Tổng hợp cơ chất, chế tạo kít và nghiên cứu điều kiện tối ưu để nhuộm tế bào phục vụ chẩn đoán bệnh ung thư bạch cầu

1
Tổng hợp cơ chất, chế tạo kít và
nghiên cứu điều kiện tối ưu để
nhuộm tế bào phục vụ chẩn
đoán bệnh ung thư bạch cầu

Trần Văn Tính

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận án TS ngành: Hóa học hữu cơ; Mã số: 62 44 27 01
Người hướng dẫn: PGS.TSKH. Lưu Văn Bôi, GS.TS.
Nguyễn Anh Trí
Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Nghiên cứu tổng hợp các 3-hiđroxi-(N-
thế)naphtalen-2-cacboxamit làm nguyên liệu điều
chế cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu
người. Nghiên cứu tổng hợp các este 3-(N-thế-
cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat làm cơ chất
nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người. Xác định
cấu trúc của các hợp chất điều chế được bằng các
phương pháp vật lý và hóa lý hiện đại (Phổ IR, 1H-
NMR và MS) và nghiên cứu mối tương quan giữa
độ nhạy của phản ứng nhuộm esteraza với cấu trúc
phân tử cơ chất bằng phương pháp tính hóa lượng
tử. Nghiên cứu sử dụng este 3-(N-thế-
cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat để nhuộm
esteraza đặc hiệu bạch cầu người và tìm kiếm cơ
chất mới có độ đặc hiệu và độ nhạy cao. Nghiên cứu

2
ảnh hưởng hiệu ứng electron các nhóm thế X, hiệu
ứng không gian của các gốc N-hiđrocacbon nhóm
amit thế và các gốc cacboxylat trong phân tử cơ chất
đến độ nhạy và độ đặc hiệu đối với phản ứng nhuộm
esteraza. Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm
bằng phương pháp đơn hình và ứng dụng để chế tạo
bộ kít nhuộm esteraza dùng phân loại dòng tế bào
trong bệnh bạch cầu người từ cơ chất tổng hợp được.

Keywords: Hóa hữu cơ; Tổng hợp cơ chất; Chế tạo
kit; Nhuộm tế bào; Ung thư bạch cầu

Content
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay việc phân loại dòng tế bào ung thư máu theo
tiêu chuẩn của các nhà khoa học Pháp, Mỹ và Anh (gọi tắt
là tiêu chuẩn FAB) chủ yếu dựa trên kết quả của ba phương
pháp: đánh dấu, miễn dịch và nhuộm hóa học tế bào.
Nhuộm esteraza đặc hiệu là một trong những phương pháp
phổ biến để phân biệt ung thư bạch cầu dòng tuỷ với các
dòng tế bào khác trong bệnh máu ác tính. Naphtol AS-D
cloaxetat là một cơ chất được sử dụng rộng rãi để nhuộm
esteraza đặc hiệu do có độ nhạy và độ đặc hiệu cao đối với
tế bào bạch cầu dòng tuỷ so với các cơ chất khác. Ngoài ra
naphtol AS-D cloaxetat còn dùng để phân biệt nhiều loại
đối tượng khác như vi khuẩn từ sa khoáng biển, khuẩn cầu
tách từ huyết thanh nhiễm HIV… Tuy nhiên, có nhiều khó
khăn khi sử dụng naphtol AS-D cloaxetat để nhuộm tế bào.

Một là, cho đến nay việc tổng hợp nguyên liệu đầu vẫn
thực hiện theo phương pháp truyền thống nên hiệu suất

3
thấp; thứ hai, kết quả nhuộm chênh lệch so với phương
pháp di truyền và miễn dịch còn cao (~29%); thứ ba, là cơ
chất dễ phân hủy khi nhiệt độ >-20
0
C, khó khăn trong vận
chuyển và bảo quản. Vì vậy, nghiên cứu sử dụng phương
pháp tiên tiến để tổng hợp cơ chất mới có hoạt tính cao và
giá thành rẻ hơn nhằm sản xuất kít nhuộm esteraza tế bào
bạch cầu ở Việt Nam, phục vụ việc khám và chữa bệnh cho
cộng đồng là đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và kinh
tế - xã hội cấp thiết.
2. Mục đích nghiên cứu
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là ứng dụng phương
pháp mới, hiệu quả cao để tổng hợp cơ chất; khảo sát một
cách có hệ thống mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính để
tìm kiếm cơ chất mới có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn;
tối ưu hóa các điều kiện nhuộm nhằm giảm sự chênh lệch
và chế tạo bộ kít nhuộm esteraza để phân loại tế bào phục
vụ việc khám và điều trị bệnh ung thư máu.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của luận án
1- Nghiên cứu tổng hợp các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-
cacboxamit làm nguyên liệu điều chế cơ chất nhuộm
esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu người.
2- Nghiên cứu tổng hợp các este 3-(N-thế-
cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat làm cơ chất
nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người.

