thử nghiệm chiết xuất kháng thể sau khi tiêm vaccin dịch tả heo cho thỏ

iii
TÓM TẮT
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 2/2008 đến tháng 8/2008
Địa điểm nghiên cứu:
 Viện Pasteur Tp. HCM
 Trung Tâm Thú Y Vùng Tp. HCM
 Phòng thí nghiệm Sinh Lý trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM
 Khu trại bò trường Đai học Nông Lâm Tp.HCM
Với mục tiêu là tìm hiểu phương pháp chiết xuất kháng thể bằng ammonium
sulphate, đồng thời xem xét khả năng đáp ứng của thỏ sau khi tiêm vaccine dich tả, đề tài
được tiến hành 2 đợt.
Đợt 1 thử liều tiêm vaccine và xét nghiệm huyết thanh bằng phương pháp ELISA, tất
cả các mẫu sau khi xét nghiệm đều cho kết quả âm tính.
Đợt 2 xem xét khả năng đáp ứng của 2 nhóm thỏ với vaccine, nhóm 2 được tiêm liều
gấp đôi nhóm 1, bằng cách lập công thức bạch cầu và xét nghiệm ELISA. Đồng thời tiến
hành thu nhận huyết thanh, tủa trong ammonium sulphate bão hòa, và thu hồi bằng
phương pháp thẩm tích để tinh chiết kháng thể (chỉ tiến hành tinh chiết kháng thể đối với
huyết thanh thu nhận vào ngày thứ 30). Kết quả tóm tắt của đợt 2 như sau:
- Tỷ lệ các loại bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân và lâm ba cầu ở 2
nhóm có điểm chung là giai đoạn đầu tỷ lệ bạch cầu trung tính tăng, giai đoạn tiếp theo tỷ
lệ bạch cầu đơn nhân tăng và giai đoạn cuối tỷ lệ lâm ba cầu tăng.
- Tiến hành xét nghiệm ELISA cho 2 nhóm vào ngày 1, ngày 20 (sau mũi
nhắc lại lần 3) và ngày 30 (sau mũi nhắc lại lần 4) kết quả là: Ở nhóm 1, thỏ 1 và thỏ 3
cho kết quả dương tính còn thỏ 2 cho kết quả âm tính vào ngày 20 và 30 (thỏ 3 vào ngày
20 nghi ngờ có kháng thể trong huyết thanh). Ở nhóm 2, thỏ 2 và thỏ 3 cho kết quả dương
tính còn thỏ 1 cho kết quả âm tính vào ngày 20 và 30.
- Qua phần trăm ức chế (PI), nhận thấy rằng hàm lượng kháng thể trong huyết
thanh sau khi tinh chiết cao hơn hàm lượng kháng thể trước khi tinh chiết.

iv
MỤC LỤC
Chương 1. MỞ ĐẦU 1
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.2. MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU 1
1.2.1. Mục tiêu 1
1.2.2. Yêu cầu 1
Chương 2. TỔNG QUAN 2
2.1. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH 2
2.1.1. Kháng nguyên 2
2.1.2. Kháng thể 3
2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của động vật 4
2.1.4. Cơ chế hình thành đáp ứng miễn dịch 8
2.2. KHÁI QUÁT VỀ CÔNG THỨC BẠCH CẦU 9
2.3. VIRUS DỊCH TẢ HEO 10
2.3.1. Đặc điểm hình thái 10
2.3.2. Độc lực 10
2.3.3. Đặc điểm nuôi cấy phân lập 11
2.4. VACCINE DỊCH TẢ HEO 11
2.3.1. Vaccine thế hệ mới 11
2.3.2. Vaccine chết 11
2.3.3. Vaccine nhược độc 11
2.5. CHIẾT XUẤT KHÁNG THỂ 13
2.5.1. Tủa bằng ammonium sulphate 13
2.5.2. Phương pháp tinh chiết bằng hệ thống gel lọc 15
2.5.3. Phương pháp tinh chiết bằng sắc ký ái lực 16
2.6. LƯỢC DUYỆT MỘT VÀI NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN 17

v
Chương 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 18
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 18
3.1.1. Thời gian 18
3.1.2. Địa điểm 18
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18
3.3. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 18
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
3.4.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ 19
3.4.2. Lập công thức bạch cầu 22
3.4.3. Thu nhận huyết thanh và kháng thể 22
3.5. CHỈ TIÊU THEO DÕI 25
3.6. XỬ LÝ SỐ LIỆU 25
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26
4.1. ĐÁP ỨNG CỦA THỎ KHI TIÊM VACCINE 26
4.1.1. Đợt 1 26
4.1.2. Đợt 2 26
4.2. PHẦN TRĂM ỨC CHẾ (PI) CỦA HUYẾT THANH NGUYÊN VÀ SAU KHI
THẨM TÍCH 31
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35
5.1. KẾT LUẬN 35
5.2. ĐỀ NGHỊ 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO 36
PHẦN PHỤ LỤC 38




vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT











Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt
APC Antigen presenting cell

Tế bào trình diện kháng
nguyên

ELISA Enzyme – linked immuno
sorbent assay

Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch
gắn enzyme
FDC Follicular dendritic cell

