Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào vero ở quy mô phòng thí nghiệm

Công ty Vắcxin và Sinh phẩm số 1






Báo cáo tổng kết đề tài:

Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ
sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero
ở quy mô phòng Thí nghiệm



Cnđt: Đỗ Tuấn Đạt

8514

Hà nội 2010



DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABLV
Lyssavirus dơi Úc (Australian Bat Lyssavirus)
BPL
Β-propiolactone
CVS
Chủng virút thử thách (Challenge Virus Standard)
EBLV
Lyssavirus dơi châu Âu (European Bat Lyssavirus)
EP
Dược điển châu Âu (European Pharmacopoeia)
IU
Đơn vị quốc tế (International unit)
LAL
Thử nghiệm xác định nội độc tố theo phương pháp LAL
(Limulus amoebocyte lysate)
LD
50

Liều lượng gây chết 50% (Lethal Dose)
MEM
Môi trường dinh dưỡng tối thiểu (Minimum Essential medium)
MNA

Tế bào nguyên bào thần kinh chuột (Murine Neuroblastoma
cell)
MOI
Multiplicity of Infection
MSV
Chủng vi rút giống gốc (Master seed virus)
NIH
Viện Sức khỏe Quốc gia Hoa Kỳ (National Institute of Health)
NMR
Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance)
PM
Chủng Pitman-Moore
PPLO
Pleuropneumonia - like organism
PV
Chủng Pasteur Virus
RFFIT
Thử nghiệm ức chế điểm huỳnh quang nhanh (Rapid
fluorescent focus inhibition test)
SDS-PAGE
Điện di trên gel acrylamide (Sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis)
TCYTTG
Tổ chức Y tế thế giới (WHO)
VABIOTECH
Công ty Vắcxin và sinh phẩm số 1
VVSDT
Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương
WCB
Ngân hàng tế bào sản xuất (Working cell bank)

WSV
Chủng vi rút giống sản xuất (Working seed virus)


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng số
Tên bảng
Trang
1.1.
Các loại vắcxin dại thế hệ thứ nhất được sử dụng cho người
và thú y

14
1.2.
Các loại vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào và quy trình sản xuất
21
2.1.
Số lượng tế bào Vero thu được qua các đời cấy chuyển trong
quá trình nhân nuôi trên chai nuôi cấy một lớp

49
2.2.
Kết quả nuôi cấy virút dại với các liều gây nhiễm khác nhau
51
2.3.
Kết quả nuôi cấy virút dại theo ngày sau gây nhiễm virút vào
tế bào
66
2.4.

Kết quả nuôi cấy virút dại theo thời điểm thay môi trường duy
trì tế bào khác nhau

69
2.5.
Kết quả nuôi cấy virút dại trên các dạng chai nuôi cấy khác
nhau

72
2.6.
Kết quả tinh sạch hỗn dịch virút bằng các loại màng lọc khác
nhau

75
2.7.
Kết quả bất hoạt virút dại bằng các phương pháp bất hoạt
khác nhau

76
2.8.
Kết quả cô đặc hỗn dịch virút dại theo các tỷ lệ khác nhau
78
2.9.
Kết quả kiểm tra chất gây sốt trong bán thành phẩm vắcxin
dại

91
3.1.
Kết quả nhân nuôi tế bào Vero của các loạt sản xuất thử
nghiệm

95
3.2.
Kết quả gây nhiễm virút dại của các loạt sản xuất thử nghiệm
96
3.3.
Kết quả nuôi cấy virút dại và thu hoạch nước nổi loạt 0109
97
3.4.
Kết quả nuôi cấy virút dại và thu hoạch nước nổi loạt 0209
98
3.5.
Kết quả nuôi cấy virút dại và thu hoạch nước nổi loạt 0309
99
3.6.
Kết quả tinh sạch hỗn dịch virút của các loạt sản xuất thử
nghiệm

100
3.7.
Kết quả bất hoạt virút của các loạt sản xuất thử nghiệm
101

3.8.
Kết quả cô đặc hỗn dịch virút của các loạt sản xuất thử
nghiệm

101
3.9.
Kết quả tinh chế virút của các loạt sản xuất thử nghiệm

102
3.10.
Kết quả pha bán thành phẩm cuối cùng của các loạt sản xuất
thử nghiệm

105
3.11.
Kết quả sản xuất vắcxin thành phẩm của các loạt sản xuất thử
nghiệm

105
3.12.
Kết quả kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm tại cơ sở của
các loạt sản xuất thử nghiệm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào
Vero dạng đông khô (VERAPVAX)


106
3.13.
Kết quả kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm tại cơ sở của
các loạt sản xuất thử nghiệm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào
Vero dạng lỏng (VERALVAX)


107
4.1.
Tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero
(dạng lỏng hấp phụ nhôm)

141

4.2.
Tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero
(dạng đông khô)
142
5.1.
Kết quả kiểm tra an toàn đặc hiệu của vắcxin dại trên nuôi
cấy tế bào Vero

153
5.2.
Kết quả kiểm tra tính an toàn chung của vắcxin dại trên nuôi
cấy tế bào Vero

153
5.3.
Kết quả kiểm tra chất gây sốt của vắcxin dại trên nuôi cấy tế
bào Vero dạng lỏng (VERALVAX)

154
5.4.
So sánh đáp ứng miễn dịch của vắcxin dại trên nuôi cấy tế
bào Vero do VABIOTECH sản xuất với vắcxin Verorab

155



DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình số

Tên hình
Trang
1.1.
Cấu trúc hạt virút dại
6
1.2.
Nguồn gốc của các chủng dại cố định được sử dụng trong sản
xuất vắcxin trên nuôi cấy tế bào

18
2.1.
Tóm tắt quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy
tế bào Vero

39
2.2.
Hình ảnh tế bào Vero qua các đời cấy chuyển
41
2.3.
Hình ảnh chuột liệt do chủng virút dại cố định PV
56
2.4.
Hình ảnh nhiễm virút dại vào tế bào Vero dưới kính hiển vi
huỳnh quang

60
2.5.
Kết quả siêu ly tâm phân vùng bằng rotor zonal tinh chế virút
dại

85
2.6.
Hình ảnh điện di sản phẩm sau khi tinh chế virút dại theo
phương pháp siêu ly tâm phân cùng bằng rotor zonal

86
2.7.
Hình ảnh siêu ly tâm phân vùng bằng rotor góc cố định tinh
chế virút dại

86
2.8.
Hình ảnh điện di các phân đoạn sau khi tinh chế virút dại theo
phương pháp siêu ly tâm phân cùng bằng rotor góc cố định

