nghiên cứu điều kiện chiết rút carotenoprotein từ đầu vỏ tôm thẻ chân trắng bằng các enzyme protease thương mại

i
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian 3 tháng vừa qua với sự nỗ lực của bản thân cùng với sự quan
tâm giúp đỡ của thầy cô, cha me và bạn bè, đến nay em đã hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp của mình. Em xin trân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trƣờng, các thầy cô
viện Công nghệ sinh học và Môi trƣờng đã truyền đạt những kiến thức trong những
năm học vừa qua. Đồng thời em xin chân thành cảm ơn các cán bộ và nhân viên
phòng thí nghiệm Viện Công nghệ sin học và môi trƣờng đã tận tình giúp đỡ em tạo
điều kiện cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ths. Nguyễn Công Minh đã trực
tiếp hƣớng dẫn em hết sức tận tình và chu đáo trong suốt thời gian làm khóa luận tốt
nghiệp.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và bạn bè đã động
viên khích lệ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận.

Nha Trang, tháng 6 năm 2012
Sinh viên thực hiện

Mai Thị Ngọc Diệp

ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CÁC BẢNG iv
DANH MỤC CÁC HÌNH v
LỜI MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1. Tổng quan về phế liệu tôm. 2
1.2. Tổng quan về carotenoprotein. 3

1.2.1. Sự tồn tại của carotenoprotein. 3
1.2.2. Tính chất của carotenoprotein 4
1.2.3. Ứng dụng của carotenoprotein. 6
1.3. Tổng quan về enzyme protease. 7
1.3.1. Đặc tính của enzyme protease. 7
1.3.2. Ứng dụng của enzyme protease. 9
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc. 12
1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc. 12
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc. 16
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. Nguyên vật liệu: 20
2.1.1Nguyên liệu đầu tôm: 20
2.1.2. Enzyme Alcalase 20
2.1.3. Enzyme Flavourzyme. 20
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu. 21
2.2.1. Sơ đồ tổng quát thí nghiệm 21
2.2.2. Xác định chế độ thích hợp để tách chiết protein giàu carotenoid từ đầu
tôm bằng Alcalase. 22
2.2.2.1. Xác định tỷ lệ enzyme/phế liệu thích hợp cho công đoạn thủy phân
bằng Alcalase. 22
2.2.2.2. Xác định thời gian xử lý thích hợp cho công đoạn thủy phân bằng
Alcalase. 24

iii
2.2.3.Xác định chế độ thích hợp để tách chiết carotenoid từ đầu tôm ở giai đoạn
hai bằng enzyme Flavourzyme (sau khi đã xử lý bằng Alcalase) 25
2.2.3.1. Xác định tỷ lệ enzyme/ phế liệu thích hợp cho công đoạn thủy phân
bằng Flavourzyme 25
2.2.3.2. Xác định thời gian xử lý thích hợp cho công đoạn thủy phân
Flavourzyme. 26

2.3. Các phƣơng pháp phân tích sử dụng trong đề tài. 27
2.4.Phƣơng pháp xử lý số liệu 27
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
3.1. Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm đầu thẻ chân trắng. 28
3.2. Nghiên cứu điều kiện thủy phân carotenoprotein từ đầu tôm bằng enzyme
Alcalase. 29
3.2.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme Alcalase/ phế liệu đến hiệu suất thu hồi
protein và astaxanthin. 29
3.2.2. Ảnh hƣởng của thời gian xử lý enzyme Alcalase/ phế liệu đến hiệu suất
thu hồi protein và astaxanthin. 32
3.3. Nghiên cứu điều kiện thủy phân carotenoprotein từ đầu tôm bằng enzyme
Flavourzyme. 34
3.3.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme Flavourzyme/ phế liệu đến hiệu suất thu hồi
protein và astaxanthin. 34
3.3.2. Ảnh hƣởng của thời gian xử lý enzyme Flavourzyme/ phế liệu đến hiệu
suất thu hồi protein và astaxanthin. 36
3.4. Thành phần hóa học của carotenoprotein 38
3.5. Đề xuất quy trình thu hồi carotenoprotein bằng hỗn hợp hai enzyme. 38
Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39
4.1. Kết luận. 39
4.2. Đề nghị. 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO. 40
PHỤ LỤC 45

iv
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm thẻ chân trắng 28
Bảng 3.2. Thành phần hóa học cơ bản của carotenoprotein 38

v
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Quy trình sản xuất chitin của Pháp. 13
Hình 1.2. Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto 15
Hình 1.3. Quy trình sản xuất Chitin của TS. Trang Sỹ Trung. 17
Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát. 21
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm cho công đoạn xác định tỷ lệ enzyme Alcalase 23
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm cho công đoạn xác định thời gian enzyme
Alcalase 24
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm cho công đoạn xác định tỷ lệ enzyme
Flavourzyme. 25
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm cho công đoạn xác định thời gian enzyme
Flavourzyme 26
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme Alcalase/phế liệu đến hiệu suất thu hồi
protein từ phế liệu tôm. 29
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme Alcalase/phế liệu đến hiệu suất thu hồi
astaxanthin từ phế liệu tôm. 31
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian enzyme Alcalase/phế liệu đến hiệu suất thu hồi
protein từ phế liệu tôm. 32
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian enzyme Alcalase/phế liệu đến hiệu suất thu hồi
astaxanthin từ phế liệu tôm. 33
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme Flavourzyme/phế liệu đến hiệu suất thu hồi
protein từ phế liệu tôm. 34
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme Flavourzyme/phế liệu đến hiệu suất thu hồi
astaxanthin từ phế liệu tôm. 35
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của thời gian enzyme Flavourzyme/phế liệu đến hiệu suất thu
hồi protein từ phế liệu tôm. 36
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của thời gian enzyme Flavourzyme/phế liệu đến hiệu suất thu
hồi astaxanthin từ phế liệu tôm. 37

