nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của hỗn hợp các chất chuyển hóa thứ cấp trong một số loài rong nâu phổ biến ở tỉnh khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM






DIỆP THỊ TỨ QUYỀN












NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH
KHÁNG KHUẨN CỦA HỖN HỢP CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA
THỨ CẤP TRONG MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU PHỔ BIẾN
Ở TỈNH KHÁNH HÒA.



ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm




Nha Trang, tháng 07 năm 2012
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM






DIỆP THỊ TỨ QUYỀN












NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH
KHÁNG KHUẨN CỦA HỖN HỢP CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA

THỨ CẤP TRONG MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU PHỔ BIẾN
Ở TỈNH KHÁNH HÒA.



ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm


GVHD: TS Nguyễn Duy Nhứt


Nha Trang, tháng 07 năm 2012
i

LỜI CẢM ƠN


Để hoàn thành được đề tài này
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Duy Nhứt đã tận tình hướng dẫn tôi
trong suốt quá trình thực hiện đồ án.
Xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong khoa Chế Biến đã truyền đạt cho tôi
những kiến thức quý báu trong suốt thời gian tôi học tập ở trường.
Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ
Nha Trang cùng các anh chị làm việc ở Viện đã quan tâm giúp đỡ tôi trong thời gian
thực tập vừa qua.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình, bạn bè đã tận tình
động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, tháng 7 năm 2012
Sinh viên thực hiện

Diệp Thị Tứ Quyền
ii

MỤC LỤC
Trang

LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC BẢNG v
DANH MỤC HÌNH vi
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2
1.1. CHẤT CHUYỂN HOÁ THỨ CẤP VÀ HOẠT TÍNH 2
1.1.1. Khái niệm về chất chuyển hóa thứ cấp 2
1.1.2. Hoạt tính sinh học của chất chuyển hóa thứ cấp 2
1.1.3. Các chất chuyển hoá thứ cấp từ rong biển 2
1.1.3.1. Acetogenins 2
1.1.3.2. Terpenoids 3
1.1.3.3. Alkaloids 4
1.1.3.4. Phenolics 5
1.1.3.5. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong biển 6
1.2. SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN VIBRIO SPP GÂY BỆNH TRÊN TÔM 10
1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio spp 10
1.2.2. Bệnh ở tôm do vi khuẩn Vibrio spp 11
1.3. ỨNG DỤNG CHẤT CHUYỂN HÓA ĐỂ SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG
WSSV. 12
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA THỨ

CẤP TỪ RONG BIỂN 13
1.4.1. Acetogenins 13
1.4.2. Terpenoids 13
1.4.3. Alkaloids 13
1.4.4. Phenolics 14
iii

1.5. KẾT LUẬN RÚT RA TỪ TỔNG QUAN 15
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
16
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 16
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.3.1. Nghiên cứu điều kiện tối ưu ở công đoạn chiết cồn của quy trình tách chiết
17
2.3.1.1. Qui trình dự kiến tách chiết hỗn hợp chất chuyển hóa thứ cấp bằng ethanol 17
2.3.1.2. Giải thích quy trình: 18
2.3.1.3. Bố trí thí nghiệm: 19
2.3.2. Xác định hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp từ rong biển Khánh Hòa
bằng phương pháp chiết ethanol. 22
2.3.3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chất chuyển hóa thứ cấp chiết ethanol
từ một số loài rong phổ biến ở tỉnh Khánh Hòa. 23
2.3.3.1. Nguyên tắc 23
2.3.3.2. Tiến hành 23
2.3.4. Tách phân đoạn hỗn hợp các chất chuyển hóa thứ cấp bằng các dung môi
phân cực khác nhau 24
2.3.5. Xác định hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp theo từng phân đoạn tách
trên các dung môi có độ phân cực khác nhau 26
2.3.6. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của một số phân đoạn các chất chuyển hóa
thứ cấp đã tách chiết được trên các dung môi phân cực khác nhau 27

2.3.7. Các máy móc thiết bị dung trong nghiên cứu khoa học 27
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28
3.1. Kết quả nghiên cứu điều kiện tối ưu của quy trình chiết ethanol 28
3.1.1. Kết quả xác định nồng độ ethanol trong công đoạn chiết ethanol 28
3.1.2. Kết quả xác định nhiệt độ chiết ethanol 29
3.1.3. Kết quả xác định thời gian chiết ethanol 30
iv

