nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn có hoạt tính protease sống bám trên cá chim vây vàng

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN























NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I. 3
TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁ CHIM VÂY VÀNG 3
1.2. GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTICS 4
CHƢƠNG II 10
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 10

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
2.2.1. Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu 12
2.2.2. Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật 13
2.2.3. Phƣơng pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh protease mạnh nhất: đƣợc đánh giá
qua hoạt tính sinh protease 15
2.2.4. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh trƣởng 16
2.2.5. Phƣơng pháp định danh chủng vi khuẩn (theo phƣơng pháp truyền thống) 17
2.2.6. Phƣơng pháp xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 19
2.2.7. Phƣơng pháp nuôi cấy và thu canh trƣờng chứa enzyme của chủng đã phân lập
trên môi trƣờng nhân giống cấp 2 22
2.3. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 25
CHƢƠNG III 26
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26



3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG SINH PROTEASE CAO SỐNG
BÁM TRÊN CÁ CHIM VÂY VÀNG 26
3.2. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP 28
3.3. ĐẶC ĐIỀM SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP 29
3.3.1. Khả năng lên men các loại đƣờng 29
3.3.2. Khả năng sinh hơi 31
3.3.3. Khả năng chịu muối 32
3.3.4. Khả năng di động 32
3.4. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH PROTEASE CỦA
CHỦNG R2.1.5 PHÂN LẬP ĐƢỢC 33
3.4.1. Thời gian nuôi cấy thích hợp 33
3.4.2. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 35
3.4.3. pH thích hợp 36
3.5. THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY CHỦNG R2.1.5 TRÊN MÔI TRƢỜNG NHÂN

GIỐNG CẤP 2 37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO 41









DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 26
Bảng 3.2. Hoạt tính protease của 5 chủng vi khuẩn cao nhất phân lập đƣợc 27
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn tuyển chọn 28
Bảng 3.4. Khả năng lên men các loại đƣờng của các chủng vi khuẩn phân lập 30

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) 4
Hình 2.1. Cách thức tiếp cận vấn đề nghiên cứu 13
Hình 2.2. Quá trình phân lập vi sinh vật 15
Hình 2.3. Quá trình tuyển chọn vi khuẩn sinh protease 16
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm định danh vi khuẩn theo phƣơng pháp truyền thống
17
Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy tối ƣu 19
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy tối ƣu 20
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ƣu 21
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH nuôi cấy tối ƣu 22
Hình 2.9. Sơ đồ quy trình sản xuất protease từ chủng đã phân lập trên môi trƣờng nhân
giống cấp 2 24
Hình 3.1. Hoạt tính protease của các chủng tuyển chọn đƣợc 28
Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng R2.1.5 dƣới độ phóng đại X-100 29
Hình 3.3 Một số hình ảnh về khả năng lên men đƣờng của các chủng vi khuẩn đƣợc
tuyển chọn 31
Hình 3.4. Khả năng sinh hơi của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 31
Hình 3.5. Khả năng chịu muối của các chủng vi khuẩn 32
Hình 3.6. Khả năng di động của các chủng vi khuẩn 33
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trƣởng và hoạt tính
enzyme của chủng R2.1.5 34

Hình 3.8. Sự thay đổi họat tính sinh enzyme của chủng vi khuẩn R2.1.5 khi nuôi ở của
nhiệt độ môi trƣờng khác nhau 36
Hình 3.9. Sự thay đổi họat tính sinh enzyme của chủng vi khuẩn R2.1.5 khi nuôi ở các
pH môi trƣờng khác nhau 37
Hình 3.10. Canh trƣờng nuôi chứa enzyme protease của chủng R2.1.5 sau 18h nuôi cấy
38
Hình 3.11 Chế phẩm chứa chủng R2.1.5 sau khi đóng gói 38
Hình 3.12. Xác định hoạt độ protease theo phƣơng pháp Gross & Fuld 39











1

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
MỞ ĐẦU

Việt Nam có bờ biển dài trên 3000km và vùng thềm lục địa hàng triệu km
2
là
điều kiện thuận lới để phát triển ngành thủy sản. Với truyền thống lao động cần cù sáng
tạo của con ngƣời Việt Nam đồng thời với sự định hƣớng đúng đắn của Đảng và Nhà
nƣớc, ngành Thủy sản đã phá triển mạnh mẽ vƣơn lên trở thành ngành có kim ngạch