1
LỜI MỞ ĐẦU
Cùng với sự phát triển của nền kinh tế trong và ngoài nƣớc, ngành thủy sản
trong những năm gần đây đã đạt đƣợc những thành tựu đáng kể về nuôi trồng, chế
biến cũng nhƣ xuất nhập khẩu. Trong các mặt hàng xuất khẩu của nƣớc ta thì mặt
hàng tôm xuất khẩu luôn chiếm tỷ lệ lớn, chiếm hơn 50% tổng kim ngạch xuất
khẩu. Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), trong sáu
tháng đầu năm 2011, cả nƣớc đã xuất khẩu 101.872 tấn tôm, trị giá 971,109 triệu
USD; tăng 16,9% về khối lƣợng và 35,2% về giá trị so với cùng kì năm 2010 và là
nhóm hàng có mức tăng trƣởng cao nhất trong các nhóm hàng thủy sản xuất khẩu
của Việt Nam. Mặc dù gặp nhiều khó khăn, xuất khẩu tôm vẫn đạt mức kỉ lục gần
2,4 tỉ USD. Theo VASEP cho biết dự kiến xuất khẩu tôm 2012 sẽ đạt 2,5 tỷ USD.
Do đó lƣợng phế liệu tôm thải ra từ các nhà máy chế biến là khá lớn khoảng
100.000 tấn/ năm. Đây là nguồn nguyên liệu dồi dào để sản xuất protein,
astaxanthin, chitin, chitosan…và các sản phẩm có giá trị kinh tế khác. Hiện nay đã
có nhiều công trình nghiên cứu tận thu phế liệu tôm nhƣng chủ yếu tập trung vào
quá trình thu hồi chitin–chitosan. Các quá trình sản xuất chitin– chitosan này
thƣờng là các quá trình hóa học, sử dụng acid và base mạnh để khử khoáng và
protein do vậy vừa gây ô nhiễm môi trƣờng do hóa chất vừa gây lãng phí về kinh tế
vì không thể tận thu đƣợc các thành phần có giá trị nhƣ protein và carotenid.
Nhằm giảm ô nhiễm môi trƣờng và tận thu đƣợc các thành phần có giá trị
nhƣ protein và astaxanthin đề tài “Nghiên cứu điều kiện chiết rút carotenoprotein từ
đầu vỏ tôm thẻ chân trắng bằng các enzyme protease thƣơng mại” đƣợc thực hiện.
Nội dung thực hiện:
- Xác định thành phần hóa học của đầu tôm the chân trắng.
- Nghiên cứu điều kiện chiết carotenoprotein từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng
các enzyme Alcalase, Flavourzyme.
- Đánh giá chất lƣợng carotenoprotein thu đƣợc.
- Đề xuất quy trình.

2
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về phế liệu tôm.
Phế liệu tôm chủ yếu là đầu và các mảnh vỏ, ngoài ra còn kể đến các mảnh
thịt vụn do bóc nõn không cẩn thận, một số tôm bị hỏng. Tùy theo giống loài,
phƣơng pháp gia công chế biến mà lƣợng phế liệu có thể lên đến 60% sản lƣợng
khai thác đƣợc. Ví dụ tôm càng xanh, phần đầu tôm chiếm 60% khối lƣợng tôm, với
tôm sú thì phần đầu chiếm khoảng 40% khối lƣợng tôm. Đối với sản phẩm tôm bóc
nõn, rút ruột mất mát theo vỏ và đuôi khoảng 25% khối lƣợng tôm. Đối với tôm
thẻ, lƣợng phế liệu đầu tôm chiếm 28% và vỏ chiếm 9%, nhƣ vậy tổng khối lƣợng
phế liệu vỏ, đầu tôm thẻ chiếm khoảng 37% [4]. Lƣợng phế liệu này có thể đƣợc
giảm xuống bằng cách nâng cao hiệu quả lột vỏ nhờ các thiết bị và công nghệ chế
biến tốt hơn. Giảm lƣợng phế liệu từ khâu chế biến hoặc tìm giải pháp tái sử dụng
chúng đang trở nên phổ biến nhƣ một phƣơng cách giúp làm tăng lợi nhuận cho
ngành thuỷ sản. Nó không chỉ đem lại giá trị kinh tế cao mà còn có ý nghĩa trong
việc bảo vệ môi trƣờng.
Thành phần hóa học trong đầu tôm.
Thành phần chiếm tỷ lệ đáng kể trong đầu tôm là protein, chitin, sắc tố,
khoáng và enzyme…tỷ lệ các thành phần này không ổn định, chúng thay đổi theo
giống, loài đặc điểm sinh lí,…thành phần chitin và protein trong vỏ tôm tƣơi tƣơng
ứng là 4,50% và 8,05%. Trong vỏ tôm khô là 11 – 27,50% và 23,25 – 53%
Hàm lƣợng chitin, khoáng, protein và carotenoid trong phế liệu vỏ tôm thay
đổi rất rộng phụ thuộc vào điều kiện bóc vỏ trong quá trình chế biến cũng nhƣ phụ
thuộc vào loài, trạng thái dinh dƣỡng, chu kì sinh sản. Vỏ giáp xác chứa chủ yếu là
protein (30-40%), khoáng (30-50%), chitin (13-42%) [34].
- Protein: protein trong phế liệu tôm thƣờng là loại protein không hòa tan, do
đó khó trích ly ra khỏi vỏ, nó tồn tại dƣới hai dạng:
- Dạng tự do: Tồn tại trong các cơ quan nội tạng và các cơ gắn ở phần vỏ.
- Dạng phức tạp: Liên kết với Chitin, CaCO

3
nhƣ một phần thống nhất của
vỏ tôm.

3
- Chitin: Tồn tại dƣới dạng liên kết với protein, khoáng và những hợp chất
hữu cơ khác, chủ yếu là CaCO
3
– thành phần chính tạo nên vỏ tôm, chính sự liên
kết này gây khó khăn trong việc tách chiết và tinh chế.
- Canxi: Trong thành phần vỏ, đầu tôm có chứa một lƣợng lớn muối vô cơ,
chủ yếu là cacbonat canxi (CaCO
3
).
- Astaxanthin: là sắc tố chủ yếu trong vỏ tôm, astaxanthin là dẫn xuất của
carotenoid, thƣờng ở dạng liên kết với acid béo (ester hóa) hay với protein tạo nên
một phức hợp chặt chẽ có màu xanh của tôm. Khi liên kết này bị phá vỡ thì
astaxanthin dễ dàng bị oxy hóa thành astaxin.
- Lipid: Chứa một lƣợng đáng kể, chủ yếu là các axit béo chƣa no bão hòa
nhƣ eicosapentaenoic acid (EPA), decosahexaenoic (DHA). Đây là những acid béo
rất có lợi cho sức khỏe con ngƣời và có nhiều ứng dụng trong y học.
- Enzyme: Trong phế liệu tôm cũng có chứa một số loại enzyme, theo tạp chí
Khoa học và Công nghệ Thủy sản (số 5/1993) thì hoạt độ enzyme protease của đầu
tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/gam tƣơi. Trong đầu tôm có chứa enzyme tiêu hóa
chymotrypsin, đƣợc sử dụng trong điều trị ung thƣ. Một vài loại enzyme khác có
mặt trong phế liệu tôm nhƣ alkaline phosphatase, β-N-acetyl glucosaminease,
chitinase cũng đƣợc ứng dụng nhiều trong thực tế.
1.2. Tổng quan về carotenoprotein.
1.2.1. Sự tồn tại của carotenoprotein.
Carotenoprotein là tên gọi chung của phức hợp bao gồm một protein và một