3- Xác định cấu trúc của các hợp chất điều chế được bằng
các phương pháp vật lý và hóa lý hiện đại (Phổ IR,
1
H-
NMR và MS) và nghiên cứu mối tương quan giữa độ
nhạy của phản ứng nhuộm esteraza với cấu trúc phân tử
cơ chất bằng phương pháp tính hóa lượng tử.

4
4- Nghiên cứu sử dụng este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-
2-yl cacboxylat để nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu
người và tìm kiếm cơ chất mới có độ đặc hiệu và độ
nhạy cao.
5- Nghiên cứu ảnh hưởng hiệu ứng electron các nhóm thế
X, hiệu ứng không gian của các gốc N-hiđrocacbon
nhóm amit thế và các gốc cacboxylat trong phân tử cơ
chất đến độ nhạy và độ đặc hiệu đối với phản ứng nhuộm
esteraza.
6- Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm bằng phương
pháp đơn hình và ứng dụng để chế tạo bộ kít nhuộm
esteraza dùng phân loại dòng tế bào trong bệnh bạch cầu
người từ cơ chất tổng hợp được.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
- Đã nghiên cứu tìm được điều kiện thích hợp để điều chế
các nguyên liệu đầu 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-
cacboxamit bằng phương pháp truyền thống và phương
pháp sử dụng kỹ thuật vi sóng.
- Đã nghiên cứu cải tiến quy trình phản ứng giữa 3-hiđroxi-
(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit với các caboxylic
cloanhiđrit và đã tổng hợp được các hợp chất 3-(N-thế-

cacbamoyl)naphtalen-2-yl-cacboxylat có hoạt tính với
esteraza đặc hiệu bạch cầu người.
- Đã nghiên cứu một cách có hệ thống và xác định được ảnh
hưởng của hiệu ứng electron các nhóm thế X, yếu tố không
gian của các gốc N-hiđrocacbon nhóm amit thế và của các
gốc cacboxylat lên hoạt tính nhuộm esteraza đặc hiệu bạch
cầu người.
- Đã khảo sát có hệ thống phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu
bạch cầu người bằng các hợp chất 3-(N-thế)naphtalen-2-yl-
cacboxylat và đã xác định được cơ chất mới có độ nhạy
cao hơn cơ chất naphtol AS-D cloaxetat của hãng Sigma

5
bán trên thị trường.
- Đã tiến hành nghiên cứu kế hoạch hóa thực nghiệm theo
phương pháp đơn hình và tìm được điều kiện tối ưu sản
xuất kít nhuộm esteraza để phân loại dòng tế bào bệnh
bạch cầu cấp.




5. Điểm mới của luận án
- Đã nghiên cứu sử dụng kỹ thuật mới hiệu quả cao là
phương pháp lò vi sóng để tổng hợp 16 3-hiđroxi-(N-
thế)naphtalen-2-cacboxamit, trong đó có 3 chất mới.
- Đã nghiên cứu cải tiến quy trình phản ứng giữa các 3-
hiđroxi- (N-thế)naphtalen-2-cacboxamit với cacboxylic
cloanhiđrit. Kết quả đã tổng hợp được 38 dẫn xuất 3-(N-
thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl-cacboxylat, trong đó có 36

chất mới.
- Trên cơ sở nghiên cứu ảnh hưởng của hiệu ứng electron,
hiệu ứng không gian và các gốc nhị diện của nhóm
cacboxyl lên độ đặc hiệu, độ nhạy của cơ chất đối với
phản ứng nhuộm esteraza, đã xác định được: Các nhóm
thế đẩy cho điểm nhuộm cao hơn các nhóm thế hút điện
tử, các nhóm thế hút điện tử ở vị trí octo- cho điểm nhuộm
cao hơn vị trí para Điểm nhuộm cao nhất thuộc về các
gốc N-hiđrocacbon amit thế và các nhóm cacboxylat kích
thước trung bình. Các góc nhị diện của nhóm cacboxyl có
ảnh hưởng quan trọng đối với độ chọn lọc của esteraza
trong phản ứng thủy phân gốc este và độ nhạy của cơ chất.
-