87
2.9.
Phương pháp lai điểm xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư
trong các sản phẩm của quá trình sản xuất vắcxin dại

88
3.1.
Xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư trong các sản phẩm
của loạt sản xuất vắcxin dại 0209

102
3.2.
Xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư trong các sản phẩm
của loạt sản xuất vắcxin dại 0109 và 0309

103
3.3.
Hình ảnh chạy điện di trên gel SDS-PAGE các sản phẩm của
loạt sản xuất vắcxin dại 0109

103
3.4.
Hình ảnh chạy điện di trên gel SDS-PAGE các sản phẩm của
loạt sản xuất vắcxin dại 0209 và 0309

104
5.1.
Sơ đồ gây miễn dịch và lấy máu chuột
146

MỤC LỤC
NỘI DUNG
Trang
MỞ ĐẦU
1
CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN
5
1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH DẠI
5
1.1.1. Tác nhân gây bệnh và đặc điểm bệnh lý
5
1.1.2. Đáp ứng miễn dịch với virút dại
7
1.1.3. Tác động của bệnh dại đối với sức khỏe cộng đồng
8

1.1.4. Các khuyến cáo về tiêm phòng bệnh dại hiện nay
9
1.2. TỔNG QUAN VỀ VẮCXIN DẠI
13
1.2.1. Các vắcxin thế hệ thứ nhất
13
1.2.2. Các vắcxin thế hệ thứ hai
17
1.3. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG
VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO

20
1.3.1. Quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào
20
1.3.2. Kiểm tra chất lƣợng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào
24
1.4. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC, TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ
SẢN XUẤT VẮCXIN DẠI TẠI VIỆT NAM

31
CHƯƠNG 2-XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT
VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO Ở QUY MÔ
PHÒNG THÍ NGHIỆM


36
2.1. QUY TRÌNH NUÔI CẤY VÀ CHUẨN BỊ TẾ BÀO VERO
39
2.1.1. Các thử nghiệm kiểm tra nƣớc nổi nuôi cấy tế bào
43

2.1.2. Thử nghiệm kiểm tra các virút hấp phụ hồng cầu
47
2.1.3. Kết quả quy trình nuôi cấy tế bào Vero trên chai tế bào một lớp
48
2.2. QUY TRÌNH GÂY NHIỄM VIRÚT DẠI VÀO TẾ BÀO VERO
49
2.3. QUY TRÌNH NUÔI CẤY VIRÚT VÀ THU HOẠCH NƢỚC NỔI
53
2.3.1. Các phƣơng pháp xác định hiệu giá virút dại
54
2.3.2. Kết quả nuôi cấy virút dại theo các điều kiện nhân nuôi khác
nhau

65

2.4. QUY TRÌNH TINH SẠCH HỖN DỊCH VIRÚT
74
2.5. QUY TRÌNH BẤT HOẠT VIRÚT
76
2.6. QUY TRÌNH CÔ ĐẶC HỖN DỊCH VIRÚT
77
2.7. QUY TRÌNH TINH CHẾ VIRÚT
79
2.7.1. Thử nghiệm phát hiện ADN tế bào Vero tồn dƣ trong các sản
phẩm của quy trình tinh chế vắcxin dại bằng phƣơng pháp lai
điểm


79
2.7.2. Các phƣơng pháp tinh chế virút dại

84
2.8. QUY TRÌNH PHA BÁN THÀNH PHẨM CUỐI CÙNG
89
2.9. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN THÀNH PHẨM
92
CHƯƠNG 3-SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM VẮCXIN DẠI Ở QUY
MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM

94
3.1. KẾT QUẢ NUÔI CẤY VÀ CHUẨN BỊ TẾ BÀO VERO
94
3.2. KẾT QUẢ GÂY NHIỄM VIRÚT DẠI VÀO TẾ BÀO VERO
95
3.3. KẾT QUẢ NUÔI CẤY VIRÚT VÀ THU HOẠCH NƢỚC NỔI
96
3.4. KẾT QUẢ TINH SẠCH HỖN DỊCH VIRÚT
100
3.5. KẾT QUẢ BẤT HOẠT VIRÚT
100
3.6. KẾT QUẢ CÔ ĐẶC HỖN DỊCH VIRÚT
101
3.7. KẾT QUẢ TINH CHẾ VIRÚT
101
3.8. KẾT QUẢ PHA BÁN THÀNH PHẨM CUỐI CÙNG
104
3.9. KẾT QUẢ SẢN XUẤT VẮCXIN THÀNH PHẨM
105
3.10. KẾT QUẢ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG VẮCXIN THÀNH PHẨM
TẠI CƠ SỞ

105
CHƯƠNG 4 - XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT
LƯỢNG VÀ TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO VẮCXIN
VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO


109
4.1. CÁC PHƢƠNG PHÁP KIỂM TRA SINH HỌC
110
4.1.1. Phƣơng pháp kiểm tra vô khuẩn
110
4.1.2. Phƣơng pháp kiểm tra an toàn chung
113
4.1.3. Phƣơng pháp kiểm tra chất gây sốt
116
4.1.4. Phƣơng pháp kiểm tra an toàn đặc hiệu
119
4.1.5. Phƣơng pháp kiểm tra công hiệu
121

4.1.6. Thử nghiệm nhận dạng
125
4.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP KIỂM TRA HÓA LÝ
126
4.2.1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein tổng số
126
4.2.2. Xác định pH trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero
130
4.2.3. Định lƣợng thimerosal trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào
Vero

131
4.2.4. Định lƣợng nhôm trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero
dạng lỏng

134
4.2.5. Xác định độ ẩm tồn dƣ trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào
Vero dạng đông khô

136
4.2.6. Kiểm tra tính chất vật lý vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero
139
5.3. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO VẮCXIN DẠI TRÊN
NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO

140
CHƯƠNG 5- ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ HIỆU LỰC
VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM

143
5.1. CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ ĐÁP
ỨNG MIỄN DỊCH CỦA VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ
NGHIỆM


144
5.1.1. Các phƣơng pháp đánh giá tính an toàn của vắcxin trên động
vật thí nghiệm

144
5.1.2. Các phƣơng pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch của vắcxin trên

chuột

144
5.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ HIỆU LỰC CỦA
VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM

152
5.2.1. Tính an toàn của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào trên động vật
thí nghiệm

152
5.2.2. Đáp ứng miễn dịch của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero
trên động vật thí nghiệm

