Bài giảng công nghệ sinh học ứng dụng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ
DỰ ÁN HỢP TÁC VIỆT NAM – HÀ LAN





BÀI GIẢNG
CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG













Người biên soạn: TS. Trần Thị Lệ

Huế, 08/2009


5

BÀI I
CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP

I. Khái niệm
1. Ý nghĩa của tạo dòng DNA
Trước đây khoảng hơn một trăm năm Gregor Mendel đã đưa ra những định
luật cho phép giải thích sự di truyền những đặc điểm sinh học. Cơ sở của những
định luật này là mỗi một đặc điểm di truyền của sinh vật được điều khiển bởi 1 yếu
tố, được gọi là gene, tồn tại ở đâu đó trong tế bào. Sự khám phá lại những định luật
này của Mendel vào năm 1900 là sự khai sinh của di truyền học, ngành khoa học
này có mục đich là hiểu bản chất của gene và giải thích những tác động của nó.
Công nghệ DNA tái tổ hợp là một tập hợp các kỹ thuật phân tử để định vị,
phân lập, biến đổi và nghiên cứu các đoạn DNA. Thuật ngữ tái tổ hợp được dùng
thường xuyên do mục tiêu của nó là phối hợp DNA từ hai nguồn xa nhau. Ví dụ:
các gene từ hai nguồn vi khuẩn khác nhau có thể được liên kết lại, hoặc một gene
người có thể được đưa vào nhiễm sắc thể vi khuẩn. Công nghệ DNA tái tổ hợp
(thường được gọi là công nghệ di truyền) hiện nay bao gồm một mạng lưới các kỹ
thuật phân tử được dùng để phân tích, biến đổi và tái tổ hợp hầu như mọi trình tự
DNA.

2. Tạo dòng DNA là gì?
Về nguyên tắc một thí nghiệm tạo dòng DNA gồm những bước cơ bản sau đây:
1. Tinh sạch DNA
2. Cắt phân tử DNA
3. Xác định độ lớn của các đoạn DNA
4. Đưa các đoạn DNA vào vectơ tạo DNA tái tổ hợp
5. Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ
6. Xác định những tế bào chủ chứa phân tử tái tổ hợp DNA

3. Tại sao sự tạo dòng DNA quan trọng như vậy ? Ý nghĩa của tạo dòng đối với
nghiên cứu và công nghệ sinh học
Từ hình 1.1 ta nhận thấy việc tạo dòng gene là một quá trình tương đối đơn
giản. Tại sao phương pháp này trong sinh học lại có ý nghĩa lớn như vậy ? Câu trả
lời là: Trước hết việc tạo dòng gene là tách một gene ra khỏi tất cả những gene khác
ở dạng tinh khiết, mà những gene này thường tồn tại với nhau trong một tế bào.
Sẽ hiểu chính xác hơn khi quan sát thí nghiệm tạo dòng ở hình 1.2. Đoạn
DNA được tạo dòng có thể thuộc một hỗn hợp gồm nhiều đoạn khác nhau, mà mỗi
đoạn mang một gene hoặc một phần của gene. Hỗn hợp này có thể là toàn bộ hệ
gene của một sinh vật (ví dụ hệ gene của người). Sau đó mỗi một đoạn được đưa
vào một phân tử vector phù hợp và tạo nên một tập hợp các phân tử DNA tái tổ hợp,
trong đó một phân tử mang gene cần tìm. Thông thường mỗi tế bào chủ chỉ tiếp
nhận một phân tử DNA tái tổ hợp duy nhất. Như vậy, khi một gene nào đó được
tách ra từ nhiều gene khác thì người ta có thể nghiên cứu đặc điểm của nó chính xác
hơn.
Quyết định sự thành công của thí nghiệm tạo dòng là liệu người ta có phân
biệt được dòng quan tâm từ nhiều dòng khác nhau không? Ví dụ khi quan sát hệ

6

gene của vi khuẩn E.coli có khoảng 2000 gene, có thể tìm ra một gene trong điều

kiện có nhiều dòng không (Hình 1.3)?
Kỹ thuật gene đã mở ra một loạt cơ hội mà trước đây không thể có được. Vấn
đề cơ bản là các gene có kích thước quá nhỏ và có hàng ngàn gene ở trong mỗi tế
bào. Thậm chí khi quan sát trên kính hiển vi mạnh nhất, thì DNA xuất hiện như là
một sợi dây bé xíu, không thể thấy các nucleotide và không có một dấu hiệu nào để
nhận biết chỗ bắt đầu và kết thúc của một gene.

Hình 1.1. Các bước cơ bản của tạo dòng DNA
1. Thiết kế phân tử DNA tái tổ hợp
Vector
Đ
o
ạn DNA
ngoại lai
Phân t
ử DNA

tái tổ hợp
2. Đưa vào tế bào chủ
Vi khuẩn

3. Nhân phân tử DNA
tái tổ hợp

Vi khu
ẩn chứa phân tử
DNA tái tổ hợp
4. Nhân tế bào chủ
5. Xu
ất hiện một d
òng
qua
nhiều lần phân chia tế bào
Các dòng vi khu
ẩn phát triển
trên môi trường agar

7

Hình 1.2. Bằng việc tạo dòng người ta tạo ra dạng đồng nhất chứa
các đoạn DNA khác nhau