carotenoid liên kết với nhau. Phức hợp protein và sắc tố này đƣợc tìm thấy rất phổ
biến trong cơ thể động vật biển không xƣơng sống [24]. Sự tƣơng tác giữa
carotenoid và protein là một đặc điểm sinh lý quan trọng trong cơ thể một số sinh
vật sống. Carotenoid ở trong cơ thể sinh vật có tính bền vững hơn so với khi đã
đƣợc tách chiết. Trong những hệ thống quang hợp, các sắc tố nhƣ carotenoid,
chlorophyll hoặc bacteriochlorophyll đều đƣợc định vị trong những phức hợp
protein - sắc tố nhằm đảm bảo vị trí và sự định hƣớng chính xác của các loại sắc tố
này, đóng vai trò quan trọng trong quá trình truyền năng lƣợng ở cơ thể sinh vật.

4
Ngoài ra, sự phân bố của carotenoprotein trong tự nhiên cũng khá đa dạng. Ở
thực vật, các carotenoid thƣờng định vị trên một số lƣợng lớn các grana của lục lạp,
và chúng tồn tại ở dạng phức hợp carotenoprotein. Động vật không xƣơng sống ở
biển nhƣ động vật da gai, động vật thân mềm, nhìn chung là các nhóm sinh vật chứa
nhiều phức hợp carotenoprotein trong cơ thể. Bên cạnh đó, các loại tảo, bao gồm cả
tảo đơn bào hai roi (indoflagellate) cũng sử dụng phức hợp carotenoprotein nhƣ
những thụ quan ánh sáng.
Carotenoid ở dạng tự do thƣờng có màu vàng, cam hoặc đỏ. Tuy nhiên, trong
cơ thể những loài động vật biển không xƣơng sống, các phức hợp carotenoprotein
tạo nên nhiều màu khác nhau nhƣ xanh lá cây, xanh dƣơng và tía. Một ví dụ điển
hình là α-crustacyanin, một phức hợp astaxanthin - protein trong vỏ tôm hùm
(Homarus gammarus) có màu xanh dƣơng. Khi còn sống, cơ thể loài tôm hùm này
có màu xanh đen; tuy nhiên, sau khi đƣợc nấu chín, cơ thể chúng chuyển thành màu
đỏ cam. Màu đỏ này đƣợc tạo ra nhờ một loại carotenoid là astaxanthin (3,3’-
dihydroxy-β,β’-carotene-4,4’-dione) đƣợc phóng thích ra ở dạng tự do thông qua
quá trình biến tính phức hợp astaxanthin - protein bởi nhiệt.
1.2.2. Tính chất của carotenoprotein
Carotenoprotein là phức hợp của carotenoid và protein. Tuy nhiên, đối với
đối tƣợng lớp giáp xác thì thành phần carotenoid này chủ yếu là astaxanthin. Do vậy
trong phạm vi nghiên cứu một khóa luận tốt nghiệp, tôi chủ yếu tập trung đề cập

những thông tin về dạng phức hợp astaxanthin - protein.
Astaxanthin là một trong các sắc tố carotenoid, có màu đỏ cam, đƣợc tìm
thấy trong một số loài thủy sản nhƣ cá hồi, cá hồng, tôm, cua trong vi tảo nƣớc
ngọt Haematococcus pluvialis, trong nấm men Phaffia rhodozyma là chất tan
trong lipid có khối lƣợng phân tử 596,8 Da. Trong tự nhiên astaxanthin thƣờng tồn
tại ở dạng astaxanthin liên kết với protein tạo phức chất có màu xanh đen. Khi gia
nhiệt hay bị oxy hóa, liên kết giữa astaxanthin và protein bị cắt đứt, giải phóng
astatin có màu đỏ cam.


5
Phức hợp carotenoid – protein
Bản chất của sự liên kết.
Theo P.F.Zagalsky (1976) [39], carotenoprotein đƣợc chia làm 2 loại chính:
loại 1, kém bền vững hơn loại 2, là dạng phức hợp carotenoprotein mà trong đó,
thành phần carotenoid liên kết với một lipo(glyco)protein. Trong khi đó, loại 2 là
dạng phức hợp mà carotenoid kết hợp với một protein đơn giản hoặc một
glycoprotein. Dạng 1 thƣờng hiện diện ở buồng trứng, trứng và máu của động vật
không xƣơng sống. Mặt khác, dạng 2 thƣờng đƣợc tìm thấy ở vùng bề mặt (vỏ và
da) của chúng.
Carotenoid đƣợc cho là nằm sâu trong lòng phức hợp, bị cách ly gần nhƣ
hoàn toàn với môi trƣờng nƣớc, với nhóm 4 và 4’-keto của nó đƣợc định vị gần bề
mặt của phân tử protein. Cơ chế “liên kết nhờ sức căng” đƣợc các nhà nghiên cứu
đề xuất yêu cầu phải có sự ăn khớp giữa chuỗi polypeptide và các nhóm methyl của
chuỗi polyene, đồng thời phải có sự duy trì bền vững của cấu trúc vòng β-ionone.
Hàm lƣợng cao các loại amino acid kích thƣớc nhỏ tạo điều kiện dễ dàng hơn cho
sự khớp nối giữa chuỗi polyme và khung sƣờn polypeptide. Cấu trúc của phức hợp
carotenoprotein hầu nhƣ đƣợc hình thành từ các xoắn ngẫu nhiên (random coil) và
có dạng cấu hình phiến β. Một minh chứng rõ rệt là trong thành phần
carotenoprotein, hàm lƣợng amino acid leucine (giúp làm bền kiểu cấu hình xoắn α)

rất thấp nhƣng hàm lƣợng các loại amino acid khác nhƣ proline, serine, glycine và
asparagine (làm phá vỡ cấu trúc xoắn α) tƣơng đối cao. Điển hình nhƣ trong phức
hợp crustacyanin, tỉ lệ cấu trúc xoắn α chỉ chiếm khoảng 6% [39]. Bên cạnh đó,
trong thành phần phức hợp carotenoprotein, các amino acid thƣờng thấy trong dạng
cấu hình β nhƣ isoleucine, valine, threonine và glutamine hiện diện với tỉ lệ không
nhỏ, đồng thời một số lƣợng lớn các “cấu trúc quay ngƣợc” β (β-bends) cũng đƣợc
tìm thấy (cấu trúc này hỗ trợ sự hình thành của dạng cấu hình phiến β đối song
song.
Sự dịch chuyển bƣớc sóng hấp thụ cực đại.