Tế bào tua ở nang

Ig Immunoglobulin

Globulin miễn dịch

MHC II Major histocompatibility
complex class II antigens

Các kháng nguyên phù hợp
tổ chức chính lớp II

SIg Surface immunoglobulin

Globulin miễn dịch màng tế
bào

T
H
Helper T cells

Tế bào lympho T hỗ trợ
T
I
Inducer T cells

Tế bào lympho T cảm ứng

T
DTH
Delayed type hypersensitivity
T cells

Tế bào lympho T gây quá
mẫn muộn

vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Kháng nguyên 2
Hình 2.2 Cấu trúc phân tử kháng thể 3
HÌnh 2.3 Phương pháp thẩm tích 14
Hình 2.4 Sắc ký gel lọc 15
Hình 2.5 Sắc ký ái lực 16
Hình 3.1 Chuồng nuôi thỏ 18
Hình 3.2 Lấy máu động mạch giữa tai 22
Hình 3.3 Thực hiện thẩm tích 24
Hình 3.4 Xét nghiệm ELISA 25













viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang
Bảng 2.1 Bảng công thức bạch cầu của một số gia súc nhỏ 9
Bảng 2.2 Một số loại vaccine DTH sử dụng tại Việt Nam hiện nay 12
Bảng 3.1 Thời điểm lấy máu và tiêm vaccine đợt ở 1 20
Bảng 3.2 Thời điểm lấy máu, tiêm vaccine, xét nghiệm và lập công thức
bạch cầu ở đợt 2 21
Bảng 4.1 Kết quả ELISA đợt 1 26
Bảng 4.2 Tỷ lệ bạch cầu trung tính, đơn nhân và lâm ba cầu
của thỏ đối chứng 27
Bảng 4.3 Tỷ lệ bạch cầu trung tính, đơn nhân và lâm ba cầu
của mỗi thỏ nhóm 1 28
Bảng 4.4 Tỷ lệ bạch cầu trung tính, đơn nhân và lâm ba cầu
của mỗi thỏ nhóm 2 29
Bảng 4.5 Kết quả ELISA đợt 2 31
Bảng 4.6 Kết quả PI của huyết thanh nguyên khi ELISA 32
Bảng 4.7 PI của thỏ I1 và thỏ I3 nhóm 1 32
Bảng 4.8 PI của thỏ II2 và thỏ II3 nhóm 2 32
Bảng 4.9 So sánh PI trong huyết thanh và PI sau khi thẩm tích 33





ix
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Trang
Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ của ba loại bạch cầu ở thỏ đối chứng qua các ngày 27
Biểu đồ 4.2 Trung bình của ba loại bạch cầu ở thỏ nhóm 1 qua các ngày 28
Biểu đồ 4.3 Trung bình của ba loại bạch cầu ở thỏ nhóm 2 qua các ngày 29

Biểu đồ 4.4 PI trung bình của thỏ nhóm 1và nhóm 2 vào ngày 20 và 30 33
Biểu đồ 4.5 PI của huyết thanh nguyên và PI của dịch thẩm tích 34














1

Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, việc sản xuất nhiều loại kháng thể phục vụ cho công tác chẩn đoán hoặc
dùng trong đo lường hàm lượng chất nội tiết đang trở nên cấp thiết. Kháng thể sau khi
tinh sạch có thể được sử dụng làm bộ kít, chẳng hạn bộ kít trong phương pháp ELISA,
đây là một trong những phương pháp xét nghiệm cho kết quả khá nhanh và chính xác.
Hiện tại có nhiều phương pháp để chiết xuất kháng thể, hai phương pháp thường
được sử dụng là phương pháp sắc kí và phương pháp sử dụng chất ổn định như
ammonium sulphate. Phương pháp sắc kí cho hàm lượng kháng thể cao tuy nhiên nhược
điểm của phương pháp này là đòi hỏi phải có trang thiết bị, nguyên liệu đắt tiền và kĩ
thuật thực hiện phức tạp. Riêng với phương pháp sử dụng ammonium sulphate, ngoài việc

cho ra hàm lượng kháng thể tương đối tốt, phương pháp này đơn giản và dễ thực hiện.
Với mục đích tìm hiểu về kỹ thuật cũng như hiệu quả của phương pháp sử dụng
chất ổn định ammonium sulphate trong chiết xuất kháng thể, được sự cho phép của Khoa
Chăn nuôi – Thú y cùng với sự hướng dẫn của BSTY. Nguyễn Kiên Cường và PGS.TS.
Trần Thị Dân chúng tôi đã thực hiện đề tài “Thử nghiệm chiết xuất kháng thể sau khi
tiêm vaccine dịch tả heo cho thỏ”.
1.2. MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU
1.2.1. Mục tiêu
Áp dụng kỹ thuật tách chiết kháng thể từ thú thí nghiệm.
1.2.2. Yêu cầu
Tiêm các liều vaccine dịch tả heo cho thỏ thí nghiệm.
Thu nhận huyết thanh từ thỏ thí nghiệm.
Li trích kháng thể bằng ammonium sulphate và bao thẩm tích.