154
KẾT LUẬN
157
KIẾN NGHỊ
160
TÀI LIỆU THAM KHẢO
161
PHỤ LỤC


1
MỞ ĐẦU

Tại trên 100 nước và vùng lãnh thổ, dại là một bệnh gây dịch trên động
vật. Bệnh dại ở chó là nguồn lây nhiễm chiếm đến 99% sang cho người và là
nguy cơ đe dọa tính mạng trên 3,3 tỷ người, chủ yếu tại các nước châu Á và

châu Phi. Cùng với chó nuôi tại nhà, nhiều giống thú ăn thịt và dơi cũng có
thể làm lây truyền bệnh dại sang cho người. Khi đã có biểu hiện trên lâm
sàng, phần lớn các ca bệnh dại đều tử vong do vậy việc tiêm phòng là biện
pháp phòng bệnh cũng như điều trị bệnh dại cho hiệu quả cao nhất. Gần 10
triệu người được tiêm phòng sau khi phơi nhiễm hàng năm chủ yếu tại các
nước châu Á. Tiêm phòng dại sau khi phơi nhiễm đã tránh được trên 300.000
ca tử vong hàng năm tại châu Á và châu Phi. Chi phí toàn cầu hàng năm cho
phòng bệnh dại ước tính khoảng trên 1 tỷ đô la Mỹ. Chi phí này cũng như tỷ
lệ đi tiêm phòng sau khi phơi nhiễm dự tính sẽ tăng lên một cách đáng kể khi
tất cả các nước thay thế vắcxin sản xuất từ mô thần kinh bằng vắcxin trên
nuôi cấy tế bào.
Trên 100 năm trước đây, Louis Pasteur và cộng sự đã phát triển vắcxin
dại thô đầu tiên để tiêm phòng sau khi phơi nhiễm dựa trên việc bất hoạt virút
trên mô thần kinh. Từ đó trở đi một số loại vắcxin đã được phát triển và sử
dụng trên thế giới. Các vắcxin thế hệ thứ nhất đều sử dụng mô động vật để có
được hỗn dịch chứa virút. Các vắcxin này đã được sử dụng rộng rãi để phòng
bệnh cho cả người và động vật. Tuy nhiên, các vắcxin này có rất nhiều nhược
điểm như còn virút sống tồn dư, hay gặp các phản ứng não tủy sau khi tiêm
vắcxin và hàm lượng kháng nguyên cho một liều tiêm thấp đòi hỏi phải có
một liệu trình điều trị kéo dài với một số lượng lớn các mũi tiêm. Dù đã có
những cải tiến bằng cách nhân nuôi virút trên não các động vật sơ sinh trước

2
khi myelin phát triển, các vắcxin bất hoạt sản xuất trên não động vật chưa dứt
sữa vẫn có thể gây ra các phản ứng thần kinh không mong muốn. Do vậy, các
vắcxin thế hệ thứ hai sản xuất trên nuôi cấy tế bào đã ra đời nhằm khắc phục
các nhược điểm của các dạng vắcxin cổ điển. Vắcxin này có tính an toàn và
công hiệu cao do đó được các nước phát triển lựa chọn để tiêm phòng cho
người trước và sau khi phơi nhiễm với virút. Đáp ứng miễn dịch và hiệu lực
của vắcxin trên nuôi cấy tế bào đã được chứng minh trên động vật thí nghiệm

và thực địa lâm sàng trên người. Ở cả phương pháp tiêm phòng trước và sau
khi phơi nhiễm, các vắcxin này đều tạo được đáp ứng kháng thể ở trên 99%
người được tiêm. Sử dụng các vắcxin thế hệ mới kết hợp với xử lý vết cắn
đúng cách và tiêm phòng globulin miễn dịch kháng dại đã tạo ra hiệu quả
phòng bệnh dại là 100% thậm chí cả với những trường hợp bị cắn có nguy cơ
mắc bệnh cao. Do vậy việc nghiên cứu, phát triển, sản xuất và tiến tới đưa ra
sử dụng rộng rãi vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào là cần thiết. Các quốc gia trên
thế giới cần sớm có các chiến lược để sử dụng và triển khai rộng khắp loại
vắcxin tiên tiến và cho hiệu quả cao này.
Tại Việt Nam, trong những năm 1991-1995, bệnh dại là vấn đề y tế
nghiêm trọng gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, tính mạng và kinh tế của
người dân. Bệnh xảy ra quanh năm, lưu hành ở hầu hết các tỉnh, thành phố
trên cả nước. Nếu tính một người tiêm vắcxin dại phí tổn 300.000 đồng (gồm
tiền thuốc, công lao động, tiền đi lại…) thì trong năm 1995 cả nước tốn gần
100 tỷ đồng. Thêm vào đó, mỗi năm có trên dưới 500 người thiệt mạng do
bệnh dại. Trước tình hình nghiêm trọng của bệnh dại, năm 1996, Chính phủ
đã ban hành chỉ thị về việc tăng cường phòng chống bệnh dại và Bộ Y tế đã
thành lập ban chỉ đạo Phòng chống bệnh dại Quốc gia. Thành công của
Chương trình là đến năm 2006 số ca tử vong do bệnh dại đã giảm 81% so với
năm 1995. Tuy nhiên, trong năm 2007, số ca tử vong do bệnh dại đã lại tăng

3
lên đến trên 100 trường hợp. Nguyên nhân có thể là do việc kiểm soát nguồn
gây bệnh mà chủ yếu là chó - nguồn gây bệnh chính tại Việt Nam còn nhiều
hạn chế. Bên cạnh đó, việc thay đổi chính sách sử dụng vắcxin, ngừng sử
dụng vắcxin thế hệ cũ rẻ tiền thay thế bằng vắcxin nhập ngoại sản xuất trên
nuôi cấy tế bào đắt tiền hơn, làm giảm khả năng được tiếp cận với vắcxin
phòng bệnh của các bệnh nhân nghèo, đặc biệt tại các vùng nông thôn, vùng
sâu, vùng xa.
Ở Việt Nam, trước năm 1974, vắcxin phòng bệnh dại cho người chủ