6
Phức hợp carotenoprotein hòa tan trong nƣớc và có tính bền vững, trong một
vài trƣờng hợp, màu sắc của nó bền đến vài năm trong không khí ở điều kiện nhiệt
độ phòng. Ngoài ra, sự tƣơng tác giữa protein và astaxanthin dẫn đến sự thay đổi
lớn về bƣớc sóng của bức xạ hấp thụ cực đại (spectral shift), từ đó dẫn đến sự thay
đổi về màu sắc của nó. Chẳng hạn, trong cơ thể động vật giáp xác, astaxanthin
thƣờng liên kết với các phân tử protein tạo thành phức hợp α-crustacyanin, hấp thụ
cực đại bức xạ ở bƣớc sóng 628 nm, tạo nên màu xanh đen đặc trƣng thƣờng thấy ở
các loài thủy sản sống. Dƣới tác dụng của nhiệt, liên kết trên bị phá hủy và giải
phóng astaxanthin tự do (có bƣớc sóng hấp thụ cực đại chỉ là 480nm) màu đỏ cam.
Sự thay đổi bƣớc sóng của bức xạ hấp thụ cực đại của astaxanthin trong phức
hợp carotenoprotein so với dạng phân tử tự do phụ thuộc vào sự liên kết của nó với
thành phần apoprotein, về vị trí không gian, và chính bản chất cấu trúc của
astaxanthin.
1.2.3. Ứng dụng của carotenoprotein.
Carotenoid và carotenoprotein chịu trách nhiệm tạo nên những màu sắc khác
nhau trong cơ thể động vật giáp xác. Những hợp chất này thu hút sự quan tâm
nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới nhờ vào các tính chất quan trọng
của chúng nhƣ có nguồn gốc tự nhiên, không chứa độc tố, cung cấp những sắc tố
tan đƣợc cả trong nƣớc và chất béo. Một trong những ứng dụng đƣợc quan tâm lớn

hiện nay của phức hợp carotenoprotein là nó có thể đƣợc sử dụng làm thức ăn cho
cá hồi để tạo nên màu sắc tƣơi tự nhiên cho thịt cá [30]. Do cá hồi không thể tự tổng
hợp astaxanthin, chúng phải thu nhận astaxanthin từ nguồn bên ngoài nhƣ ở các loại
vi tảo hoặc từ thức ăn có bổ sung loại sắc tố này [36].
Mặt khác, trong tình hình hiện nay, khi mà nguồn astaxanthin tổng hợp bị
kiểm duyệt nghiêm ngặt về tính an toàn với sức khỏe con ngƣời, nhu cầu
astaxanthin tách chiết từ nguồn nguyên liệu tự nhiên phát triển mạnh mẽ hơn bao
giờ hết [30]. Bên cạnh đó, nhờ vào tính chất không gây ra các phản ứng dị ứng
trong cơ thể ngƣời, dạng astaxanthin tự nhiên (ở dạng tự do và dạng phức hợp

7
carotenoprotein) hiện nay đã đƣợc nghiên cứu trong những ứng dụng mỹ phẩm và
thẫm mỹ [32].
Một hƣớng ứng dụng khác của phức hợp carotenoprotein, đó là dựa trên tính
chất dịch chuyển bƣớc sóng của bức xạ hấp thụ cực đại của phức hợp này so với
phân tử sắc tố tự do, kéo theo sự thay đổi về màu sắc, mà carotenoprotein có thể
đƣợc sử dụng làm chất chỉ thị cảm ứng nhiệt độ, đối với cả khoảng nhiệt gây ra xảy
ra sự đổi màu thuận nghịch và không thuận nghịch.
Cuối cùng, carotenoprotein còn có tiềm năng trong việc sử dụng để bổ sung
vào nguồn thực phẩm cho ngƣời khi mà nhu cầu về protein thực phẩm ngày càng
tăng mạnh trên toàn cầu, đặc biệt là ở các nƣớc chƣa phát triển. Carotenoprotein
chứa nhiều loại amino acid thiết yếu, đồng thời lại kết hợp với thành phần
carotenoid (chủ yếu là astaxanthin), rất có lợi cho sức khỏe con ngƣời nhờ khả năng
chống oxy hóa mạnh (gần gấp 10 lần so với các loại carotenoid khác nhƣ
zeaxanthin, lutein, canthaxanthin và β-carotene, và mạnh hơn gấp 500 lần so với α-
tocopherol). Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã tập trung vào đối tƣợng
carotenoprotein nhƣ là nguồn thực phẩm mới giúp giảm thiểu hoặc kiểm soát các
bệnh liên quan đến vấn đề ăn uống nhƣ: chứng xơ vữa động mạch, ung thƣ, suy
thận và suy gan [17] cũng nhƣ giúp kiểm soát cân nặng cho các bệnh nhân đang
đƣợc điều trị [38].

1.3. Tổng quan về enzyme protease.
1.3.1. Đặc tính của enzyme protease.
Enzyme là chất xúc tác sinh học mang bản chất protein ra, có khả năng xúc
tác cho các phản ứng hóa học xảy ra nhanh chóng trong điều kiện sinh lý bình
thƣờng của cơ thể sống và chỉ cần một lƣợng nhỏ cũng xúc tác để chuyển hóa một
lƣợng cơ chất lớn.
Protease là enzyme thủy phân liên kết peptid của phân tử protein. Enzyme
protease đƣợc phân thành hai dạng là endoprotease và exoprotease.
- Các endoprotease nhƣ trypsin, chymotrypsin, chymosin thủy phân các liên
kết peptid bên trong chuỗi polypeptid.