2

Chương 2
TỔNG QUAN
2.1. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH
2.1.1. Kháng nguyên
2.1.1.1. Định nghĩa
Có thể tạm hiểu kháng nguyên là những chất có đặc tính như sau:
- Tính sinh miễn dịch: khả năng kích thích cơ thể có một đáp ứng miễn dịch.
- Tính đặc hiệu: khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng thể trong miễn dịch
dịch thể. Riêng trong miễn dịch trung gian qua tế bào, kháng nguyên có khả năng kết hợp
đặc hiệu với các thụ thể trên bề mặt lympho T mẫn cảm.
2.1.1.2. Khái niệm epitop
Epitop là những cấu trúc trên bề mặt của phân tử kháng nguyên, và có khả năng kích
thích tạo kháng thể chuyên biệt.

Epitop có 2 đặc tính:
 Tính kháng nguyên:
là đặc tính của một epitop có cấu
trúc ba chiều liên kết bổ sung với
phần cấu trúc ba chiều của phân tử
kháng thể. Phần cấu trúc này của
phân tử kháng thể hoặc của thụ thể
được gọi là paratop.
 Tính miễn dịch:
epitop gây ra một đáp ứng miễn
dịch trong một cơ thể.

Hình 2.1: Kháng nguyên
( />rchive.html)


3

Nếu kháng nguyên là protein thì kích thước của một epitop kháng nguyên vào
khoảng 5 – 10 acid amin. Một phân tử kháng nguyên có thể có một hoặc nhiều epitop. Số
lượng epitop phụ thuộc vào kích thước của phân tử kháng nguyên và thường có khoảng 1
epitop cho mỗi 5 kDa.
2.1.2. Kháng thể
2.1.2.1. Định nghĩa
Kháng thể được gọi là globulin miễn dịch (Ig = immunoglobulin). Ở người có 5
lớp Ig gồm IgG, IgA, IgM, IgD và IgE. Ở động vật tùy từng loài: cá chép chỉ có IgG; ở
loài nhai lại có IgA, IgM và IgG; ở gà ngoài IgA, IgM và IgG còn có IgY; IgY không
tương ứng với loại nào trên người (dẫn liệu Lê Văn Hùng, 2002). Nhìn chung các Ig đều
có chung đặc điểm: các Ig đều là protein hình cầu.

2.1.2.2. Cấu trúc của một phân tử immoglobulin
Mỗi phân tử Ig đều có hai
chuỗi polypeptide nặng kí hiệu là
chuỗi H (heavy chain) và hai
chuỗi nhẹ ký hiệu L (light chain).
Sự khác biệt chủ yếu giữa hai lớp
Ig là ở chuỗi nặng. Các chuỗi H
hoặc L trên cùng một phân tử
kháng thể bao giờ cũng giống
nhau hoàn toàn từng đôi một. Các
chuỗi được nối với nhau bằng
những cầu nối disulfua (-S-S-).
 Chuỗi nhẹ
Chuỗi nhẹ có trọng lượng
khoảng 22.000 Da, có thể phân
biệt hai týp chuỗi nhẹ khác nhau đó là týp kappa (κ) và týp lamda (λ). Hai chuỗi này có

Hình 2.2: Cấu trúc phân tử kháng thể
( />ismate5.html)


4

tính kháng nguyên khác nhau hoàn toàn. Tỉ lệ mang chuỗi nhẹ κ và λ của các Ig khác
nhau giữa các loài.
Mỗi chuỗi nhẹ có 214 acid amin. Thứ tự các acid amin 108 – 214 là hoàn toàn không
thay đổi. Còn các acid amin từ 1 – 107 có thể thay đổi về thứ tự. Đoạn này được gọi là
vùng biến đổi VL (variable light), trong vùng biến đổi có đoạn thay đổi mạnh nhất gọi là
vùng siêu biến (hypervariable regions).
 Chuỗi nặng

Chuỗi nặng có trọng lượng phân tử 50.000 Da, gồm 446 acid amin được chia làm
hai phần: vùng hằng định CH (constand heavy) và vùng biến đổi VH (variable heavy).
Người ta phân biệt 5 lớp Ig chủ yếu dựa vào sự khác nhau của các mạch
polypeptide trong chuỗi nặng. Nếu trong chuỗi nặng của Ig có các chuỗi:
- Gamma (γ) thì Ig đó được gọi là IgG
- Muy (µ) thì Ig đó được gọi là IgM
- Alpha (α) thì Ig đó được gọi là IgA
- Delta (δ) thì Ig đó được gọi là IgD
- Epsilon (ε) thì Ig đó được gọi là IgE
Ngoài các phần bất biến và siêu biến, chuỗi nặng còn một nhóm glucid được gọi là
oligosaccharide có nhiệm vụ cố định bổ thể giúp cho kháng thể dễ dàng bám vào bề mặt
của tế bào thực bào và quyết định tính kháng nguyên của phân tử kháng thể.
Theo quan điểm ngày nay, vùng siêu biến của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ tham gia
vào sự hình thành vị trí kết hợp của kháng nguyên với phân tử kháng thể (dẫn liệu Lê Văn
Hùng, 2002).
2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của động vật
2.1.3.1. Loài động vật
Đáp ứng miễn dịch càng tăng khi có sự khác biệt di truyền càng lớn giữa thú gây
miễn dịch (túc chủ) với loài được sử dụng tạo kháng nguyên, bởi vì kháng nguyên sẽ có


5

nhiều epitop lạ đối với túc chủ. Đối với hầu hết các kháng nguyên protein, thỏ là thú
thuận tiện để gây miễn dịch thực nghiệm.
2.1.3.2. Yếu tố di truyền
Khả năng đáp ứng miễn dịch của thú còn phụ thuộc vào yếu tố di truyền. Với cùng
một loại kháng nguyên, nếu đưa vào các cá thể khác nhau sẽ cho đáp ứng miễn dịch khác
nhau. Thông thường các thú lai khác dòng có khả năng kích thích miễn dịch cao hơn các
thú lai cùng dòng.