Vector
Các đoạn DNA
Các phân tử DNA tái tổ hợp
M
ỗi phân tử chứa một
đ

o
ạn
DNA khác nhau
Đưa vào vi khuẩn
Nuôi trên môi

trường agar
M
ỗi một d
òng ch
ứa một phân tử DNA tá
i t
ổ
hợp khác nhau với nhiều bản sao

8

Để minh họa vấn đề này chúng ta hãy xem xét một ví dụ đặc trưng về di
truyền phân tử như sau: Giả thiết chúng ta muốn phân lập một gene của người và
đưa nó vào vi khuẩn để sản xuất một lượng lớn các protein người. Vấn đề đầu tiên
là phải tìm được gene mong muốn. Geneome đơn bội của người chứa khoảng 3,3 tỷ
cặp base. Giả sử gene mà chúng ta muốn phân lập dài 3.000 bp. Như vậy gene đích
của chúng ta chỉ chiếm một phần triệu của geneome, vì thế để tìm kiếm gene trong
một hệ gene đồ sộ là khó khăn hơn nhiều so với việc tìm kiếm một cây kim trong
một đống cỏ khô. Và nếu chúng ta có thể định vị gene, thì tách nó ra khỏi geneome
như thế nào? Không có forcep đủ nhỏ để gắp một đoạn DNA, và cũng không có
một cái kéo cơ học nào đủ nhỏ để cắt ra khỏi hệ gene một đoạn gene riêng biệt.

Hình 1.3. Vấn đề khó khăn khi chọn lọc
M
ột

đ
o
ạn rất nhỏ từ
geneome của E. coli
Gene mu
ốn tạo
dòng

Nh
ững
đ
o
ạn DNA với những
gene khác nhau, trong đó có
trpA mà người ta muốn tạo
dòng

Làm th
ế n
ào mà ng
ư
ời ta t
ìm
ra được 1 gene hoặc xác định
nó?


9

Công nghệ DNA tái tổ hợp đã biến đổi sâu sắc phương thức nghiên cứu
gene. Trước đây thông tin về cấu trúc và tổ chức của gene thu được bằng cách kiểm
tra biểu hiện kiểu hình, ngày nay những kỹ thuật mới đã tạo ra khả năng tự đọc các
trình tự nucleotide. Trước đây các nhà di truyền phải chờ đợi sự xuất hiện các đột
biên ngẫu nhiên hoặc cảm ứng để phân tích hiệu quả của sự sai khác di truyền, ngày
nay họ có thể tạo ra đột biến ở các điểm nhất định một cách chính xác và xem
chúng thay đổi kiểu hình như thế nào.
Công nghệ DNA tái tổ hợp đã cung cấp thông tin mới về cấu trúc và chức
năng của gene và đã thay đổi nhiều khái niệm cơ bản của di truyền học. Ví dụ: trong
khi mã di truyền được xem là rất phổ biến, thì bây giờ chúng ta còn biết rằng các
mã không phổ biến cũng tồn tại trong DNA ty thể. Trước đây chúng ta cho rằng tổ
chức gene eukaryote giống với prokaryote, nhưng bây giờ đã chứng minh được
nhiều gene eukaryote bị gián đoạn bởi các intron. Ngày nay, chúng ta đã biết đầy đủ
hơn về các quá trình tái bản, phiên mã, dịch mã, biến đổi RNA (RNA processing)
và điều hòa gene thông qua việc sử dụng các kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Các kỹ thuật
này cũng được dùng trong nhiều trong nhiều lĩnh vực khác, như hóa sinh học, vi
sinh vật học, sinh học phát triển, sinh học thần kinh, tiến hóa và sinh thái học.
Công nghệ DNA tái tổ hợp cũng được ứng dụng để tạo ra nhiều sản phẩm
thương mại: thuốc, hormone, enzyme và các giống cây trồng, vật nuôi. Một nền
công nghiệp hoàn toàn mới, công nghệ sinh học, đã phát triển chung quanh việc sử
dụng các kỹ thuật này để tạo ra các sản phẩm mới. Trong y học, kỹ thuật DNA tái tổ
hợp được dùng để thăm dò bản chất của ung thư, chẩn đoán các bệnh di truyền và
nhiễm trùng, sản xuất thuốc và điều trị các rối loạn di truyền.
Nếu chúng ta thành công trong việc định vị và phân lập gene mong muốn, thì
bước tiếp theo là đưa nó vào tế bào vi khuẩn. Các đoạn DNA mạch thẳng sẽ bị thoái
biến nhanh bởi vi khuẩn và để tồn tại và tái bản được gene phải được chèn vào
trong một dạng ổn định.
Khi biến nạp DNA tái tổ hợp thành công vào vi khuẩn còn phải đảm bảo
rằng gene được phiên mã và dịch mã. Sự biểu hiện của gene là một quá trình phức
tạp đòi hỏi một số trình tự DNA khác nằm ở ngoài gene. Tất cả những trình tự này

phải hiện diện trong các hướng, ở các vị trí thích hợp của chúng để sản xuất protein.