8
- Các exoprotease cắt các liên kết ở hai đầu tận cùng của chuỗi polypeptid,
các exoprotease cắt vào đầu các nhóm carboxyl tận cùng đƣợc gọi là
carboxylpeptidese còn những enzyme tác dụng vào đầu có nhóm amin tận cùng gọi
là aminopeptidase [27].
Các endo và exoprotease kể trên cộng tác với nhau rất có hiệu quả trong việc
phân giải protein. Có thể nói rằng, chức năng chính của endoenzyme tạo ra một
lƣợng lớn các chuỗi peptid có đầu C và đầu N tự do để tạo điều kiện cho các
exoprotease hoạt động [23].
Tuy nhiên, tác dụng của các protease rất phức tạp, bản chất của các mạch
nhánh của acid amin ở bên cạnh các liên kết peptid có ảnh hƣởng mạnh đến hoạt
động của các enzyme. Trên thực tế, các protease rất đặc hiệu và tỷ lệ những liên kết
peptid trong một phân tử protein bị bẻ gãy bởi một protease là không cao [27].
Hiện nay, các enzyme protease đã đƣợc thƣơng mại hóa nhƣ enzyme
Alcalase, Flavourzyme, Protamex, Neutrase …
Enzyme Alcalase.
Năm 1947, Linderstrom, Lang và Ottesen tại phòng thí nghiệm Carlsberg đã
tiến hành nuôi cấy Bacillus licheniformis và thu đƣợc loại enzyme Subtilisin
Carlsberg. Nó đƣợc thu lần đầu tiên ở dạng kết tinh vào năm 1952 và từ đó đến nay,

subtilisin là protease vi sinh vật công nghiệp quan trọng nhất, đƣợc sử dụng nhiều
trong sản xuất các chất tẩy rửa. Subtilisin là một nhóm enzyme protease kiềm
(serine protease) và Alcalase là một dẫn xuất thuộc nhóm này đã đƣợc thƣơng mại
hóa. Điều kiện hoạt động tối ƣu của Alcalase là ở khoảng pH hơi kiềm. Một số
nghiên cứu cho thấy enzyme Alcalase hoạt động tối ƣu ở pH = 8, nhiệt độ 50 –
60
0
C [29]. Alcalase đƣợc xếp vào nhóm endoprotease, nó bị bất hoạt ở điều kiện pH
thấp.
Enzyme Flavourzyme.
Flavourzyme là peptidase mang cả hai hoạt tính endo và exoprotease
(aminopeptidase), đƣợc sản xuất từ quá trình lên men chìm loài Aspergillus oryzae.
Enzyme này hoạt động thủy phân protein trong điều kiện trung tính hoặc acid yếu.

9
Điều kiện hoạt động tối ƣu của Flavourzyme 500 L là pH 5 – 7, nhiệt độ khoảng
50
0
C. Flavourzyme 500 L có hoạt tính 500 L APU/g. Flavourzyme có thể bị ức chế
hoạt động ở 90°C trong 10 minutes hoặc 120°C trong 5 giây [21].
1.3.2. Ứng dụng của enzyme protease.
Ngày nay, cùng với sự phát triển của các ngành công nghiệp, nông nghiệp, y
học… thì enzyme protease đƣợc ứng dụng khá rộng rãi nhất là trong ngành công
nghiệp thực phẩm.
Quá trình thủy phân protein có thể đƣợc tiến hành bằng cách sử dụng đơn
enzyme hoặc kết hợp nhiều enzyme, tuy nhiên hiệu quả của quá trình thủy phân khi
sử dụng đơn enzyme không đƣợc tốt. Vì vậy, sự kết hợp các hệ enzyme
endoprotease và exoprotease khác nhau đƣợc tiến hành. Việc bổ sung endoprotease
trong giai đoạn đầu của quá trình sẽ làm tăng số lƣợng chuỗi peptid do đó tăng số
lƣợng đầu C và đầu N tận cùng để các exoprotease hoạt động [27]. Hơn nữa, sau khi

thêm endoprotease, pH của dung dịch phản ứng sẽ giảm chậm từ giá trị pH ban đầu
là 8,5 xuống gần 7 đây là pH thích hợp của các exopeptidase, sau 24 giờ thủy phân
bằng exopeptidase, giá trị pH của dịch thủy phân giảm còn 6,5 [21].
Khi thủy phân một enzyme, hiệu suất thƣờng đạt không cao do enzyme đó
chỉ mang một trong hai đặc tính hoặc là exo hoặc là endoprotease. Theo nghiên cứu
của Adriena Drya´kova (2010) khi sử dụng một enzyme để thủy phân protein sữa
chua trong 4 loại enzyme đƣợc sử dụng là Alcalase, Neutrase, Protamex và
Flavourzyme thì Flavourzyme cho hiệu quả thủy phân cao nhất với DH đạt đƣợc
tƣơng ứng là 37% điều đó đã chứng tỏ ƣu thế vƣợt trội khi enzyme mang bản chất
exoprotease [15].
Nhƣ vậy việc kết hợp nhiều enzyme để thủy phân protein là có triển vọng.
Theo Chulaporn Kamnerdpetch và cộng sự (2007) [21], trong quá trình thủy phân
bột khoai tây, Alcalase hoặc Flavourzyme thích hợp để thủy phân hơn novo – pro D
hoặc corolase . Tuy nhiên độ thủy phân đạt cao nhất chỉ đạt 22%, (đối với mẫu sử
dụng Flavourzyme). Báo cáo cũng chỉ ra rằng, việc sử dụng kết hợp endoprotease

10
Alcalase hoặc novo – pro D và exopeptidase Flavourzyme cho hiệu quả thủy phân
tốt hơn khi sử dụng đơn enzyme. Độ thủy phân đạt cao nhất 44% khi sử dụng phối
hợp Alcalase và Flavourzyme (2% Alacalse (v/w) + 5% Flavourzyme (w/w)). Hơn
nữa, hàm lƣợng amino acid trong dịch thủy phân đạt rất cao, đặc biệt là các acid
amin thiết yếu (His, Phe, Trp and Tyr) và acid amin chứa lƣu huỳnh methionine
(Met)[21].
1999, Javier Vioque và cộng sự đã tiến hành thủy phân Rapeseed Protein, kết
quả cho thấy rằng, nếu chỉ sử dụng Alcalase thì độ thủy phân đạt tối đa là 27%, tuy
nhiên khi ông tiến hành ủ Alcalase trong 60 phút rồi cho tiếp Flavourzyme vào và ủ
tiếp 2 giờ, độ DH đạt tối đa là 60% [28].
Việc sử dụng hai enzyme Alcalase và Flavourzyme cũng đã đƣợc Cristina
Megías (2009) ứng dụng trên sunflover protein. Theo Cristina Megías sau khi thủy
phân Alcalase 60 phút, DH đạt 27%, tuy nhiên, nếu dùng cả hai loại enzyme