2.1.3.3. Kháng nguyên
a. Tính lạ của kháng nguyên
Điều kiện quan trọng để một kháng nguyên có tính sinh miễn dịch cao là sự khác
biệt chủng loài giữa túc chủ và kháng nguyên.
Trong miễn dịch dịch thể, kháng nguyên càng lạ với túc chủ bao nhiêu, khả năng
sinh miễn dịch càng cao bấy nhiêu. Còn trong miễn dịch qua trung gian tế bào, chỉ cần sự
khác nhau giữa các cá thể cũng gây đáp ứng miễn dịch cao.
Có một số thành phần gây tự miễn dịch với chính cơ thể đó – đây là hiện tượng do
tự kháng thể. Ví dụ: trong bệnh viêm cầu thận do cơ chế miễn dịch, cơ thể sinh kháng thể
để chống lại chính cầu thận của cơ thể mình.
b. Cấu tạo hóa học của kháng nguyên
Nhìn chung các kháng nguyên là protein hay polysaccharide đều có tính miễn dịch
cao, ngay cả khi chúng ở dạng hòa tan hay trong cấu trúc phức tạp.
Các chất gồm lipid, steroid, acid nucleic có tính sinh miễn dịch yếu hoặc không có
tính sinh miễn dịch, trừ khi chúng được gắn với một protein tải để trở thành một phức hợp
có tính sinh miễn dịch.
Các kháng nguyên được tổng hợp từ một loại acid amin thì có tính sinh miễn dịch
yếu. Các kháng nguyên được tổng hợp từ hai loại acid amin trở lên có tính sinh miễn dịch
cao. Nếu trong mạch polypeptide có thêm acid amin mạch vòng (đặc biệt là tylosin) sẽ
làm tăng tính sinh miễn dịch của phân tử polypeptide đó.


6

c. Kích thước của phân tử kháng nguyên
Kháng nguyên có kích thước lớn và cấu trúc càng phức tạp thì chúng càng dễ bị
đại thực bào phát hiện và xử lí nên có tính sinh miễn dịch cao. Những kháng nguyên có
cấu trúc phân tử nhỏ dễ bị đại thực bào bỏ qua nên có tính sinh miễn dịch thấp.
Ngoài ra, các kháng nguyên có kích thước nhỏ có thể gắn với các protein mang để
tạo đáp ứng miễn dịch.

d. Cách gây miễn dịch và liều lượng kháng nguyên
Với những kháng nguyên mạnh, đưa kháng nguyên vào đường mạch máu có thể dễ
dàng gây đáp ứng miễn dịch (ví dụ: vi khuẩn, virus, tế bào). Nhưng với kháng nguyên hòa
tan thì phải có quy trình gây miễn dịch thích hợp, tốt nhất là đường tiêm trong da, dưới da
và phải tiêm nhắc lại nhiều lần (dẫn liệu Lê Văn Hùng, 2002).
Nếu lượng kháng nguyên quá ít thì không đủ gây đáp ứng miễn dịch. Ngược lại,
nếu lượng kháng nguyên nhiều quá sẽ gây ức chế miễn dịch.
Quy trình gây miễn dịch có ảnh hưởng lớn tới tính sinh miễn dịch của phân tử
kháng nguyên. Gây miễn dịch trên hai lô thú thuần chủng với cùng một loại kháng
nguyên nhưng ở hai quy trình chủng ngừa khác nhau thì đáp ứng miễn dịch cũng khác
nhau. Với những kháng nguyên yếu thường phải chủng ngừa bằng quy trình hết sức
nghiêm ngặt và chủng nhiều lần mới có đáp ứng miễn dịch mạnh. Trong khi đó, những
kháng nguyên mạnh có khi chỉ cần chủng ngừa một lần cũng gây đáp ứng miễn dịch
mạnh.
e. Hiệu ứng cộng lực kháng nguyên
Nếu cùng một lúc gây mẫn cảm nhiều loại kháng nguyên cho con thú, kháng thể
đặc hiệu được sinh ra tương ứng với mỗi loại kháng nguyên; tuy nhiên, lượng kháng thể ít
nhất ngang bằng hoặc nhiều hơn so với khi kháng nguyên đó tác dụng một mình. Hiện
tượng này là sự cộng lực kháng nguyên hay cộng kích thích kháng nguyên. Đây là cơ sở
khoa học cho các nhà chế tạo vaccine đa giá. Tuy nhiên, cũng cần phải chú ý rằng: nếu
cùng một lúc cho con thú mẫn cảm hai loại kháng nguyên (một liều mạnh, một liều nhẹ)


7

thì con thú chỉ phản ứng với kháng nguyên liều mạnh. Hiện tượng này gọi là sự cạnh
tranh kháng nguyên. Hiện tượng cạnh tranh kháng nguyên chỉ xảy ra ở hai kháng nguyên
có cấu trúc hóa học gần giống nhau (dẫn liệu Lê Văn Hùng, 2002).
f. Phản ứng thứ phát (phản ứng nhớ)
Nếu sử dụng kháng nguyên cho một con vật đã được mẫn cảm với kháng nguyên