Phản ứng chuỗi polymerase

10











Hình 1.4. Bằng phản ứng chuỗi polymerase người ta có hàng triệu bản sao từ
một gene

Cuối cùng, các phương pháp được sử dụng để chuyển gene có hiệu quả rất
thấp, trong hàng triệu tế bào chỉ có một số tế bào được biến nạp thành công và biểu
hiện gene. Vì vậy, chúng ta có phương pháp để phát hiện được tế bào mang DNA
tái tổ hợp mong muốn.
Trong toàn bộ nghiên cứu sinh học chỉ có rất ít lĩnh vực không bị tác động
bởi tạo dòng DNA, PCR và kỹ thuật tái tổ hợp DNA. Đã từ lâu con người đã sử
dụng vi sinh vật như vi khuẩn để sản xuất các hợp chất có ích, ví dụ thuốc kháng
sinh penicillin, được tạo thành từ loài nấm có tên là Penicillium và streptomycin,
một sản phẩm của vi khuẩn Streptomyces griseus. Tạo dòng DNA đã đưa lại cho
sinh học một cuộc cách mạng, vì chúng mở ra một khả năng sản xuất protein của
động vật có vú trong tế bào vi khuẩn. Các gene tạo dòng có một đặc điểm quan
trọng là có thể biểu hiện trong một loài sinh vật không có quan hệ họ hàng gì với
loài của nó. Như vậy, người ta có thể tạo dòng gene động vật trong vi khuẩn (Hình
1.5). Điều này có ý nghĩa rất lớn, người ta có thể tách các gene điều khiển tổng hợp
chất kích thích và hocmon từ một cơ thể tồn tại trong tự nhiên. Sự tách chiết một
chất từ sinh vật nguyên thuỷ thường đắt và khó khăn, nhưng khi đưa gene tương
ứng vào vi khuẩn hoặc sinh vật khác thì sẽ thu được sản phẩm dễ dàng và với khối
lượng lớn. Với phương pháp này người ta đã thành công trong nhiều trường hợp,
cho đến nay có ý nghĩa nhất là sản xuất insulin bằng công nghệ gene.

T
ế b
ào đ
ộng vật

Gene mã hóa cho m
ột
protein đ
ộng vật

Vector cùng
v
ới gene động
Nhi
ễm sắc thể

Vi khu
ẩn biến
đ
ổi gene
mRNA


11

Hình 1.5. Phương pháp để sản xuất một protein động vật trong vi khuẩn
Những nghiên cứu về y học và nông nghiệp nhờ tạo dòng DNA đã có những
bước tiến quan trọng. Nhờ tạo dòng DNA mà người ta đã phát triển những chất tiêm
phòng để bảo vệ cơ thể chống lại bệnh tật. Nhiều bệnh di truyền ngày nay có thể
chẩn đoán ở giai đoạn bào thai và những nghiên cứu xác định được bệnh ở giai
đoạn sớm nhất, như ung thư vú và những bệnh hiểm nghèo, có hy vọng chữa trị
được.
II. Các enzyme tác động lên DNA
Khả năng thay đổi DNA trong ống nghiệm là dựa trên những nghiên cứu về
sự tổng hợp và biến đổi DNA trong tế bào sống. Người ta đã phát hiện những
enzyme có trong tế bào có thể cắt và nối DNA và đã phân lập được những enzyme
này. Với chúng ngày nay người ta có thể tạo ra các phân tử DNA tái tổ hợp. Đặc
điểm của những enzyme này và việc sử dụng chúng vào thí nghiệm tạo dòng sẽ đề
cập chi tiết sau đây.

Ch
ỗ cắt

Ch
ỗ cắt

Liên kết hydro
Nucleotide
Liên kết phosphodiester
a. M
ột exonuclease

Ch
ỗ cắt

b. M
ột endonuclease

12




Hình 1.6. Các phản ứng do hai loại nuclease xúc tác
a. Exonuclease tách các nucleotide từ các đầu cuối phân tử
DNA
b. Endonuclease cắt liên kết phosphodiester từ bên trong

Khi đã có DNA tinh khiết, bước tiếp theo của thí nghiệm tạo dòng là thiết kế
phân tử DNA tái tổ hợp. Vector tạo dòng cũng như DNA phải được cắt ở những vị
trí xác định và bằng cách xác định để nối lại với nhau. Cắt và nối là hai ví dụ về
phương pháp thay đổi DNA. Trong những năm qua một loạt các phương pháp được
phát triển để biến đổi các phân tử DNA không những chỉ cắt, nối mà có thể làm
ngắn, nối dài, gắn vào hoặc tách những nhóm hoá học xác định nào đó. Tất cả
những biến đổi này có thể thực hiện được trong ống nghiệm, và tạo nên nền tảng
không chỉ đối với tạo dòng mà còn đối với những nghiên cứu cơ bản về hoá sinh
DNA, cấu trúc của gene và điều khiển sự biểu hiện gene.
Trong tế bào những enzyme này tham gia vào các quá trình sống, như tái
sinh, sao chép, phân giải (ví dụ DNA của virus), sửa chữa DNA đột biến và kết hợp
các phân tử DNA khác nhau. Nhiều loại enzyme này được tách từ dịch tế bào và
chúng có thể thực hiện chức năng trong điều kiện nhân tạo. Các phản ứng enzyme
thường rất đơn giản, nhưng đòi hỏi enzyme phải ở dạng tinh khiết.
Enzyme được chia làm 5 nhóm lớn dựa trên phản ứng mà enzyme xúc tác.
1. Nuclease là những enzyme cắt, làm ngắn, phân giải các phân tử nucleic
acid
2. Ligase nối các phân tử nucleic acid

