Đề tài Sản xuất chế phẩm Enzym Amylase từ môi trường lỏng

Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 1


LỜI NÓI ĐẦU

Enzyme giữ vai trò cực kì quan trọng trong ngành công nghệ sinh học hiện đại, hiện
nay việc sản xuất và ứng dụng các chế phẩm enzym đang phát triển rất mạnh mẽ.
Nước ta là một nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm rất thuận lợi cho sự phát triển của
vi sinh vật. Vì thế ngành công nghiệp sản xuất các chế phẩm enzym và ứng dụng chúng ở
nước ta hiện nay rất phát triển, trong đó hệ enzyme amylase là một trong số các hệ
enzyme được sử dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực khác nhau.
Với đề tài: “Sản xuất chế phẩm enzym amylase từ môi trường lỏng”, thuộc môn
Công nghệ Lên Men Thực Phẩm, đây là đề tài rất thú vị và phù hợp với xu thế phát triển
hiện nay của ngành công nghiệp enzyme, nhờ sự chỉ dẫn tận tình của quý thầy cô thuộc
Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, mà đặc biệt là thầy Lê Văn Việt Mẫn, chúng tôi đã hoàn
thành đề tài này.
Trong quá trình thực hiện đề tài, không tránh khỏi thiếu sót, kính mong sự góp ý của
thầy và để chúng tôi có thêm kinh nghiệm cho các bài báo cáo tiếp theo, và luận văn sau
này.

Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 2

MỤC LỤC

1. GIỚI THIỆU CHUNG 4
2. ĐỊNH NGHĨA – PHÂN LOẠI 4
2.1 Định nghĩa 4
2.2 Phân loại 4
2.2.1 α – amylase 5
2.2.2 β – amylase 7
2.2.3 Glucoamylase 8
2.2.4 Một số amylase khác 10
3. NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE 12
3.1 Thu nhận enzyme từ nguồn thực vật 12
3.2 Thu nhận enzyme từ nguồn vi sinh vật 13
4. SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AMYLASE TỪ MÔI TRƯỜNG LỎNG 13
A. Sơ đồ quy trình công nghệ 14
B. Giải thích quy trình 15
4.1 Chọn giống vi sinh vật 15
4.2 Nhân giống vi sinh vật 16
4.2.1 Môi trường nhân giống 16
4.2.2 Phương pháp và điều kiện nhân giống 16

4.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống 17
4.2.4 Thiết bị nhân giống 17
4.3 Chuẩn bị môi trường lên men 18
4.4 Tiệt trùng môi trường 19
4.4.1 Mục đích 19
4.4.2 Những biến đổi trong quá trình tiệt trùng 19
4.4.3 Thiết bị 19
4.5 Lên men sinh tổng hợp enzyme 20
4.5.1 Mục đích 20
4.5.2 Các biến đổi xảy ra trong quá trình lên men 20
4.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 21
4.5.4 Thiết bị 22
4.6 Ly tâm thu nhận chế phẩm enzyme thô 24
4.7 Tách và tinh sạch enzyme 25
4.7.1 Siêu lọc 25
4.7.2 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel 27
Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 3
4.8 Sấy 32
5. CHẾ PHẨM AMYLASE 34
5.1 Yêu cầu chế phẩm enzyme amylase trong công nghiệp 34
5.2 Các dạng chế phẩm enzyme 35
5.3 Một số chế phẩm amylase thương mại 35
6. THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ 38
6 α – amylase Bacillus subtilis
38
6.2 Sản xuất enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus niger theo phương
pháp nuôi cấy bề sâu từ hai nguồn nước thải trong công nghiệp thực phẩm 43
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 4
1. GIỚI THIỆU CHUNG
Hệ enzyme amylase là một trong những hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất

trong công nghiệp thực phẩm, y học và nhiều lĩnh vực kinh tế quốc dân khác.
Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về amylase nói
riêng được bắt đầu từ những năm 1811 – 1814. Những nghiên cứu này gắn liền với tên
tuổi nhà bác học Nga – Viện sĩ K.S Kirhof. Ông nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột
dưới tác dụng của dịch chiết malt nảy mầm và nhận thấy trong malt có chứa các chất
phân giải tinh bột thành đường. 19 năm sau, tức là vào năm 1833, hai nhà khoa học người
Pháp Payen và Persoz đã tách được chất phân giải tinh bột thành đường từ dịch chiết
malt, hai ông đã dùng rượu để kết tủa nó và thu được enzyme dưới dạng bột, đồng thời
đặt tên nó là diastase. Sau này, theo đề nghị của Duclo, enzyme phân giải tinh bột được
gọi là amylase.
Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của con người và động vật,
trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Hiện nay, người ta chủ yếu sản xuất
amylase từ vi khuẩn và nấm mốc.
Những nghiên cứu về amylase vi sinh vật đã đặt nền móng cho việc sản xuất chế
phẩm amylase và là cơ sở khoa học để áp dụng chúng trong sản xuất và đời sống, đồng
thời cũng mở ra những phương hướng mới, triển vọng mới to lớn đối với nền kinh tế
quốc dân.