đó một lần rồi, hàm lượng kháng thể sẽ tăng sớm và nhiều hơn lần đầu (có trường hợp gấp
hàng trăm lần). Phản ứng nhớ này tồn tại trong một thời gian khá dài sau mũi tiêm thứ
nhất. Đó là nhờ các tế bào lympho sau tiếp xúc với kháng nguyên đã trở thành tế bào ký
ức, để khi kháng nguyên vào lần sau sẽ lập tức tăng sinh thành dòng tế bào có hoạt tính
miễn dịch.
g. Chất bổ trợ
Các tá chất được sử dụng rộng rãi để tăng hiệu quả của các loại vaccine, tăng khả
năng thực bào của đại thực bào đối với kháng nguyên. Ngoài ra, tá chất còn gây một phản
ứng viêm không đặc hiệu làm tăng tính sinh miễn dịch.
Các nghiên cứu gần đây đã kết luận tá chất có tác dụng làm tăng lympho hỗ trợ
(helper T cells - T
H
). Khi bổ sung tá chất vào kháng nguyên sẽ làm kháng nguyên tồn tại
lâu hơn trong cơ thể túc chủ. Kháng nguyên được giải phóng dần dần có tác dụng giống
như kích thích miễn dịch nhiều lần.
Một số loại tá chất: Freund’s complete adjuvant (FCA) và Freund’s incomplete
adjuvant (FIA), aluminium hydroxide (ALUM), ribi adjuvant system (RAS)…
h. Sự hợp tác tế bào
Có hai loại đáp ứng miễn dịch: đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào do lympho
T phụ trách và đáp ứng miễn dịch dịch thể do lympho B phụ trách. Hai hình thức này có
liên quan chặt chẽ với nhau. Trong đáp ứng miễn dịch dịch thể với nhiều loại kháng
nguyên, sự hỗ trợ của lympho T là rất quan trọng. Những tế bào lympho T làm nhiệm vụ
này được gọi là lympho T
H
.


8

Các kháng nguyên là protein khi vào cơ thể thường tương tác với các lympho T

H

và hoạt hóa tế bào này nên thường có tính sinh miễn dịch mạnh. Các kháng nguyên là
carbonhydrate khi vào cơ thể không tương tác với lympho T
H
, nên tính sinh miễn dịch
yếu.
2.1.4. Cơ chế hình thành đáp ứng miễn dịch
Đối với kháng nguyên phụ thuộc tuyến ức
Kháng nguyên phụ thuộc tuyến ức sẽ bị đại thực bào bắt và xử lý, sau đó các quyết
định kháng nguyên này được trình diện trên bề mặt đại thực bào. Các lympho T đến nhận
diện các quyết định kháng nguyên, trong đó lympho T cảm ứng (T
I
) có vai trò quan trọng
đặc biệt.
Khi nhận diện được quyết định kháng nguyên đặc hiệu nằm trong phức hợp kháng
nguyên của đại thực bào, lympho T
I
bị kích thích và tiết ra yếu tố C1 để hoạt hóa đại thực
bào. Đại thực bào được hoạt hóa sẽ tiết ra interleukin 1 để tác động trở lại lympho T
I
. Sau
khi được hoạt hóa, lympho T
I
tăng sinh và tiết ra interleukin 2, chất này sẽ tác động lên
một loạt tế bào, trước hết là các loại tế bào lympho cùng đến nhận diện các quyết định
kháng nguyên được trình diện trên bề mặt đại thực bào, đó là lympho T hỗ trợ cho
lympho B, lympho T gây quá mẫn muộn. Các tế bào này sau khi đã nhận diện được các
quyết định kháng nguyên thì xuất hiện các thụ thể để tiếp nhận kích thích của interleukin
2. Sau khi có hai tín hiệu cần và đủ, chúng hoạt hóa và phát huy tác dụng.

Lympho T gây quá mẫn muộn (T
DTH
) sẽ tăng sinh và tiết ra lymphokin có ảnh
hưởng đến hoạt động của các tế bào khác tại nơi có mặt kháng nguyên, dẫn đến hình
thành phản ứng viêm kiểu quá mẫn muộn.
Đối với kháng nguyên không phụ thuộc tuyến ức
Một số ít kháng nguyên có thể hoạt tác làm tăng sinh biệt hóa lympho B rồi sản
xuất kháng thể mà không cần sự giúp đỡ của lympho T. Các kháng nguyên này thường có
đặc điểm chung là một đại phân tử do sự trùng phân của các đơn vị nhỏ và có khả năng