Đã điều chế được naphtol AS-OL

-clopropionat làm cơ chất
mới có độ đặc hiệu tương đương, nhưng độ nhạy cao hơn

6
1,188 lần so với naphtol AS-D cloaxetat của hãng Sigma
cung cấp với giá thành chỉ bằng 20%.
- Đã chế tạo thành công kít nhuộm esteraza đặc hiệu bạch
cầu người sử dụng cơ chất mới naphtol AS-OL -
clopropionat; kết quả kiểm định trên máu của người bình
thường ở Viện Huyết học-Truyền máu trung ương và tủy
bệnh nhân bị bệnh máu đã phân loại dòng tế bào cho thấy:
bộ kit chế tạo được có tính đặc hiệu tương đương với sản
phẩm của hãng Sigma, nhưng độ nhạy cao hơn 1,188 lần,
được khuyến cáo đưa vào sản xuất thay thế sản phẩm

nhập ngoại.
6. Bố cục của luận án
Luận án gồm 135 trang, trong đó có 21 hình vẽ, đồ thị,
41 bảng biểu, chưa kể 129 trang phụ lục và 115 tài liệu
tham khảo. Ngoài phần mở đầu và kết luận, luận án chia
làm ba chương; chương I – Tổng quan tài liệu, gồm 24
trang; chương II – Thực nghiệm, gồm 22 trang và chương
III – Kết quả và bàn luận, gồm 76 trang, Kết luận và kiến
nghị 2 trang.
Liên quan đến nội dung luận án đã đăng 1 bài trên Tạp
chí Thông tin y dược, 3 bài báo trên Tạp chí hóa học (Viện
KH&CN Việt Nam), 1 bài trên Tạp chí Khoa học (ĐHQG
Hà Nội) và đã đăng ký 1 bằng sáng chế (Cục sở hữu trí tuệ
Bộ KH&CN).
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Hóa học các hợp chất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-
cacboxamit
Đã tổng kết các kết quả đạt được trong việc điều
chế, nghiên cứu tính chất và ứng dụng của các hợp chất 3-
hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit có cấu trúc như
sau:

7
2
3
1
4
6
5
7

8
NH
R
1
OH
O
9
10

R
1
= xiclohexyl, 1-naphtyl, 1-antraxyl và X-C
6
H
4
-;
trong đó X = o- và p-ankyl, o- và p-Hal, o- và p-NO
2

1.1. Các phương pháp điều chế
Các hợp chất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-
cacboxamit chủ yếu được điều chế bằng hai phương pháp
truyền thống, gồm:
a) Phương pháp trực tiếp một giai đoạn
OH
O
OH
+
NH
2

PCl
3
/SOCl
2
OH
O
NH

b) Phương pháp gián tiếp hai giai đoạn
COOH
OH
+ SOCl
2
COCl
OH
- SO
2
COCl
OH
+
NH
2
X
CONH
OH
X
1)
2)

3-Hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit điều chế theo các

phương pháp truyền thống mất nhiều thời gian, tốn năng lượng và
hiệu suất thấp (20-70%).
1.2. Tính chất của 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-
cacboxamit
Đã khái quát tính chất vật lý, tính chất phổ và các
tính chất hóa học chủ yếu của 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-
2-cacboxamit.
1.3. Ứng dụng của 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-
A

8
cacboxamit
3-Hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit được ứng
dụng chủ yếu trong hai lĩnh vực.
a) Làm phẩm màu: được tổng hợp bằng phản ứng
ghép đôi với muối điazo.
NH
O
OH
X
O
NH
X
2
X
3
N N
O
NH
OH

NN
X
2
X
3
NH
O
X

b) Làm cơ chất nhuộm hóa học tế bào.
Chương 2. THỰC NGHIỆM
2.1. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên
cứu.
2.2. Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng trong
luận án
- Phương pháp tổng hợp hữu cơ truyền thống;
- Phương pháp tổng hợp hữu cơ sử dụng lò vi sóng;
- Phương pháp Vật lý và Hóa lý xác định cấu trúc;
- Phương pháp kế hoạch hóa thực nghiệm và thống
kê xử lý số liệu;
- Phương pháp nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào và
phương pháp FAB phân loại dòng tế bào;
- Phương pháp tính toán Hóa lượng tử Gaussian
2003 khảo sát mối tương quan định lượng giữa hoạt tính và
cấu trúc.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

