Bài giảng Kỹ thuật thu hồi và hoàn thiện sản phẩm: Chương 4.1 - Các phương pháp sắc ký

Chương IV. Các phương pháp tinh
sạch sản phẩm
4.1 Các phương pháp sắc ký
4.1.1 Sắc ký trao đổi ion
4.1.2 Sắc kí ái lực
4.1.3 Sắc kí lọc gel
4.1.4 Sắc kí đảo pha
4.1.5. Sắc kí tương tác kỵ nước
4.2 Phương pháp kết tinh
1


4.1.Sắc ký trao đổi ion
Nguồn protein

Tách chiết

Enzyme thô

Kết tủa

Tinh sạch
Lọc gel

Trao đổi ion

2


4.1.1Sắc ký trao đổi ion
ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY

1. Nguyên tắc trao đổi ion
2. Các dạng sắc ký trao đổi ion
3. Nhựa trao đổi ion
- Tính chất của nhựa
- Cách lựa chọn nhựa
4. Thao tác thực hiện quá trình.
- lựa chọn dung dịch đệm
3


1. Nguyên tắc trao đổi ion
• Protein là phân tử tích điện. Có thể ở dạng
điện tích dương hoặc điện tích âm, cũng có
thể trung hòa về điện
Cation

pH=pI

Anion

pH tăng
4


2. Các dạng sắc ký trao đổi ion
• Có 2 dạng tích điện (+) và (-) của phân
tử protein
• Liên kết với các nhóm chức tích điện
trái dấu
- Dạng sắc ký trao đổi anion (anion exchange

chromatography)
- Dạng sắc ký trao đổi cation (cation exchange
chromatography)
5


3. Nhựa trao đổi ion

+ +
-

+

Anion exchanger tích điện
dương bao quanh

-

Nhựa trao đổi anion- Anionit

6


7


8


9

The charged groups linked to ion
exchange matrices
Anion exchangers

Functional group

diethyl-aminoethyl (DEAE)

-OCH2CH2N+H(CH2CH3)2

quaternary aminoethyl (QAE)

-OCH2CH2N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3

quaternary ammonium (Q)

-CH2N+(CH3)3

Cation exchangers

Functional group

carboxymethyl (CM)

-OCH2COO-

sulfopropyl (SP)

-CH2CH2CH2SO3-

methylsulfonate (S)

-CH2SO310


trao đổi ANION VÀ CATION
Anion exchanger:
Inert Matrix—CH2—CH2—NH(CH2CH3)2+ diethylaminoethyl (DEAE) group

Cation exchanger:
Inert Matrix —CH2—COO- carboxymethyl
(CM) group

11


12


Khả năng và dung lượng trao đổi ion
• Khả năng xác định bởi nhóm chức, trao đổi
mạnh hay yếu tùy theo khả năng ion hóa khi
thay đổi pH
• khả năng mạnh: ion hóa trong dải pH rợng
Ví dụ DEAE:- trao đổi ion yếu
SP: trao đổi ion mạnh
Định lượng khả năng trao đổi ion để liên kết ion.
Tùy thuộc vào số nhóm chức

13


Carboxymethyl Sephadexđ
( CM Sephadexđ)
Properties
ã bead size: 40-125 m (dry)
ã pore size: ~200,000 Da exclusion limit
• operating pH: 6 – 10
• Capacity: 3-4 meq/g ion exchange
capacity
• Compatibility: mode of use weak cation
exchange chromatography
14


DEAE Sephadexđ,
Diethylaminoethyl Sephadexđ
Properties
ã Bead size: 40-125 m (dry)
ã pore size: ~30,000 Da exclusion limit
• operating pH: 2 - 9
• Capacity: 3-4 meq/g ion exchange capacity
• Compatibility: mode of use mixed weak and
strong anion exchange chromatography
meq- miliequivalent

15

Sulfopropyl Sephadexđ
PROPERTIES:
ã bead size: 40-125 m (dry)
ã pore size: 200,000 exclusion limit (av. mol. wt.)
• operating pH: 2 - 10
• Capacity: 2.0-2.6 meq/g ion exchange capacity
• Compatibility: mode of use strong cation
exchange chromatography
16