2. ĐỊNH NGHĨA – PHÂN LOẠI
2.1 Định nghĩa
Amylase thuộc nhóm hydrolase, phân giải liên kết glycoside, enzyme này làm
nhiệm vụ thủy phân tinh bột thành các phân tử có chiều dài mạch ngắn hơn như dextrin,
oligosaccharide, glucose, …

2.2 Phân loại
Dựa theo tính chất và cách thức tác dụng lên tinh bột, có thể chia amylase
thành các loại sau:

Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 5
2.2.1 α – amylase

Hình 2.2.1.1: Cấu trúc không gian của α – amylase
 Đặc điểm và hoạt động:
 α – amylase (α – 1,4 – glucan – 4glucanohydrolase) là một endo enzyme. Nó xúc
tác phản ứng thủy phân liên kết α – 1,4 – glycoside nằm bên trong phân tử của các cơ
chất amylase, amylopectin và glycogen.
 α – amylase được tìm thấy trong cơ thể của động vật, thực vật và tế bào vi sinh
vật.
 Tùy theo nguồn gốc mà phân tử lượng của enzyme sẽ thay đổi, thường dao động
trong khoảng 45 – 60kDa. Có một số trường hợp đặc biệt như α – amylase từ loài vi
khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130kDa.
 Tất cả các α – amylase đều là metalloenzyme. Người ta tìm thấy Ca
2+
trong phân
tử enzyme với hàm lượng từ 1 – 30g.nguyên tử/1g.mol enzyme. Nếu chúng ta tách toàn
bộ Ca
2+
ra khỏi α – amylase, enzyme sẽ bị vô hoạt.
 Nhìn chung, tỷ lệ tryptophan và tyrosin trong phân tử của các amylase là khá cao.
Riêng thành phần acid glutamic và acid aspartic có thể chiếm tới 25% trọng lượng phân
tử. Ngoài thành phần protein, một số enzyme amylase từ nấm mốc còn có phân đoạn

glucid có chứa mannose, xylose và hexosamine. Chức năng của thành phần glucid này
hiện này còn chưa rõ.
 Một đặc điểm cần lưu ý là hầu hết các α – amylase khá bền với các tác động của
các protease như peppin, trypsin, papain, …
Bảng bên dưới giới thiệu tính chất của 1 số chế phẩm α – amylase từ vi sinh vật.
Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 6
Bảng 2.2.1.1: Một số tính chất của α – amylase từ vi sinh vật (Fogarty, 1983)
Tên vi sinh vật
pH
opt
T
opt
Phân tử lượng (kDa)
Bacillus acidocaldarius
3.5
75
68
Bacillus stearothermophilus
4.5 – 6.5
65 – 73
48
Bacillus subtilis
5.3 – 6.4
50
47
Acinetobacter sp.I
7.0
50 – 55
55

Acinetobacter sp.II
7.0
50 – 55
65
Bacteirodes amylophilus
6.3
43
92
Micrococcus halobius
6.0 – 7.0
50 – 55
89
Streptomyces hygroscopicus
5.0 – 6.0
50 – 55
48
Streptomyces aureofaciens
4.6 – 5.3
40
40
Thermonospora curvata
5.5 – 6.5
65
62
Aspergillus oryzae
5.5 – 5.9
40
52
Mucor pusillus
3.5 – 4.0

65 – 70
48
Lipomyces kononenkaae
5.5
40
38
Schwaniomyces castellii
6.0
60
40

 Dựa trên quá trình thủy phân tinh bột thành đường glucose, người ta tạm thời chia
α – amylase thành hai nhóm: enzyme dịch hóa và enzyme đường hóa.
o α – amylase dịch hóa
- Sản phẩm thủy phân tinh bột bởi các amylase dịch hóa chủ yếu là các dextrin.
- Enzyme này thường được sử dụng trong giai đoạn đầu của quá trình thủy phân
tinh bột, nhằm hỗ trợ cho quá trình hồ hóa và dịch hóa.
o α –
- α –
oligosaccharide.
- Tùy
.
Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 7
ư α – Aspergillus oryzae ủy
2 (maltose 3 (maltotriose α – Bacillus subtilis
thủy 6 (malitohexaose
9. α – amylase của nấm mốc Aspergillus oryzae bền vững đối với acid
hơn α – amylase của malt và vi khuẩn Bacillus subtilis.
, tùy thủy

α – thủy
.
2.2.2 β – amylase

Hình 2.2.1.2: Cấu trúc không gian của β – amylase

 Đặc điểm và hoạt động:
 β – amylase là một exo enzyme, thủy phân từ đầu không khử của mạch amylose,
amylopectin và glycogen. Chúng phân cắt liên kết α – 1,4 – glycoside từ đầu không khử
của mạch tinh bột tạo ra maltose (dạng β – anomeric).
 Enzyme này không thủy phân được liên kết α – 1,6 – glycoside ở amylopectin nên
sản phẩm cuối cùng thường gồm 50 – 60% maltose và β – dextrin.
 β – amylase không tác dụng lên tinh bột nguyên thể nhưng tác dụng lên tinh bột đã
hồ hóa, enzyme này vẫn giữ được hoạt tính khi không có Ca
2+
.
 Điều kiện hoạt động:
 β – amylase bền trong môi trường acid (kể cả pH 3 – 4), enzyme này hoạt động
mạnh trong môi trường có pH 4.5 – 5.5.
 β – amylase kém bền dưới tác dụng của nhiệt độ cao, bị vô hoạt hoàn toàn dưới tác
dụng của nhiệt độ 70
0
C, nhưng trong dịch nấu, t
opt
là 60 – 65
0
C.

Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 8

2.2.3 Glucoamylase



Hình 2.2.1.3: Cấu trúc không gian của glucoamylase

 Đặc điểm và hoạt động:
 Glucoamylase ( – c
ủy – –
– amylase.

.
 5 –
48 –
bên dưới
.



Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 9
2.2.3.1: a glucoamylase t
Gratreva, 1987)

pH
opt

T
opt

(
o
C)

(kDa)
pH

Aspergillus awamori
4.5
60
83.7 – 88
3.7
Aspergillus niger 1
4.5 – 5.0
-
99
3.4
Aspergillus niger 2
4.5 – 5.0
-
112
4.0
Aspergillus oryzae 1
4.5
60
76
5.6
Aspergillus oryzae 2
4.5
50

38
5.6
Aspergillus oryzae 3
4.5
40
38
5.6
Aspergillus saitoi
4.5
-
90
3.9
Cephalosporium eichhorniae
4.2
45 – 62
26.85
-
Lipomyces kononenkoae
4.5
50
81.5
6.1
Mucor rouxianus 1
4.6
55
59
8.4
Mucor rouxianus 2
5.0
55

49
8.4
Penicillium oxalicum 1
5.0
55 – 60
84
7.0
Penicillium oxalicum 2
4.5
60
86
7.45
Rhizopus delemar
4.5
40
100
-
Rhizopus javanicis
5.0 – 5.2
-
48
7.5 – 8.0
Endomycopsis sp. 20-9
5.7 – 5.9
50
53
3.8
Endomyces JF 00111
4.8 – 5.0
-

55
4.8 – 5.5

 Nhận xét:
o Đa số các chế phẩm glucoamylase của vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc)
và của mô động vật đều có pH tối ưu ở vùng acid: pH 3.5 – 5.5.
Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 10
o T
0
opt
của glucoamylase là 50 – 60
0
C, nhưng hầu hết các glucoamylase bị mất hoạt
tính khi đun nóng trên 70
0
C.
o So với α – amylase, glucoamylase bền acid hơn, nhưng lại kém bền hơn dưới tác
dụng của rượu, acetone, không được bảo vệ bằng Ca
2+
.

Bảng 2.2.3.2: Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến glucoamylase từ các nguồn vi sinh
vật khác nhau
Chỉ số
Nguồn thu glucoamylase
Rhizopus detemar
Aspergillus niger
pH
opt

4.5
3.8
pH bảo đảm độ bền cho enzyme trong 1
ngày ở 30
0
C
3.5 – 8.0
2.2 – 7.5
Nhiệt độ cao nhất (
0
C) mà enzyme có thể
chịu được trong 15 phút ở pH 5.5
55
70
Điểm đẳng điện pI
7.4
6.5

2.2.4 Một số amylase khác
Bên cạnh 3 loại amylase trên, các enzyme thủy phân liên kết nhánh cũng được
sử dụng nhiều trong công nghiệpt thủy phân tinh bột.
α – glucosidase thủy phân từ đầu không khử các liên kết α – 1,4 – glycoside và
α – 1,6 – glycoside của các gốc glucopyranose để tạo ra α – D – glucose. Enzyme này
thủy phân rất tốt đường đôi và các oligosaccharide, có tiềm năng ứng dụng trong nhiều
lĩnh vực, đặc biệt trong chuyển hóa syrup giàu maltose sang syrup giàu glucose.
Enzyme thủy phân liên kết α – 1,6 – glycoside trong phân tử amylopectin,
glycogen và một số polymer khác như pullulanase, exopullulanase, isomaltose. Enzyme
này thường được sử dụng kết hợp với β – amylase, glucoamylase trong sản xuất một số
sản phẩm syrup hay glucose với mục đích tăng hiệu suất thủy phân.

Kể từ khi Robyt và Ackerman phát hiện amylase thủy phân tinh bột thành
maltotetraose năm 1971, một số amylase của vi khuẩn đã được công bố có khả năng tạo
ra các sản phẩm từ DP2 đến DP6. Hiện nay, các enzyme thủy phân tinh bột tạo các malto
– oligosaccharide đang được quan tâm. Malto – oligosaccharide có tiềm năng ứng dụng
trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược và công nghiệp hóa chất tinh khiết.
Những sản phẩm từ DP2 đến DP6 đã được sử dụng trong việc chẩn đoán lâm sang để xác
định sự có mặt của α – amylase. Những chất này đều tan rất tốt, tạo ra một dung dịch
nhớt và là một thực phẩm tuyệt hảo cho trẻ sơ sinh cũng như người già. Tuy nhiên, giá
thành của những sản phẩm này khá đắt do những khó khăn trong việc sản xuất chúng.
Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 11
 Amylase tạo maltotriose:
Lần đầu tiên, Wako mô tả một exo – amylase từ Streptomyces griceus có khả
năng thủy phân tinh bột từ đầu không khử, cho sản phẩm chủ yếu là maltotriose, không
có glucose và maltose.
Gần đây, một số công bố về khả năng tạo maltosetriose của α – amylase từ
chủng Bacillus subtilis với hàm lượng 56%.
Enzyme này không tác dụng lên pullutan và cyclodextrin, khi sử dụng cùng
pullulanase, lượng maltosetriose có thể tăng lên 73% (Forgaty 1990, Hebeda 1995).
 Amylase tạo maltotetraose:
 Đặc điểm và hoạt động:
Hoạt tính này được tìm thấy ở amylase của Pseudomonas stutzeri. Đây là một exo
– amylase ngoại bào, nó tấn công tinh bột từ đầu không khử của mạch và phân cắt liên
kết α – 1,4 – glycoside thứ tư để tạo maltotetraose.
 Điều kiện hoạt động:
o pH
opt
8.0.
o Bị mất hoạt tính ở 40
0