xuất khẩu đứng hàng thứ 3 chỉ sau dệt may và dầu khí. Năm 2010, sản lƣợng khai thác
thủy sản là 2.450,8 ngàn tấn, kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 4,94 tỷ USD; sản lƣợng
nuôi trồng thủy sản năm 2010 lên 2.706,8 ngàn tấn đã đƣa Việt Nam đứng thứ 6 trong
số 10 nhà xuất khẩu thủy sản hàng đầu của thế giới và đứng thứ 5 trong khu vực châu
Á sau Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia và Philippines.
Để đẩy mạnh phát triển ngành thủy sản và khẳng định chủ quyền biển đảo, Chính
phủ đã định hƣớng phải tăng cƣờng khai thác đánh bắt xa bờ và đẩy mạnh phát triển
nuôi các loài cá biển có giá trị kinh tế, trong đó có cá chim vây vàng - đối tƣợng nuôi
mới, có giá trị kinh tế cao. Tuy vậy muốn phát triển nuôi bền vững các đối tƣợng này
cần phải sản xuất thức ăn có chứa các chế phẩm vi sinh vật hữu ích (probiotics) giúp
tăng sức đề kháng, tăng khả năng tiêu hóa của cá trong điều kiện nuôi công nghiệp và
hạn chế ô nhiễm môi trƣờng. Song hiện tại Việt Nam việc nghiên cứu chƣa nghiên cứu
về chế phẩm probiotics dùng cho nuôi thủy sản còn rất hạn chế. Đặc biệt đối với cá
chim vây vàng, hiện chƣa có chế phẩm dạng này. Xuất phát từ thực tế trên, em đƣợc
Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học giao thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân lập một
số chủng vi khuẩn có hoạt tính protease sống bám trên cá chim vây vàng”, với mục
đích phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme protease ứng
dụng trong nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotics dùng trong sản xuất thức ăn cho
cá chim vây vàng.
Nội dung của đề tài:
1) Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn sinh protease cao sống bám
trên cá chim vây vàng,
2

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
2) Xác định một số đặc tính của chủng có hoạt tính sinh protease cao,
3) Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của chủng phân
lập được
Do thời gian và kinh phí có hạn nên báo cáo này chắc hẳn sẽ còn có các hạn
chế, em kính mong nhận đƣợc các ý kiến góp ý của quý thầy cô và bạn bè đồng nghiệp

để cho các nghiên cứu thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cảm ơn!



















3

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
CHƢƠNG I.
TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁ CHIM VÂY VÀNG
Cá chim trắng vây vàng là loài cá biển có giá trị kinh tế cao, đƣợc nuôi nhiều ở
Đài Loan, Trung Quốc, Singapore và tiêu thụ mạnh trên thị trƣờng thế giới. Tuy
nhiên ở nƣớc ta, cá chim trắng vây vàng là đối tƣợng khá mới mẻ. Với đƣờng bờ biển
dài, diện tích mặt nƣớc biển lớn, ngành nuôi cá biển đang trên đà phát triển mạnh. Đặc

biệt, điều kiện biển tự nhiên ở nƣớc ta rất thích hợp với loài cá chim trắng vây vàng. Vì
môi trƣờng sống của loại cá này là vùng biển ấm, vị trí rất thích hợp, những vùng vịnh,
đầm phá, eo biển, biển nội địa ít sóng gió. Bên cạnh đó, là chất lƣợng nƣớc tốt, độ mặn
nƣớc biển tƣơng đối ổn định. Nguồn thức ăn cho cá có tự nhiên, thức ăn tổng hợp đơn
giản và giá thành không quá đắt.
Cá chim vây vàng còn có một tên gọi khác là cá sòng mũi hếch hay cá chim
trứng. Là loài cá ăn tạp, thiên về động vật, cá có thể kiếm thức ăn ở trong cát, cá trƣởng
thành có thể bắt những động vật vỏ cứng nhƣ: ngao, cua, ốc. Giai đoạn cá giống thức
ăn là động vật phù du và động vật đáy, chủ yếu là luân trùng, nauplius của Artemia. Cá
con ăn tôm cá nhỏ, hai mảnh vỏ nhỏ. Thức ăn chính của cá trƣởng thành là các loại tôm
cá nhỏ.Trong điều kiện ƣơng nuôi cá dài 2 cm thức ăn là cá tạp xay nhỏ, tôm tép băm
nhỏ, thức ăn tổng hợp. Cá trƣởng thành ăn tôm nhỏ và thức ăn công nghiệp hoặc hoàn
toàn thức ăn công nghiệp trong nuôi thƣơng phẩm. Sau đây là hệ thống phân loại của
cá chim vây vàng:
Nghành: Vertebrata
Lớp: Osteichthyes
Bộ: Perciformes
Họ: Carangidae
Giống: Trachinotus
Loài: Trachinotus blochii Lacepede, 1801
4

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
Theo Borut Forlan (2004) cá chim vây vàng sống ở vùng biển hở và đƣợc tìm
thấy ở Thái Bình Dƣơng, Đại Tây Dƣơng, Ấn Độ Dƣơng. Ở châu Á, cá chim vây vàng
phân bố ở miền Nam Nhật Bản, Indonesia, Trung Quốc (Hoàng Hải, Đông Hải, Quảng
Đông, Phúc Kiến, Hải Nam), Đài Loan. Ở Việt Nam, cá chim vây vàng đƣợc tìm thấy
trên vịnh Bắc Bộ, miền Trung và Nam Bộ.

