Bài giảng Kỹ thuật thu hồi và hoàn thiện sản phẩm: Chương 4.2 - Phương pháp kết tinh

4.2 Phương pháp kết tinh

Crystallization
Methods and Protein Crystal
Properties
1


Tinh thể hóa protein
1.
2.
3.
4.

Mục đích tạo tinh thể protein
Tính chất của tinh thể protein
Các giai đoạn của quá trình tinh thể hóa
Các phương pháp tinh thể hóa

2


Khái niệm
• Kết tinh ( tinh thể hóa) là dạng đặc biệt của
quá trình kết tủa, khi mà các chất rắn không
tan thu được ở dạng tinh thể. Sự hình thành
các tinh thể diễn ra rất chậm
• Kết tủa là quá trình phân tách chọn lọc thành
phần các chất tan trong hỗn hợp các chất tạo
thành dạng không tan bằng phương pháp vật
lý hoặc hóa lý tương ứng

3


1. Mục đích
• xác định cấu trúc protein
• hiểu được sự liên kết của protein với các cấu tử/ cơ chất
/ th́c
• hiểu được cơ chế xúc tác enzym của protein
• xác định vị trí đúng của nguyên tử trong phân tử
proteinTinh thể học tia X ( vì 80% cấu trúc phân tử
protein là được xác định bằng tia X
• Không giới hạn về kích thước: tất cả virus và riboxơm
đều được phân tích
• Tinh thể dùng để kh́ch đại tín hiệu
(1 tinh thể chứa 109 – 1013 phân tử)
4


Một tinh thể là tổ hợp ba chiều của các phân tử riêng biệt tự sắp
xếp trong một trật tự nhắc lại của các phần tử giống nhau. Điều
này đúng cho phân tử nhỏ như phân tử muối và đại phân tử
như protein
Tinh thể học là khoa học thực nghiệm xác định sự sắp xếp
nguyên tử trong chất rắn
5


2. Tính chất tinh thể protein
Khác với các phân tử muối (sắp xếp chặt)
các phân tử protein có đặc tính:

-Lớn hơn (>1000 nguyên tử- so với 2-10 nguyên tử)
-Hình dạng không đều
-Có bề mặt dị thường. Vì vậy các tinh thể protein có
diện tích tiếp xúc giữa các phân tử riêng biệt ít hơn
- Mềm hơn và dề vỡ hơn
-Một loại protein có thể phát triển thành các tinh thể
có hình dạng khác nhau, sử dụng các vùng tiếp xúc
giữa các phân tử khác nhau
- Cần có điều kiện pH, nồng độ muối, nhiệt độ để giữ
trạng thái ban đầu.
-Chứa khoảng 50% nước hình thành các kênh
- Khó tạo tinh thể hơn muối nhiều.
6


Lịch sử phát triển
• Tinh thể protein đầu tiên là phycoerythrine-chất màu có bản chất
protein trong tảo cyanobacteria) được mô tả chi tiêt từ 1894
• Vào năm 1912, -bớn năm sau khi phát hiện ra tia X, Lần đầu tiên
Max Von Laue và P. Knipping và W. Friedrich sử dụng tinh thể để
tách tia X. Sau phát minh này, P.Ewald và W.H. Bragg và
W.L.Bragg đã khởi đầu ngành tinh thể học X-ray
• Perutz và Kendrew vào những năm ći 1950 đã xác định cấu trúc
phân tử protein đầu tiên là myoglobine
• Ngày nay, có hơn 40 000 cấu trúc protein đã được mô tả và làm
nguồn cơ sở dữ liệu ( bao gồm cả riboxơm và virut)
• 1962, Max. Perutz đoạt giải Nobel hóa học về công trình nghiên
cứu protein bằng X-ray
7

3. Các giai đoạn quá trình tinh thể hóa
1. Thu nhận lượng lớn protein tinh khiết
2. Chọn dung dịch đệm protein mà protein
có thể tan tốt và bền vững
3. Làm bão hòa dung dịch protein để có thể
xảy ra quá trình tạo nhân tinh thể một
cách tự phát
4. Các tinh thể lớn dần

8


Tính tan
Tính tan của protein
tăng lên khi bổ sung
muối vào dung dịch và
sau đó giảm dần khi
nồng độ đạt đến một
giá trị làm kết tủa
HbCO (carboxyhemoglobin) solubility as a function of
ionic strength in the presence of several different types
of salts
9