3. Polymerase sản sinh các bản sao của phân tử nucleic acid
4. Các enzyme biến đổi bằng cách tách hoặc gắn những nhóm hoá học
5. Topoisomerase: làm xuất hiện hoặc mất cấu trúc xoắn của DNA dạng
vòng.
Trước khi đi vào các nhóm enzyme cụ thể cần phải nêu lên hai điểm:
Thứ nhất phần lớn các enzyme được xếp vào một nhóm, tuy nhiên một số
enzyme có thể thuộc vào hai hay nhiều nhóm. Vi dụ các polymerase, chúng vừa có
thể tạo nên phân tử DNA mới và vừa có hoạt tính của nuclease là phân giải DNA.
Thứ hai là cần chú ý rằng, bên cạnh những enzyme làm thay đổi DNA, người
ta cũng biết nhiều enzyme tương tự tác dụng lên RNA. Ví dụ enzyme ribonuclease,
sử dụng để phân giải RNA trong dịch tế bào khi muốn thu nhận DNA tinh sạch. Ở
đây trước hết đề cập đến enzyme tác động lên DNA.
1. Nuclease
Cũng theo tiêu chuẩn này người ta phân biệt các endonuclease. Endonuclease
S1 (từ nấm Aspergillus oryzae) chỉ tác động lên từng sợi đơn (Hình 1.8a), trong khi
đó deoxyribonuclease I (DNase I, từ dạ cỏ bò), cắt cả sợi đơn và sợi kép (Hình
1.8b). DNase I tác động lên DNA ở các liên kết phosphodiester bên trong. Khi xử lý
với enzyme càng lâu thì xuất hiện một hỗn hợp các mononucleotide và các
oligonucleotide rất ngắn.

13

Hình 1.7. Các loại exonuclease khác nhau xúc tác cho các phản ứng
a. Bal31 tách các nucleotide từ hai đầu của DNA sợi kép
b. Exonuclease III tách nucleotide chỉ đầu cuối 3’

Ngược lại, có một nhóm đặc enzyme biệt hơn, được gọi là enzyme hạn chế
(restriction endonuclease), cắt DNA sợi kép chỉ ở một số vị trí xác định (Hình 1.8c).
Những enzyme này sẽ được mô tả chi tiết ở phần sau.

a.
Bal
31

b. Exonuclease III


14
2. Ligase
Trong tế bào DNA-ligase sửa chữa những chỗ đứt trên sợi đơn của phân tử
DNA sợi kép, những chỗ đứt này có thể xuất hiện khi tái sinh DNA. Ngoài ra DNA-
ligase của hầu hết các sinh vật có thể nối hai đoạn DNA sợi kép lại với nhau.

3. Polymerase

a. Nuclease S1

b. DNase I

c. Endonuclease

Không có s
ự cắt tiếp theo

L
ỗ hổng tr
ên s
ợi
đơn

15



Hình 1.8. Các phản ứng được xúc tác bởi nhiều loại endonuclease khác nhau
a. Nuclease I chỉ cắt các sợi đơn và các lổ hổng trên sợi đơn của DNA
sợi kép
b. DNAase I cắt DNA cả sợi đơn và kép
c. Một endonuclease cắt sợi kép chỉ ở một số vị trí nhất định

DNA-polymerase là những enzyme tổng hợp sợi DNA mới nhờ có sợi DNA
hoặc RNA khuôn mẫu (template) (Hình 1.10a). Phần lớn các polymerase chỉ hoạt
động khi trong khuôn có một đoạn sợi kép, đoạn này được gọi là primer (mồi) bắt
đầu cho phản ứng tổng hợp. Có ba loại DNA-polymerase được sử dụng trong công
nghệ gene: DNA-polymerase I, được tách ra từ E. coli. Enzyme này gắn vào một
đoạn đơn ngắn là điểm đứt trên 1 sợi DNA trong DNA sợi đôi (nick) của phân tử
DNA sợi kép và tổng hợp nên một sợi hoàn toàn mới. DNA-polymerase I cũng là
một ví dụ cho enzym có hai chức năng: tổng hợp và phân giải DNA.

a. Sữa chữa chỗ đứt trên sợi đơn

Chỗ đứt trên sợi đơn
DNA-ligase
b. Gắn kết hai phân tử
DNA-ligase

16






Hình 1.9. Hai loại phản ứng được xúc tác bởi DNA-ligase
a. Sửa chữa liên kết phosphodiester bị thiếu trên một sợi đơn
b. Gắn hai sợi kép lại với nhau

Hoạt tính polymerase và nuclease của DNA polymerase I được điều khiển
bởi những vùng khác nhau của phân tử enzyme. Hoạt tính nuclease nằm ở 323 gốc
amino acid đầu tiên của chuỗi polypeptide. Nếu cắt đi phần này thì enzyme bị thay
đổi, hoạt tính polymerase vẫn còn, nhưng hoạt tính phân giải DNA bị mất. Enzyme
bị biến đổi này được gọi là đoạn Klenow. Đoạn Klenow có thể tổng hợp sợi bổ sung
từ DNA khuôn, tuy nhiên sự tổng hợp không tiếp tục khi chỗ đứt trên sợi đơn được
lấp đầy (Hình 1.10c). Ứng dụng quan trọng nhất là đoạn Klenow là xác định trình tự
DNA.
Một loại DNA-polymerase thứ ba là reverse transcriptase, enzyme tham gia
vào sự tái sinh của nhiều virus. Đặc tính duy nhất của nó là sử dụng RNA làm
khuôn (Hình 1.10d). Khả năng tổng hợp nên sợi DNA bổ sung từ RNA khuôn của
enzyme có ý nghĩa trung tâm trong kỹ thuật tạo dòng cDNA.