yếu là vắcxin sản xuất từ não cừu, dê (Fermi, Semple). Các vắcxin này có
chứa một lượng virút chưa bất hoạt và tính sinh miễn dịch thấp nên phải tiêm
nhiều mũi cùng với liều tiêm lớn. Từ năm 1974, Viện Vệ sinh dịch tễ học Hà
Nội đã nghiên cứu sản xuất vắcxin dại trên não chuột ổ theo phương pháp của
Fuenzalida-Palacios được chuyển giao kỹ thuật từ Viện Pasteur Paris (Pháp).
Ưu điểm chính của vắcxin này là không chứa hoặc chứa rất ít myelin của não
nên ít gây các tai biến thần kinh hơn. Hiệu giá virút thu hoạch từ não chuột ổ
cao hơn do đó tính sinh miễn dịch tốt hơn do vậy làm giảm số liều tiêm. Việc
sử dụng vắcxin dại trên não chuột ổ trong hơn 30 năm qua đã góp phần hạn
chế nguy cơ tử vong do bệnh dại. Theo kết quả báo cáo từ các Trung tâm Y tế
Dự phòng trên cả nước, trên 80% các trường hợp sau khi tiêm vắcxin
Fuenzalida có các phản ứng không mong muốn, các phản ứng không mong
muốn nghiêm trọng như viêm não tủy gây liệt vĩnh viễn và tử vong gặp với tỷ
lệ 1-2 trường hợp/10.000 mũi tiêm. Do các phản ứng không mong muốn
nghiêm trọng này, nên từ năm 2007, Bộ Y tế đã ra quyết định ngừng việc sử
dụng vắcxin dại Fuenzalida trên toàn quốc thay thế bằng các vắcxin nhập
ngoại sản xuất trên nuôi cấy tế bào trong đó chủ yếu là vắcxin Verorab của
Hãng Aventis Pasteur. Tỷ lệ bệnh nhân được tiêm phòng bằng vắcxin trên
nuôi cấy tế bào được nhập ngoại trước đây chỉ chiếm 15% số người được tiêm

4
vắcxin dại và giá thành cho một liệu trình tiêm loại vắcxin này rất đắt (gần
800.000 đồng) do đó cơ hội để các bệnh nhân nghèo, vùng sâu, vùng xa được
tiêm loại vắcxin này là rất hạn chế.
Đứng trước yêu cầu cần sớm có được vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào
được sản xuất trong nước nhằm làm giảm chi phí tiêm phòng cho bệnh nhân,
để nhiều người có cơ hội được tiêm phòng vắcxin dại từ đó giảm tỷ lệ tử vong
do bệnh dại, từ năm 2005 nhóm nghiên cứu của Công ty Vắcxin và sinh phẩm
số 1 (VABIOTECH) đã hướng đến việc nghiên cứu và phát triển vắcxin dại
trên nuôi cấy tế bào Vero tại Việt Nam. Nhận được sự hợp tác và giúp đỡ của

của Trung tâm Kiểm soát bệnh tật và Dự phòng Hoa kỳ (CDC) trong việc
cung cấp các chủng giống sản xuất vắcxin dại, nhóm nghiên cứu đã tiến hành
các nghiên cứu ở cấp cơ sở và lựa chọn ra được chủng virút PV (Pasteur
Virus) và môi trường nuôi cấy không huyết thanh đạt các yêu cầu cho sản
xuất vắcxin. Từ những thành công này, nhóm nghiên cứu bắt đầu tiến hành
xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở
quy mô phòng thí nghiệm. Với kinh nghiệm trên 30 năm sản xuất và kiểm
định chất lượng vắcxin dại sản xuất trên não chuột ổ, cùng với những kinh
nghiệm và thành công trong việc phát triển các vắcxin mới, VABIOTECH
đưa ra các mục tiêu và nội dung trong Đề tài nghiên cứu này với mong muốn
sớm có được sản phẩm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào đạt tiêu chuẩn được
sản xuất tại Việt Nam.
Các mục tiêu nghiên cứu của Đề tài
1. Xây dựng được qui trình công nghệ ổn định sản xuất vắcxin dại trên
nuôi cấy tế bào Vero ở qui mô phòng thí nghiệm.
2. Sản xuất được các loạt vắcxin dại có chất lượng đạt yêu cầu của Tổ
chức Y tế thế giới và tương đương với các vắcxin cùng loại của nước
ngoài như vắcxin Verorab của Aventis Pasteur.
5

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH DẠI
1.1.1. Tác nhân gây bệnh và đặc điểm bệnh lý
Virút dại thuộc nhóm Rhabdoviridae, họ Lyssavirus. Trong họ
Lyssavirus, virút dại cổ điển (các chủng virút hoang dại ở chó, mèo… và các
chủng virút dại cố định) thuộc genotype đầu tiên trong 7 genotype của nhóm.
Các virút thuộc các genotype còn lại thường gây bệnh ở động vật, tuy nhiên
đã có những trường hợp tử vong do nhiễm các virút này ở người như nhiễm

Lyssavirus dơi Úc (ABLV) hay nhiễm Lyssavirus dơi châu Âu (EBLV). Hạt
virút dại có hình viên đạn với chiều dài trung bình là 180 nm và đường kính là
75nm. Mỗi hạt virút có chứa nucleocapsid xoắn bao quanh bởi lớp một vỏ
lipid kép (Hình 1.1). Hệ gen là một ARN chuỗi đơn âm không phân đoạn có
chiều dài 11,9 kb. Bề mặt ngoài bao phủ bởi các gai có chiều dài khoảng 10
nm gắn vào lớp lipid. Virút dại có 5 protein cấu trúc chính. Phức hợp
ribonucleoprotein hạt nhân xoắn chứa ARN hệ gen liên kết với 3 protein bên
ngoài là enzyme ARN polymerase phụ thuộc ARN (L) (190kd), nucleoprotein
(N) (55 Kd) và phosphoprotein (NS) (38 KD). Các protein này cùng với ARN
tạo thành phức hợp ARN hoạt động kiểm soát cả quá trình phiên mã và nhân
lên của virút. Các protein cấu trúc khác là protein phức hợp (M) (26 kD) nằm
ở mặt trong vỏ của virút tạo thành cấu trúc ống và glycoprotein (G) (67K) tạo
thành các gai trên bề mặt virút [46], [52].
Bệnh dại bản chất là bệnh thú y và lây nhiễm sang người qua vết cắn và
vết cào xuyên da của động vật nhiễm. Lây truyền cũng có thể xảy ra khi chất
lây nhiễm thường là nước bọt xâm nhập trực tiếp vào niêm mạc hoặc tổn
6

thương da mới của nạn nhân. Bệnh dại rất hiếm xảy ra do hít phải các chất tiết
có chứa virút hoặc cấy ghép phủ tạng nhiễm bệnh.