3.2. Kết quả xác định hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp từ rong biển Khánh
Hòa bằng phương pháp chiết ethanol. 32
3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chất chuyển hóa thứ cấp chiết
ethanol từ một số loài rong phổ biến ở tỉnh Khánh Hòa. 34
3.4. Xác định hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp theo từng phân đoạn tách trên
dung môi có độ phân cực khác nhau. 36
3.5. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của một số phân đoạn các chất chuyển hóa thứ
cấp đã tách chiết được trên các dung môi phân cưc khác nhau 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO 39
PHỤ LỤC 40
v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Danh mục các loài rong dùng tách chiết chất chuyển hoá thứ cấp 16
Bảng 3.1. Kết quả định lượng chất chuyển hóa thứ cấp từ các loài rong biển 32
Bảng 3.2: Hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết ethanol từ một số loài rong nghiên
cứu được pha đến nồng độ 50g/ml bằng ethanol 35
Bảng 3.3. Hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp trong các phân đoạn được phân lập
bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau 36
Bảng 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết các dung môi khác nhau từ một số

loài rong nghiên cứu 37


vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc của acetogenins 2
Hình 1.2. Cấu trúc của terpenoids 3
Hình 1.3. Cấu trúc của halogenate terpenoids 3
Hình 1.4. Cấu trúc của alkaloids 4
Hình 1.5. Cấu trúc của phenolics 5
Hình 1.6. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong đỏ 6
Hình 1.7. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong nâu 7
Hình 1.8. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong lục 8
Hình 1.9. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ tảo lam 9
Hình 1.10. Vibrio spp phân lập từ tôm sú bệnh đốm trắng 11
Hình 1.11. Đốm trắng trên vỏ đầu ngực của tôm nhiễm bệnh đốm trắng 11
Hình 2.1. Sơ đồ qui trình dự kiến tách chiết chất chuyển hóa thứ cấp bằng ethanol 18
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ ethanol 19
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết ethanol 20
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết ethanol 21
Hình 2.5. Sơ đồ qui trình tách phân đoạn hỗn hợp các chất chuyển hóa thứ cấp bằng
các dung môi phân cực khác nhau. 25
Hình 3.1. Khối lượng chất khô phụ thuộc vào nồng độ ethanol 28
Hình 3.2. Khối lượng chất khô phụ thuộc vào nhiệt độ 30
Hình 3.3. Khối lượng chất khô phụ thuộc vào thời gian 31
Hình 3.4. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết ethanol 34
Hình 3.5. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn khác nhau 36

vii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT


CHỮ VIẾT TẮT DIẾN GIẢI
WSSV White Spot Syndrome Virus
LHM Lobster Haemolymph Medium
1

MỞ ĐẦU


Trong thảm thực vật đa dạng và vô tận của đại dương, rong nâu là một trong số
các loài thực vật biển có khả năng tự tái tạo đáng được lưu ý nhất. Rong nâu chứa
nhiều các hợp chất thiên nhiên có giá trị dinh dưỡng và dược dụng cao. Đó là các chất
dinh dưỡng đường (galactose, manose, xylose, ); 17 axít béo không no; các chất
khoáng; keo và các vitamin cần thiết cho cơ thể sống; các polyphenol có khả năng
chống oxy hóa mạnh mẽ bảo vệ cơ thể loại trừ các gốc tự do nguy hiểm; fucoidan
fucan có khả năng kích thích hệ miễn dịch, chống viêm nhiễm, ngăn ngừa ung thư,
đồng thời làm tăng chỉ số chức năng gan; iốt hữu cơ giúp tuyến giáp hoạt động tối ưu,
alginate là chất giải độc tự nhiên và laminaran là chất chống đông tụ máu và ung thư.
Nước ta có bờ biển dài hơn 3.200 km trải dài từ Bắc xuống Nam, bao dọc hết
phía Đông và phía Nam đất nước với diện tích mặt nước rộng hơn 1.000.000 km
2
,
được thiên nhiên ban tặng cho nguồn tài nguyên rong nâu rất đa dạng và phong phú
trong đó rong mơ (Sargassaceae) được phát hiện trên 60 loài với sản lượng khai thác
ước tính trên 10.000 tấn/năm.
Tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu phong phú, ngày nay có rất nhiều công

trình nghiên cứu về rong biển và đã đưa vào thực tiễn ứng dụng trên người, động vật
và thủy hải sản. Tuy nhiên nghiên cứu về hoạt tính sinh học từ rong biển thì không
nhiều.
Vì vậy, đề tài ”Nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của
hỗn hợp các chất chuyển hóa thứ cấp trong một số loài rong nâu phổ biến ở tỉnh
Khánh Hòa ” là cần thiết, góp phần mở rộng nguồn nguyên liệu dược liệu, công nghệ
sinh học và nông nghiệp.
Nha Trang, tháng 7 năm 2012
Sinh viên thực hiện