a. Phản ứng cơ bản
Sợi khuôn
Đoạn mồi
Sợi mới được tổng hợp
b. DNA-polymerase I
Sợi khuôn
Lỗ hổng trên sợi đơn (nick)
Nh
ững nucleotide n
ày
đư
ợc thay thế

bằng những nucleotide mới
c. Đoạn Klenow
Nh
ữn
g nucleotide này không
được thay thế
Chỉ có lỗ hổng được lấp đầy
d. Reverse transcriptase

17
















Hình 1.10. Các phản ứng được xúc tác bởi DNA-polymerase
a. Phản ứng cơ bản: Một sợi DNA mới được tổng hợp theo hướng 5’
3’
b. DNA-polymerase I trước hết lấp những lỗ hổng trên sợi đơn và sau đó

tổng hợp sợi mới trên cơ sở phân giải sợi cũ
c. Đoạn Klenow chỉ lấp những lỗ hổng
d. Enzyme Reverse Transcriptase sử dụng RNA làm khuôn

4. Các enzyme biến đổi DNA
Có nhiều enzyme làm thay đổi DNA bằng cách gắn vào hoặc tách ra các
nhóm hoá học. Quan trọng nhất là những enzyme sau đây:
1. Phosphatase kiềm (từ E. coli hoặc ruột bê) tách nhóm phosphate của đầu 5’ của
phân tử DNA (Hình 1.11a).
2. Polynucleotide kinase (từ E. coli nhiễm phage T4) có tác dụng ngược với
phosphatase kiềm: gắn nhóm phosphate vào đầu 5’ tự do (Hình 1.11b). Enzyme
terminal deoxynucleotide transferase gắn một hoặc nhiều deoxynucleotide vào
đầu cuối 3’ của phân tử DNA.











a. Phosphatase kiềm
b. Polynucleotide transfrease
c. Terminal deoxynucleotide transferase

18

Hình 1.11. Các phản ứng được xúc tác bởi các enzyme biến đổi DNA

a. Phosphatase kiềm tách nhóm phosphate ở đầu 5’
b. Polynucleotide kinase gắn nhóm phosphate ở đầu 5’
c. Terminal deoxynucleotide transferase gắn các nucleotide vào đầu 3’ của
sợi đơn (1)
hoặc sợi kép (2).
5. Topoisomerase
Topoisomerase là enzyme có khả năng thay đổi hình dạng của DNA vòng,
đồng hoá trị (DNA plasmid), bằng cách làm mất hoặc xuất hiện xoắn ở mức cao
hơn. Đối với nghiên cứu sự tái sinh DNA thì những enzyme này quan trọng, nhưng
với công nghệ gene cho đến nay chưa có ứng dụng thực sự nào.

III. Enzym hạn chế: Restriction endonuclease

Khi tạo dòng điều cần thiết là cắt các phân tử DNA chính xác và luôn luôn
cùng cách. Vector phải được cắt ở một vị trí duy nhất để mở vòng và chèn đoạn
DNA ngoại lai vào. Phân tử DNA bị cắt nhiều lần, thành hai hoặc nhiều đoạn riêng
lẻ thì không thể dùng làm vector tạo dòng. Vậy vector phải được thiết kế như thế
nào và cần những endonuclease nào để thực hiện sự thay đổi này?





a. Phân t
ử vector

M
ở
vector
ở vị trí cắt


19

Hình 1.12. Tại sao ở thí nghiệm tạo dòng người ta phải cắt thật chính xác

Thường người ta phải cắt DNA khi tạo dòng (Hình 1.12 b), vì phần lớn
những vector tạo dòng tiếp nhận đoạn DNA có độ lớn xác định. Ví dụ các vector
trên cơ sở M13 chỉ tạo dòng có hiệu quả khi đoạn DNA nhỏ hơn 3 kb.
Với các enzyme hạn chế tinh khiết người ta mới có thể cắt chính xác các
phân tử DNA. Nhờ sự phát hiện những enzyme này mà Arber, Smith và Nathans
nhận được giải thưởng Nobel vào năm 1978, là một trong những điều kiện quan
trọng nhất đối với sự phát triển của công nghệ gene.