Alcalase và Flavourzyme thì sau 2 giờ thủy phân DH có thể đạt > 66% [19].
Theo Hee Jeong Chae (1998), sử dụng kết hợp 3 enzyme Neutrase, Alcalase
và Flavourzyme để thủy phân protein sẽ cho độ thủy phân cao hơn khi sử dụng kết
hợp hai enzyme Alcalase và Flavourzyme. Theo tác giả này, độ thủy phân đạt cao
nhất khi sử dụng kết hợp 3 enzyme là 51% trong khi đó giá trị DH chỉ đạt 47 % khi
sử dụng hai enzyme [26].
Đối với phế liệu protein tôm, việc ứng dụng enzyme để tách protein trong
quá trình sản suất chitin đã đƣợc quan tâm từ lâu. Tuy nhiên, các nghiên cứu chỉ
dừng lại ở hƣớng nghiên cứu đơn enzyme để tách protein. Do vậy việc ứng dụng
phƣơng pháp kết hợp đa enzyme trong quá trình tách protein tôm là một hƣớng mới
cần đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều hơn trong thời gian đến.
Enzyme protease đƣợc dùng để thủy phân protein trong sản xuất chitin,
astaxanthin, bột đạm… Phần lớn phế liệu tôm tại Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới
hiện nay chủ yếu đƣợc sử dụng để sản xuất chitin – chitosan, một ứng dụng có ý
nghĩa lớn. Công nghệ sản xuất chitin - chitosan còn đang gặp nhiều bất cập khi các

11
quy trình sản xuất chitin - chitosan quy mô lớn tại Việt Nam chủ yếu là quy trình
hóa học. Việc sử dụng hóa chất với nồng độ cao dẫn đến lƣợng chitin - chitosan thu
đƣợc chƣa cao và nhiều tạp chất. Mặt khác các quy trình này chỉ tập trung vào việc
thu nhận chitin – chitosan chƣa chú trọng đến việc tận thu các sản phẩm khác của
phế liệu tôm nhƣ protein, chất màu. Các hóa chất và chất hữu cơ chƣa đƣợc tận thu
thải ra gây ô nhiễm môi trƣờng.
Việc kết hợp enzyme protease trong quá trình sản xuất chitin - chitosan có ƣu
thế hơn so với phƣơng pháp hóa học truyền thống. Nó giảm thiểu lƣợng hóa chất sử
dụng và thải ra môi trƣờng. Mặt khác, quy trình cải tiến với sự vƣợt trội về chất
lƣợng chitin - chitosan thu đƣợc và thu hồi sản phẩm protein - astaxanthin có giá trị
dinh dƣỡng và sinh học, làm hạn chế các chất hữu cơ chứa trong nƣớc thải, giảm
thiểu chi phí xử lý môi trƣờng. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc giải quyết
vấn đề ô nhiễm môi trƣờng trầm trọng do các cơ sở chế biến chitin - chitosan gây

ra, góp phần phát triển bền vững ngành công nghiệp sản xuất chitin - chitosan từ
phế liệu thủy sản. Đây là một hƣớng đi cho phƣơng pháp sản xuất sạch hơn. Bên
cạnh đó, việc kết hợp sinh học và hóa học còn đảm bảo vấn đề giá thành sản xuất
hợp lý, cơ hội cho mở rộng sản xuất với quy mô lớn. Chitin - chitosan thu đƣợc có
chất lƣợng cao hơn so với phƣơng pháp hóa học, đặc biệt là độ nhớt và phân tử
lƣợng. Đồng thời, giảm hơn 50% lƣợng hóa chất sử dụng so với phƣơng pháp hóa
học truyền thống.
Enzyme protease còn dùng để thủy phân phế liệu cá để sản xuất phế phẩm
dẫn mùi giàu đạm dùng trong thức ăn nuôi tôm, cá hạn chế ô nhiễm môi trƣờng.
Với công nghệ sản xuất đơn giản sử dụng chất xúc tác enzyme của vi khuẩn đã phân
lập đƣợc bổ sung vào phế liệu thủy sản (đầu, xƣơng cá), chúng sẽ tự tách phần thịt
ra khỏi xƣơng. Với phần thịt đƣợc cô đặc giàu chất đặc giàu chất đạm trộn với thức
ăn cho tôm, phần xƣơng đƣợc làm sạch, sấy khô, nghiền thành bột dùng cho chăn
nuôi gia súc. Biện pháp không những xử lý ngay đƣợc chất thải rắn với chi phí thấp,
mà còn mang lại hiệu quả kinh tế từ việc sản xuất ra thức ăn dùng cho chăn nuôi
đƣợc ngƣời tiêu dùng chấp nhận.

12
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc.
1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc.
Các nhà nghiên cứu trên thế giới từ lâu đã quan tâm đến lĩnh vực nghiên cứu
sản xuất chitin – chitosan, protein và carotenoid từ phế liệu tôm bằng nhiều phƣơng
pháp nhƣ phƣơng pháp hóa học, phƣơng pháp sinh học hay kết hợp giữa phƣơng
pháp hóa học và sinh học.
Quá trình sản xuất chtin – chitosan theo phƣơng pháp hóa học diễn ra theo
các bƣớc sau:
Nguyên liệu → xử lý acid (khử khoáng)→ xử lý kiềm (khử protein và
deaceatyl) → sản phẩm (có độ deaceatyl khác nhau)
Quy trình sản xuất chitosan của Pháp [6].

13

Hình 1.1. Quy trình sản xuất chitin của Pháp.
Quy trình sản xuất này rút ngắn đƣợc thời gian sản xuất rất nhiều. Sản phẩm
thu đƣợc rất sạch có màu trắng đẹp do đã khử đƣợc sắc tố triệt để. Tuy nhiên
NaOCl là một chất oxy hóa mạnh nên ảnh hƣởng đến mạch polymer làm cho độ
Vỏ tôm
Hấp chín, phơi khô
Xay nhỏ
Tách protein
Rửa trung tính
Ngâm HCl
Ngâm aceton
Ngâm NaOCl
Rửa trung tính
Deacetyl chitin
Rửa trung tính
NaOH 40%
Nhiệt độ = 85
0
C
Thời gian 4 giờ
w/v = 1/4
NaOH 3,5%
Nhiệt độ = 65
0
C
Thời gian 2h
w/v = 1/10
HCl 1N

Nhiệt độ phòng
Thời gian 2 h
w/v =1/10
NaOCl 0,135%
Nhiệt dộ phòng
Thời gian 6 phút
w/v = 1/10
Chitosan