Hình 1.1 Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii)

1.2. GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTICS
Thuật ngữ “probiotic” đƣợc Lilly và Stiwell đề xuất năm 1965 để mô tả những
chất sản sinh bởi vi sinh vật làm tăng trƣởng một vi sinh vật (hoặc sinh vật) khác. Năm
1989, Parker lại định nghĩa thêm cho rõ:”Probiotic là những vi sinh vật (chủ yếu là vi
khuẩn) có khả năng cộng sinh (hoặc hợp sinh) trong đường ruột có tác dụng cân bằng
hệ vi sinh vật trong đó có một số tác dụng hữu ích cho vật chủ” (Parker, 1989). Nghiên
cứu ứng dụng probiotic mới đƣợc chú ý trong 20 năm trở lại đây, nhƣng tác dụng của
nó đã đƣợc nhận thấy từ lâu. Elie Metnhicoff là ngƣời đầu tiên đặt nền móng cho việc
sử dụng probiotic (Metnhicoff, 1908). Năm 1908, ông đề nghị sử dụng vi khuẩn lactic
(Lactobacterium delbruekii spp bulgaricus) để kéo dài tuổi thọ con ngƣời. Ngày nay
chế phẩm probiotic đƣợc sử dụng khá hiệu quả trong chăn nuôi đặc biệt là trong nuôi
tôm, trồng trọt, trong bảo vệ sức khỏe con ngƣời và bảo vệ môi trƣờng. Tuy nhiên việc
dùng chế phẩm này vào nuôi trồng thủy sản (tôm, cua, cá, nhuyễn thể…) mới bắt đầu
trong hơn thập kỷ gần đây.
5

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
Sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản giúp phân hủy các chất hữu cơ trong
nƣớc (chất hữu cơ là một trong nhiều nguyên nhân làm môi trƣờng nƣớc bị ô nhiễm),
hấp thu xác tảo chết và làm giảm sự gia tăng của lớp bùn đáy, giảm các độc tố trong
môi trƣờng nƣớc (do các chất khí: NH
3
, H
2
S… phát sinh), do đó sẽ làm giảm mùi hôi
trong nƣớc, giúp tôm cá phát triển tốt, nâng cao khả năng miễn dịch của tôm cá (do
kích thích tôm, cá sản sinh ra kháng thể). Hơn nữa chế phẩm probiotic sẽ ức chế sự
hoạt động và phát triển của vi sinh vật có hại (do các loài vi sinh vật có lợi sẽ cạnh
tranh thức ăn và tranh giành vị trí bám với vi sinh vật có hại). Trong môi trƣờng nƣớc,
nếu vi sinh vật có lợi phát triển nhiều sẽ kìm hãm, ức chế, lấn át sự phát triển của vi

sinh vật có hại, do đó sẽ hạn chế đƣợc mầm bệnh phát triển để gây bệnh cho tôm cá.
Đồng thời chế phẩm probiotic giúp ổn định độ pH của nƣớc, ổn định màu nƣớc do
probiotic hấp thu chất dinh dƣỡng hòa tan trong nƣớc nên hạn chế tảo phát triển nhiều.
Thành phần chế phẩm probiotic thƣờng có những nhóm vi sinh vật sau:
- Các nhóm vi sinh vật cơ bản: Vi khuẩn lactic, Vi khuẩn Bacillus, Vi khuẩn
quang dƣỡng khử H
2
S – vi khuẩn tía lƣu huỳnh, Nấm men (men rƣợu Saccharomyses).
- Các nhóm vi sinh vật phụ: Nhóm vi khuẩn nitrat (Nitrosomonas và
Nitrobacter), Nhóm xạ khuẩn, Nhóm nấm mốc.
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Tại Nhật Bản, chế phẩm probiotic có tên gọi là E.M (các vi sinh vật hữu hiệu) do
giáo sƣ, tiến sỹ Teruo Higa, Trƣờng đại học Ryukyus, Okinawa, Nhật Bản đề xuất năm
1980 đã đƣợc sử dụng nhiều trong chăn nuôi, trồng trọt cũng nhƣ bảo vệ môi trƣờng
đều cho kết quả khả quan (Higa, 1980). Đến nay chế phẩm này đƣợc hơn 80 nƣớc và
vùng lãnh thổ sử dụng, đặc biệt là khu vực Châu Á và Thái Bình Dƣơng trong đó có
Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam.
Griffith (1995) thông báo nhờ việc đƣa probiotic vào nuôi tôm giống ở Ecuador
trong năm 1992, mà các trại nuôi tôm giống giảm thời gian nghỉ để làm vệ sinh ở các
6