Diệp Thị Tứ Quyền
2

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. CHẤT CHUYỂN HOÁ THỨ CẤP VÀ HOẠT TÍNH
1.1.1. Khái niệm về chất chuyển hóa thứ cấp
Các chất chuyển hóa thứ cấp là các hợp chất không cần thiết cho sự tăng
trưởng và tái sinh của thực vật, tuy nhiên các chất này góp phần giúp cho thực vật
ngăn cản các loại động vật ăn cỏ sử dụng chúng làm thức ăn, giúp thực vật chống đỡ
các loài vi khuẩn, và giúp cho thực vật nhận ra các mối đe dọa xung quanh [6].
Các chất chuyển hóa thứ cấp là chìa khóa cho sự tương tác giữa thực vật với
môi trường hữu sinh và vô sinh đang gây ảnh hưởng lên chúng. Theo suốt lịch sử phát
hiện và ứng dụng của các chất chuyển hóa thứ cấp phục vụ cho loài người, có thể
phân chúng thành 4 nhóm chính: alkaloids, phenylpropanoids, flavonoids và
terpenoids và đối với rong biển các chất chuyển hóa thứ cấp có trong rong biển có thể
liệt kê thành 4 nhóm cấu trúc: Terpenoids, Acetogenins, Alkaloids và Phenolics.[9]
1.1.2. Hoạt tính sinh học của chất chuyển hóa thứ cấp
Hoạt tính sinh học của chất chuyển hóa thứ cấp có thể liệt kê ra như sau:
 Antistaphylococcal [4]
 Sử dụng chúng như tín hiệu phân loài [7]

 Kháng khuẩn, chống ôxy hóa [10]
 Hoạt tính gây độc tế bào [5]
 Chống mùi hôi [2]
 Kháng virus đốm trắng của tôm [8], tăng cường miễn dịch cho tôm [13]
1.1.3. Các chất chuyển hoá thứ cấp từ rong biển [3]
1.1.3.1. Acetogenins






Hình 1.1. Cấu trúc của acetogenins
3

Acetogenins là những hợp chất tự nhiên rất phức tạp, luôn có mặt nhiều tâm
đối xứng. Cấu trúc thông thường của acetogenin có ankan mạch chính thẳng dài đến
35 hoặc 37 nguyên tử carbon với đầu cuối mạch là một -lactone. Gốc ưa nước
thường là 1 đến 2 vòng tetrahydrofuran, một vài nhóm hydroxyl ở các vị trí khác
nhau. Hầu hết các trường hợp, tâm đối xứng trong acetogenin chính là các tâm phân
cực. Acetogenin trong rong thường có mạch carbon 11 hoặc 15 nguyên tử.
1.1.3.2. Terpenoids
Terpenoids, đôi khi còn có tên gọi isoterpenoid là các hợp chất hữu cơ tự nhiên
giống như terpene, gồm các dẫn suất tạo thành từ isoprene, ví dụ như:

Hình 1.2. Cấu trúc của terpenoids
Trong tảo, rất nhiều terpenoids còn có chứa halogen gọi chung là halogenate
terpenoids.