C.
Một số tác giả thử nghiệm sản xuất maltotetraose liên tục bằng cách sử dụng
amylase từ Pseudomonas stutzeri NRRLB – 3389, được cố định trên các hạt xốp resin kị
nước.
Gen sinh tổng hợp exo – maltotetraose của chủng Pseudomonas sacharophila
cũng đã nghiên cứu biểu hiện ở E.coli với hoạt tính enzyme thu được cao gấp 4 lần chủng
bình thường (Duedahl – Olesen 2000, Gerhartz 1990).
 Αmylase tạo maltopentaose:
Maltopentaose được sử dụng như cơ chất để nhận biết serum α – amylase. Nó
cũng được sử dụng làm thức ăn cho người bị bệnh thận hoặc suy dinh dưỡng.
α – amylase từ ngoại bào của Bacillus cereus có thể tạo ra pentaose với hàm
lượng 44% từ tinh bột. Một số chủng Pseudomonas từ đất cũng có khả năng tạo
maltopentaose, đặc biệt trong giai đoạn đầu của quá trình thủy phân (Duedahl – Olesen
2000, Forgaty 1990).
 Amylase tạo maltohexaose:
 Đặc điểm và hoạt động:
Acetobacter aerogenes (Klebsiella pneumonia) tổng hợp một exo – enzyme có khả
năng tạo maltohexaose từ tinh bột, amylopectin và amylase. Khi thủy phân amylopectin
và glycogen, ngoài maltohexaose, còn có một lượng dextrin giới hạn, các β – limit
dextrin sau đó tiếp tục được thủy phân tạo ra các oligo phân nhánh.
 Điều kiện hoạt động:
o pH
opt
5.8 – 6.0.
o t
0
opt
= 50 – 520C.
Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 12

Enzyme này có hoạt tính transferase tạo maltohexaose từ maltotetraose.
α – amylase của Bacillus circulans và Bacillus amyloliquefacines cũng có khả
năng thủy phân tinh bột đến 30 – 34% maltohexaose. Sự có mặt của pullanase có thể tăng
lượng maltohexaose thêm 12%.

3. NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE
3.1 Thu nhận enzyme từ nguồn thực vật
Từ lâu, người ta đã biết sử dụng các loại enzyme từ hạt nảy mầm để sử dụng
trong ngành chế biến thực phẩm (mạch nha), nước giải khát (bia), … hoặc sản xuất bột
enzyme amylase để bổ sung vào các loại bột dinh dưỡng cho trẻ em, người già, những
người bị suy tiêu hóa.
Hạt ngũ cốc được cho nảy mầm, tách bỏ phần rễ và thân mầm, sấy khô ở nhiệt
độ thấp để giữ nguyên hoạt tính của enzyme được gọi là malt. Malt có thể được sản xuất
từ nhiều loại hạt ngũ cốc như đại mạch, lúa, ngô, đậu, … mà chủ yếu là từ đại mạch,
lúa,…
 Đại mạch (Hordeum sativum):
Các enzyme có vai trò rất quan trọng: nó tham gia xúc tác tất cả các phản ứng
sinh hóa trong suốt quá trình sản xuất malt và sản xuất bia. Trong hạt khô, enzyme phần
lớn ở dạng liên kết, chúng chỉ được giải phóng và hoạt động khi hạt đi vào giai đoạn nảy
mầm và các quá trình đường hóa sau đó.
Các enzyme thủy phân tinh bột: chủ yếu là amylase gồm có – amylase và –
amylase.
Quá trình nảy mầm của đại mạch là giai đoạn chuyển các enzyme từ trạng thái
không hoạt động sang trạng thái hoạt động, đồng thời còn tổng hợp nên hàng loạt các
enzyme mới và trong giai đoạn này cần chú ý không làm giảm nhiều chất khô của hạt
bằng cách đảo trộn thường xuyên để tạo độ thóang khí. Hạt đại mạch trước khi ngâm
không có hoạt lực của enzyme - amylase. Khi hạt trải qua 3 – 4 ngày trong giai đoạn
nảy mầm thì hoạt lực của enzyme đạt đến mức cực đại vào ngày thứ 7, sau đó sẽ giảm
xuống.
 Lúa (Oryza sativa L.):

Hệ enzyme amylase trong hạt lúa gồm – amylase và – amylase
Trong quá trình nảy mầm hoạt động của các enzyme tăng cao thúc đẩy cho các
quá trình sinh tổng hợp các loại enzyme và các quá trình sinh hóa gần giống ở đại mạch,
chỉ khác về mức độ tạo thành enzyme và tốc độ phản ứng.
Khi hạt chưa nảy mầm, các enzyme tồn tại ở dạng liên kết. Khi hạt nảy mầm,
các enzyme này chuyển sang hoạt động.

Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 13
3.2 Thu nhận enzyme từ nguồn vi sinh vật
Trong ba nguồn sinh vật (động vật, thực vật, vi sinh vật) để khai thác và thu
nhận enzyme thì nguồn vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất, do nguồn enzyme khai thác
từ vi sinh vật có ưu điểm sau:
- Có thể điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn
nguyên liệu khác.
- Hệ enzyme từ vi sinh vật vô cùng phong phú.
- Khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính của các enzyme rất mạnh.
- Vi sinh vật có tốc độ sinh sản nhanh.
- Giá thành thấp vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật đơn giản, rẻ tiền, …
- Sản xuất enzyme từ vi sinh vật được thực hiện theo quy mô công nghiệp và dễ
dàng kiểm soát quá trình sản xuất.
Các giống vi sinh vật được sử dụng trong công nghiệp sản xuất amylase trong
môi trường lỏng:
- Nấm mốc: Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, Aspergillus niger,
Rhizopus delemar.
- Nấm men: Candida, Saccharomyces.
- Vi khuẩn: Bacillus subtilis, Bacillus polymixa, Bacillus macerans.

4. SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AMYLASE TỪ MÔI TRƯỜNG LỎNG

Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 14
A. Sơ đồ quy trình công nghệ

Nguyên liệu
Chuẩn bị môi trường
Ly tâm

Lên men sinh tổng hợp
enzyme
Nhân giống

Cấy giống
Tiệt trùng
Sấy
Giống VSV
Chế phẩm
enzyme
Sinh khối
Tạp chất
Tách và tinh sạch
enzyme

Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 15
B. Giải thích quy trình
4.1 Chọn giống vi sinh vật
 Chọn nấm mốc Aspergillus oryzae do các ưu điểm sau:
- Không sinh tổng hợp độc tố.
- Khả năng sinh tổng hợp sản phẩm chính cao.
- Khả năng thích nghi nhanh và tốc độ sinh trưởng mạnh.
- Điều kiện nuôi cấy: đơn giản.
- Môi trường nuôi cấy: rẻ tiền, dễ tìm.
- Dễ dàng tách được khỏi môi trường nuôi cấy lỏng để thu nhận enzyme ngoại
bào.
 Đặc điểm về hình thái của nấm mốc Aspergillus oryzae:
Aspergillus oryzae hay còn gọi là mốc hoa cau, được nghiên cứu sớm nhất bởi ông
bà Jokichi Takamine (1854 – 1922, người Nhật).

Aspergillus oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes
(nang khuẩn). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh,
chiều ngang 5 – 7 m, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang chia sợi thành nhiều bào tế
bào (nấm đa bào).



Hình 4.1.1: Hình thái của Aspergillus oryzae
Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 16
Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính
bào tử, ở đầu có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Aspergillus oryzae
thường dài 1.0 – 2.0 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào
tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài gọi
là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử dính
vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Aspergillus oryzae có màu vàng lục,
chính là màu ta thường thấy ở mốc tương.
Nấm sợi thường có màu vàng khi già nên còn được gọi là nấm sợi màu vàng. Khi
mới phá triển, hệ sợi có màu trắng, sau đó chuyển dần sang màu lục và khi già thì chuyển
hẳn sang màu vàng.
Nấm mốc Aspergillus oryzae có khả năng sinh tổng hợp enzyme rất mạnh, trong
đó có enzyme amylae.

4.2 Nhân giống vi sinh vật
Giống sản xuất thường được bảo quản để tránh giảm hoạt tính. Do đó, việc cấy
giống trên môi trường thạch nghiêng trước khi nhân giống là việc làm rất cần thiết. Có
thể coi đây là việc “đánh thức” chủng giống, đồng thời để kiểm tra hoạt tính của giống
sau một thời gian bảo quản ở nhiệt độ thấp. Từ những những tế bào hoặc bào tử riêng rẽ
của chủng bảo quản, cấy ra một số canh trường, những canh trường này được nhân giống
trong phòng thí nghiệm và được kiểm tra hoạt tính. Nếu có sự khác nhau thì dùng canh

trường có hoạt tính mạnh nhất để gây nguyên liệu cấy và tạo thành chủng mới.
4.2.1 Môi trường nhân giống
o 3% saccharose
o 0.3% NaNO
3

o 0.1% KH
2
PO
4

o 0.05% MgSO
4
.7H
2
O
o 0.05% KCl
o 0.001% FeSO
4

o 10 – 20mL dịch tự phân nấm men
o 1000mL nước cất
o 0.3% agar
4.2.2 Phương pháp và điều kiện nhân giống
Nhân giống trên môi trường rắn xốp (thường áp dụng đối với nấm sợi như
Aspergillus oryzae, với mục đích thu nhận bào tử) với các thông số kỹ thuật sau:
- Độ ẩm của môi trường : 45 – 50%.
- Nhiệt độ : 27 – 30
0
C.

- Thời gian : 30 – 36 giờ.
- Độ ẩm của không khí : 85 – 95%.
Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 17
Aspergillus oryzae là vi sinh vật hiếu khí, chỉ phát triển bình thường khi đầy đủ
oxy. Để đáp ứng điều kiện nuôi này, môi trường nuôi phải xốp, rải thành lớp không dày
quá 2.5 – 3cm. Theo thực nghiệm, để thỏa mãn cho sự hô hấp của Aspergillus oryzae
trong toàn bộ chu kỳ phát triển, cứ 1kg môi trường cần khoảng 1.7m
3
không khí.
Aspergillus oryzae phát triển bình thường khi nồng độ CO
2
trong khí quyển lên tới 8%.
Đôi khi khả năng sinh bào tử của nấm mốc bị yếu hoặc mất hẳn. Để khôi phục
khả năng này, có thể nuôi nấm mốc trong ánh sáng khuếch tán trong một vài thế hệ.
Trong sản xuất công nghiệp hiện nay, quá trình nhân giống vi sinh vật thường
được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy tĩnh (nuôi cấy theo từng mẻ - batch culture).
4.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống
 Nhiệt độ:
Nếu tiến hành nhân giống vi sinh vật ở nhiệt độ thấp hoặc cao hơn khoảng
nhiệt độ tối ưu (t
opt
= 27 – 30
0
C) thì vi sinh vật sinh trưởng chậm hơn và hằng số tốc độ
sinh trưởng của giống (µ
expo
) sẽ giảm xuống.
 Oxy:
Đối với nhóm vi sinh vật hiếu khí bắt buộc như Aspergillus oryzae, việc cung