1. Phát hiện và kiểu tác động của enzyme hạn chế
Quan sát đầu tiên dẫn đến sự phát hiện ra enzyme hạn chế đã bắt đầu từ
những năm đầu những năm năm mươi. Người ta thấy một số loài vi khuẩn miễn
dịch đối với một số phage, hiện tượng này được gọi là hạn chế ký chủ. Cơ chế của

quá trình này không phức tạp lắm, tuy nhiên mãi 20 năm sau người ta mới hiểu một
cách đầy đủ. Nguyên nhân của hạn chế là enzyme do vi khuẩn sản sinh ra, phân
giải DNA của phage trước khi chúng tự tái sinh và tổng hợp nên hạt phage mới
(Hình 1.13a).

a. Gi
ới hạn của DNA phage

Phage
đ
ẩy DNA
vào t
ế b
ào vi

20

Hình 1.13 Chức năng của endonuclease trong tế bào

DNA của phage (a) bị phân giải nhưng DNA của vi khuẩn (b) thì không


Tuy nhiên, DNA của vi khuẩn không bị phân giải vì các base nitrogene ở
trình tự nhận biết đã bị methyl hóa nên enzyme không còn nhận ra được vị trí cắt
(Hình 1.13b). Những enzyme phân giải này được gọi là enzym hạn chế (restriction
endonuclease). Chúng có mặt ở tất cả các loài vi khuẩn. Hiện nay, đã có hơn 1200
enzyme thuộc loại này được xác định. Người ta biết có ba loại enzyme hạn chế khác
nhau. Loại I và III có ý nghĩa rất giới hạn đối với công nghệ sinh học. Ngược lại
loại II là những enzyme cắt rất quan trọng đối với tạo dòng DNA.
2. Enzyme hạn chế loại II cắt DNA ở những trình tự hoàn toàn xác định
Enzyme hạn chế loại II đặc biệt đã trở thành một công cụ rất hữu ích đối với
các nhà sinh học phân tử. Những enzyme này gắn vào DNA ở bất kỳ vị trí nào và di
chuyển dọc theo sợi DNA cho đến khi gặp trình tự nhận biết. Khi enzyme gắn vào
trình tự nhận biết cấu trúc của enzyme thay đổi tạo điều kiện cho phản ứng cắt. Các
vị trí nhận biết này có kích thước khác nhau tuỳ thuộc loại enzyme: Nhiều enzyme

21

hạn chế có trình tự nhận biết 6 nucleotide, một số khác có 4, 5, 8 nucleotide, hoặc
cũng có thể là 20. Ví dụ Sau3A (từ Staphylococcus aureus dòng 3A) có trình tự
nhận biết là GATC và AluI (từ Arthrobacter luteus) là trình tự AGCT. Ngoài ra còn
có những enzyme nhận biết các trình tự thoái hoá, nghĩa là chúng có thể cắt DNA ở
nhiều trình tự tương tự nhau. Ví dụ HinfI (từ Haemophulus influenzae dòng R
f
)
nhận biết trình tự GANTC và có khả năng cắt ở các trình tự sau: GAATC, GATTC,
GACTC và GAGTC.
Mặc dù trình tự nhận biết của các enzyme hạn chế là khác nhau, nhưng khi
cắt so le chúng đều tạo ra trình tự palindrome giống nhau khi đọc theo hướng 5' đến
3' trên mỗi sợi đơn. Một ví dụ về trình tự palindrome được tạo bởi enzyme EcoRI là
AATT.



Hình 1.14 Enzym EcoRI

Các trình tự nhận biết của một số enzyme hạn chế thường được sử dụng trình
bày ở bảng 1.1

EcoRI nhận biết trình tự 6 nucleotide là GAATTC đọc từ đầu 5' đến 3'.
Trình tự bổ sung (trên sợi DNA bổ sung) khi đọc từ 5' đến 3' cũng là GAATTC.
Trên hình 1.14 biểu diễn enzyme EcoRI gắn và cắt đối xứng ở cùng điểm bên trong
trình tự (giữa G và A khi đọc từ 5' đến 3') trên cả hai sợi, ở đây ta có thể nhận ra
trình tự palindrome.

22
Bảng 1.1 Một số enzymne hạn chế thường được sử dụng

Enzyme Nguồn vi sinh vật Trình tự nhận biết Loại đầu
EcoRI

BamHI

BglII

PvuI

PvuII

HindIII

Hinfl

Sau3A

AluI
TaqI
HaeIII
Notl
Escherichia coli

Bacillus amyloliquefaciens


Bacillus globigii

Proteus vulgaris

Proteus vulgaris

Haemophilus influenzae
R
d


Haemophilus influenzae R
f

Staphylococcus aureus

Arthrobacter luteus
Thermus aquaticus
Haemophilus aegyptius
Nocardia otitidis-
caviarum
5’-G AATTC-3’
3”-CTTAA G-5’
5’-G GATCC-3’
3’-CCTAG G5’
5’-A GATCT-3’
3’-TCTAG A-5’
CGATCG

CAGCTG

AAGCTT

GANTC

GATC

AGCT
TCGA
GGCC
GCGGCCGC
Dính

Dính

Dính

Dính

Đầu bằng

Dính

Dính

Dính

Đầu bằng
Dính
Đầu bằng
Dính

23


3. Đầu bằng và đầu dính

Đối với thí nghiệm tạo dòng điều quan trọng là đoạn cắt được tạo ra từ
enzyme hạn chế như thế nào. Nhiều enzyme cắt đơn giản hai sợi DNA ở giữa trình
tự nhận biết (Hình 1.15a), vì vậy xuất hiện đầu bằng (blunt ends), ví dụ enzyme
PvuII và AluI.