Tính chọn lọc của nhựa trao đởi ion
• Tính chọn lọc biểu hiện ở ái lực của nhựa với
các ion. Nhựa có thể trao đổi với ion này trong
dung dịch dễ hơn ion kia. Ái lực tương đối của
các ion với nhựa có thể sắp xếp thành dãy đối
với từng loại nhựa:

17


a/ Nhựa sunfon:
• Trong dung dịch lỗng ở nhiệt đợ thường thì :
-ái lực của cation với nhựa tăng khi điện tích của
cation tăng: Na+- Với các cation có cùng điện tích thì ái lực trao
đổi tăng khi bán kính của các ion tăng:
Li+Mg 2+< Ca2+< Sn2+< Ba2+

18


b/ Nhựa có nhóm cacboxylic,
aminoaxetat
• Các loại nhựa này có nhóm chức có khả năng tạo phức
với các cation kim loại. Sự phụ thuộc cùng chiều của ái
lực của nhựa với các cation kim loại theo độ bền của
phức các nhóm chức với ion kim loại.
H+>Ca2+>Mg2+>Li+>Na+>K+>Rb+.
• Đới với các ionit nhóm chức aminoaxetat:
Fe2+>Mn2+>Ca2+>Mg2+>Ba2+>Sn2+ Li+Na+>K+
• Đới với anionit bazơ mạnh:F-
19


MECHANISM OF ION-EXCHANGE
CHROMATOGRAPHY OF AMINO ACIDS
pH2

SO3

-

+

Na

H3 N

+

COOH
Ion-exchange Resin

SO3

-

H3 N
Na

+

+
-

COO

pH4.5

20


Cách lựa chọn nhựa trao đổi ion
1/ Dựa vào độ bền của protein
- Nếu bền ở giá trị pH thấp hơn pI thì dùng cationit
- Nếu bền ở giá trị pH cao hơn pI thì dùng anionit
2/ Dựa vào kích thước phân tử protein

- Nhỏ hơn 10 000 Da, sử dụng nhựa có kích thước lỡ
nhỏ
- Từ 10000 Da đến 100 000 Da- loại tương đương
sepharose
3/ Lưu ý: Lựa chọn buffer phù hợp
21


4. Cách tiến hành sắc ký trao đổi ion
4.1. Cột trao đổi ion
• Người ta thực hiện trên cợt có chứa ionit
• Ionit sau khi đã ngâm trương trong nước được đưa
vào cợt cùng với nước để tránh bọt khí giữa các
hạt. Lượng ionit chiếm 2/3 thể tích cợt. Cợt thường
có kích thứớc: D:H= 1:810. Trên cùng đổ 1 lớp
bơng thủy tinh dày 3-5 mm và một lớp bi thủy tinh
dày 1-2 cm để lớp ionit không bị xáo trộn.

22


4.2. các giai đoạn
-a/ Hấp thu ion của dung dịch phân tích trên
ionit:
• Để giữ cho toàn bợ ion trong dung dịch cần sử
dụng lượng ionit lớn hơn lượng tính tốn. Nếu
cationit dạng axit ́u HR thì dung dịch chảy
qua có tính axit. Khi làm thay đổi pH sẽ làm
thay đổi khả năng trao đổi ionit

23


Các giai đoạn (2)
- giải hấp ion bị hấp thu
Ion bị hấp thu được tách ra khỏi ionit bằng
dung dịch thích hợp như dung dịch axit ở nờng
đợ khác nhau.
- rửa ionit để loại trừ hết dung dịch giải hấp
nằm giữa khe hở của hạt ionit

24


Lựa chọn đệm, chọn đúng
*Đối với anionit (DEAE) dùng :
- Tris, imidazole, pyridine
* Đối với cationit (CM) dùng đệm :
-axetat, citrat, phosphat
pH:
Đối với cationit pH= pI-1
Đối với anionit pH=pI+1
Sử dụng muối: NaCl và KCl.
25