Hình 1.1. Cấu trúc hạt virút dại
Đối với các ca bệnh ở người, giai đoạn ủ bệnh thường từ vài tuần đến
vài tháng nhưng cũng có thể thay đổi từ dưới 1 tuần đến trên 1 năm. Thời gian
ủ bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố như lượng virút lây nhiễm, mức độ tổn
thương và vị trí gần với thần kinh trung ương không của nơi virút xâm nhập

[13], [55].
Virút lây nhiễm di chuyển vào hệ thống thần kinh trung ương qua các
dây thần kinh ngoại vi, khi đến não bộ vi rút nhân lên và phát tán ngược trở ra
hệ thống thần kinh và nhiều phủ tạng khác nhau như tuyến nước bọt. Virút dại
lan truyền đến toàn bộ cơ thể thì bắt đầu các triệu chứng khởi phát tuy nhiên
lúc đó cơ thể không có được đáp ứng miễn dịch với vi rút [52].
Hiện chưa có thử nghiệm nào được sử dụng để chẩn đoán bệnh dại ở
người trước khi bệnh khởi phát trên lâm sàng. Do vậy, chẩn đoán bệnh sẽ chỉ
dựa trên tiền sử bệnh, các biểu hiện và triệu chứng có liên quan đến tình hình
Hệ gen ARN
cuộn xoắn
Nucleoprotein
Phosphoprotein
ARN polymerase
Phức hợp
ribonucleoprotein
hoặc nucleocapsid
Protein phức hợp
Màng lipid
từ vật chủ
Glycoprotein
Vỏ bao ngoài
7

dịch tễ của bệnh trên động vật. Biểu hiện đầu tiên của bệnh dại thường là sốt
nhẹ, đau và dị cảm tại vết thương. Khi virút lan truyền vào hệ thần kinh trung
ương, viêm não tiến triển sẽ xuất hiện có các đặc trưng là sợ nước hoặc sợ
gió, tăng động và mất ngủ, co giật toàn thân, sau đó một vài ngày sẽ ngừng
thở ngừng tim. Bệnh dại gây liệt có thể xảy ra ở 30% ca bệnh ở người, tiến
triển ít trầm trọng hơn tuy nhiên kết cục cuối cùng cũng là tử vong. Dạng

bệnh dại này thường bị chẩn đoán nhầm là bệnh lý khác [55].
Các chất kháng virút, interferon và liều lượng cao huyết thanh kháng dại
được sử dụng trong điều trị các ca bệnh ở người nhưng thường không tránh
được nguy cơ tử vong. Cho dù hiện đã có 1 trường hợp bệnh dại lây truyền từ
dơi được cứu sống sau khi dùng các thuốc gây ức chế thần kinh và thuốc
kháng virút nhưng liệu trình điều trị tích cực này lại gặp thất bại khi áp dụng
trên một số bệnh nhân khác cũng bị nhiễm dại do dơi [52].
1.1.2. Đáp ứng miễn dịch với vi rút dại
Sau khi nhiễm, virút dại chủ yếu xâm nhập vào hệ thần kinh do dó
kháng nguyên thường bị tách biệt ra khỏi hệ thống miễn dịch. Đáp ứng kháng
thể thường không được phát hiện ở người nhiễm trước 2 tuần đầu tiên của
bệnh. Các vắcxin trên nuôi cấy tế bào hiện nay cho kháng thể trung hòa virút
với protein G cao và sớm [46].
Với vắcxin dại, không thể tiến hành các thử nghiệm lâm sàng ngẫu
nhiên có nhóm chứng và theo dõi dọc ở các nhóm so sánh không điều trị. Do
vậy, thông tin về hiệu quả vắcxin sẽ chủ yếu dựa trên các kết quả thực địa
tiêm phòng sau phơi nhiễm ở người đã bị phơi nhiễm với chó có chẩn đoán
chắc chắn mắc dại trong phòng thí nghiệm. Đánh giá gián tiếp hiệu quả
vắcxin có thể được tiến hành qua các nghiên cứu về tính sinh miễn dịch so
sánh giữa hiệu giá kháng thể trung hòa virút sau khi tiêm vắcxin thử nghiệm
8

với kháng thể có được khi tiêm vắcxin đối chứng đã biết hiệu quả bảo vệ.
Thêm vào đó, mô hình động vật sẽ được sử dụng để chứng minh lợi ích của
tiêm phòng vắcxin. Tuy hiệu giá kháng thể trung hòa virút bảo vệ ở người
chưa được thiết lập nhưng nồng độ tối thiểu là 0,5 IU/ml được coi là tương
đương với khả năng bảo vệ. Ở người khỏe mạnh sau khi tiêm vắcxin, nồng độ
kháng thể có thể đạt được vào ngày thứ 14 của liệu trình tiêm sau phơi nhiễm
không phụ thuộc vào độ tuổi [46], [55].
1.1.3. Tác động của bệnh dại đối với sức khỏe cộng đồng

Tại trên 100 nước và vùng lãnh thổ, dại là một bệnh gây dịch trên động
vật. Bệnh dại ở chó là nguồn lây nhiễm chiếm đến 99% sang cho người và là
nguy cơ đe dọa tính mạng trên 3,3 tỷ người, chủ yếu tại các nước châu Á và
châu Phi. Cùng với chó nuôi tại nhà, nhiều giống thú ăn thịt và dơi cũng có
thể làm lây truyền bệnh dại sang cho người [55].
Khi đã có biểu hiện trên lâm sàng, phần lớn các ca bệnh dại đều tử vong.
Tuy nhiên, các ca tử vong do bệnh dại còn ít được báo cáo tại một số nước có
bệnh dại lưu hành đặc biệt ở nhóm tuổi nhỏ. Số ca tử vong hàng năm ước tính
là 55.000 có thể là thấp hơn so với con số thực. Châu Á và châu Phi chiếm
phần lớn các ca tử vong do bệnh dại. Tính riêng tại Ấn Độ, ước tính có
khoảng 20.000 ca chết mỗi năm với tỷ lệ là 2 /100.000 dân; tại châu Phi con
số này cũng tương đương là 24.000 ca (hoặc 4 ca /100.000 dân). Cho dù tất cả
các lứa tuổi đều có thể mắc bệnh nhưng trẻ dưới 15 tuổi là đối tượng thường
mắc nhất với 30-50% số trường hợp được tiêm phòng sau khi bị cắn là trẻ từ
5-14 tuổi và phần lớn là con trai [55].
Khoảng 98% trường hợp bệnh dại ở người xảy ra tại những vùng nuôi
nhiều chó mà đa phần được thả rông. Bệnh dại ở người là một bệnh hiếm gặp
tại các nước công nghiệp phát triển và ở phần lớn các nước Mỹ La tinh nơi
9