Hình 1.15. Các đầu cuối xuất hiện do DNA được cắt bằng những endonuclease
khác nhau
a. Đầu bằng được tạo ra bởi AluI
a. Tạo ra các đầu bằng
b. Tạo ra các đầu dính
Các đầu bằng
Các đầu dính
c. Các endonuclease khác nhau t
ạo ra các
đầu dính giống nhau
BamHI
BglII
Sau3A
EcoRI
AluI
“N”=A, G, C hoặc T

24
b. Đầu dính được tạo ra bởi EcoRI
c. Các đầu dính giống nhau được tạo ra bởi BamHI, BglII và
Sau3A

Điểm quan trọng là khi cắt tạo nên những “đầu dính”, vì chúng dễ dàng gắn
lại với nhau theo nguyên tắc bổ sung.
Những enzyme này cắt hai sợi DNA không ở cùng một vị trí mà thường dịch
chuyển 2 hoặc 4 nucleotide, vì vậy những đoạn DNA xuất hiện có đầu cuối là sợi
đơn nhô ra (Hình 1.15b). Những enzyme hạn chế với các trình tự nhận biết khác
nhau có thể tạo ra những đầu dính giống nhau. Ví dụ, BamHI (trình tự nhận biết là
GGATCC) và BglII (trình tự nhận biết AGATCT). Khi cắt bằng hai enzyme này
đều xuất hiện đầu dính có trình tự GATC (Hình 1.15c). Đầu dính như vậy cũng
được tạo ra bởi Sau3AI, enzyme có trình tự nhận biết 4 nucleotide GATC. Các đoạn
DNA xuất hiện khi cắt bằng những enzyme này có thể gắn lại được với nhau, vì các
đầu dính này bổ sung cho nhau.

4. Số vị trí nhận biết của enzyme hạn chế trong phân tử DNA
Chúng ta có thể ước lượng được tần suất cắt DNA khi biết được kích thước
của vị trí cắt. Có 4 loại nucleotide cấu tạo nên DNA nên khả năng cắt xảy ra ở bất
kỳ một loại nucleotide nào là 1/4. Trong trường hợp kích thước của vị trí cắt có 4
nucleotide thì xác suất cắt xảy ra ở bất kỳ vị trí nào đó là 1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4 =
1/256, có nghĩa là cứ trung bình 256 bp có một lần cắt. Bằng cách tính tương tự có
thể dự đoán được số đoạn DNA tạo ra nếu biết kích thước của trình tự nhận biết.
Điều này có ý nghĩa đối với lập bản đồ gene và kỹ thuật di truyền.
Tuy nhiên, trong thực tế không hoàn toàn chính xác như vậy. Ví dụ DNA của
phage  có chiều dài 49 kb, theo tính toán có chứa khoảng 12 chỗ cắt cho một
enzyme có trình tự nhận biết là 6 nucleotide, nhưng thực tế số lượng vị trí cắt ít hơn
(ví dụ có 6 vị trí cắt đối với BglII, 5 với BamHI và chỉ 2 với SalI).

Bgl
II: có 6 v
ị trí cắt

a. Các v
ị trí cắt của một số enzyme tr
ên

D
NA

Bam
HI: có 5 v
ị trí cắt

Sal
I: có 2 v
ị trí cắt

b.
Đ

ộ lớn của các
đ
o
ạn DNA

BglII

BamHI


25










Hình 1.16. Cắt DNA phage  bằng các enzyme hạn chế khác nhau
a. Vị trí nhận biết của BglII, BamHI và SalI
b. Các đoạn thu được khi cắt bằng các endonuclease. Các con số biểu
diễn độ
lớn của các đoạn DNA bằng cặp base (bp)
Ngoài ra, các vị trí cắt phân bố không đồng đều trên phân tử DNA, vì nếu
phân bố đồng đều thì các đoạn tạo ra có độ lớn phải bằng nhau. Hình 1.16b cho thấy
độ lớn các đoạn thu được khi cắt phage  bằng BglII, BamHI và SalI. Trong nhiều
trường hợp các đoạn thu được có độ lớn phân tán rất rộng. Điều này nói lên rằng

các nucleotide sắp xếp hoàn toàn ngẫu nhiên trên DNA.
Từ hình 1.16 với phương pháp toán học người ta có thể hình dung có bao
nhiêu vị trí cắt có thể chờ đợi ở một phân tử DNA, nhưng bức tranh thực tế chỉ có
được khi phân tích thực nghiệm.

5. Quá trình cắt bằng enzyme hạn chế trong phòng thí nghiệm
Ví dụ cắt -DNA (nồng độ 125 g/ml) bằng BglII. Trước hết cho DNA vào
eppendorf, lượng bao nhiêu là tùy thuộc vào mục đích của từng loại thí nghiệm, ví
dụ
2 g DNA tube (có trong 16 l, Hình 1.17). Thành phần được cho vào tiếp theo là
dung dịch đệm. Đệm được cung cấp trên thị trường có nồng độ cao hơn 10 lần so
với nồng độ phản ứng, vì vậy phải được pha loãng 10 lần. Ví dụ thể tích cuối cùng
của hỗn hợp phản ứng là 20 l, thì chỉ cần 2 l dung dịch đệm BglII. Enzyme là
thành phần cuối cùng được cho vào hỗn hợp phản ứng. Enzyme ở dạng tinh khiết
với nồng độ đã biết do nhà sản xuất cung cấp. Nồng độ enzyme phải được tính
chính xác để đảm bảo hoạt tính enzyme là cao nhất. Một đơn vị enzyme là lượng
enzyme cần để cắt 1 g DNA trong thời gian 1 giờ, ví dụ có 2g DNA thì cần 2 đơn
vị BglII. BglII trên thị trường có nồng độ 4 đơn vị/l nên chỉ cần 0,5 l cho thí
nghiệm này. Để có thể tích cuối cùng là 20l cần thêm 1,5 l nước cất (Hình
1.17c).
Phần lớn các enzyme hạn chế hoạt động tốt ở pH 7,4, nhưng các loại enzyme
khác nhau cần nồng độ ion khác nhau (được tạo ra bởi NaCl) và nồng độ Mg
2+
(tất
cả các enzyme hạn chế loại II cần Mg
2+
). Ngoài ra, cần cho thêm chất khử
dithiothreitol để tăng sự bền vững và giảm sự bất hoạt của enzyme. Điều quan trọng
là phải tạo điều kiện phản ứng chính xác cho mỗi loại enzyme. Nồng độ NaCl và