9

hoạt hóa lympho B. Ví dụ: lipopolysaccharide, dextran, ficoll… (dẫn liệu Phạm Hoàng
Phiệt, 2006).
2.2. KHÁI QUÁT VỀ CÔNG THỨC BẠCH CẦU
Bạch cầu trung tính có kích thước 10 – 15 µm. Giai đoạn non có nhân hình móng
ngựa, hình gậy; khi già nhân chia thành 2 – 5 thùy nên còn gọi là bạch cầu đa nhân. Tế
bào này vận động amip, xuyên mạch, thực bào một số vật lạ nhỏ. Bạch cầu trung tính tăng
trong nhiều bệnh truyền nhiễm, phản ứng viêm có mủ, bị ngộ độc, hay tiêm protein lạ vào
cơ thể (dẫn liệu Trần Thị Dân và Dương Nguyên Khang, 2006).
Bạch cầu ưa acid khoảng 14 – 20 µm, nhân hình móng ngựa, hình bầu dục, hình ba
lá. Tế bào chất có hạt bắt màu eosin. Hạt nhỏ có ở loài nhai lại (trâu, bò, dê, cừu), hạt vừa
ở heo, hạt to ở ngựa.
Bạch cầu ưa bazơ có kích thước 10 – 18 µm. Chúng có rất ít trong máu.
Lâm ba cầu có hai loại. Lâm ba cầu lớn có kích thước 10 – 18 µm, có khả năng vận
động amip giới hạn. Lâm ba cầu nhỏ có kích thước khoảng 6 – 10 µm.
Bạch cầu đơn nhân lớn khoảng 14 – 22 µm, còn gọi là đại thực bào, có vai trò loại
bỏ các mô bào chết.
Công thức bạch cầu thay đổi đi đôi với những xáo trộn cơ quan tạo máu. Ví dụ: khi

bị khối u bạch huyết làm cho lâm ba cầu tăng; khi bị khối u tủy xương làm cho bạch cầu
hạt tăng; khi bị khối u mạng lưới võng nội làm cho bạch cầu đơn nhân lớn tăng.
Bảng 2.1: Bảng công thức bạch cầu của một số gia súc nhỏ
Loài
BC trung
tính
BC ưa acid BC ưa bazơ Lâm ba cầu BC đơn nhân

Chó 60 – 75 3 – 8 0,2 – 0,6 20 – 25 2 – 4
Mèo 55 – 63 3 – 6 0,2 – 0,6 30 – 35 2 – 4
Thỏ 45 – 55 1 – 3 1 – 5 35 – 45 4 – 6
Bọ 40 – 45 3 – 6 0,4 – 0,8 45 – 50 4 – 8
(dẫn liệu Trần Thị Dân và Dương Nguyên Khang, 2006)


10

Tiến trình phòng vệ của cơ thể có thể dự đoán qua sự biến đổi của tỷ lệ các loại
bạch cầu trong công thức bạch cầu, nó chia làm 3 kỳ như sau (dẫn liệu Trần Thị Dân và
Dương Nguyên Khang, 2006).
- Giai đoạn đầu: tổng số bạch cầu tăng cùng với bạch cầu trung tính tăng.
- Giai đoạn 2: tổng số bạch cầu giảm cùng với bạch cầu đơn nhân tăng.
- Giai đoạn lành bệnh: tổng số bạch cầu tiếp tục giảm, bạch cầu ưa acid và
lâm ba cầu tăng cao.
2.3. VIRUS DỊCH TẢ HEO
Virus dịch tả heo (DTH) thuộc giống Pestivirus của họ Flaviviridae, có đặc điểm
không nhân lên trong động vật không xương sống và có phản ứng chéo giữa các virus
trong giống.
2.3.1. Đặc điểm hình thái
- Kích thước nhỏ

- Đối xứng 20 mặt
- Có vỏ bọc
- Chỉ số lắng: 140 s
- Tỷ trọng: 1,13
2.3.2. Độc lực
Các chủng virus có độc lực cao gây ra bệnh cấp tính, tỷ lệ chết cao cùng với sự
bùng nổ của các ổ dịch. Heo nhiễm virus cường độc sẽ thải virus với số lượng lớn trong
suốt quá trình bệnh. Các chủng có độc lực thấp gây bệnh ở thể bán cấp tính, mãn tính
hoặc ở thể không điển hình, gây tỷ lệ chết cao trên bào thai và heo sơ sinh.
Các chủng có độc lực khác nhau thì có tốc độ lây lan khác nhau. Tuy nhiên, sự phát
bệnh còn chịu nhiều ảnh hưởng bởi các yếu tố như giống, tuổi, sự cạnh tranh miễn dịch và
điều kiện dinh dưỡng (van Oirschot, 1998).




11

2.3.3. Đặc điểm nuôi cấy phân lập
Trên động vật cảm thụ: khi tiêm truyền qua cơ thể heo, các chủng virus DTH giữ
nguyên các đặc tính gây bệnh và miễn dịch của chúng. Sự thích nghi của virus đối với các
loài động vật khác làm thay đổi tính gây bệnh của virus đối với heo (Stadejek, 1994). Thỏ
là động vật được chú ý nhất, đặc biệt là để tạo ra những chủng virus vaccine giảm độc.
Trên môi trường nuôi cấy tế bào, virus có thể nhân lên trên một số lớn loại tế bào,
đặc biệt là tế bào nguyên thủy từ thận heo (PK – 15 hay R.P) và cả trên tế bào dịch hoàn
heo. Virus không gây bệnh tích tế bào trên tế bào nuôi cấy.
2.4. VACCINE DỊCH TẢ HEO
2.3.1. Vaccine thế hệ mới
Bao gồm vaccine tái tổ hợp E
2