bệnh dại trên chó đã gần được loại trừ do giảm thiểu số lượng chó thả rông và
tiêm phòng cho chó nuôi tại nhà. Tại các nước như Thái Lan, việc triển khai
tiêm phòng rộng rãi cho chó và tăng cường tiêm phòng sau khi bị cắn đã làm
giảm đáng kể số ca chết do bệnh dại ở người.
Gần 10 triệu người được tiêm phòng sau khi bị cắn hàng năm chủ yếu là
tại Trung Quốc và Ấn Độ. Tiêm phòng dại sau khi bị cắn đã tránh được
330.304 ca tử vong hàng năm tại châu Á và châu Phi. Chi phí toàn cầu hàng
năm cho phòng bệnh dại ước tính khoảng trên 1 tỷ đô la Mỹ. Chi phí này
cũng như tỷ lệ đi tiêm phòng sau khi bị cắn dự tính sẽ tăng lên một cách đáng
kể khi tất cả các nước thay thế vắcxin sản xuất từ mô thần kinh bằng vắcxin

trên nuôi cấy tế bào hiện đại, an toàn và có hiệu lực cao [55].
1.1.4. Các khuyến cáo về tiêm phòng bệnh dại hiện nay
1.1.4.1. Tiêm phòng trước khi phơi nhiễm
Tiêm phòng trước phơi nhiễm được chỉ định cho những người có nguy
cơ phơi nhiễm cao với virút dại. Những đối tượng này bao gồm nhân viên
phòng thí nghiệm, nhân viên thú y, người nuôi giữ động vật, nhân viên bảo vệ
động vật hoang dại thường xuyên phải tiếp xúc với những động vật có khả
năng lây nhiễm cao cũng như các khách du lịch đến các khu vực có nguy cơ
mắc bệnh dại cao. Tuy nhiên, theo các nghiên cứu về độ tuổi mắc bệnh, nguy
cơ nhiễm bệnh cao nhất là trẻ em sống trong vùng động vật nhiễm bệnh dại
tại các nước đang phát triển [13], [55].
Chỉ định tiêm bắp
Tiêm phòng vắcxin dại trước phơi nhiễm cần liều tiêm bắp 1 ml hoặc
0,5 ml tùy thuộc vào loại vắcxin, tiêm theo lịch 0, 7, 28 ngày (ngày thứ 28
được lựa chọn nhưng có thể tiêm sớm hơn vào ngày 21 nếu có giới hạn về
10

mặt thời gian).
Chỉ định tiêm trong da
Tiêm trong da 0,1 ml vào ngày 0, 7, 28 (ngày thứ 28 được lựa chọn
nhưng có thể tiêm sớm hơn vào ngày 21 nếu có giới hạn về mặt thời gian) là
một liệu pháp được lựa chọn thay thể đường tiêm bắp. Tuy nhiên, tiêm trong
da đòi hỏi phải thực hành đúng kỹ thuật, cán bộ tiêm cần được đào tạo và
đượcgiám sát tốt.
Tiêm nhắc lại
Tiêm nhắc lại định kỳ chỉ dành cho các đối tượng thường xuyên và liên
tục tiếp xúc với virút dại. Trong các trường hợp này, liều nhắc cần được tiêm
với khoảng cách phù hợp được dự tính tùy theo kết quả xét nghiệm kháng thể.
Các nhân viên phòng thí nghiệm có nguy cơ lây nhiễm vỉ rút dại cao cần được
xét nghiệm 6 tháng một lần. Hiệu giá kháng thể trung hòa virút ít nhất là 0,5

IU/ml được cho là có khả năng bảo vệ. Ở những nơi không có điều kiện xét
nghiệm huyết thanh học, tiêm phòng nhắc lại được tiến hành 5 năm một lần.
1.1.4.2. Tiêm phòng sau khi phơi nhiễm
Chỉ định tiêm phòng sau phơi nhiễm kết hợp hoặc không kết hợp với
huyết thanh kháng dại tùy thuộc vào mức độ tiếp xúc với động vật nghi dại:
Độ I - Sờ hoặc cho động vật ăn, liếm trên bề mặt da (không tiếp xúc)
Độ II - Ngậm, cắn trên da không tổn thương, các vết sây xướt hoặc trợt
nhẹ không gây chảy máu.
Độ III - Một hoặc nhiều vết cắn hoặc vết cào trên da, liếm trên da tổn
thương, lây nhiễm niêm mạc với nước bọt, tiếp xúc với dơi.
11

Đối với độ I không cần tiêm phòng, độ II tiêm vắcxin ngay lập tức, độ
II tiêm vắcxin kết hợp với huyết thanh. Đối với độ II và độ III, rửa và sát xà
phòng (trong khoảng 15 phút) toàn bộ vết thương và vết cắn ngay lập tức
hoặc càng sớm càng tốt.
Không tiếp tục tiêm phòng sau phơi nhiễm nữa nếu động vật nghi dại
đã được khằng định bằng các xét nghiệm là không nhiễm dại hoặc chó hoặc
mèo nuôi vẫn khỏe mạnh sau 10 ngày theo dõi.
Các yếu tố để quyết định xem có bắt đầu tiêm phòng sau phơi nhiễm
hay không là mức độ nghi ngờ động vật mắc dại, mức độ tiếp xúc (độ I-III),
đặc điểm lâm sàng của động vật cũng như khả năng xét nghiệm của phòng thí
nghiệm. Trong phần lớn các trường hợp tại các nước đang phát triển, tình
trạng tiêm phòng vắcxin của động vật cũng là một trong những yếu tố cần
được quan tâm đến [55].
Chỉ định tiêm bắp
Lịch tiêm phòng sau phơi nhiễm với liều tiêm bắp là 1 hoặc 0,5 ml tùy
thuộc vào nhà sản xuất. Liệu trình tiêm khuyến cáo bao gồm 4 hoặc 5 liều
tiêm.
- Liệu trình tiêm 5 liều là tiêm bắp 1 liều vào các ngày 0, 3, 7, 14, 28.