Hình 1.3. Cấu trúc của halogenate terpenoids
4

1.1.3.3. Alkaloids
Alkaloids là hoạt chất có nguồn gốc từ sinh vật, thường là thực vật. Phân tử
alkaloids luôn luôn có chứa C, H, N, và rất hay gặp oxi, đặc biệt có vài alkaloids có
chứa lưu huỳnh. Có ít hoặc nhiều phản ứng kiềm, những alkaloids đầu tiên phát hiện
được gọi là các chất kiềm thực vật. Chúng được coi như là các bazơ nitơ hữu cơ và
cho các muối với axít. Các muối này dễ kết tinh. Về danh pháp, tên của chúng
(thường nhắc đến tên cây mà từ đó chúng được chiết xuất) mang đuôi in.
Hàm lượng alkaloids trong thực vật thay đổi trong giới hạn rất rộng. Ngày nay
người ta qui ước nói đến thực vật có alkaloids khi hàm lượng của chúng lớn hơn
100ppm. Nhiều alkaloids có trong thực vật 2 đến 3%. Đặc biệt trong vỏ cây canh ki
na có hơn 10%. Alkaloids hòa tan trong dịch tế bào, ít thấy ở trạng thái tự do, thông
thường ở dạng muối (malat, xitrat, tactrat …) hoặc kết hợp với tanin. Trong một loài
thực vật hiếm thấy chỉ có một alkaloid, mà hay gặp một nhóm bazơ ít nhiều giống
nhau về cấu trúc.
Trong alkaloids, thường gặp amin bậc 1 bậc 2 hay bậc 3. Thông thường nitơ
tham gia vào nhân dị vòng, nhưng đôi khi cũng có thể ở ngoài vòng.
Nhiều alkaloids có tác dụng trên hệ thần kinh trung ương như là chất gây trầm
uất hoặc làm chất kích thích. Một số lớn các chất tác dụng lên dây thần kinh tự chủ:
chất kích thích giao cảm, các chất liệt giao cảm, các chất kích thích phó giao cảm, các
chất liệt phó giao cảm, các chất phong bế hạch giao cảm.
Trong số các alkaloids có các chất gây tê tại chỗ, có chất trị co giật. Một ít

alkaloid có tác dụng trên tim chống rung tim cũng có chất gây trầm uất. Nhiều
alkaloids có khả năng diệt ký sinh trùng, trị amip hoặc giun và kháng virus ở liều cao.
Một số alkaloids từ rong biển như:






Hình 1.4. Cấu trúc của alkaloids
5

1.1.3.4. Phenolics
Phenol thường không có ở dạng tự do trong thực vật, nhưng lại thường gặp ở
dạng phenyl. Nhiều phenol ở dạng ete-oxyt trong tinh dầu như esragol, safrol, apion,
aneton. Trong số các diphenol, pyrocatechol là một sản phẩm của sự nhiệt phân từ
catechol, gaiacol, ete monometylic của nó có trong các sản phẩm chưng cất của nhựa
Guaiacum officinale, hắc ín của gỗ. Hydroquinol không có ở trạng thái tự do mà ở
trạng thái kết hợp dưới dạng glycozit trong acbutozit. Các diphenol có chuỗi ngang
thường gặp gồm có laccol, uruxitol…
Trong các triphenol, pyrogalon là dẫn xuất từ sự nhiệt phân của axít galic, chất
này là thành phần của vài tanin, nhân plurogluxinol có trong phân tử của thành phần
có tác dụng trị giun sán. Phenolics có hoạt tính chống oxi hóa, kháng viêm nhiễm,
chống ung thư, chữa dạ dày, kháng khuẩn …
Phloroglucinol (algae polyphenolic) từ rong biển:

Hình 1.5. Cấu trúc của phenolics





6

1.1.3.5. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong biển

Hình 1.6. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong đỏ

7

Hình 1.7. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong nâu
8

Hình 1.8. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong lục


9

Hình 1.9. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ tảo lam
10

1.2. SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN VIBRIO SPP GÂY BỆNH TRÊN TÔM
1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio spp [1]
Đặc điểm chung các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio: Gram âm, hình que