9
Mục tiêu đề ra của luận án được thực hiện bắt đầu từ
việc nghiên cứu phương pháp tổng hợp các chất 3-hiđroxi-

(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit làm nguyên liệu đầu để
điều chế các cơ chất 3-(N-thế)-naphtalen-2-yl-cacboxylat
dùng nhuộm tế bào bạch cầu.
3.1. Tổng hợp 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
Các hợp chất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-
cacboxamit có công thức chung như hình A trang 4, được
chia làm hai dãy:
1) Dãy 1: Naphtol AS-X.
R
1
= X-C
6
H
4
; x; X = o- và p-ankyl, o- và p-Hal, o- và p-
NO
2

2) Dãy 2: R
1
= xiclohexyl, phenyl, naphtyl, antraxyl,
được tổng hợp để nghiên cứu ảnh hưởng hiệu ứng không
gian lên phản ứng nhuộm esteraza tế bào bạch cầu.
3.1.1. Tổng hợp các naphtol AS-X bằng phương pháp
truyền thống
Đun hồi lưu hỗn hợp axit 3-hiđroxi-2-naphtoic, dẫn
xuất anilin và PCl
3
, theo tỷ lệ mol khác nhau, trong điều
kiện không dung môi ở 120-130

0
C và có dung môi
clobenzen ở 135
0
C, thời gian đến 2h. Phản ứng xảy ra theo
sơ đồ sau:
COOH
OH
NH
2
X
C
O
NH
OH
+
PCl
3
, T
0
C
X
Ia-l
h = 40-70%


10
X = o-CH
3
(Ia), p-CH

3
(Ib), o-Cl (Ic), p-Cl (Id), o-Br (Ie),
p-Br (If), o-NO
2
(Ig), p-NO
2
(Ih), o-OCH
3
(Ii), p-OCH
3
(Ij), o-COOCH
3
(Ik), p-COOCH
3
(Il)
Đã tìm được điều kiện thích hợp là: tỷ lệ mol axit 3-
hiđroxi-2-naphtoic : dẫn xuất anilin : PCl
3
= 1 : 1 : 0,3;
dung môi clobenzen; nhiệt độ 130
0
C và thời gian 2h. Ở
những điều kiện đó hiệu suất naphtol AS-X đạt 40-70%.
3.1.2. Tổng hợp các naphtol AS-X sử dụng lò vi sóng
Đã nghiên cứu sử dụng lò vi sóng để tổng hợp naphtol
AS-X. Quá trình phản ứng mô tả trên sơ đồ sau:
COOH
OH
NH
2

X
Clobenzen
C
O
NH
OH
I a-l
Microwave
PCl
3
,
+

Kết quả khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tác nhân, thời gian,
nhiệt độ, bản chất dung môi và chế độ làm việc của lò vi
sóng lên hiệu suất sản phẩm Ia-l cho thấy, điều kiện thích
hợp là: tỷ lệ mol axit 3-hiđroxi-2-naphtoic : dẫn xuất anilin
: PCl
3
= 1 : 1 : 0,3; thời gian 20 phút, nhiệt độ 130
0
C; dung
môi clobenzen; công suất lò 200w. Trong những điều kiện
đó, hiệu suất naphtol AS-X Ia-l đạt 80 - 90%.
Kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý và các dữ kiện
phổ được đưa ra trong bảng 3.4 và 3.5 (xem toàn văn luận
án).
Trên phổ IR của các naphtol AS-X Ia-l có các cực đại
hấp thụ đặc trưng cho dao động hoá trị các nhóm hiđroxyl-
νOH ở khoảng 3482 đến 3172 (liên kết hiđro) cm

-1
; nhóm

11
NH amit-νNH ở khoảng 3335 cm
-1
và nhóm cacbonyl amit-
νCONH ở khoảng 1693 - 1619 cm
-1
.
Trên phổ
1
H-NMR của các dẫn xuất naphtol AS-X có
cộng hưởng của các proton nhóm metyl-δCH
3
ở 2,30-2,34;
nhóm metoxi-δOCH
3
ở 2,77-2,92; nhóm metyl este-
δCOOCH
3
ở 3,87-3,85; các gốc phenyl và naphtyl-δArH ở
6,97-8,68 và 7,30-8,72; nhóm NH amit-δNH ở 10,50-11,82
và nhóm hiđroxyl- δOH ở 11,04-12,11 ppm.
Trên phổ MS, hầu hết các pic ion phân tử đều có cường
độ nhỏ hơn 50% (hình 3.4), chứng tỏ naphtol AS-X không
bền, rất dễ bị phân hủy dưới tác dụng chùm tia electron.
3.1.3. Tổng hợp 3-hiđroxi-N-
(xiclohexyl/phenyl/naphtyl/antraxyl)-naphtalen-2-
cacboxamit