- Liệu trình tiêm 4 liều là tiêm bắp 2 liều vào ngày 0 tiếp theo tiêm 1 liều
vào ngày 7 và 21
Chỉ định tiêm trong da
Có thể tiêm theo liệu trình 2 vị trí hoặc 8 vị trí tùy thuộc theo khuyến
cáo của nhà sản xuất
12

- Liệu trình tiêm trong da 8 vị trí là vào ngày 0, tiêm 8 vị trí (1 mũi vào
mỗi bên cánh tay, 1 mũi vào mỗi bên đùi, 1 mũi vào mỗi bên vùng thượng
đòn và 1 mũi vào mỗi bên vùng bụng dưới); vào ngày thứ 7, tiêm 1 mũi
vào mỗi bên cánh tay và mỗi bên đùi và vào ngày 30 và 90, tiêm 1 mũi vào
một bên cánh tay. Một liều tiêm vào ngày 90 có thể thay thế bằng 2 liều
tiêm ngày thứ 30.
- Liệu trình tiêm trong da 2 vị trí là tiêm 1 mũi 0,1 ml tại 2 vị trí vào
ngày 0, 3, 7 và 28.
Đối với những đối tượng đã tiêm phòng đầy đủ trước phơi nhiễm hoặc
đã từng tiêm phòng sau phơi nhiễm với vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào hoặc
hiện có hiệu giá kháng thể trung hòa virút ít nhất là 0,5 IU/ml, chỉ cần tiêm 2
liều tiêm bắp hoặc dưới da vào ngày 0 và 3 là đủ.
1.1.4.3. Tiêm kháng huyết thanh phòng dại
Huyết thanh phòng dại được chỉ định cho phơi nhiễm độ III và phơi
nhiễm độ II ở người suy giảm miễn dịch. Do mức độ thải trừ tương đối chậm,
globulin miễn dịch kháng dại ở người (HRIG) thường được lựa chọn đặc biệt
trong trường hợp bị phơi nhiễm nghiêm trọng và đa vị trí. Tuy nhiên, dạng
HRIG rất hiếm, chỉ đủ sử dụng tại các nước công nghiệp phát triển. Globulin
miễn dịch ngựa tinh chế (ERIG) hoặc sản phẩm F(ab’) của ERIG cũng có thể
được sử dụng. Phần lớn các chế phẩm ERIG mới đều tốt, có độ tinh khiết cao,
an toàn và rẻ hơn so với HRIG. Tuy nhiên, do có nguồn gốc khác loài nên khi
tiêm ERIG sẽ có nguy cơ gặp phải các phản ứng quá mẫn.
Huyết thanh kháng dại không được tiêm muộn quá 7 ngày sau khi bắt

đầu tiêm phòng sau phơi nhiễm. Liều lượng của HRIG là 20IU/kg cân nặng
còn đối với ERIG và sản phẩn F(ab’) là 40IU/kg cân nặng. Toàn bộ các sản
13

phẩm huyết thanh kháng dại cần được tiêm vào trong hoặc xung quanh vết
thương. Phần còn lại của huyết thanh phải được tiêm bắp vào vị trí xa chỗ
tiêm vắcxin [55].


1.2. TỔNG QUAN VỀ VẮC XIN DẠI
Trên 100 năm trước đây, Louis Pasteur và cộng sự đã phát triển vắcxin
dại thô đầu tiên để tiêm phòng sau khi bị cắn dựa trên việc bất hoạt virút trên
mô thần kinh. Từ đây trở đi một số loại vắcxin đã được phát triển và sử dụng
trên thế giới.

1.2.1. Các vắcxin thế hệ thứ nhất
Các vắcxin thế hệ thứ nhất đều sử dụng mô động vật để có được hỗn
dịch chứa virút. Các vắcxin này đều đã được sử dụng rộng rãi cho cả người và
động vật. Các loại vắcxin dại chủ yếu thuộc thế hệ thứ nhất được sử dụng cho
người và thú y được trình bày trong Bảng 1.1 [27], [36].
14

Bảng 1.1. Các loại vắc xin dại thế hệ thứ nhất
đƣợc sử dụng cho ngƣời và thú y
Mô đƣợc sử dụng
Chủng
virút
Loại
vắcxin
Phƣơng pháp

bất hoạt
Sử dụng
cho ngƣời
Dạng
vắcxin
Mô thần kinh: Cừu, dê
Pasteur
Bất hoạt
Phenol (1 ngày)
Có
Dung dịch
Mô thần kinh: Thỏ, cừu,
dê
Pasteur
Bất hoạt
Phenol, 30
0
C
Có
Dung dịch
Mô thần kinh: Cừu
Pasteur
Bất hoạt
Ether-Phenol
Có
Dung dịch
Mô thần kinh: Cừu
Pasteur
Bất hoạt
Phenol (14 ngày)

Có
Đông khô
Mô thần kinh: Cừu
PV11
Bất hoạt
-propiolactone
Có
Đông khô
Não chuột nhắt chưa
dứt sữa
CVS, 51,
91
Bất hoạt
Tia cực tím
Có
Dung dịch
Não thỏ chưa dứt sữa
PV
Bất hoạt
Tia cực tím
Có
Đông khô
Não chuột chưa dứt sữa
PV
Bất hoạt
Phenol (14 ngày)
Có
Đông khô
Phôi vịt
PM

Bất hoạt
-propiolactone
Có
Đông khô
Phôi gà
Flury
LEP
Giảm độc
lực
-
Không (chỉ
sử dụng cho
chó)
Đông khô
Phôi gà
Kelev
Giảm độc
lực
-
Không (chỉ
sử dụng cho
chó)
Đông khô
Phôi gà
Flury
HEP
Giảm độc
lực
-
Không (sử

dụng cho gia
súc, mèo)
Đông khô

Dựa trên các loại mô được sử dụng để sản xuất khác nhau, các vắcxin
thế hệ thứ nhất có thể được xếp loại theo:
Vắcxin sản xuất từ mô thần kinh động vật trưởng thành
Các vắcxin này có rất nhiều các nhược điểm như:
- Còn virút sống tồn dư: các vắcxin như vắcxin Fermi thường có chứa virút
sống do chưa được bất hoạt hoàn toàn bởi phenol nên được coi như là
15