(gp55) và vaccine DNA mã hóa E
2
… Các vaccine
này ngoài việc bảo hộ heo chống bệnh DTH, còn phân biệt được heo có kháng thể do
nhiễm bệnh hay do tiêm vaccine dựa trên sự phát hiện kháng thể kháng protein E
rns
hay
NS3 (vaccine tiểu phần) hay E
2
(vaccine tái tổ hợp). Các kháng thể này được gọi là kháng
thể đánh dấu (marker antibodies) (Koenen và ctv,1999).
2.3.2. Vaccine chết
Ưu điểm của vaccine này là mức độ an toàn nhưng có nhược điểm là đáp ứng miễn
dịch chậm, kém và thời gian bảo hộ chỉ được vài tháng ngay cả sau khi tiêm nhắc lại
nhiều lần.
2.3.3. Vaccine nhược độc
Vaccine này tạo được miễn dịch cao, miễn dịch này thường phát triển trong vòng
4 – 7 ngày sau tiêm phòng và kéo dài vài năm. Tuy nhiên, vì mức độ nhược độc chưa đạt
yêu cầu nên tính an toàn và ổn định về di truyền là vấn đề cần được chú trọng trong sản
xuất vaccine (dẫn liệu Nguyễn Tiến Dũng, 2002).


12


Hiện nay, nước ta đang sử dụng một vài loại vaccine DTH như sau:

Bảng 2.2: Một số loại vaccine DTH sử dụng tại Việt Nam hiện nay

Tên thương mại của

vaccine DTH
(Nước sản xuất)
Chủng virus
dùng sản xuất
vaccine
Cách sản xuất
vaccine
Thời điểm tiêm lần
đầu (heo con từ nái
đã tiêm phòng, vùng
đe dọa)
DTH ĐÔNG KHÔ
(Việt Nam)
C Thỏ hóa 15 – 30 ngày tuổi
COLAPEST
(Hungary)
Thiveral Tế bào thận heo 28 – 35 ngày tuổi
PESTIFFA
(Pháp)
C Tế bào thận heo 30 ngày tuổi
PEST – VAC
(Mỹ)
C Tế bào thận heo
1 tuần trước tuổi
phát bệnh
PORCILIS CSF LIVE
(Hà Lan)
GPE Tế bào thận heo
1 – 2 tháng tuổi (lưu
ý lượng KT mẹ

truyền)
(dẫn liệu Nguyễn Thị Thu Hồng, 2003)




13

2.5. CHIẾT XUẤT KHÁNG THỂ
2.5.1. Tủa bằng ammonium sulphate
Kháng huyết thanh thu được không những chứa kháng thể mà còn có một số chất
khác. Để tách kháng thể ra khỏi kháng huyết thanh ta có thể dùng phương pháp sắc kí, kết
tinh hay tủa trong muối…
Phương pháp tủa kháng thể trong ammonium sulphate là một trong những phương
pháp phổ biến nhất để tách protein ra khỏi dung dịch. Trong dung dịch, protein liên kết
với nước bằng các liên kết hydrogen thông qua các nhóm ion tích điện của chúng. Khi
thêm vào một lượng lớn các ion nhỏ và tích điện lớn như ammonium hay sulphate thì
những nhóm này cạnh tranh với protein để gắn vào các phân tử nước, do đó làm giảm khả
năng hòa tan của protein và chúng kết tủa lại. Protein kết tủa có thể hòa tan lại trong môi
trường có nồng độ ammonium sulphate thấp hơn. Khả năng kết tủa của các protein khác
nhau tùy thuộc vào số lượng và vị trí các nhóm cực tích điện, trọng lượng phân tử của
protein, pH của dung dịch, nhiệt độ xảy ra sự kết tủa.
Để tủa kháng thể người ta thường sử dụng ammonium sulphate (đôi khi dùng
sodium sulphate). Nồng độ muối để kháng thể kết tủa ở các loài thì khác nhau. Hầu hết
các kháng thể của thỏ có thể kết tủa ở dung dịch muối bão hòa 40 %, còn ở chuột khoảng
45-50 %. Bởi vì hầu hết các thành phần khác của huyết thanh không kết tủa ở khoảng
nồng độ muối này và không có sự khác biệt lớn giữa hai nồng độ trên nên nồng độ muối
bão hòa 50 % là mức thích hợp nhất cho hầu hết các ứng dụng khác nhau (dẫn liệu
Nguyễn Vân Anh, 2005).
Một điểm bất lợi của kháng thể tủa trong ammonium sulphate bão hòa là kháng thể

không được tinh sạch vì có các phân tử protein có trọng lượng phân tử lớn khác cũng kết
tủa. Do đó, ngoài việc tủa trong muối ammonium sulphate cần phải kết hợp với một số
phương pháp khác (sắc ký ái lực, sắc ký lọc) nếu yêu cầu kháng thể cuối cùng phải được
tinh sạch hoàn toàn.