3.1.3.1. Tổng hợp bằng phương pháp trực tiếp sử dụng
SOCl
2

Để khảo sát ảnh hưởng của tác nhân, đã tiến hành
phản ứng giữa axit 3-hiđroxi-2-naphtoic với SOCl
2,
tỷ lệ
mol 1 : 20 ở nhiệt độ phòng trong môi axetonitrin, tiếp theo
cho hỗn hợp tác dụng với dẫn xuất amin (từ 1-1,1 đương
lượng mol so với axit naphtoic). Quá trình phản ứng được
mô tả trên sơ đồ sau:
[CH
3
CN]
COOH
OH
1) SOCl
2
, 2) R
1
NH
2
CONHR
1
OH
1
2
3
45

6
7
8
IIa-d

R
1
=
,
,
,
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'

8'
1'
2'
3'
4'5'
6'
7'
8'
9' 10'
(IIa) (IIb) (IIc)
(IId)


12
Sau khi cất loại dung môi, trung hòa bằng NaOH rồi kết
tủa naphtol AS bằng dung dịch HCl, hiệu suất 3-hiđroxi-N-
(xiclohexyl/-phenyl/naphtyl/antraxyl)naphtalen-2-
cacboxamit (IIa-d) đạt gần 20%.
Để cải thiện hiệu suất, đã thực hiện phản ứng theo thứ tự
khác, hòa tan axit 3-hiđroxi-2-naphtoic và amin trong
axetonitrin, sau đó nhỏ giọt SOCl
2
và khuấy hỗn hợp phản
ứng trong thời gian khoảng 2h. Sau khi xử lý, thu được các
sản phẩm IIa-d với hiệu suất như trước.
3.1.3.2. Tổng hợp các hợp chất IIa-d bằng phương pháp
gián tiếp
Đã thực hiện phản ứng giữa axit 3-hiđroxi-2-naphtoic,
amin và SOCl
2

theo hai giai đoạn riêng biệt.
Giai đoạn 1: cho axit 3-hiđroxi-2-naphtoic tác dụng với
SOCl
2
trong ete dầu hỏa khoảng 4 h, sau đó cất loại dung
môi, đuổi SOCl
2
dưới áp suất thấp, thu naphtoyl clorua.
Phản ứng xảy ra như sơ đồ:
- SO
2
, - [Pyridin.HCl]
COOH
OH
1) SOCl
2
, 2) Pyridin
COCl
OH

Giai đoạn 2: cho naphtoyl clorua tác dụng với các
amin theo tỷ lệ mol 1 : 1,2 trong dung môi dioxan. Phản
ứng xảy ra như sau:
+
COCl
OH
R
1
NH
2

CONHR
1
OH
R
1
NH
2
.HCl
1
2
3
4
5
6
7
8
IIa-d

Sau khi xử lý, hiệu suất 3-hiđroxi-N-
(xiclohexyl/phenyl/naphtyl/-antraxyl)naphtalen-2-cacboxamit

13
(IIa-d) chỉ đạt tối đa 32%, thấp hơn mong đợi. Nguyên nhân
hiệu suất thấp có lẽ do một phần amin bị kết tủa dưới dạng
muối amoni hiđroclorua.
3.1.3.3. Tổng hợp IIa-d bằng phương pháp trực tiếp sử
dụng PCl
3

Đun hồi lưu hỗn hợp axit 3-hiđroxi-2-naphtoic, amin và

thay SOCl
2
bằng PCl
3
, theo tỷ lệ mol 1 : 1,1 : 0,3 trong
dung môi clobenzen trong 1-2 h. Phản ứng xảy ra theo sơ
đồ sau:

Sau khi xử lý, hiệu suất 3-hiđroxi-N-(xiclo-
hexyl/phenyl/naphtyl/-antraxyl)naphtalen-2-cacboxamit (IIa-
d) đạt đến 81%. Cần chú ý rằng, nếu đun trên 130
0
C, hiệu suất
sản phẩm bị giảm, có lẽ do phân hủy nhiệt.
3.1.3.4. Tổng hợp IIa-d bằng phương pháp sử dụng lò vi
sóng
Quá trình tổng hợp được tiến hành tương tự như với
các dẫn xuất anilin thế mô tả ở mục 3.1.2. Phản ứng xảy ra
theo sơ đồ sau:
COCl
OH
+
RNH
2
PCl
3
/Clobenzen
120
o
C, 20ph