vắcxin hỗn hợp có cả virút sống tồn dư và virút đã bất hoạt, do vậy vắcxin
này nguy hiểm khi sử dụng.
- Phản ứng não tủy sau khi tiêm vắcxin: một số vắcxin thuộc nhóm này
như vắcxin Semple và vắcxin Hempt tuy đã được bất hoạt hoàn toàn và
đáp ứng được yêu cầu về mặt công hiệu nhưng những phản ứng não tủy
nghiêm trọng do tiêm vắcxin vẫn xảy ra trong hoặc sau khi tiêm phòng.
Phản ứng do yếu tố gây phản ứng trong não (một protein cơ bản liên quan
đến myelin) tăng cao khi sử dụng các mô thần kinh động vật trưởng thành.
Những phản ứng này là các tai biến liệt thần kinh từ liệt nhẹ thoáng qua
đến các thương tổn thần kinh vĩnh viễn và thậm chí là tử vong.
- Hàm lượng kháng nguyên cho một liều tiêm thấp: đặc tính này đòi hỏi
phải có một liệu trình điều trị kéo dài với một số lượng lớn các mũi tiêm.
Các vắcxin này thường được đóng dưới dạng dung dịch nên có tính ổn
định thấp chỉ trong vòng gần 6 tháng [27].
Vắcxin sản xuất trên trứng có phôi
Thích ứng các chủng vắcxin dại trên trứng có phôi (chủng Pitman
Moore) đã phát triển được các vắcxin dại sử dụng cho người an toàn hơn,
giảm thiểu các phản ứng não tủy sau tiêm vắcxin. Tỷ lệ có các phản ứng thần

kinh thấp hơn (dưới 3/100.000 mũi tiêm) ở các vắcxin dùng cho người được
sản xuất trên phôi vịt so với các vắcxin được sản xuất trên mô thần kinh. Tuy
nhiên các phản ứng tại chỗ lại rất hay gặp như có đến 70% gặp ở các liệu
trình tiêm vắcxin dự phòng và 100% ở các liệu trình tiêm điều trị với 14 liều
tiêm. Tính sinh miễn dịch của loại vắcxin này cần được xem xét thêm do
trong một số trường hợp lượng kháng thể đạt được rất thấp. Các chủng virút
cố định Flury và Kelev đã thích ứng trên phôi gà được cấy chuyển nhiều đời
(180 đối với Flury và 70 đối với Kelev) tạo ra các chủng virút giảm độc lực.
16

Các vắcxin sản xuất với các chủng giảm độc lực trên phôi gà đã được sử dụng
cho chó, mèo và bò.
Trứng có phôi sử dụng trong sản xuất vắcxin đòi hỏi một chất lượng rất
cao, phải đảm bảo loại trừ được tất cả virút ngoại lai (bệnh đốm trắng ở gia
cầm) và vi khuẩn (Salmonella) [27], [36].
Vắcxin sản xuất từ não động vật chưa dứt sữa
Yếu tố gây phản ứng trong não là nguyên nhân của các tai biến thần kinh
sau tiêm vắcxin có trong mô thần kinh động vật trưởng thành nhưng có không
đáng kể hoặc không có ở trong các mô thần kinh của một số động vật chưa
dứt sữa. Thêm vào đó, một lượng lớn hơn virút có được khi nhân nuôi trên
các mô thần kinh của động vật sơ sinh, do đó vắcxin dại đã được phát triển
trên những động vật này. Vắcxin đầu tiên thuộc loại này được phát triển bởi
Fuenzalida và Palacios trên não chuột ổ với việc sử dụng 3 chủng virút dại cố
định (CVS, 51 và 91). Dù đã có những cải tiến bằng cách nhân nuôi virút trên
não các động vật sơ sinh trước khi myelin phát triển, các vắcxin bất hoạt sản
xuất trên não động vật chưa dứt sữa vẫn có thể có các phản ứng thần kinh
không mong muốn. Khoảng 0,3 - 0,8 trên 1.000 cá thể được tiêm vắcxin có
biểu hiện viêm não tủy nặng do trong vắcxin vẫn tồn dư các protein thần
kinh. Thêm vào đó, các vắcxin trên mô thần kinh có hiệu lực thấp hơn so với
vắcxin trên nuôi cấy tế bào nên đòi hỏi một liệu trình tiêm phòng dài hơn.

Trong những năm gần đây, Ấn Độ và Nepal đã dần thành công trong việc
ngừng sản xuất và sử dụng vắcxin trên mô thần kinh. Tuy nhiên, với giá thành
rẻ và điều kiện kinh tế còn khó khăn, vắcxin trên mô thần kinh hiện vẫn được
sử dụng tại một số nước chủ yếu là tại vùng Đông Nam châu Á [36], [55].

17

1.2.2. Các vắcxin thế hệ thứ hai
Đây là các vắcxin được sản xuất trên nuôi cấy tế bào. Vắcxin chứa virút
bất hoạt sau khi nhân nuôi trên các dòng tế bào như tế bào lưỡng bội người, tế
bào thận khỉ phôi thai, tế bào thận chuột đất vàng tiên phát, tế bào Vero, tế
bào phôi gà… Các vắcxin này sử dụng tiêm phòng trước và sau phơi nhiễm
[22], [34].
Vắcxin sản xuất trên tế bào lưỡng bội người là vắcxin được đưa vào sử
dụng đầu tiên vào năm 1967. Vắcxin này có tính an toàn và công hiệu cao do
đó được các nước phát triển lựa chọn để tiêm phòng cho người trước và sau
khi phơi nhiễm với virút [11]. Với cố gắng tìm ra các vắcxin có giá thành thấp
hơn và nhưng đặc tính lại tương đương với vắcxin sản xuất trên tế bào lưỡng
bội người, trong những năm gần đây vắcxin tinh khiết trên tế bào phôi gà và
vắcxin tinh khiết trên tế bào Vero đã được phát triển [30]. Các vắcxin trên
nuôi cấy tế bào đều sử dụng các virút cố định thuộc genotype 1 [36]. Nguồn
gốc của các chủng virút dại cố định chính được sử dụng để sản xuất vắcxin
trên nuôi cấy tế bào được trình bày trong Hình 1.2.
Đáp ứng miễn dịch và hiệu quả cả vắcxin trên nuôi cấy tế bào được
chứng minh qua các nghiên cứu trên động vật thí nghiệm và các đánh giá lâm
sàng trên người. Đối với cả phòng trước và sau khi phơi nhiễm, vắcxin cho
đáp ứng kháng thể ở trên 99% người được tiêm. Sử dụng đúng thời điểm
vắcxin mới kết hợp với việc xử trí vết thương đúng cách và tiêm huyết thanh
kháng dại cho hiệu quả phòng dại gần 100% thậm chí đối với cả các trường
hợp phơi nhiễm nguy cơ cao. Tuy nhiên, việc tiêm phòng muộn hoặc không

tiêm phòng đủ mũi đặc biệt với các tổn thương ở đầu, cổ, tay hoặc đa vết cắn
có thể vẫn bị tử vong do mắc bệnh dại [55].
Các vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào cũng được cho là các vắcxin có độ