26
Mg
2+
không chính xác không những làm giảm hoạt tính của enzyme mà còn thay
đổi tính đặc hiệu của chúng là cắt DNA ở những vị trí không đặc hiệu.
Thành phần dung dịch đệm thích hợp cho BglII được trình bày ở bảng 1.2.

Bảng 1.2 Thành phần đệm của enzyme BglII có nồng độ cao gấp 10 lần

Thành phần
Nồng độ (mM)
Tris-HCl, pH 7,4
MgCl
2

NaCl
Dithiothreitol
500
100
500
10

Yếu tố cuối cùng cần chú ý là nhiệt độ ủ. Hầu hết enzyme hạn chế có hoạt
tính cao nhất ở nhiệt độ 37
0
C, nhưng một số khác có nhiệt độ tối thích cao hơn. Ví
dụ TaqI thu được từ vi khuẩn Thermus aquaticus thích nghi ở nhiệt độ cao như suối
nước nóng. Khi cắt bằng enzyme này người ta ủ ở nhiệt độ 65
0
C mới đạt được hoạt

tính cực đại.
Sau thời gian ủ 1 giờ phản ứng xảy ra hoàn toàn (Hình 1.17d). Nếu muốn sử
dụng các đoạn DNA này cho thí nghiệm tạo dòng thì phải khử hoạt enzyme bằng
cách nào đó. Có nhiều phương pháp làm bất hoạt enzyme. Trong nhiều trường hợp
chỉ cần ủ trong thời gian ngắn ở nhiệt độ 70
0
C hoặc chiết bằng phenol hoặc cho vào
hỗn hợp phản ứng EDTA, chất này kết hợp với Mg
2+
làm cho enzyme mất hoạt tính
(Hình 1.17c).


















Cho vào 2 l đệm BglII

Cho vào 1,5

l H
2
O

và 0,5 l BglII
2 g -DNA (16 l)
Ủ: 1 giờ ở 37
o
C
DNA c
ủa phage
 được cắt ra
Cho thêm phenol ho
ặc
EDTA hoặc gia nhiệt 70
o
C
trong 15 phút

(a) (b) (c)
(d)
(e)

27

Hình 1.17 Tiến trình cắt bằng enzyme giới hạn trong phòng thí nghiệm

6. Phân tích kết quả của phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế
Phản ứng cắt làm xuất hiện một số đoạn DNA, độ lớn của từng đoạn phụ thuộc
vào vị trí các điểm cắt trong phân tử DNA gốc (Hình 1.16). Khi tạo dòng người ta
cần một phương pháp để xác định số lượng và độ lớn của các đoạn DNA. Nói
chung, phân tử DNA được cắt hay không, có thể dễ dàng nhận biết bằng cách xác
định độ nhớt của dung dịch. Các phân tử DNA lớn làm cho dung dịch đặc quánh
hơn phân tử DNA nhỏ. Tuy nhiên để xác định chính xác số lượng và độ lớn của sản
phẩm là khó khăn và mất nhiều thời gian. Vào đầu những năm 70 vấn đề này đã
được giải quyết nhờ phương pháp điện di.
6.1. Sự tách các phân tử bằng điện di

a.
Đ
i
ện di th
ư
ờng

DNA

Đ
ệm

Đ
i
ện di

DNA di chuy
ển về cực d
ươ
ng
nh
ư
ng quá trì

nh tách theo
đ
ộ lớn
b.
Đ
i
ện di tr
ên gel


28

Hình 1.18. Điện di thường (a) không tách được các đoạn DNA có độ lớn khác
nhau, điện di trên gel (b) thì tách được

Cũng như protein và nhiều phân tử khác, DNA mang điện và tích điện âm.
Vì vậy, chúng di chuyển về cực dương khi ở trong điện trường (Hình 1.18a). Tốc độ
di chuyển của chúng phụ thuộc vào hai đặc điểm: hình dạng và điện tích của phân
tử. Phần lớn các phân tử DNA có cùng hình dạng và điện tích thì tỷ lệ với độ lớn.
Bằng điện di đơn giản người ta không thể tách các đoạn DNA có độ lớn khác nhau.
Khi cho hỗn hợp các đoạn DNA điện di trong gel được tạo nên từ agarose hoặc
polyacrylamide, các phân tử DNA phải di chuyển qua hệ thống lỗ rây để đi đến cực
dương. Phân tử DNA càng nhỏ, thì di chuyển càng nhanh. Nhờ vậy các phân tử
DNA được tách ra trong điện di theo độ lớn của nó (Hình 1.18b).