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
bể nuôi từ 7 ngày trong một tháng đến 21 ngày trong một năm, sản lƣợng tôm giống
tăng 35%, và giảm sử dụng các chất diệt khuẩn đến 94% .
Ở Châu Á đã có nhiều nghiên cứu sử dụng các chế phẩm vi sinh trong nuôi tôm,
đặc biệt ở Thái Lan. Jiravanichpaisal & cộng sự (1997) đã sử dụng Lactobacillus sp.
trong nuôi tôm sú (P. monodon Fabrius) . Ở Trung Quốc, nghiên cứu probiotic trong
nuôi thủy sản đƣợc tập trung vào vi khuẩn quang hợp. Qiao Zhenguo & cộng sự (1992)
nghiên cứu 3 chủng vi khuẩn quang hợp sử dụng cho tôm (P. chinensis) bằng cách cho
vào thức ăn hoặc cho và nƣớc nuôi tôm cho thấy có sự gia tăng khả năng phát triển của

tôm, loại trừ nhanh chóng NH
3
-N, H
2
S, acid hữu cơ và những chất có hại, cải thiện
chất lƣợng nƣớc, cân bằng độ pH.
Ngày nay probiotics đƣợc sử dụng rộng rãi và rất hiệu quả trong việc phòng bệnh
cho động vật thủy sản và con ngƣời. Hiện có khoảng 500 loại chế phẩm sinh học đang
lƣu thông trên thị trƣờng, trong đó có khoảng 430 loại dùng để xử lý môi trƣờng và
trên 60 loại dùng để trộn vào thức ăn nhằm mục đích kích thích tăng trƣởng, tăng sức
đề kháng…nhƣng chủ yếu vẫn tập trung vào xử lý môi trƣờng. Các loại chế phẩm này
có nguồn gốc từ nhiều nƣớc: Trung Quốc, Indonesia, Đài Loan, Anh, Mỹ, Ấn Độ, Hàn
Quốc, Úc, Đức, và Thái Lan (Aditya et al., 2008; Wang et al., 2008).
Để tạo thành các chế phẩm hoàn chỉnh, các probiotics có thể đƣợc sử dụng kết
hợp với các chất có hoạt tính sinh học khác. Chẳng hạn, chế phẩm De-Odorase của
hãng Bayer sử dụng hoạt chất chính đƣợc chiết xuất từ thực vật (từ cây Yucca) kết hợp
với nấm men và vi khuẩn. Chế phẩm này giúp loại bỏ các khí độc trong ao ƣơng nuôi
tôm cá nhƣ khí: NH
3
, H
2
S, NO
2
… do đó giảm ô nhiễm môi trƣờng nuôi. Tuy nhiên,
chế phẩm này có nhƣợc điểm là không khống chế đƣợc vi khuẩn, nấm, nguyên sinh
động vật trong ao. Chế phẩm BZT (BZT Aquaculture và BZT Waster digester) là sự
kết hợp giữa các vi khuẩn và enzyme, giúp xử lý lớp bùn đáy ao ô nhiễm và làm sạch
môi trƣờng. Các vi khuẩn có lợi trong chế phẩm này bao gồm Lactobaccilus spp.,
Nitromonas spp., Nitrobacter spp., Bacillus spp., và Clostridium spp.
7

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
Những nghiên cứu về việc sử dụng chế phẩm probiotics trong lĩnh vực thủy sản
chỉ ra rằng các probiotics có một số lợi ích sau: làm ổn định chất lƣợng nƣớc và nền
đáy trong ao nuôi tôm cá, nâng cao sức khoẻ và sức đề kháng cho tôm, cá nuôi, giảm
thiểu ô nhiễm môi trƣờng ao nuôi và xung quanh do nuôi trồng thuỷ sản gây nên và
nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn (Verschuere et al., 2000). Các đánh giá về hiệu quả
môi trƣờng của chế phẩm sinh học chỉ ra rằng các chủng vi sinh vật trong các chế
phẩm probiotics có khả năng phân giải nhanh xác tảo tàn, thức ăn thừa, hoặc có tác
dụng xử lý các chất hữu cơ lơ lửng, cạnh tranh và làm giảm vi khuẩn gây bệnh trong
nƣớc, xử lý ô nhiễm bùn đáy ao nuôi (Zhou et al., 2009).
Một số công trình nghiên cứu trên thế giới đã công bố cho thấy sử dụng các chế
phẩm probiotics trong thức ăn nuôi trồng thuỷ sản còn có các lợi ích nhƣ sau:
- Giúp làm giảm stress cho tôm cá qua đó cải thiện sức khỏe của động vật nuôi
đồng thời làm giảm tác động có hại của thức ăn thừa đến môi trƣờng.
- Do quy luật cạnh tranh và loại trừ vi khuẩn gây bệnh, các vi sinh vật có lợi trong chế
phẩm probiotics sẽ cạnh tranh và làm giảm sự phát triển cũng nhƣ độc tính của vi
khuẩn gây bệnh. Vì thế chế phẩm probiotics sẽ giúp cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột
và giảm thiểu vi sinh vật gây bệnh trong đƣờng ruột của vật nuôi.
- Mặt khác, một số lọai vi khuẩn có lợi trong chế phẩm probiotics nhƣ Bacillus
subtilis, nấm men còn là nguồn cung cấp dinh dƣỡng protein, vitamin, nhất là sản xuất
ra các enzyme tiêu hóa nhƣ protease, amylase, Vì thế khi bổ sung chế phẩm probiotics
có khả năng sinh enzyme vào thức ăn nuôi động vật thủy sản nhất là nuôi tôm nói
chung và thức ăn nuôi tôm hùm nói riêng sẽ làm tăng cƣờng quá trình tiêu hóa thức ăn
trong đƣờng ruột của tôm và giảm chi phí thức ăn.
- Quan trọng hơn, các vi sinh vật có lợi trong chế phẩm probiotics nhƣ các lọai vi
khuẩn lactic còn kích thích tăng cƣờng hệ miễn dịch của động vật thủy sản chống lại vi
sinh vật gây bệnh nên nguy cơ dịch bệnh ở vật nuôi sẽ đƣợc giảm thiểu. Do vậy khi sử
dụng chế phẩm probiotics trong thức ăn nuôi động vật thủy sản nói chung và cá chim
8