thẳng hoặc nơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm. Cơ bản chúng đều sống
trong môi trường nước, đặc biệt là nước biển và cửa sông, liên quan đến các động vật
biển. Một số loài là tác nhân gây bệnh cho người và động vật biển.
Vi khuẩn vibrio có rất nhiều trong nước mặn, và độ mặn càng cao thì vibrio càng
nhiều, vì chất Natri (Na, Sodium) trong nước mặn là yếu tố phát triển của vi khuẩn vibrio,
do đó khi độ mặn cao trên 20 phần ngàn thì phát sang nước thường xảy ra.
Loại vi khuẩn này thuộc nhóm Gram âm sống dưới nước và phân chia tế bào
rất nhanh ở độ mặn 0-40 phần nghìn đặc biệt khi nhiệt độ nước tăng cao. Do đó bệnh
thường hay xảy ra vào mùa hè.
Ngoài ra vi khuẩn loại này còn phát triển ở môi trường nước có hàm lượng chất
hữu cơ cao, hàm lượng oxy thấp. Các triệu chứng bệnh như: mòn đuôi, đứt râu, đường
ruột, đen mang, đỏ than, đỏ đuôi. Tôm bơi gần bờ phát hiện có màu đỏ nhạt và các
chứng bệnh như trên.
Vi khuẩn vibrio có nhiều trong môi trường nước mặn, do đó khó phát hiện ra là
chủng loại nào thật sự gây bệnh. Có rất nhiều tranh luận về tác nhân gây bệnh vibrio,
nhưng những báo cáo khoa học về bệnh vibrio không chung một chủng loại ở một nơi
nhất định. Cũng có nhiều ý kiến cho rằng tác nhân gây bệnh vibrio chính là một
protein độc của vi khuẩn này sau khi chết được tiết ra trong cơ thể tôm gây ngộ độc,
vì có rất nhiều trường hợp khi phát hiện tôm nhiễm vibrio người nuôi thường dùng
kháng sinh trị bệnh, nhưng tôm lại có dấu hiệu bệnh nặng hơn trước khi dùng thuốc.
Vi khuẩn này có thể sống được trong môi trường thiên nhiên, tuy nhiên chúng sẽ
chết dưới ánh sáng mặt trời, sức đề kháng yếu. Sống được khá lâu ở sông ngòi, ao hồ.
Môi trường nuôi cấy thường là canh thang, pepton kiềm ph = 8,6 hoặc thạch
kiềm muối hoặc thạch TCBS hoặc thạch TSB.


11

1.2.2. Bệnh ở tôm do vi khuẩn Vibrio spp
Những loài gây bệnh cho tôm là: V. alginolyticus, V. anguillrium, V. ordalii, V.

salmonicida, V. parahaemolyticus, V. harvey, V. vulnificus…[1].
Bệnh Vibrio thường đi chung với bệnh khác do virut, nấm ,môi trường tốt và
dinh dưỡng đầy đủ thì cơ thể tôm đủ mạnh để ngăn cản sự xâm nhập của vibrio.
Vibrio spp gây bệnh phát sáng, đỏ dọc thân, ăn mòn vỏ kitin, bệnh hoại tử mắt,
bệnh đốm trắng…[1].







Hình 1.10. Vibrio spp phân lập từ tôm sú bệnh đốm trắng








Hình 1.11. Đốm trắng trên vỏ đầu ngực của tôm nhiễm bệnh đốm trắng
12

1.3. ỨNG DỤNG CHẤT CHUYỂN HÓA ĐỂ SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG
WSSV [10].
Hiện nay, có nhiều phương pháp sử dụng các chất chuyển hóa để xử lý virus
đốm trắng như dùng bổ sung vào thức ăn, làm giàu trên atermia để cho ấu trùng ăn,
hoặc tiêm vào tôm bệnh, hoặc dùng diệt virus trong dịch chứa virus dưới đây chúng
tôi trình bày phương pháp:

Sử dụng chất chuyển hóa đưa thẳng vào dịch chứa virus để diệt:
Chuẩn bị dịch chứa virus đốm trắng [12]
Nội tạng của tôm bị bệnh đốm trắng được nghiền với hỗn hợp gồm:
90 ml (1% w/v M199, 1.88 M NaCl, 0.06 M CaCl
2.
2H
2
O, 0.1 M L-glutamine,
9.14 mM Hepes) trộn với 10ml (3.2 mM NaH
2
PO
4
.2H
2
O, pH 7.3–7.6) có chứa 5g hỗn
hợp (3.725g KCl, 29.52g MgSO
4
.7H
2
O, 32.48g MgCl
2
.6H
2
O). Sau đó ly tâm
3000v/phút trong 10 phút. Phần lỏng bên trên được tách ra và tiếp tục ly tâm
8000v/phút ở 4
0
C trong 30 phút, lọc qua màng lọc 0.45m.
Các dịch chứa virus đốm trắng sử dụng được pha loãng trong LHM (lobster
haemolymph medium)

Chuẩn bị dịch chiết thô của rong
Rong được chiết hồi lưu với ethanol trong 3 giờ, ở 40
0
C sau đó lọc, ly tâm, cô
quay chân không đến khô, ethanol tuyệt đối được đưa vào chiết các chất chuyển hóa
ra khỏi muối (NaCl tan 0% trong ethanol). Cô cạn dịch chiết lần 2 thu được hỗn hợp
các chất dạng đặc sánh bao gồm nhiều thành phần trong lipid (chất A).
Tùy theo phương pháp sàng lọc hoạt tính trên các đối tượng khác nhau chất A
được chế biến như sau:
Hòa tan lại chất A trong ethanol 1mg/ml. Dịch chiết này được hòa vào nước
biển đã được lọc tỉ lệ 3%, thổi khí mạnh để làm mất tác dụng của ethanol. Hoạt chất
được làm giàu trên Artemia, sau đó enriched-Artemia được sử dụng cho ấu trùng tôm
làm thức ăn.

