đề tài sản xuất chế phẩm trichoderma, bacillus dùng kiểm soát sinh học fusarium sp. và pythium sp. và kích thích sinh trưởng ở cây đậu

ĐỀ TÀI:
Sản xuất chế phẩm Trichoderma,
Bacillus dùng kiểm soát sinh học
Fusarium sp. và Pythium sp. và kích
thích sinh trưởng ở cây đậu.
NHÓM 7
BÀI BÁO CÁO VI SINH ỨNG DỤNG
Tổng Quan

Bacillus.

Là vi khuẩn hình que, Gram dương, có khả
năng chuyển động.

Phần lớn có lợi cho con người.

Hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi

Hình thành nội bào tử.

Nhiệt độ tối ưu: 30 - 45 độ.

pH: 2- 11

Có khả năng gây bệnh cho côn trùng.

Trichoderma:

Thuộc nghành nấm Mycota.


Hiện diện nhiều trong đất.

pH: 4- 8, hiếu khí.

Sinh sản vô tính bằng bào tử, một số sinh sản hữu
tính.

Tiêu diệt, khống chế, ngăn ngừa các loại nấm bệnh:
Fusarium, Pythium

Tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm.

kích thích tăng trưởng và phục hồi bộ rễ cây trồng.

Phân giải tốt các chất xơ , chitin, lignin giúp cho
cây hấp thụ dễ dàng.

Nấm Fusarium sp.

Là một trong những loại nấm gây hại nhiều
nhất cho cây trồng.

Sinh độc tố có tính độc cao.

phổ biến trong đất, lưu tồn dạng bào tử hoặc
khuẩn ty.

Gây bệnh ngẽn mạch, thối rễ thối thân, thối
hạt, trái.


Tấn công vào bộ rễ. gây hại cho đậu, cà chua,
cam quýt, khoai tây.

Pythium sp.

Là một vsv giống với nấm.

Phổ ký chủ rộng.

Sinh sản vô tính bằng bào tử động.

Gây tàn lụi và chết rạp ở cây con( do ẩm
ướt).

Gây thối củ ( khoai tây, cà rốt ).

Gây thối củ và quả : là một bệnh chủ yếu ở
Lạc.
Nguyên tắc phân lập:
- Gieo cấy vi khuẩn đã pha loãng trên môi trường
dinh dưỡng đặc trưng (2% thạch hay còn gọi là agar).
- Nuôi dưỡng trong điều kiện thích hợp cho mọc các
khuẩn lạc tách biệt nhau.
- Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi
trường dinh dưỡng thạch nghiêng để thu nhận chủng
vi khuẩn thuần khiết (do Robert Koch đề ra).
PHÂN LẬP
PHÂN LẬP BACILLUS
1. Mẫu:


Nốt sần đậu phộng có kích thước lớn, có màu đỏ hống.
Rửa sạch, ngâm cồn 5 phút, rửa nước, nghiền nát bằng kim
mũi mác, bổ sung thêm 3ml nước cất ta thu được dung dịch
chứa vi khuẩn trên.

Đất: lấy đất gần tầng mặt, không lấy ở phần đất sâu.
2. Pha loãng mẫu:
Cân 10g đất nghiền trong cối sứ (đã sấy tiệt trùng) hòa với
90ml nước muối sinh lý chứa sẵn trong bình tam giác 200ml
vô trùng.
Lắc đều trên máy lắc tốc độ 150v/p trong 30 phút.
Đun sôi cách thủy 15 phút thu được huyền dịch 10
-1,
Lắc đều
huyền dịch rồi dùng micropipet hút vô trùng 1ml huyền dịch
vào ống nghiệm chứa sẵn 90ml nước muối sinh lý đã tiệt
trùng để được độ pha loãng 10
-2
, tương tự thu được các nồng
độ 10
-3
, 10
-4
,…
3.Cấy phân lập:
Cấy trang các dung dịch thu được trên thạch đĩa NA
nuôi trong tủ ấm ở 37
0
C trong 24h.
Chọn khuẩn lạc nghi ngờ tiến hành nhuộm Gram và

thử các phản ứng sinh hóa.
4. Xác định vi khuẩn Bacillus
Đem khuẩn lạc nghi ngờ đi nhuộm Gram và xem dưới
kính hiển vi.
Nếu thấy có đặc điểm của Bacillus thì cấy truyền
khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường thạch nghiêng NA
để giữ giống thử test sinh hóa tiếp theo.
Giám định đặc tính sinh hóa: catalaza (+), nitrate (+),
VP (+), citrate (+), methyred (+), maltose (-).
PHÂN LẬP TRICHODE RMA

1. Mẫu:

Đất: lấy từ các ruộng trồng đậu.

Làm mịn đất qua rây 1mm.
2. Pha loãng mẫu:

Cân 1g đất mịn hòa vào 100ml nước sinh lý
có 0,5% tween 80.

Đặt lên máy lắc trong 30 phút với tốc độ
110v/p.

Hòa loãng ở các nồng độ khác nhau.