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
vây vàng nói riêng sẽ giúp hạn chế dịch bệnh và ngăn chặn việc lạm dụng kháng sinh
trong nuôi trồng.
1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Hiện đã có một số chế phẩm probiotics đƣợc đƣa vào sử dụng trong nuôi trồng
thuỷ sản ở Việt Nam từ đầu những năm 1995, chủ yếu là các chế phẩm nhập ngoại từ
Mỹ và Nhật Bản. Một số chế phẩm đƣợc sản xuất trong nƣớc. Các chế phẩm đƣợc biết
đến nhiều nhất thuộc nhóm EM (“Effective Microorganisms™”) có nguồn gốc từ Nhật
Bản. Một số chế phẩm khác nhƣ: ACTIVE CARE, ACTIVE CLEANER, GEM-P …
đƣợc sử dụng để bổ sung vào ao nuôi nhằm cải thiện chất lƣợng nƣớc và làm giảm
stress cho động vật thuỷ sản, đã mang lại những hiệu quả đáng khích lệ và góp phần
đáng kể vào việc phát triển của ngành nuôi trồng thuỷ sản.
Một số nghiên cứu trong nƣớc ở lĩnh vực sản xuất các chế phẩm probiotics ứng
dụng trong nuôi trồng thuỷ sản đã đƣợc tiến hành và cho một số kết quả bƣớc đầu đáng
chú ý. Khuất Hữu Thanh (2009) đã công bố nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học
để hoàn thiện chế phẩm BIO-TS3 có khả năng tăng sức đề kháng của tôm trong nuôi
tôm sú thâm canh và thu đƣợc nhiều kết quả đáng khích lệ là chế phẩm này có khả
năng cải thiện chất lƣợng ao nuôi (Khuất Hữu Thanh (2009), Nghiên cứu ứng dụng
công nghệ sinh học hoàn thiện chế phẩm BIO-TS3 có khả năng tăng sức đề kháng của
tôm trong nuôi tôm sú thâm canh, Hội thảo đánh giá kết quả thực hiện đề tài dự án
CNSH Nông nghiệp, Thủy sản giai đoạn 2007-2008).
Trong năm 2009, Chi cục Quản lý chất lƣợng nông lâm sản và thủy sản tỉnh Đồng
Tháp đã triển khai mô hình “Qui trình ƣơng cá tra giống trên ao có sử dụng chế phẩm
sinh học”. Mô hình tiến hành trên 2 ao diện tích 4.000 m
2
và 2 ao diện tích 6.000 m
2
.
Kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng chế phẩm sinh học làm giảm nồng độ N-NH

4
,
NO
2
, H
2
S, số lƣợng vi khuẩn Aeromonas và Pseudomonas trong ao nuôi cá tra. Hơn
nữa, ở ao dùng chế phẩm sinh học, tình trạng cá khỏe và không có biểu hiện nhiễm
bệnh. Trong ao không sử dụng chế phẩm sinh học, cá bị nhiễm ký sinh trùng (15 – 20
9

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
con/10x10) và có biểu hiện bệnh nhiễm khuẩn từ ngày thứ 20-25, sau khi điều trị thì cá
bị hao hụt, tỷ lệ sống giảm và tăng trƣởng không đều. Cuối cùng, sử dụng chế phẩm
sinh học còn làm tăng tỉ lệ sống đạt 33,26% so với ao đối chứng không sử dụng chế
phẩm là 26% và làm giảm hệ số chuyển hóa thức ăn là 0,6 so với đối chứng là 0,8.
Sử dụng probiotics có tác dụng trên nhiều mặt và có nhiều triển vọng. Tuy nhiên,
tại Việt Nam chƣa có những nghiên cứu đầy đủ về vai trò của vi sinh vật, đặc biệt là
chƣa có các nghiên cứu bổ sung chúng vào thành phần thức ăn viên cho nuôi cá chim
vây vàng.
Do vậy việc “Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn có hoạt tính protease
sống bám trên cá chim vây vàng” với mục đích sử dụng cho sản xuất probiotics làm
thức ăn cho cá chim vây vàng là một hƣớng nghiên cứu cần thiết.