cấp oxy cho môi trường là rất cần thiết để giúp vi sinh vật tổng hợp năng lượng, duy trì
các hoạt động trao đổi chất và tổng hợp sinh khối. Cụ thể: cứ 1kg môi trường cần khoảng
1.7m
3
không khí.
 Sự khuấy trộn:
Đối với nấm mốc sử dụng trong chế biến thực phẩm, giống thường được sử
dụng dưới dạng bào tử. Khi đó, người ta thường nhân giống trên môi trường rắn xốp.
Nếu sử dụng thiết bị nhân giống dạng khay – hình hộp chữ nhật (cuvet), sự đảo
trộn môi trường sẽ khó thực hiện hoặc không đạt hiệu quả cao. Trong trường hợp này, sử
dụng thiết bị nhân giống dạng hình trụ ngang và có thể quay quanh trục của nó, quá trình
đảo trộn môi trường có thể thực hiện một cách tự động và canh trường nuôi đạt được độ
đồng nhất cao hơn.
 Thời gian:
Theo lý thuyết, vào thời điểm đầu của giai đoạn ổn định, số lượng tế bào thu
được trong canh trường là cao nhất và chúng có hoạt tính sinh lý ổn định. Do đó, ta kết
thúc quá trình nhân giống để thu nhận sinh khối vào thời điểm này để đạt được hiệu quả
kỹ thuật và kinh tế cao nhất. Thông thường thời gian nhân giống từ 30 – 36 giờ.
4.2.4 Thiết bị nhân giống
 Nhân giống giai đoạn phòng thí nghiệm:
Sau khi chuẩn bị môi trường, tiến hành tiệt trùng môi trường ở 121
0
C trong 40
phút.
Môi trường sau khi tiệt trùng được lắc đều nhằm làm cho môi trường được tơi
xốp và làm nguội đến nhiệt độ phòng.
Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 18

Hình 4.2.4.1: Máy lắc ổn nhiệt (Personal – 11 , TAITEC)

Giống được nuôi trên môi trường thạch nghiêng, và giữ ở nhiệt độ phòng.
 Nhân giống giai đoạn phân xưởng:
Nếu sử dụng thiết bị nhân giống dạng khay – hình hộp chữ nhật (cuvet), sự đảo
trộn môi trường sẽ khó thực hiện hoặc không đạt hiệu quả cao. Trong trường hợp sử dụng
thiết bị nhân giống dạng hình trụ ngang và có thể quay quanh trục của nó, quá trình đảo
trộn môi trường có thể thực hiện một cách tự động và canh trường nuôi đạt được độ đồng
nhất cao hơn.

4.3 Chuẩn bị môi trường lên men
Để nuôi Aspergillus oryzae 3 – 9 – 15 với mục đích thu – amylase,
Fenikxova và Dvatxatova (1959, 1960) chọn môi trường có 65% bột ngô; 0.9% NaNO
3
;
0.005% MgSO
4
và 10% nước chiết mầm mạch (100g/1 lít nước), pH môi trường 6 – 7.
 Nguồn glucid:
 Ngoài bột ngô, môi trường cần chứa maltose và dextrin.
 Các loại đường:
Sự có mặt của glucose, fructose và saccharose có tác dụng giúp cho sự phát triển
của nấm mốc, nhưng lại hạn chế sự tích tụ amylase. Ngược lại, khi thêm lactose và MgO
vào môi trường thì nấm mốc kém phát triển hơn nhưng lại tích tụ nhiều amylase.
 Nguồn carbon được vi sinh vật sử dụng để đáp ứng các nhu cầu sinh sản và phát
triển:
- Cung cấp năng lượng cho vi sinh vật.
- Cung cấp các tiền chất cho vi sinh vật.
- Tạo các quá trình oxy hóa nhờ vi sinh vật.

Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 19

 Các yếu tố khác:
Sự tạo thành và tích tụ amylase còn gắn với sự có mặt của các ion Mg
2+
, Ca
2+
, và
sự có mặt của các nguyên tố phosphor, đặc biệt là magie.
- Trong môi trường thiếu MgSO
4
, amylase hầu như không được tạo thành, hàm
lượng MgSO
4
cần thiết chỉ vào khoảng 0.005%. Sau magie là phosphor, nguyên tố này
đóng vai trò quan trọng trong việc tạo thành acid nucleic. Hàm lượng của muối KH
2
PO
4

vào khoảng 0.1 – 0.2%.
- Calci có trong thành phần của α – amylase. Mỗi phân tử α – amylase có 2 hoặc
3 ion calci, mà tính chịu nhiệt của enzyme này lại phụ thuộc vào số ion calci có trong
phân tử.
- Lưu huỳnh cũng đóng vai trò quan trọng không kém. Hoạt độ amylase gắn liền
với sự có mặt của nhóm – SH; mặt khác còn tham gia vào thành phần của acid amin cấu
thành enzyme. Hàm lượng lưu huỳnh trong canh trường chứa 0.04g/100ml bảo đảm cho
hoạt độ amylase cực đại và bằng 360 đơn vị/100ml. Nếu giảm tới 0.004%, hoạt độ
amylase của Aspergillus oryzae 3 – 9 – 45 chỉ còn 50% và bằng 180 đơn vị/100ml.
- Các nguyên tố vi lượng như đồng, thiếc molipden, borac, mangan, sắt,
coban,… làm tăng hoạt độ của nhiều enzyme.