CONHR
1
OH
Microwave
IIa-d
1
2
3
4
5
6
7
8

Kết quả tổng hợp được đưa ra trên bảng 3.7 cho
thấy, trừ trường hợp tác nhân là aniline, tạo sản phẩm IIb
có hiệu suất tương tự như naphtol AS-X, còn
COOH
OH
1) PCl
3
, 2) R
1
NH
2
CONHR
1
OH
1
2

3
45
6
7
8
Clobenzen, 130
0
C
IIa-d

14
xiclohexylamin, naphtylamin và antraxylamin đều cho hiệu
suất IIa, IIc và IId thấp. Điều này có thể giải thích là do
xiclohexylamin tạo muối amoni hiđroclorua bền, bị kết tủa và
mất khả năng tham gia phản ứng; hai amin còn lại có cấu trúc
cồng kềnh, gây cản trở cho sự tấn công nucleophin vào nhóm
cacbonyl.
Hiệu suất, một số hằng số vật lý và các dữ kiện phổ IR,
1
H-NMR và MS được thể hiện ở bảng 3.7 và bảng 3.8 (xem
toàn văn luận án).
Như vậy, bằng phương pháp sử dụng lò vi sóng đã tổng
hợp được 16 hợp chất 3-hiđroxi-(N-(thế)naphtalen-2-
cacboxamit (IIa-d) với hiệu suất cao, trong đó có 3 hợp
chất mới.
Trên phổ IR xuất hiện cực đại hấp thụ đặc trưng cho dao
động hóa trị của nhóm hiđroxyl-νOH ở vùng 3440-3458;
nhóm NH amit-νNH ở 3245-3301 và nhóm cacbonyl amit-
νC=O ở 1623-1648 cm
-1

.

15
Bảng trích kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, phổ IR và
1
H-NMR của
các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
2
3
1
4
6
5
7
8
OH
CONHRX
10
9
R=C
6
H
4
(dãy ); C
6
H
10
/C
6
H

4
/C
10
H
7
/C
14
H
9
(dãy )

Chất
X
Hiê
̣
u
suất,
%
Tnc,
0
C
IR (υ, cm
-1
, KBr)
1
H-NMR
(DMSO-d6;
δ, ppm; J,
Hz)
Chất

X
Hiê
̣
u
suất,
%
Tnc,
0
C
IR (υ, cm
-1
, KBr)
1
H-NMR
(DMSO-d6; δ,
ppm; J, Hz)
OH
NH
CO
amit
OH
NH
OH
NH
CO
amit
OH
NH
Ia
o-

CH
3

80
194-
195
3400,
3051
3325
1615
11,81
10,54
Ij
p-OCH
3

82
236-
237
3423,
3053
3283
1638,
1620
11,47;
s
10,51;
s
Ib
p-

80
227-
3406,
3294
1623
11,39
10,53
Ik
o-
80
174-
3482
3374
1615
12,11;
11,50;
Ia-l
IIa-l

16
CH
3

229
3048
COOCH
3

176
s

s
Ic
o-Cl
78
226-
228
3408,
3172
3408,
3172
1642,
1626
11,91
11,13
Il
p-
COOCH
3

83
270-
272
3444,
3058
3248
1619
11,13;
s
10,82;
s

Id
p-Cl
83
254-
256
3422,
3054
3291
1636,
1619
11,19
10,66
Chất
R
Hiê
̣
u
suất,
%
Tnc,
0
C
IR (υ, cm
-1
, KBr)
1
H-NMR
(DMSO-d6; δ,
ppm; J, Hz)
Ie

o-Br
82
218-
221
3445,
3224
3224
1640,
1625
11,90
11,00
OH
NH
CO
amit
OH
NH
If
p-Br
89
267-
269
3442,
3054
3287
1618
11,84
10,88
IIa
C

6
H
11

47
160-
162
3441
1623
1604
12,10;
s
8,78;
d;