14
nhớt của sản phẩm giảm rõ rệt. Mặt khác, aceton rất đắt tiền, tổn thất nhiều, giá
thành sản phẩm cao.
Tách chiết chitin bằng phƣơng pháp hóa học tuy có ƣu điểm nhƣ đơn giản,
hiệu quả, dễ triển khai ở qui mô lớn. Tuy nhiên, phƣơng pháp hóa học cũng có một
số nhƣợc điểm nhƣ xử lý bằng acid và kiềm ở nồng độ cao, thời gian dài dẫn đến
chất lƣợng sản phẩm chitin, chitosan thu đƣợc có độ nhớt và phân tử lƣợng thấp,
đồng thời sản phẩm có thể còn chứa tạp chất hóa học, chƣa tận thu nguồn protein và
astaxanthin có giá trị để ứng dụng trong chế biến thức ăn. Bên cạnh đó, lƣợng hóa
chất thải ra từ qui trình sản xuất là rất lớn, gây ô nhiễm môi trƣờng. Vì vậy, việc hạn
chế sử dụng hóa chất, cải tiến công nghệ theo hƣớng thân thiện môi trƣởng, ứng
dụng công nghệ sinh học trong chế biến chitin - chitosan là xu thế hiện nay nhằm
nâng cao chất lƣợng chitin, chitosan, tận thu các thành phần có giá trị phi chitin
(protein và astaxanthin,…), giảm thiểu chất thải hóa học, góp phần phát triển bền
vững ngành công nghiệp chế biến chitin.
Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto (2006) [25].

15

Hình 1.2. Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto.

Quy trình này có ƣu điểm là rút ngắn đƣợc thời gian sản xuất rất nhiều. Sản
phẩm chitin thu đƣợc cho chất lƣợng khá tốt, màu trắng đẹp do đã đƣợc khử sắc tố
trong công đoạn chiết astaxanthin. Ngoài ra còn tận thu đƣợc protein và astaxanthin
mang lại hiệu quả kinh tế cao, đồng thời giảm thiểu đƣợc lƣợng hóa chất sử dụng.
Synowiecki và cộng sự (2000) nghiên cứu ứng dụng Alcalase để khử protein
của phế liệu vỏ tôm Cangon cangon thu hồi chitin - protein. Ban đầu vỏ tôm
Cangon cangon đƣợc khử khoáng sơ bộ bằng dung dịch HCl 10% ở 20
0
C trong 30
Phế liệu tôm
Khử protein bằng enzyme
Alcalase
Ly tâm (4
0
C, 15 phút)
Phần bã
Chiết astaxanthin bằng dầu
nành và hỗn hợp dung môi
Rửa trung tính
Khử khoáng HCl 2,5%, 2h,
t
0
phòng
Chitin
Sấy khô (60
0
C, 16h)
Sấy lạnh
Bột protein
Phần dịch nổi phía trên

pH = 8,5
t
0
= 55
0
C
tỷ lệ enzyme/ nguyên liệu: 3%
w/v = 1/1

16
phút và khử protein bởi enzyme thƣơng mại Alcalase ở 55
0
C và pH 8,5. Độ thủy
phân cao nhất 30% và dịch thủy phân thu đƣợc chứa 63% protein so với vật chất
khô [34].
Nghiên cứu của Synowiecki và Al-Khateeb (2001) cho rằng enzyme tốt nhất
cho việc phân tách carotenoprotein là Trypsin. Phƣơng pháp enzyme lấy đi khoảng
90% protein và carotenoid từ phế liệu tôm. Protease nội tại thích ứng với nhiệt độ
thấp rất hữu ích cho quá trình xử lý vỏ phế liệu giáp xác, phƣơng pháp trên dựa trên
việc kiểm soát tự động sự phân giải protein. Sản phẩm đó thu đƣợc có chứa khoảng
4,5% carotenoid, đây cũng là nguồn hợp chất tốt để tạo màu đẹp cho cá hồi và lòng
đỏ trứng gà. Việc xử lý sơ bộ phế liệu giáp xác bằng enzyme protease thƣơng mại
còn tăng hàm lƣợng carotenoid khoảng 58% [35].
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc.
Đối với phế liệu tôm thì các ngiên cứu trong nƣớc từ trƣớc tới nay chủ yếu
tập trung ở các lĩnh vực thu hồi, tách chiết và ứng dụng chitin, chitosan. Gần đây,
do sự cập nhật những thông tin khoa học mới về chitin – chitosan cũng nhƣ nhu cầu
thị trƣờng tăng mạnh, đã thúc đẩy các nhà khoa học trong nƣớc nghiên cứu hoàn
thiện quy trình tách chiết chitin – chitosan, đồng thời mở rộng những ứng dụng của
chúng trong đời sống.

Các quy trình tách chiết chitin, chitosan phần lớn là các quy trình hóa học,
trong đó, ở mỗi công đoạn đều tiến hành xử lý bằng các loại hóa chất phù hợp (điều
kiện xử lý phụ thuộc vào loại nguyên liệu và yêu cầu về chất lƣợng sản phẩm muốn
thu nhận). Thời gian gần đây, để cải tiến quy trình sản xuất chitin – chitosan với tiêu
chí giảm thiểu lƣợng hóa chất sử dụng và nâng cao chất lƣợng sản phẩm thu hồi, đã
xuất hiện một số đề tài nghiên cứu về việc ứng dụng enzyme protease trong quy
trình sản xuất. Chẳng hạn nhƣ sử dụng các loại enzyme Papain, Flavourzyme,
Alcalase để khử protein trong quy trình sản xuất chitin (Trần Thị Luyến, 2000;
Trang Sĩ Trung, 2008).
TS. Trang Sỹ Trung [12] đã nghiên cứu quy trình sản xuất chitin bằng
phƣơng pháp kết hợp sinh học và hóa học có thể tận thu protein làm bột dinh

17
dƣỡng, thức ăn cho gia súc, các chất khác nhƣ lipid và astaxanthin cũng đƣợc thu
hồi trong quá trình sản xuất, giảm lƣợng hóa chất sử dụng và đặc biệt giảm lƣợng
chi phí lớn cho công ty xử lý ô nhiễm môi trƣờng. Quy trình sản xuất nhƣ sau:

Hình 1.3. Quy trình sản xuất Chitin của TS. Trang Sỹ Trung, trƣờng
Đại học Nha Trang.
Từ quy trình sản xuất cho thấy, thời gian để cho ra sản phẩm ngắn (khoảng
30 giờ), nồng độ hóa chất sử dụng thấp (NaOH 2%, HCl 4%), nhiệt độ thấp (50
0
C
trong quá trình thủy phân bằng enzyme và ở nhiệt độ thƣờng với việc sử dụng hóa
chất). Bên cạnh đó lại có thể tận thu protein và astaxanthin góp phần làm tăng hiệu
Xay nhỏ
Phế liệu vỏ đầu tôm
Khử protein bằng enzyme
Flavourzyme
Thu dịch protein-astaxanthin

