công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật

Công ngh nuôi c yệ ấ
mô t bào th c v tế ự ậ
Mục lục
I.
I.
Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật
Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật
II.
II.
Nhân giống vô tính in vitro
Nhân giống vô tính in vitro
III.
III.
Nuôi cấy giao tử,tạo cây đơn bội invitro
Nuôi cấy giao tử,tạo cây đơn bội invitro
IV.
IV.
Nuôi cấy tế bào trần
Nuôi cấy tế bào trần
V.
V.
Thụ phấn và nuôi cấy phôi in virto
Thụ phấn và nuôi cấy phôi in virto
VI.
VI.
Ưu và nhược điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Ưu và nhược điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật : khái niệm chung cho các nguyên
Nuôi cấy mô tế bào thực vật : khái niệm chung cho các nguyên
liệu thực vật
liệu thực vật

hoàn toàn sạch vi sinh vật
hoàn toàn sạch vi sinh vật
được nuôi trong mt dinh dưỡng nhân tạo
được nuôi trong mt dinh dưỡng nhân tạo
trong điều kiện vô trùng
trong điều kiện vô trùng
I.Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực
vật
•
Tính toàn năng của tế bào thực vật:
Tính toàn năng của tế bào thực vật:
từ 1 dạng tế bào bất kì trong cơ thể thực
từ 1 dạng tế bào bất kì trong cơ thể thực
vật(lá,thân,hoa…)cũng đều có khả năng phát triển thành 1 cơ
vật(lá,thân,hoa…)cũng đều có khả năng phát triển thành 1 cơ
thể hoàn chỉnh
thể hoàn chỉnh
•
Sự phân hóa của tb:
Sự phân hóa của tb:
sự chuyển hóa các tb phôi sinh thành tb mô chuyên
sự chuyển hóa các tb phôi sinh thành tb mô chuyên
biệt,đảm nhận các chức năng khác nhau
biệt,đảm nhận các chức năng khác nhau
•
Sự phản phân hóa của tb:
Sự phản phân hóa của tb:
trong điều kiện cần thiết và thích hợp,các tb,cơ quan
trong điều kiện cần thiết và thích hợp,các tb,cơ quan
lại có thể trở về dạng phôi sinh và phân chia mạnh

lại có thể trở về dạng phôi sinh và phân chia mạnh
mẽ
mẽ
Tế bào phôi sinh
Tế bào phôi sinh
Tế bào dãn
Tế bào dãn
Tế bào phân hóa có
Tế bào phân hóa có
chức năng riêng biệt
chức năng riêng biệt
Phân hóa tế bào
Phân hóa tế bào
Phân hóa tế bào
Phân hóa tế bào
II.Nhân giống vô tính in vitro
Nhân giống 1 loài trong ống nghiệm trên mt nhân tạo và trong
Nhân giống 1 loài trong ống nghiệm trên mt nhân tạo và trong
điều kiện vô trùng
điều kiện vô trùng
Vô trùng
Vô trùng
mẫu cấy
mẫu cấy
Tạo cây
Tạo cây
in
in
vitro
vitro

Nhâm giống
Nhâm giống
in
in
vitro
vitro
Chuyển cây ra vườn
Chuyển cây ra vườn
ươm
ươm



Quy trình nhân giống vô tính
Quy trình nhân giống vô tính
in vitro
in vitro
Chuẩn bị cây mẹ
Chuẩn bị cây mẹ
•
Ưu điểm:
Ưu điểm:
nhân giống cây ở quy mô công nghiệp
nhân giống cây ở quy mô công nghiệp
nhân nhanh với hệ số nhân giống cao
nhân nhanh với hệ số nhân giống cao
sản phẩm cây giống đồng nhất,sạch bệnh
sản phẩm cây giống đồng nhất,sạch bệnh
tiết kiệm thời gian,thu hoạch lớn
tiết kiệm thời gian,thu hoạch lớn

•
Nhược điểm:
Nhược điểm:
tính bất định về mặt di truyền
tính bất định về mặt di truyền
sự nhiễm mẫu
sự nhiễm mẫu
tạo ra độc tố
tạo ra độc tố
sự hóa thủy tinh thể
sự hóa thủy tinh thể
III.Nuôi cấy giao tử,tạo cây đơn bội
invitro
1.Tạo cây đơn bội bằng
1.Tạo cây đơn bội bằng
nuôi cấy bao phấn
nuôi cấy bao phấn
Nguyên lý:
Nguyên lý:


sự hình thành cây đơn
sự hình thành cây đơn
bội từ hạt phấn là sự
bội từ hạt phấn là sự
sinh sản đơn tính đực
sinh sản đơn tính đực
theo 3 phương thức
theo 3 phương thức
Sinh