Mầm tinh thể
• Hiện tượng mà mợt nhân, chẳng hạn như hạt
bụi, một hạt tinh thể nhỏ hay thường là dạng
tinh thể protein, một khối kết tụ các hạt

protein, và quá trình tinh thể hóa bắt đầu
Những khó khăn thường gặp phải
1. Nếu độ bão hòa quá cao, quá nhiều dạng
nhân vì vậy, quá thừa các tinh thể nhỏ
2. Trong dung dịch quá bão hòa sẽ không có
sự tạo nhân tự phát và sự lớn dần của tinh
thể chỉ xảy ra khi có mặt của mầm tinh thể
10


Sự phát triển kích thước của tinh thể

The growth steps and growth units of
Lysozyme. The growth steps are at least
bimolecular in height. The minimum growth unit
for this step must be a tetramer corresponding to
a single turn of the 43 helix
11


Kết thúc quá trình
• Dung dịch mẹ
Dung dịch, trong đó tinh thể tồn tại, không
phải là dung dịch kết tinh nhưng thay thế
được dung dịch mà nó tồn tại sau một vài
mức khuếch tán hơi, cân bằng qua quá
trình thẩm tích hay bốc hơi.

12

Các yếu tố ảnh hưởng
1) Độ tinh khiết của protein
2) Nồng độ Protein
3) Điều kiện ban đầu (chuẩn bị dung dịch protein)
4) Tác nhân gây kết tủa
5) Nhiệt độ
6) pH
7)Các chất bổ sung: Chất tẩy rửa, chất khử, cơ chất, đồng nhân tố
13


14


Các yếu tố ảnh hưởng
1.Độ tinh khiết protein
2. Nồng độ protein
Là ́u tố quan trọng ảnh hưởng đến
• Tính đồng nhất và khả năng tái lập
• Thường được xác định bằng Bradford Assay (BSA is
used as a standard)

15


4) Tác nhân kết tủa
Precipitating agent (precipitant)
Salts
Ammonium sulfate

Sodium chloride
Potassium phosphate
Organic reagents
MPD
Isopropanol
Polyethylene glycol
PEG 4000
PEG 6000
PEG 8000
16


LOẠI MUỐI NÀO ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ
TINH THỂ HÓA PROTEIN ?

17


DUNG MÔI NÀO ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ TINH THỂ HÓA PROTEIN ?

18


19


5) Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến tính tan protein và động
học của quá trình mà dung dịch đạt đến trạng thái
bão hịa

Lý tưởng:
• Một tinh thể riêng biệt cần được duy trì ở
nhiệt độ khơng đổi
•Dễ kết tinh ở 4 C và cũng có thể ở nhiệt độ
12 hay 15 C

20


6) pH

Điện tích bề mặt ảnh hưởng đến sự sắp xếp
không gian của các phân tử giữa tinh thể, đặc
biệt là liên quan giữa các tinh thể với nhau.
Tương tác kỵ nước ít quan trọng hơn so với
tương tác tĩnh điện khi tạo cấu trúc tinh thể

21


7) Additives:
Sometimes you can increase the stability of your
protein,
and/or the homogeneity of its conformation by
having relevant additives present in the crystal
screen:
•
•
•
•

•

Detergents
Reducing agents
Substrates
Co-factors
etc.
22


4. CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH THỂ HÓA
4.1 Phương pháp khuếch tán hơi
4.2 PP bốc hơi chậm
4.3 PP thẩm tích
Vapor Diffusion
Slow Evaporation
Dialysis

23


Hanging Drop Vapor Diffusion
Most popular method among
protein crystallographers.
1. Crystal screen buffer is the
well solution (0.5 - 1 mL)
2. Drop (on siliconized glass
cover slip) is 1/2 protein
solution, 1/2 crystal screen
buffer (6-10 L). So, the

concentration of precipitant
in the drop is 1/2 the
concentration in the well.
3. Cover slip is inverted over
the top of the well and sealed
with vacuum grease
(airtight).
4. The precipitant concentration in the drop will equilibrate with
the precipitant concentration in the well via vapor diffusion.
24


Sitting Drop Vapor Diffusion
Same basic principles
as in hanging drop
method, except the drop
containing your sample
sits on a bridge within
the well. This allows for
a larger sample size (20 40 L), however protein
is frequently precious to
the crystallographer, so
there isn’t that much
demand for a larger sample
size.

25