4.4 Tiệt trùng môi trường
4.4.1 Mục đích
Bảo quản: vô hoạt enzyme, ức chế vi sinh vật.
4.4.2 Những biến đổi trong quá trình tiệt trùng
 Biến đổi vật lý:
Sự thay đổi về thể tích, khối lượng, tỉ trọng (nước bốc hơi), …
Độ nhớt của dung dịch giảm.
 Biến đổi hóa học:
Thay đổi tốc độ các phản ứng hóa học (sự oxy hóa vitamin C, các chất màu).
 Biến đổi hóa lý:
Độ hòa tan tăng, sự bốc hơi nước.
 Biến đổi hóa sinh:
Enzym bị vô hoạt.
 Biến đổi sinh học:
Ức chế, tiêu diệt vi sinh vật.
 Biến đổi về mặt cảm quan:
Sự tổn thất của một số cấu tử mẫn cảm với nhiệt (vitamin, …).
4.4.3 Thiết bị
 Dùng thiết bị trao đổi nhiệt dạng bản mỏng.

Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 20
 Thông số công nghệ:
 : 121
0
C.
 : 20 – .

4.5 Lên men sinh tổng hợp enzyme
Sử dụng phương pháp lên men bề sâu.

1. Thùng trộn môi trường dinh dưỡng. 7. Thùng dịch lên men.
2. Nồi tiệt trùng. 8. Thùng lên men.
3. Thùng chứa. 9. Lọc khí sơ bộ.
4. Van xả. 10. Nén khí.
5. Thiết bị trao đổi nhiệt. 11. Lọc khí bước hai.
6. Bơm ly tâm. 12. Thùng canh trường thành phẩm.
Hình 4.5.1: Sơ đồ nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp bề sâu

4.5.1 Mục đích
Khai thác: tạo điều kiện cho mốc phát triển đều trên môi trường nuôi cấy để
hình thành hệ enzyme amylase.
4.5.2 Các biến đổi xảy ra trong quá trình lên men
 Biến đổi vật lý: sự tăng nhiệt độ do quá trình hô hấp của nấm mốc.
 Biến đổi hóa sinh: sự tổng hợp enzyme amylase.
 Biến đổi sinh học: sự gia tăng sinh khối.
Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 21
4.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
 Môi trường lên men:
 Hàm lượng chất khô:
Các chất hòa tan trong môi trường sẽ tạo nên một áp lực thẩm thấu. Hàm lượng
các chất hòa tan trong môi trường càng lớn thì giá trị áp lực thẩm thấu càng cao. Khi hàm
lượng các chất hòa tan trong môi trường quá cao, màng tế bào chất không thể duy trì sự
cân bằng áp lực thẩm thấu được nữa, do đó phải xác định hàm lượng chất khô tối ưu cho
môi trường trước khi lên men.
 pH môi trường:

pH có ảnh hưởng nhiều đến tích tụ enzyme nên trong thực tế sản xuất, người ta
thường sử dụng acid hoặc ammoniac để điều chỉnh cho pH luôn trong khoảng tối ưu:
- Nếu như thêm vào môi trường các muối ammonium, thì khi vi sinh vật tiêu thụ ion
ammonium, các ion được giải phóng ra sẽ acid hóa môi trường. Vì thế, cần phải cho thêm
CaCO
3
vào để trung hòa môi trường hoặc duy trì tự động giá trị pH thích hợp cho việc
tổng hợp các enzyme amylase.
- Khi nguồn nitơ vô cơ được dùng là các muối nitrate, thì trong quá trình vi sinh vật
tiêu thụ anion (NO
3
-
) sẽ giải phóng ra các ion kim loại và môi trường bị kiềm hóa làm pH
tăng lên.
Khi dùng các muối ammonium phosphate làm nguồn nitơ để nuôi chủng mốc này thì
pH tối thích của môi trường phải nằm trong vùng 6- 7.
 Điều kiện lên men:
 Lượng giống cấy:
Nếu lượng giống cấy quá ít, thời gian lên men kéo dài. Các vi sinh vật tạp nhiễm
trong môi trường lên men dễ phát triển và có thể gây hư hỏng sản phẩm.
Nếu lượng giống cấy quá nhiều, thời gian lên men có thể rút ngắn, nhưng hàm
lượng các sản phẩm phụ tạo thành sẽ thay đổi và gây ảnh hưởng đến chất lượng thành
phẩm, hơn nữa, việc tăng lượng giống cấy sẽ làm tăng chi phí cho quá trình nhân giống
trong sản xuất.
Tỉ lệ giống cấy: 2 – 5%.
 Nhiệt độ:
Khi nhiệt độ thấp, quá trình lên men kéo dài.
Khi nhiệt độ quá cao, hoạt tính trao đổi chất của vi sinh vật bị giảm và các cấu tử
mẫn cảm với nhiệt bị tổn thất.
Trong quá trình lên men, một phần năng lượng do vi sinh vật chuyển hóa sẽ được

thải vào môi trường dưới dạng nhiệt năng, dẫn đến làm tăng nhiệt độ dịch lên men, do đó
ở quy mô công nghiệp, thiết bị lên men có bộ phận hiệu chỉnh nhiệt độ để ổn định hoạt
tính cho giống trong suốt quá trình lên men.

Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 22
 Thời gian lên men:
Trong sản xuất, xác định thời điểm kết thúc quá trình lên men thông qua việc lấy
mẫu đánh giá kiểm tra một số chỉ tiêu hóa lý, vi sinh và cảm quan (thường 2 – 4 ngày).
 Cung cấp oxy:
Trong môi trường lỏng, tế bào vi sinh vật phân tán trong dịch thể, sự tiếp xúc của
tế bào với oxy phải thông qua môi trường nuôi cấy. Do đó, khuấy và sục khí là biện pháp
tốt để oxy của không khí có thể hòa tan vào canh trường. Lượng oxy hòa tan vào môi
trường phải đủ để bù đắp cho sự phát triển của vi sinh vật, đồng thời phải dư ra từ
1 – 3mg/L.
Mức độ hòa tan của oxy phụ thuộc vào các yếu tố: nhiệt độ, nồng độ chất và
phương pháp sục khí, trong đó nhiệt độ cao thì oxy hòa tan kém, còn nồng độ chất tỷ lệ
nghịch với khả năng hòa tan của oxy.
Một số chất khi hòa tan vào môi trường sẽ ảnh hưởng xấu đến khả năng hòa tan
của oxy, ví dụ như trong dung dịch có nồng độ chất khô là 13%, độ hòa tan oxy sẽ giảm
85%, và nếu chỉ bỏ 2% bột giấy hoặc xác tế bào chết vào dung dịch thì độ hòa tan của
oxy sẽ giảm đến 85 – 90%.
Ngược lại, có một số chất khi hòa tan vào dung dịch lại làm tăng độ hòa tan của
oxy, đó là các ester, rượu, acid hữu cơ và các hợp chất háo nước khác.
Khi nuôi cấy nấm mốc để thu nhận enzyme, lượng không khí cần sục vào 1m
3
môi
trường vào khoảng 30 – 40m
3
/m

3
×giờ. Với sự phát triển của kỹ thuật sục khí, tiêu hao
không khí cho 1m
3
môi trường×giờ sẽ giảm dần. Chiều hướng phát triển hiện nay không
phải là giảm lượng không khí cho 1m
3
môi trường mà người ta tăng nồng độ chất dinh
dưỡng tương đương với lượng oxy hòa tan để đạt sinh khối cao và do đó tăng năng suất
của thiết bị.
4.5.4 Thiết bị
Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 23

Hình 4.5.2: Thùng lên men
 Cấu tạo thiết bị:
Thiết bị có dạng hình trụ đứng, được chế tạo từ vật liệu thép không rỉ.
Bên trong thiết bị có hệ thống cánh khuấy và các đầu dò nhiệt độ, pH, … để
theo dõi trực tiếp các thông số công nghệ trong quá trình lên men. Hệ thống sục khí được
bố trí trên đáy thiết bị để cung cấp lượng oxy cần thiết cho vi sinh vật hiếu khí.
Xung quanh thiết bị là lớp vỏ áo cho tác nhân điều nhiệt để ổn định nhiệt độ
canh trường trong quá trình lên men.
Phần trên nắp thiết bị có các cửa với nhiều chức năng khác nhau: cửa thông
cánh khuấy gắn với motor, cửa nạp giống, cửa vào và ra cho không khí, cửa nạp chất phá
bọt, cửa nạp chất điều chỉnh pH, … Cửa nạp môi trường và tháo canh trường ra khỏi thiết
bị thường được bố trí ở phần đáy.
Thiết bị được thiết kế ở dạng vô trùng: kín và có thể chịu được áp lực cao, có
thể dùng hơi vô trùng trực tiếp và vệ sinh thiết bị.
 Thông số công nghệ:
 Nhiệt độ: 28 – 32

0
C.
 Không khí cần sục vào môi trường: 30 – 40m
3
/m
3
×giờ.
]



Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 24
4.6 Ly tâm thu nhận chế phẩm enzyme thô
 Mục đích
 Khai thác: Tách sinh khối ra khỏi canh trường sau lên men.
 Những biến đổi trong quá trình ly tâm
 Biến đổi hóa học: tăng độ tinh sạch của sản phẩm
 Biến đổi vật lý: khối lượng giảm.
 Biến đổi hóa lý: tách pha .
 Thiết bị:
 Cấu tạo thiết bị



Hình 4.6.1: Thiết bị lọc ly tâm nằm ngang

Thiết bị lọc ly tâm
Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng
Trang 25

- Tốc độ 4500 – 6000 vòng/phút.
- Đường kính đĩa ly tâm 200mm, chiều dài 1m.
- Công suất động cơ đạt 5.5kW, khối lượng 600kg.
 Ưu điểm
- Năng suất lớn, kích thước nhỏ.
- Thời gian nhanh.
- Khả năng tách tốt, độ đồng đều cao.
- Khả năng cơ giới hóa cao.
 Nhược điểm
Kết cấu thiết bị phức tạp.

- : 15 – 20
0
C.
- – .

4.7 Tách và tinh sạch enzyme
4.7.1 Siêu lọc
 Mục đích
Khai thác: làm giảm hàm lượng các chất có phân tử lượng nhỏ ra khỏi dung
dịch enzyme thô.
 Những biến đổi trong quá trình siêu lọc
 Biến đổi vật lý:
Khối lượng riêng hỗn hợp giảm.
 Biến đổi hóa học:
Hàm lượng enzyme tăng.
 Thiết bị: thiết bị UF
Phương pháp siêu lọc dùng để tách các chất có phân tử lượng khác nhau. Các
chất có phân tử lượng nhỏ như đường, muối, nước… sẽ chui qua màng, enzyme và
protein phi enzyme được giữ lại trên màng.

 Cấu tạo thiết bị