13

Nếu đưa vào thức ăn cho tôm, các chất chiết được chuẩn bị bằng cách trộn với
polyvinylpyrolidon thành dạng viên.
Nếu sử dụng bằng cách trực tiếp đưa vào dịch chứa virus đốm trắng để sàng
lọc thì trước hết được hòa tan vào EtOH nồng độ 1mg/ml sau đó hòa vào nước biển đã
được lọc.
Sàng lọc hoạt tính kháng WSSV của dịch chiết rong biển bằng ethanol
25 con tôm nặng trung bình 10g/con được sử dụng cho mỗi phép thử, dịch
chứa virus được pha loãng bằng LHM đến 10 lần, dịch chứa virus đã trộn với dịch
chiết thô của tảo, LHM, được tiêm 0.2ml vào cơ thể, nuôi trong 14 ngày.
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA THỨ
CẤP TỪ RONG BIỂN [6]
1.4.1. Acetogenins
Acetogenin được chiết thô từ thực vật bằng dung môi MeOH/H
2

O (90/10). Tỉ
lệ vật liệu khô/dịch chiết là 2/3 (w/v). Metanol được loại bỏ, phần còn lại được chiết
với EtOAc vài lần. Sau đó cho bay hơi dung môi thu được hỗn hợp các chất chuyển
hóa. Chất chuyển hóa được đưa lên cột silicagen, sau đó được rửa giải với 3 dung môi
CHCl
3
, EtOAc, MeOH với tỉ lệ cho độ phân cực tăng dần. Các phân đoạn rửa giải thu
trên collection sẽ được xác định cấu trúc bằng các phương pháp hóa học cũng như các
phổ cấu trúc.
1.4.2. Terpenoids
Terpenoids được chiết từ rong bằng hỗn hợp dung môi CH
2
Cl
2
-MeOH, sau đó
hoạt chất được đưa lên silicagen và rửa bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau
như n-hexan, CH
2
Cl
2
, EtOAc, MeOH thành các phân đoạn khác nhau. Các hợp chất
trong phân đoạn được tách trên sắc ký bản mỏng và xác định cấu trúc bằng các
phương pháp hóa cùng với các phổ cấu trúc.
1.4.3. Alkaloids
Alkaloids được chiết trong MeOH 70%, cho hấp phụ lên silicagen, sau đó rửa
giải với các dung môi MeOH, CH
2
Cl
2
, n-hexan, H

2
O với các tỉ lệ khác nhau theo
14

chiều tăng dần của độ phân cực dung môi để thu các phân đoạn, sau đó cho chạy từng
phân đoạn trên sắc ký bản mỏng để tách riêng phân tích cấu trúc.
1.4.4. Phenolics
Polyphenolics trong rong được gọi là phlorotanin, đặc điểm của phlorotanin là
không chứa các thành phần đường như phenolics ở thực vật trên cạn.
Phlorotanin được chiết bằng hỗn hợp dung môi MeOH/CHCl
3
, sau khi đã loại
bỏ lipid và pigment bằng hỗn hợp dung môi n-hexan/EtOAc, tiếp theo được sấy khô,
tách thành 2 pha với EtOAc và nước. Pha hữu cơ được phân tách trên cột pha đảo để
khảo sát cấu trúc các chất phân lập được.
Trong thực tế việc chứng minh một hợp chất là chất chuyển hóa thứ cấp rất
khó khăn. Đồng thời, phải đi kèm với việc phân lập và khảo sát cấu trúc. Tất nhiên,
chỉ những chất có hoạt tính theo định hướng cần khảo sát mới được nghiên cứu cấu
trúc, và bước đầu tiên là phải sàng lọc hoạt tính. Do đó, thông thường khi sàng lọc
hoạt tính sinh học, các nhà nghiên cứu khảo sát chung tất cả các chất chuyển hóa từ
rong và dịch chiết thô từ chúng bao gồm một số nhóm chính là: fatty acids, steroids,
carotenoids, polysaccharides, lectins, mycosporine-like amino acids, halogenated
compounds, polyketides và toxins.
Để sàng lọc hoạt tính kháng WSSV của các hợp chất chuyển hoá thứ cấp từ
rong biển, tác giả Piyalai Hemtanon trong công trình đã công bố “Antiviral and
Antibacterial Substances from Spirulina platensis to combat White Spot Syndrome
Virus and Vibrio harveyi” đã dùng phương pháp chiết thô trong ethanol chung cho
các loài rong và sản phẩm thu được dùng để sàng lọc hoạt tính kháng virus đốm trắng
của tôm.
Năm 2006 nhóm tác giả của trường đại học Ege Thổ nhĩ kỳ đã chiết thô rong