3
J=8,5
Ig
o-
NO
2

73
193-
195
3420,
3059
3328
1661
12,00

11,72
IIb
C
6
H
5

81
246-
247
3440
3298
1636
11,33;
s
10,59;
s

17
Ih
p-
NO
2

83
256-
258
3074
3289
1627

11,04
11,02
IIc
C
10
H
7

67
214-
215
3458
3245
1648
11,93;
s
11,11;
s
Ii
o-
OCH
3

82
161-
162
3197
3197
1640,
1625

11,76
11,07
IId
C
14
H
9

58
242-
244
3445
3301
1642
12,01;
s
11,27;
s

18
Trên phổ
1
H-NMR của các hợp chất IIa-d, cộng
hưởng của các proton nhóm hiđroxyl-δOH xuất hiện ở
11,33-12,0; nhóm HN amit-δNH ở 10,59-11,27; vòng
phenyl/naphtyl/antraxyl-δArH ở 7,25-8,11 ppm. Riêng hợp
chất IIa, các proton nhóm NH amit-δNH và vòng
xiclohexyl cộng hưởng ở vùng trường mạnh hơn, tương
ứng ở 8,77 và 1,16-3,84 ppm.
Phổ MS của các hợp chất IIa-d cũng có pic ion phân

tử cường độ 35-45%. Trên hình 3.7 là phổ MS của hợp chất
IId lần đầu tiên tổng hợp được, pic ion phân tử có cường
độ [M+H]
+
(35%).








Hình 3.7. Phổ MS của hợp chất IId
3.2. Tổng hợp các 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl-2-
clocacboxylat làm cơ chất nhuộm tế bào bạch cầu
Đã tiến hành điều chế các este 3-(N-thế-
cacbamoyl)naphtalen-2-yl-2-clo-cacboxylat bằng phương pháp
tương tự mô tả trong tài liệu của Burtone [16] (xem luận án):
Hòa tan nguyên liệu đầu cacboxamit Ia-l hoặc IIa-d và


NH
O
OH
NH
O
OH
NH
O

O
O
Cl
CH
3
NH
O
OH
CH
3
1) CH
2
ClCOCl, THF
2) NaOH
Ia IIIa

19
cloaxetyl clorua vào THF. Sau đó, khuấy và nhỏ giọt dung
dịch NaOH 5N vào phản ứng ở nhiệt độ khoảng 0
0
C. Trên
sơ đồ sau là ví dụ phản ứng giữa naphtol AS-D với
cloaxetyl clorua:

Tuy nhiên, sau khi xử lý, xác định cấu trúc, sản phẩm
thu được không phải este naphtol AS-D cloaxetat (IIIa)
như dự kiến, mà là nguyên liệu đầu naphtol AS-D (Ia).
Điều này có thể giải thích là cloaxetyl clorua đã thủy phân
thành muối cloaxetat, trước khi kịp tác dung với naphtolat.
Vì vậy, phản ứng este hóa đã không thể xảy ra.

Để thu được các este 3-(N-thế-cacbamoyl)-naphtalen-2-yl-2-
clo-cacboxylat, đã cải tiến quy trình thí nghiệm, bằng cách
thực hiện phản ứng theo hai giai đoạn. Giai đoạn 1, cho
nguyên liệu đầu Ia-l hoặc IIa-d tác dụng với NaOH, điều
chỉnh pH = 8. Giai đoạn 2, cho clocacboxyl clorua tác dụng
với muối naphtolat tạo thành trong giai đoạn 1. Toàn bộ
quá trình phản ứng được mô tả trên sơ đồ sau:
IIIa-l ;
IVa-l ; Va-g ; VIa-f
CONHR
1
OH
CONHR
1
ONa
2
NaOH 5N
THF
1)
CONHR
1
ONa
2)
RCOCl
THF
5
6
7
8 1
2

3
4
CONHR
1
OCOR

Sau khi xử lý, xác định cấu trúc, sản phẩm thu được là các 3-
(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl-2-clocacboxylat.
Như vậy, bằng cách cải tiến quy trình thí nghiệm, đã
tổng hợp thành công 4 dãy, gồm 38 cơ chất 3-(N-thế-
cacbamoyl)naphtalen-2-yl- 2-clocacboxylat IIIa-l, IVa-l,

20
Va-g và VIa-f với hiệu suất đạt từ 49-62%. Bốn dãy cơ
chất đó là:
1) Naphtol AS-X cloaxetat: R = ClCH
2
, R
1
= X-C
6
H
4
;
X = o-CH
3
(IIIa), p-CH
3
(IIIb), o-Cl (IIIc), p-Cl (IIId), o-
Br (IIIe), p-Br (IIIf), o-NO

2
(IIIg), p-NO
2
(IIIh), o-OCH
3

(IIIi),
p-OCH
3
(IIIj), o-COOCH
3
(IIIk), p-COOCH
3
(IIIl)
2) Naphtol AS-X α-clopropionat: R = CH
3
CHCl; R
1
= X-
C
6
H
4
;
X = o-CH
3
(IVa), p-CH
3
(IVb), o-Cl (IVc), p-Cl (IVd),
o-Br (IVe), p-Br (IVf), o-NO