14


Hình 2.3: Phương pháp thẩm tích
(
Tinh chiết kháng thể bằng phương pháp thẩm tích
Một trong các phương pháp cổ điển để loại muối ra khỏi protein kháng thể là thẩm
tích. Dung dịch protein được chứa trong bao thẩm tích làm bằng cellulose có thắt nút ở
hai đầu. Bao này được đặt trong cốc lớn chứa dung dịch đệm có ái lực thấp và để ở nhiệt
độ lạnh có khuấy trộn vừa phải. Trên bao thẩm tích có những lỗ nhỏ cho phép những phân
tử muối có kích thước nhỏ đi ra ngoài còn các phân tử protein kháng thể có kích thước lớn
được giữ lại trong bao thẩm tích. Sự khuếch tán các phân tử muối vào trong dung dịch
đệm thẩm tích vẫn tiếp tục cho đến khi nồng độ muối bên trong và bên ngoài bao thẩm
tích đạt trạng thái cân bằng (thường khoảng 5 – 6 giờ). Nếu sau khi đạt trạng thái cân
bằng mà dung dịch protein chưa loại hết muối thì đặt bao thẩm tích trên vào một dung
dịch đệm mới và cứ tiếp tục như thế cho đến khi loại hết muối ra khỏi dung dịch protein.
Trong quá trình thẩm tích, ngoài muối còn có các chất chuyển hóa có kích thước nhỏ như
ATP, coenzyme… cũng bị loại ra khỏi bao thẩm tích.

15


Hình 2.4: Sắc ký gel lọc
( />erheads-1/ch5_mol-seive.jpg)
2.5.2. Phương pháp tinh chiết bằng hệ thống gel lọc
Là phương pháp để phân
tách các phân tử có kích thước và
trọng lượng phân tử khác nhau
bằng cách cho chúng đi qua cột
gel.
Sắc kí lọc dùng vật liệu là
những vi hạt gel có khả năng
ngậm nước rất cao. Các hạt gel
này là những sợi polymer dài, có
những cầu nối liên kết ngang để
làm giảm bớt độ mềm, chịu được
sức ép khi bị nén mà không biến
dạng, vẫn cho phép dung môi lưu
thông.
Giữa các sợi polymer có
không gian trống cho phép các
phân tử tan trong dung môi có thể
thấm vào, do đó có thể di chuyển
quanh co trong cấu trúc của hạt
gel.
Khi cho hỗn hợp chứa những phân tử có kích thước khác nhau qua cột sắc kí, với
những lỗ có kích thước giới hạn nhất định thì các phân tử có kích thước lớn hơn không
khuếch tán qua lỗ. Do đó, chúng sẽ ra khỏi cột trước. Những phân tử nhỏ khuếch tán vào

trong lỗ gel và di chuyển trong lỗ gel. Sau đó chúng sẽ được đẩy ra khỏi cột bằng dung
dịch đẩy.



16

Hình 2.5: Sắc kí ái lực
(dd: dung dịch)
/>/overheads-1/ch5_affinity.jpg

2.5.3. Phương pháp tinh chiết bằng sắc ký ái lực
Trong phương pháp này các chất mang trên cột chứa các nhóm hóa học có ái lực
đặc biệt với sản phẩm. Vì vậy khi cho một hỗn hợp các chất trong đó có chứa sản phẩm đi
qua cột, sản phẩm mục tiêu được gắn một cách chuyên biệt vào chất mang và tất cả các
thành phần khác không có ái lực với chất mang sẽ đi qua cột nhờ một đệm rửa. Sau đó,
sản phẩm sẽ được thu nhờ dung dịch đẩy.












17

2.6. LƯỢC DUYỆT MỘT VÀI NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN
Nước ngoài
Wilson and Nakane (1978) đã chiết xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp tủa
ammonium sulphate, sau đó gắn kháng thể với horesradish peroxidase (HPRO).
Kháng thể đơn dòng được tủa ammonium sulphate từ dịch báng nước chứa tế bào
lai (Wurzer và Schulze, 1992) .
Michael Yiu – Kwong Leung và Walter Kwok Ho (2005) tinh sạch kháng thể đơn
dòng bằng cách sử dụng phương pháp sắc kí lọc (cột protein G), tủa ammonium sulphate
và thẩm tích.
Trong nước
Nguyên Vân Anh (2005) thử nghiệm sản xuất kháng huyết thanh kháng vi khuẩn E.
coli. Một vài kết quả ghi nhận của tác giả là: phát hiện được kháng thể trong kháng huyết
thanh sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến
kính; hiệu giá kháng thể của huyết thanh sau khi tủa và thẩm tích giảm đáng kể so với ban
đầu.
Nguyễn Thị Kim Hiền (2006) tinh chế kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B bằng
3 phương pháp: tủa ammonium sulphate, sắc kí gel lọc và sắc kí ái lực. Trong 3 phương
pháp, sắc kí ái lực cho kết quả tinh chế tối ưu nhất.


18


Hình 3.1: Chuồng nuôi thỏ
Chương 3
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
3.1.1. Thời gian
Từ tháng 02/2008 đến tháng 08/2008

3.1.2. Địa điểm
 Viện Pasteur Tp. HCM
 Trung Tâm Thú Y Vùng Tp.HCM
 Phòng thí nghiệm Sinh lý trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM
 Khu trại bò trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
 Ghi nhận đáp ứng miễn dịch của thỏ đối với vaccine dịch tả heo.
 Đánh giá lượng kháng thể sau khi tiêm các liều vaccine DTH khác nhau và
sau khi chiết xuất bằng phương pháp của ammonium sulphate.
3.3. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM
 Thỏ có tất cả 10
con. Đây là giống thỏ lai với
trọng lượng mỗi con khoảng 2
kg, mỗi thỏ được nuôi trong
chuồng có kích thước 40 × 60 ×
40 cm. Thức ăn cho thỏ gồm
cám hỗn hợp và thức ăn xanh
được rửa sạch như rau muống,
cà rốt …