệu quả bảo vệ có thấp hơn nhưng đã
khắc phục được các nhược điểm của công nghệ sản xuất trên não chuột ổ. Điều đáng
quan tâm hơn đó là cơng nghệ sản xuất vắc xin trên tế bào có thể mở rộng qui mơ sản
xuất một cách nhanh chóng, do đó có khả năng cung cấp sản lượng vắc xin lớn, giá
thành rẻ và người dân dễ dàng tiếp cận vắc xin, nhất là trong các vụ dịch. Công nghệ
tế bào cũng là công nghệ nền mở đường cho các công nghệ sản xuất hiện đại hơn như
vắc xin tái tổ hợp, vắc xin vector, vắc xin DNA…trong tương lai.
1.2.3. Các biến thể di truyền và kháng nguyên trong vi rút VNNB và việc tiêm
phòng[34]
Việc sử dụng chủng vi rút VNNB thuộc genotype III (GIII) để sản xuất vắc
xin VNNB đến nay đã giúp thế giới đẩy lùi, giảm tỷ lệ bị mắc bệnh VNNB một cách
đáng kể.
Tuy nhiên, trong 2 thập kỷ qua, việc thay thế chủng vi rút VNNB lưu hành
trên người từ GIII bằng GI đã được quan sát thấy ở một số nơi[35, 36]. Một nghiên
cứu gần đây ở người cho thấy hiệu quả trung hòa giảm đi đối với GI bằng các kháng