3. Phân lập mẫu:
Đem các dung dịch được pha loãng ở các nồng độ khác
nhau cấy trên mội trường thạch.
Phân lập các khuẩn lạc điển hình của Trichoderma, làm

thuần các dòng Trichoderma.
4. Thử ảnh hưởng độc tố trên cây trồng:
Tẩm hạt và phun lên cây, khi thấy không có ảnh hưởng
xấu với cây mới, thực hiện các thí nghiệm tiếp theo như
định danh, xác định khả năng ức chế phát triển các vi
sinh vật gây bệnh cây.
ĐỊNH TÍNH

Các bước thực hiện:

Chuẩn bị dịch khuẩn: Vi khuẩn được hòa vào
nước muối sinh lý nồng độ 0,85% để có mật độ
khoảng: 1-2.108 CFU/ml).

Chuẩn bị dịch nấm (Fusarium sp, Pythium sp,
Trichoderma): Nấm mốc được pha trong nước
muối sinh lý 0,85% để có mật độ 1 - 2.106 tb/ml
(đếm bằng buồng đếm hồng cầu).

Môi trường thử định tính: NA 37
o
C/24h.

Nấm gây bệnh được hoạt hóa trên môi
trường PDA (Potato dextrose agra)
37
o
C/3 ngày (ống thạch nghiêng).
1. Thử khả năng đối kháng nấm gây bệnh của
các chủng Bacillus.


Nhằmchọn ra chủng có hoạt tính mạnh nhất.

Tiến hành thử nghiệm đối kháng:

Hút 10µl dịch nấm (Fusarium sp và Pythium sp)
và dịch khuẩn (Bacillus) cấy đối xứng nhau qua
đường kính đĩa môi trường PGA.

Khoảng cách giữa chúng là 3cm.

Tiến hành lập lại thí nghiệm nhiều lần để cho kết
quả chính xác.

Sau khi cấy: Ủ ở 37
o
C trong 3 ngày.

Đánh giá kết quả: xem chủng Bacillus
nào kháng nấm mạnh nhất, chọn chủng
Bacillus đó.
2. Thử khả năng kháng nấm của Trichoderma.

Môi trường thử đối kháng: SA( Sabouraud
agar).

Nấm gây bệnh cũng được nuôi trên môi
trường thích hợp để chúng phát triển tốt.

Tiến hành thử nghiệm đối kháng:


Hút 10µl dịch nấm Trichoderma và 10µl dịch
nấm gây bệnh (Fusarium sp. và Pythium sp.) cấy
đối xứng nhau qua đường kính đĩa, cách mép đĩa
petri 1-1.5cm.
Tiến hành lập lại thí nghiệm nhiều lần.

Thí nghiệm được quan sát 2 ngày 1 lần, sau 3
ngày tiến hành chọn lọc các chủng kháng bệnh
mạnh nhất.
Trichoderma kháng Fusaryum
sp.
a. Đánh giá khả năng kháng nấm:
•
Phần nấm Trichoderma phát triển bao phủ
qua phần nấm gây hại.
•
Phần nấm gây hại bị bào mòn dần ở mép
khuẩn lạc.
•
Phần nấm Trichoderma phát triển và khống
chế làm cho nấm gây hại không phát triển
được.
b. Đánh giá mức đối kháng của nấm:
•
Kháng mạnh: Nấm Trichoderma tấn công và phá hủy
hoàn toàn nấm gây hại, kí hiệu: +++
•
Kháng trung bình: Nấm Trichoderma tấn công và phá
hủy một phần nấm gây hại, kí hiệu: ++

•
Kháng yếu: Nấm Trichoderma ngăn chặn sự phát triển
của nấm gây hại, kí hiệu: +
•
Không kháng: nấm gây hại gần như phát triển bình
thường, xâm nhập vào vùng phát triển của nấm, kí
hiệu: Chọn chủng Trichoderma kháng nấm mạnh nhất.
3. Thử khả năng kết hợp của nấm Trichoderma với chủng
Bacillus đã được chọn qua định tính.
•
Từ chủng nấm Trichoderma và chủng Bacillus đã được
chọn ra sau khi định tính ta tiến hành thử khả năng kết hợp
giữa chúng.
•
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: PGA.
•
Trichoderma và Bacillus được cấy đối xứng nhau qua
đường kính đĩa petri, khoảng cách giữa chúng là 3cm .
•
Quan sát khả năng kết hợp giữa chúng:

Trichoderma và Bacillus cùng mọc được trên cùng môi
trường: không ức chế lẫn nhau.

Trichoderma mọc lấn ác Bacillus hoặc ngược lại.

Ức chế lẫn nhau.
•
Chọn ra chủng nấm Trichoderma và chủng Bacillus có
khả năng kết hợp nhau tốt nhất.

ĐỊNH LƯỢNG

Khảo sát phần trăm ức chế:
Công thức tính phần trăm ức chế:

Đường kính đĩa đối chứng - Đường kính đĩa cấy x 100%
Đường kính đĩa đối chứng
Nếu % ức chế càng lớn thì khả năng
ức chế của Trichoderma và Bacillus
càng mạnh. Người ta sẽ chọn những
nấm có % ức chế lớn nhất đem thử
nghiệm Invivo.