10

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
CHƢƠNG II
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1. Mẫu phân lập vi sinh
Mẫu cá chim vây vàng đƣợc thu tại Trại thực nghiệm nuôi cá chim vây vàng của
Khoa Nuôi trồng Thủy sản - Ba Làng - Nha Trang.
2.1.2. Môi trƣờng nuôi vi sinh vật, hóa chất và thuốc thử
Môi trƣờng phân lập vi khuẩn
Môi trƣờng TSB
Casein peptone 17g
Soya peptone 3g
NaCl 5g
K
2
HPO
4
4g
Glucose 2.5g
Bile Salts 1.5g
pH 7.4 ± 0.2
Môi trƣờng tăng sinh: Ankaline Peptone Water (APW)
Pepton : 10 g;
Natri clorua (NaCl) : 30 g

Nƣớc cất : 1 lít ;
pH = 8,5 ± 0,2
Hoà tan các thành phần, điều chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình tam
giác. Hấp ở nhiệt độ 121
o
C trong 10 phút. Khi bảo quản phải vặn chặt nắp bình, để
tránh bay hơi nƣớc và pH bị thay đổi.
Môi trƣờng lên men đƣờng (Môi trƣờng cơ bản)
Pepton : 10 g
NaCl : 30 g;
Cao thịt bò : 3 g;
11

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
Phenol đỏ : 0,04 g;
Nƣớc cất : 1 lít;
pH = 7,0 ± 0,2
Hoà tan các thành phần trên, chỉnh pH rồi rót 2,5 ml vào các ống nghiệm. Hấp ở
nhiệt độ 121
0
C trong 10 phút. Pha các loại dung dịch cacbonhydrat 50% (nhƣ: sucrose,
lactose,D-mannitol, mantose ) trong nƣớc cất rồi lọc vô trùng. Thêm 0,278 ± 0,002 ml
dung dịch này vào ống nghiệm chứa 2,5 ml môi trƣờng cơ bản. Môi trƣờng cuối cùng
có nồng độ carbohydrat là 5%.
Môi trƣờng thạch thƣờng
Pepton 10g
Nƣớc mắm 20ml
Nƣớc cất 1000ml
Môi trƣờng nhân giống cấp 2
Bột đậu nành 30%

Cám gạo 20%
Bột sữa 10%
Bột bắp 40%
Khoáng DAP 32%
Nƣớc 80%
Thuốc nhuộm Tím Violet
Tím violet : 1 g
Rƣợu ethylic : 1 g
Phenol tinh thể: 2g
Nƣớc cất : 100 ml
Pha chế
Hòa tan 1 g tím violet vào trong 10 ml cồn (dung dịch 1)
Hòa tan 2 g phenol tinh thể vào 10 ml nƣớc cất (dung dịch 2)
Trộn chung dung dịch 1 và dung dịch 2 lại với nhau ta có dung dịch thuốc nhuộm
tím violet
Thuốc nhuộm Liugol
12

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
Iod tinh thể : 1 g
KI : 2 g
Nƣớc cất : 200 ml
Pha chế: Hòa tan iod vào nƣớc cất, sau đó cho KI vào, bảo quản trong lọ tối màu.
Thuốc nhuộm Fuschin
Fuschin kiềm : 1g
Rƣợu ethylic 95% : 10 ml
Phenol tinh thể : 5g
Nƣớc cất : 100 ml
Pha chế:
Hòa tan Fuschin vào trong 10 ml cồn 95% (dung dịch 1).

Hòa tan phenol tinh thể vào 100 ml nƣớc cất (dung dịch 2).
Trộn đều dung dịch 1 và dung dịch 2 đem lọc, ta có thuốc nhuộm Fuschin.
Dung dịch xanh methylen
Rƣợu ethylic: 300 ml
Xanh methylen: 25 g
Hòa tan xanh methylen vào rƣợu rồi lọc (dung dịch 1).
Dịch lọc 1 thêm 1 ml KOH 1% và 1000 ml nƣớc cất.
Dung dịch nƣớc muối sinh lý
Hoà tan 8,5 g NaCl trong 1 lít nƣớc cất. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121
0
C trong 15
phút rồi để nguội.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu
Đề tài sử dụng cách tiếp cận kế thừa và chọn lọc các phƣơng pháp phân lập tuyển
chọn các chủng probiotics có khả năng sinh enzyme protease theo sơ đồ:
13

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân

Hình2.1. Cách thức tiếp cận vấn đề nghiên cứu
2.2.2. Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật
Mục tiêu của thí nghiệm là tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn sinh protease mạnh
nhất. Thí nghiệm đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau:
Xử lý mẫu
Phân lập
• Phân lập vi khuẩn tổng số trên môi trƣờng TSB
• Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính protease
Xác định hình thái
• Xác định các đặc điểm hình thái

• Xác định một số đặc tính sinh lý, sinh hóa
Định danh
• Tiến hành định danh chủng có hoạt tính cao
nhất
Thử nghiệm nuôi cấy và
thu sinh khối trên môi
trường nhân giống cấp 1
và 2
• Tiến hành khảo sát một số điều kiện nuôi cấy
thích hợp
• Thu sinh khối
14