Khử protein còn lại bằng
NaOH loãng
Rửa trung tính
Khử khoáng bằng HCl
Rửa trung tính
pH = 6,5
thời gian 6 giờ
nhiệt độ 50
0
C
enzyme/phế liệu : 0,1% (v/w)
Thời gian 12 giờ
Nhiệt độ phòng
NaOH 2%
Thời gian 6 giờ
Nhiệt độ phòng
HCl 4%
Chitin

18
quả kinh tế và giảm tác nhân gây ô nhiễm môi trƣờng cung với giảm một lƣợng
đáng kể nồng độ của những hóa chất độc hại gây tác động xấu cho chitin và môi
trƣờng. Do đó, chất lƣợng chitin thu đƣợc rất cao và hiệu quả kinh tế thu đƣợc cũng
cao. Từ đây, mở ra một hƣớng nghiên cứu cho các nhà khoa học để có thể sản xuất
ra chitin chất lƣợng cao và có thể thân thiện với môi trƣờng có thể ứng dụng trong
sản xuất ở quy mô công nghiệp.
Ngoài việc sử dụng nguồn phế liệu tôm để sản xuất chitin và chitosan nhƣ đã
trình bày, một số nghiên cứu trong nƣớc gần đây cũng tập trung vào quy trình tách
chiết các sắc tố carotenoid (chủ yếu là astaxanthin). Năm 1995, Nguyễn Văn Ngoạn
đã nghiên cứu thu hồi astaxanthin từ phế liệu tôm ở quy mô phòng thí nghiệm. Quy

trình sử dụng nguyên liệu đầu và vỏ tôm tƣơi, trải qua các công đoạn: khử protein,
khử khoáng và thu hồi astaxanthin bằng dung môi acetone. Quy trình này đã bƣớc
đầu cho phép kết hợp thu hồi cả protein, astaxanthin và chitin. Bên cạnh đó (năm
2000) Nguyễn Thái Uyên, Mai Hoàng Dũng lại chiết xuất carotenoid từ vỏ tôm
bằng cách sử dụng cồn 96
0
(thời gian chiết trong 7 -10 ngày). Dịch chiết sau đó
đƣợc cô cạn thành bột sệt màu cam và trộn vào thức ăn nuôi tôm, cá cảnh để nghiên
cứu khả năng tạo màu của hỗn hợp này. Đề tài “Xây dựng quy trình chiết xuất
astaxanthin từ vỏ tôm” (Hoàng Thị Huệ An, 2002) đã trình bày phƣơng pháp tách
chiết astaxanthin bằng cách kết hợp cồn và ether dầu mỏ. Sản phẩm astaxanthin thu
đƣợc có thể dùng làm phụ gia trong chế biến thức ăn nuôi tôm, cá (dƣới dạng dầu
astaxanthin cô đặc hay bột màu astaxanthin).
Nhìn chung, các nghiên cứu nói trên chỉ mới tập trung thu hồi từng hợp chất
một cách riêng lẽ; đặc biệt là đối với protein và astaxanthin, có rất ít những nghiên
cứu về quy trình thu hồi chúng dƣới dạng phức hợp carotenoprotein. Điều này làm
giảm tính bền vững của astaxanthin khi astaxanthin đƣợc thu hồi ở dạng phân tử tự
do.
Trần Lê Minh (2010) [8] với đề tài : “So sánh khả năng thủy phân protein
của 3 loại enzyme protease thƣơng mại: Alcalase, Flavourzyme và Protamex trong
quá trình thu nhận phức hợp carotenoprotein từ phế liệu đầu tôm” cho thấy khi sử

19
dụng Alcalase và Protamex (có hoạt tính endoprotease) thì hiệu suất thu hồi của 2
enzyme này cao hơn Flavourzyme (có hoạt tính exoprotease). Với enzyme Alcalase
hiệu suất thu hồi protein và astaxanthin lần lƣợt là 12,6% và 52,5% với tỉ lệ
nƣớc/phế liệu là 1/1; tỉ lệ enzyme/phế liệu là 1%; thời gian thủy phân là 1 giờ; pH
tự nhiên trong khoảng 6,0 – 6,5. Enzyme Protamex với hiệu suất thu hồi protein và
carotenoid lần lƣợt là 22,5% và 52,3% trong điều kiện tỉ lệ nƣớc/phế liệu là 1/1; tỉ lệ
enzyme/phế liệu là 0,5%; thời gian thủy phân là 1 giờ; pH tự nhiên trong khoảng

6,0 – 6,5. Enzyme Flavourzyme với hiệu suất thu hồi protein và carotenoid lần lƣợt
là 35,0% và 45,7% trong điều kiện tỉ lệ nƣớc/phế liệu là 1/1; tỉ lệ enzyme/phế liệu là
1%; thời gian thủy phân là 1,5 giờ; pH tự nhiên trong khoảng 6,0 – 6,5.














20
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu:
2.1.1Nguyên liệu đầu tôm:
Đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) đƣợc lấy tại phân xƣởng chế
biến Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17). Nguyên liệu sau khi lấy đƣợc vận
chuyển ngay bằng thùng xốp cách nhiệt (<5
0
C) về phòng thí nghiệm. Phế liệu đầu
tôm trƣớc khi sử dụng đƣợc rửa sạch, để ráo. Trong trƣờng hợp chƣa thí nghiệm
ngay thì bao gói bảo quản đông trong điều kiện nhiệt độ - 20
0
C tại phòng thí

nghiệm Viện Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng.
2.1.2. Enzyme Alcalase
Enzyme Alcalase 2.4 L (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark). Là protease
của Bacillus licheniformis với hoạt tính endopeptidase.
Nhiệt độ bảo quản tốt nhất 0 - 10
0
C.
Điều kiện hoạt động tốt nhất của enzyme Alcalase là:
-Nhiệt độ từ 50 – 60
0
C.
-pH = 8.
2.1.3. Enzyme Flavourzyme.
Enzyme Flavourzyme 500 L đƣợc sản xuất từ quá trình lên men chìm loài
Aspergillus oryzae. Flavourzyme là peptidase mang cả hai hoạt tính endo và
exoprotease.
Nhiệt độ bảo quản tốt nhất 0 - 10
0
C.
Điều kiện hoạt động tốt nhất của enzyme Flavourzyme là:
-Nhiệt độ từ 50 – 55
0
C.
-pH từ 5 – 7.