Sản
Đơn
Tính
Đực
Trực
Tiếp
Gián
Tiếp
Hỗn
Hợp
Theo 2 phương pháp
•
Các bao phấn được nuôi cấy trên môi trường có agar hoặc
Các bao phấn được nuôi cấy trên môi trường có agar hoặc
môi trường lỏng và sự phát sinh phôi xảy ra trong bao
môi trường lỏng và sự phát sinh phôi xảy ra trong bao
phấn
phấn
.
.
•
Hạt phấn được tách rời khỏi bao phấn hoặc bằng phương
Hạt phấn được tách rời khỏi bao phấn hoặc bằng phương
pháp cơ học hoặc do nứt nẻ tự nhiên của bao phấn và
pháp cơ học hoặc do nứt nẻ tự nhiên của bao phấn và
được nuôi trên môi trường lỏng.
được nuôi trên môi trường lỏng.
Quy trình nuôi cấy
•
Chọn bao phấn:

Chọn bao phấn:
hoa đầu tiên,hạt phấn thể 4 nhân sau lần
hoa đầu tiên,hạt phấn thể 4 nhân sau lần
nguyên phân thứ nhất
nguyên phân thứ nhất
•
Xử lý nụ hoa:
Xử lý nụ hoa:
bằng nhiệt độ kích thích sự phân chia hạt phấn
bằng nhiệt độ kích thích sự phân chia hạt phấn
•
Chọn mt tái sinh thích hợp
Chọn mt tái sinh thích hợp
•
Chọn lọc cây đơn bội:
Chọn lọc cây đơn bội:
đếm số lượng NST,đo hàm lượng
đếm số lượng NST,đo hàm lượng
DNA,so với cây mẹ
DNA,so với cây mẹ
Sơ đồ tạo cây đơn bội từ nuôi cấy
bao phấn
Tách các bao phấn
Khử trùng bề mặt
Nhuộm acetoarmine để xác định
GĐPT của hạt phấn
Nuôi cấy trên
mt đặc
Nuôi cấy trên
mt lỏng

Phát triển phôi
Loại bỏ chỉ nhị
Cây đơn bội
Hoa
•
Ưu điểm
Ưu điểm
Môi trường nuôi cấy đơn giản
Môi trường nuôi cấy đơn giản
Tạo ra giống cây trồng sạch bệnh, có phẩm chất di
Tạo ra giống cây trồng sạch bệnh, có phẩm chất di
truyền đồng đều
truyền đồng đều
Phát sinh phôi dễ dàng
Phát sinh phôi dễ dàng
Thuận lợi cho việc nghiên cứu di truyền.
Thuận lợi cho việc nghiên cứu di truyền.
•
Nhược điểm
Nhược điểm
Hiệu suất tạo cây đơn bội không cao
Hiệu suất tạo cây đơn bội không cao
Khó sàng lọc cây đơn bội
Khó sàng lọc cây đơn bội
Khi nuôi cấy bao phấn thường gặp hiện tượng bạch tạng
Khi nuôi cấy bao phấn thường gặp hiện tượng bạch tạng


IV.Nuôi cấy tế bào trần
Phương pháp cơ bản để tách và nuôi cấy

Phương pháp cơ bản để tách và nuôi cấy
1.Tách tế bào trần
1.Tách tế bào trần
•
Khử trùng mẫu lá
Khử trùng mẫu lá
•
Ngâm mẫu trong dung dịch thẩm thấu để tế bào co
Ngâm mẫu trong dung dịch thẩm thấu để tế bào co
nguyên sinh chất
nguyên sinh chất
•
Tách lớp mặt dưới lá
Tách lớp mặt dưới lá
•
Ngâm mẫu trong hỗn hợp enzym
Ngâm mẫu trong hỗn hợp enzym
•
Tinh sạch tế bào trần
Tinh sạch tế bào trần
•
Nuôi cấy tế bào trần trong môi trường thích hợp
Nuôi cấy tế bào trần trong môi trường thích hợp
2.Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh
2.Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh
Nguyên lý:
Nguyên lý:
nuôi cấy noãn chưa thụ tinh phát triển thành cây đơn bội là sự
nuôi cấy noãn chưa thụ tinh phát triển thành cây đơn bội là sự
sinh sản đơn tính cái

sinh sản đơn tính cái
Theo 2 phương pháp
Theo 2 phương pháp
•
Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh tách rời
Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh tách rời
•
Nuôi cấy cùng lúc nhiều noãn trên 1 phần của lõi bắp
Nuôi cấy cùng lúc nhiều noãn trên 1 phần của lõi bắp
Gặp khó khăn trong việc tách tb noãn cũng như dễ làm tổn
Gặp khó khăn trong việc tách tb noãn cũng như dễ làm tổn
thương mô
thương mô
2.Tái sinh cây từ protoblast:
2.Tái sinh cây từ protoblast:
•
Tạo vách tế bào:
Tạo vách tế bào:
khi đưa tb trần vào trong mt tái sinh sau
khi đưa tb trần vào trong mt tái sinh sau
1-2 tuần
1-2 tuần
•
Phát triển mô sẹo vào tạo cây hoàn chỉnh:
Phát triển mô sẹo vào tạo cây hoàn chỉnh:
chuyển tb sang mt
chuyển tb sang mt
đặc tạo mô sẹo
đặc tạo mô sẹo