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
Thu lấy phần nội tạng (ruột, gan) và máu của cá cho vào túi PE vô trùng. Tùy vào
khối lƣợng của từng mẫu thêm vào dung dịch APW với thể tích thích hợp theo tỉ lệ 1:9.
Chuẩn bị mẫu xong, cho vào túi PE có chứa mẫu và APW, đem đi đồng nhất mẫu bằng
máy dập mẫu. Thời gian đồng nhất mỗi mẫu từ 90 đến 120 giây. Ủ mẫu đã dập với
APW ở 37
0
C trong thời gian 6-8 giờ trong tủ ấm.
Tiến hành phân lập (hình 2.1)
- Chuẩn bị các ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml dung dịch nƣớc muối sinh lý đã
đƣợc hấp khử trùng.
- Hút 1ml dịch mẫu đã ủ từ các túi PE vào ống nghiệm, thu đƣợc dịch mẫu pha
loãng với nồng độ 10
-1
, rồi đƣa lên máy vortex để trộn đều.
- Từ ống nghiệm 10
-1

, pha loãng ra ống nghiệm có nồng độ thấp hơn 10
-2
bằng
cách hút 1ml từ ống nghiệm 10
-1
cho vào 9 ml dung dịch nƣớc muối sinh lý đã hấp khử
trùng ở ống nghiệm khác, rồi đƣa lên máy vortex để trộn đều, thu đƣợc ống nghiệm có
độ pha loãng mẫu 10
-2
, tiếp tục làm tƣơng tự, ta có các ống nghiệm có độ pha loãng
mẫu 10
-3
, 10
-4
, 10
-5
, 10
-6
,10
-7
, 10
-8
.
- Môi trƣờng TSB đƣợc chuẩn bị, hấp khử trùng và phân phối vào các đĩa petri,
mỗi đĩa 10-15ml. Dùng pipet man hút 0.1 ml dịch đã pha loãng nhỏ vào đĩa thạch đã
ghi tên mẫu, nồng độ và ngày phân lập. Dùng que cấy tran trang đều dịch mẫu trên mặt
thạch. Sau đó cất và nuôi cấy mẫu phân lập ở 37
0
C. Sau khoảng 48h vi khuẩn đã phát
triển trên đĩa thạch tiến hành quan sát, tách và thuần khiết khuẩn lạc.

- Tách và thuần khiết khuẩn lạc: Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa peptri
cấy rồi cấy vào ống nghiệm, mỗi khuẩn lạc cấy vào một ống (ghi kí hiệu đầy đủ để cho
các bƣớc nghiên cứu tiếp theo), đặt vào tủ ấm 37
0
C. Sau các khoảng thời gian thích
hợp cấy ziczac ra đĩa petri để tinh sạch các chủng VSV, tiến hành tinh sạch nhiều lần.
Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy, kiểm tra độ thuần chủng
của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào dƣới kính hiển vi. Khi đƣợc khuẩn lạc thuần nhất
và tách rời trên đĩa thạch thì cấy vào ống nghiệm giữ giống.
- Phƣơng pháp giữ giống và cấy chuyền: Sau khi tinh sạch xong ta chọn khuẩn lạc
mọc riêng rẽ cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng. Tiến hành cấy ziczac trên ống thạch
nghiêng để đƣợc giống thuần khiết. Các chủng vi khuẩn đã đƣợc lựa chọn cấy trên môi
15

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
trƣờng thạch nghiêng đặc hiệu để vào tủ ấm 37
0
C. Sau 10-14 ngày khi vi sinh vật đã
mọc tốt, các ống giống đƣợc bảo quản trong tủ lạnh ở 4-6
0
C. Sau 2-3 tháng cấy chuyền
lại một lần. Để bảo quản giống đƣợc lâu từ 6 tháng đến 2 năm có thể giữ giống trong
paraffin lỏng vô trùng hay giữ lạnh sâu trong glycerin hoặc đông khô.

Hình 2.2. Quá trình phân lập vi sinh vật
2.2.3. Phƣơng pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh protease mạnh nhất:
đƣợc đánh giá qua hoạt tính sinh protease
Phƣơng pháp xác định hoạt tính sinh protease: theo phƣơng pháp đo đƣờng
kính phân giải casein
Vi khuẩn đƣợc nuôi cấy lắc 180 vòng/phút ở 30

0
C trong môi trƣờng dịch thể, sau
24h tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch
enzyme nhỏ vào lỗ thạch đã khoan trên đĩa petri chứa môi trƣờng cơ chất. Để vào tủ
ấm 30
0
C sau 24h xác định vòng phân giải.
Sử dụng thuốc thử Liugol, thuốc thử không bắt màu với phần cơ chất bị phân
giải, tạo ra vòng phân giải.
Tủ ấm 37
0
C
16

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
Hoạt tính enzyme đƣợc xác định theo công thức:
H D d

Trong đó D: đƣờng kính vòng phân giải + đƣờng kính lỗ khoan
d: đƣờng kính lỗ khoan