biển trong nhiều dung môi khác nhau bao gồm: Methanol, acetone, diethyl ether, và
ethanol để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính thể hiện mạnh nhất ở rong nâu là
dịch chiết thô ethanol “Antimicrobial Activities of the Extracts of Marine Algae from
the Coast of Urla (Üzmir, Turkey)”.
15

Ở Việt Nam, năm 2009, tác giả Bùi Minh Lý cùng các cộng sự cũng đã tiến
hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết thô từ một số loài rong biển trong
công bố “Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn của một số loài rong biển Khánh Hoà” đã
chiết các chất chuyển hoá thứ cấp bằng ethanol.
1.5. KẾT LUẬN RÚT RA TỪ TỔNG QUAN
Từ các nghiên cứu đã công bố cho thấy hoạt tính kháng vi sinh vật của các chất
chuyển hóa thứ cấp từ các loài thực vật khác nhau được thể hiển trong dịch chiết từ
các dung môi khác nhau, tuy nhiên đối với rong biển các tác giả thường khảo sát dịch
chiết trong ethanol.
Như đã nêu trên, tác giả Piyalai Hemtanon trong công trình “Antiviral and
Antibacterial Substances from Spirulina platensis to combat White Spot Syndrome
Virus and Vibrio harveyi” đã dùng phương pháp chiết thô rong trong ethanol và dùng
chung dịch chiết này để xử lý virus đốm trắng và vibrio.
Trong khuôn khổ luận văn tốt nghiệp đại học với thời gian rất ngắn cùng với
việc Bộ NN&PTNT không cho phép gây nhiễm WSSV, chúng tôi chọn đối tượng cần
xử lý để khảo sát hoạt tính của các chất chuyển hóa thứ cấp từ rong biển là vibrio
harveyi và phương pháp chiết các chất chuyển hóa thứ cấp từ rong biển ban đầu là
chiết trong ethanol, hoàn toàn phù hợp theo phương pháp của các nhà khoa học đã
thực hiện.
16

CHƯƠNG II
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Vi khuẩn sử dụng cho nghiên cứu: vibrio harveyi
+ Vibrio harveyi thuộc giống Vibrio, họ Vibrionaceae
+ Vi khuẩn gram (-)
+ Hình que thẳng hoặc hơi uốn cong
+ Kích thước 0,3 - 0,5 x 1,4 - 2,6 µm
- 36 loài rong biển được thu từ tháng 3 đến tháng 5 năm 2012, được phân loài
và lưu trữ tiêu bản tại Viện Nghiên cứu và Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang. Danh
mục các loài rong được sử dụng tách chiết chất chuyển hoá thứ cấp được trình bày
trong bảng 2.1.
Bảng 2.1: Danh mục các loài rong dùng tách chiết chất chuyển hoá thứ cấp
STT

Tên loài rong STT

Tên loài rong STT

Tên loài rong
1
Gracilaria fisheri
13 Ulva lactuca 25 Sargassum
microcystum
2 Gracilaria blodgetii

14 Ulva reticulata 26 Sargassum
duplycatum
3 Gracilaria
tenuistipitata
15 Ulva fenestrata 27 Sargassum mcclurei

4 Gracilariopsis
bailinea
16 Valonia macrophysa 28 Sargassum
denticarpum
5 Gracilaria firma 17 Monostroma nitidum

29 Sargassum
oligocystum
6 Gelidiella acerosa 18 Acetabularia major 30 Sargassum swartzii
7 Laurencia concreta 19 Enteromorpha
compressa
31 Sargassum assimile