tái sinh chồi
tái sinh chồi


cây hoàn chỉnh
cây hoàn chỉnh
Sơ
đồ
nuôi
cấy
tế
bào
trần


Ứng dụng nuôi cấy tế bào trần trong chọn tạo giống
Ứng dụng nuôi cấy tế bào trần trong chọn tạo giống
•
Dung hợp tế bào trần: là sự kết hợp của hai hay nhiều tế
Dung hợp tế bào trần: là sự kết hợp của hai hay nhiều tế
bào trần tạo ra một khối tế bào trần, trong đó nhân của
bào trần tạo ra một khối tế bào trần, trong đó nhân của
chúng có thể kết hợp hoặc tồn tại riêng rẽ.
chúng có thể kết hợp hoặc tồn tại riêng rẽ.




tạo ra các khối mô sẹo hoặc phôi soma, ứng dụng trong

tạo ra các khối mô sẹo hoặc phôi soma, ứng dụng trong
tạo con lai tế bào soma, có thể xáy ra theo 2 con đường:
tạo con lai tế bào soma, có thể xáy ra theo 2 con đường:
tự phát hay cảm ứng
tự phát hay cảm ứng
•
Chọn dòng tb: Bằng biện pháp bỏ thành cellulose và đưa cơ
Chọn dòng tb: Bằng biện pháp bỏ thành cellulose và đưa cơ
thể thực vật về trạng thái từng tế bào riêng rẽ với kích thước
thể thực vật về trạng thái từng tế bào riêng rẽ với kích thước
không lớn hơn nhiều so với cơ thể vi sinh vật đã cho phép tiến
không lớn hơn nhiều so với cơ thể vi sinh vật đã cho phép tiến
hành kỹ thuật chọn dòng vi sinh vật đối với thực vật bậc cao
hành kỹ thuật chọn dòng vi sinh vật đối với thực vật bậc cao
V.Thụ phấn và nuôi cấy phôi in virto
•
Thụ phấn trong tự nhiên:
Thụ phấn trong tự nhiên:
Hạt phấn chín rơi vào núm nhụy
Hạt phấn chín rơi vào núm nhụy


nảy mầm,tạo ống phấn.
nảy mầm,tạo ống phấn.
Hai tinh tử 1n tới noãn
Hai tinh tử 1n tới noãn


thụ tinh kép (tạo phôi + hợp bào nội
thụ tinh kép (tạo phôi + hợp bào nội

nhũ tam bội)
nhũ tam bội)
•
Bất hợp giao tử trước khi thụ tinh:
Bất hợp giao tử trước khi thụ tinh:
1 hạt phấn lạ rơi vào núm nhụy
1 hạt phấn lạ rơi vào núm nhụy


nhụy tạo ra chất ức
nhụy tạo ra chất ức
chế ngăn cản sự phát triển hoặc làm biến dạng ống
chế ngăn cản sự phát triển hoặc làm biến dạng ống
phấn,ngăn thụ tinh
phấn,ngăn thụ tinh
•
Bất hợp giao tử sau khi thụ tinh:
Bất hợp giao tử sau khi thụ tinh:
hạt phấn lạ rơi vào núm nhụy
hạt phấn lạ rơi vào núm nhụy


thụ phấn vẫn diễn ra
thụ phấn vẫn diễn ra
nhưng hạt không phát triển
nhưng hạt không phát triển
(do giữa nội nhũ và phôi hình thành cơ chế ức chế sự
(do giữa nội nhũ và phôi hình thành cơ chế ức chế sự
phát triển của phôi)
phát triển của phôi)

1.Thụ phấn in vitro
1.Thụ phấn in vitro
Để khắc phục hiện tượng bất hợp giao tử trong lai xa
Để khắc phục hiện tượng bất hợp giao tử trong lai xa
Quá trình thụ phấn
Quá trình thụ phấn
•
Khử trùng nhụy hoa,tách bầu quả chứa noãn và nuôi cấy trong
Khử trùng nhụy hoa,tách bầu quả chứa noãn và nuôi cấy trong
mt vô trùng
mt vô trùng
•
Đặt hạt phấn trực tiếp lên đầu nhụy
Đặt hạt phấn trực tiếp lên đầu nhụy


thụ phấn thành công,phôi sẽ phát triển trong mt nuôi cấy
thụ phấn thành công,phôi sẽ phát triển trong mt nuôi cấy