2
(IVg), p-NO
2
(IVh), o-
OCH
3
(IVi),
p-OCH
3
(IVj), o-COOCH
3
(IVk), p-COOCH
3
(IVl).
3)-3-
(xiclohexyl/phenyl/naphtyl/antraxylcacbamoyl)naphtalen-2-
yl- -cloaxetat và -clopropionat:
R=CH
2
Cl; R
1
=Xiclohexyl (
Va
), phenyl (
Vb
), naphtyl (
Vc
),
antraxyl (
Vd

).
R= CH3CHCl; R1 = Xiclohexyl (
Ve
), phenyl (
Vf
), naphtyl (
Vg
),
antraxyl (
Vh
).
4)
-
Naphtol AS-D và naphtol AS-OL butyrat,

-clobutyrat,

-
clophenylaxetat:

R
1
=o-toluidin; R=CH
2
Cl (
VIa
), CHClCH
3
(
VIb

),
CHClCH
2
CH
3
(
VIc
).
R1 = o-anisidyl; R = CH
2
Cl (
VId
), CHClCH
3
(
VIe
),
CHClC
6
H
5
(
VIf
).

21
Kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý và các dữ
kiện phổ của các cơ chất mô tả trong bảng 3.9 đến 3.16
(xem toàn văn luận án).

22
Bảng trích kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, phổ IR và
1
H-NMR của các naphtol AS-X cacboxylat
3
2
4
1
7
8
6
5
OCOCHClR
CONH
1'
5'
2'
6'
X
10
3'
4'
9
12
R=H (dãy IIIa-l), CH
3
(dãy IVa-l)

X
Chất

Hiê
̣
u
suất,
%
Tnc,
0
C
IR (υ, cm
-1
, KBr)
1
H-NMR;
(δ, ppm; J,
Hz)
Chất
Hiê
̣
u
suất,
%
Tnc,
0
C
IR (υ, cm
-1
, KBr)
1
H-NMR (δ,
ppm; J, Hz)

NH
CO
este
CO
amit
NH
H-
12
NH
CO
este
CO
amit
NH
H-12
o-CH
3

IIIa
55
173-
175
3323
1770
1658
10,45
4,66
IVa
52
131-

134
3368
1765
1657
10,03
5,0;
q;
3
J=7,0
p-CH
3

IIIb
52
160-
162
3276
1773
1654
10,45
4,65
IVb
54
167-
169
3246
1770
1658
10,46
5,0;

q;
3
J=7,0

23
o-Cl
IIIc
51
128-
130
3232
1769
1650
10,68
4,65
IVc
52
132-
134
3343
1776
1684
10,22
5,0;
q;
3
J=7,0
p-Cl
IIId
54

187-
189
3297
1777
1656
10,64
4,65
IVd
54
168-
170
3364
1760
1681
10,68
5,0;
q;
3
J=7,0
o-Br
IIIe
49
143-
145
3226
1779
1644
10,22
4,68
IVe

53
120-
123
3226
1779
1627
10,21
5,02;
q;
3
J=7,0
p-Br
IIIf
48
188-
190
3281
1769
1621
10,70
4,65
IVf
53
160-
162
3384
1774
1667
10,68
5,01;

q;
3
J=7,0
o-NO
2

IIIg
60
156-
158
3403
1782
1692
10,98
4,65
IVg
60
141-
143
3399
1770
1702
10,97
4,99;
q;

24
3
J=7,0
p-NO

2

IIIh
54
179-
181
3384
1774
1667
11,16
4,67
IVh
54
157-
159
3354
1759
1688
11,16
5,01;
q;
3
J=7,0
o-OCH
3

IIIi
53
132-
134

3315
1767
1656
9,55
4,68
IVi
55
123-
125
3325
1761
1657
9,51
5,01;
q;
3
J=7,0
p-OCH
3

IIIj
53
175-
177
3278
1773
1648
10,40
4,65
IVj

51
139-
141
3337
1764
1651
10,39
5,0;
q;
3
J=7,0
o-
COOCH
3

IIIk
51
186-
188
3327
1764
1718
11,35
4,69
IVk
42
121-
122
3286
1766

1664
11,35
5,01;
d;
3
J=7,0
p-
IIIl
50
186-
3311
1776
1715
10,92
4,66
IVl
50
172-
3327
1764
1718
10,90
5,02;

25
COOCH
3

188
174

t;
3
J=7,0