Hình 2.3. Quá trình tuyển chọn vi khuẩn sinh protease
2.2.4. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh trƣởng
Để đánh giá khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn cũng nhƣ khả năng tích lũy sinh

khối ta sử dụng phƣơng pháp đo mật độ quang (OD). Các thí nghiệm đƣợc thực hiện ở
bƣớc sóng 540nm
Nguyên tắc: Khi pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành
một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trƣờng lỏng cản
ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi
hiện diện trong môi trƣờng cũng làm môi trƣờng trở nên đục. Giá trị OD (optical
density, mật độ quang) càng cao thì độ đục càng cao, chứng tỏ vi khuẩn sinh trƣởng
càng mạnh. Vì vậy có thể xác định khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn thông qua đo độ
đục bằng máy so màu.
Cách tiến hành: Đo độ đục của dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng máy quang phổ.
Cho môi trƣờng vào cuvet số 1 làm đối chứng, cho vào máy đo OD ở 540nm, đƣa về
giá trị bằng 0. Lấy dịch nuôi cấy vi khuẩn cho vào cuvet số 2 và cho vào máy đo, đọc
Dịch vi
khuẩn sau li
tâm
Nhỏ vào đĩa thạch đã
đƣợc đục lỗ
Đo đƣờng kính vòng
phân giải
17

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
kết quả hiện trên màn hình.
2.2.5. Phƣơng pháp định danh chủng vi khuẩn (theo phƣơng pháp truyền thống)
Phƣơng pháp định danh chủng vi khuẩn theo phƣơng pháp truyền thống là
phƣơng pháp định danh dựa trên các đặc điểm về hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa.
Dựa vào đó, ta có thể phân loại chúng. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo sơ đồ sau:

Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm định danh vi khuẩn theo phƣơng pháp truyền
thống
Phƣơng pháp nhuộm gram
- Nguyên tắc của phƣơng pháp: Vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng của thuốc
nhuộm fuchsin, vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím của violet.
- Cách tiến hành:
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch hòa vào một giọt nƣớc cất
trên phiến kính, để khô tự nhiên. Sau đó cố định mẫu trên ngọn lửa đèn cồn. Tiến hành
nhuộm bằng crystal violet trong 1 phút, rửa với nƣớc cất. Tiếp tục nhỏ dung dịch
Liugol, để một phút rồi lại rửa bằng nƣớc cất, thấm khô. Tẩy cồn trong 15 – 20 giây và
Nuôi cấy vi khuẩn đƣợc tuyển
chọn
Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn
Test sinh hóa
Định danh vi khuẩn
18

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
rửa lại bằng nƣớc cất sau đó phủ dung dịch fuchsin lên lam kính trong 30 giây, đổ bỏ
dung dịch và rửa qua nƣớc. Dùng giấy thấm để thấm hoặc để khô tự nhiên. Khảo sát
hình thái tế bào và tính chất bắt màu của vi khuẩn dƣới kính hiển vi với vật kính dầu
X -100.
Phƣơng pháp xác định khả năng chịu muối
Cấy vi khuẩn lên đĩa petri chứa môi trƣờng thạch thƣờng với các nồng độ muối
khác nhau từ 1-12%, giữ trong tủ ấm. Sau 24h, quan sát nếu vi khuẩn vẫn phát triển
chứng tỏ chúng có khả năng chịu muối
Phƣơng pháp xác định khả năng lên men đƣờng
- Rót 5 ml môi trƣờng cơ bản vào các ống nghiệm. Thêm 0,5 ml dung dịch từng
loại đƣờng vào từng ống nghiệm tƣơng ứng sao cho môi trƣờng cuối cùng có nồng độ

carbonhydrate là 5%.
- Đậy nút bông và giấy bạc lại ở mỗi ống nghiệm cho kín.
- Dùng que cấy vô trùng thu sinh khối khuẩn lạc các chủng, cấy vào các ống
nghiệm môi trƣờng chứa các loại đƣờng.
- Ủ các ống nghiệm đã cấy trong tủ ấm 37
O
C. Quan sát từng ngày trong 5 ngày.
- Phản ứng dƣơng tính khi môi trƣờng chuyển từ màu đỏ sang màu vàng và
ngƣợc lại; VSV có khả năng sinh hơi khi có bọt khí trong ống duhaml
Phƣơng pháp xác định khả năng di đông
Môi trƣờng thạch mềm đƣợc rót vào ống nghiệm sau đó hấp khử trùng. Dùng kim
cấy thẳng khuẩn lạc vào tâm môi trƣờng trong ống nghiệm. Ủ các ống nghiệm đã cấy
trong tủ ấm ở 37
o
C. Sau 24h quan sát kết quả.
Xác định hoạt tính catalase
Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 5ml môi trƣờng thạch thƣờng dịch thể, đặt ở
30
o
C. Sau 1 ngày nhỏ 2 giọt H
2
O
2
30% vào dịch nuôi cấy, nếu sủi bọt ta kết luận có
hoạt tính protease, ngƣợc lại không có.