Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

ĐỀ TÀI:
Tìm hiểu và thu nhận
enzyme protease từ mủ mít
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
Nhóm thực hiện:
1. Nguyễn Thị Mỹ Phụng 072541S
2. Lâm Minh Thuận 072599S
3. Phan Thị Minh Tuyền 072639S
4. Lê Văn Như Vinh 072654S
5. Hồ Thị Tường Vy 072661S
Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít
MỤC LỤC
I.Tổng quan:
1.Giới thiệu về mít.
1.1 Nguồn gốc
1.2 Đặc điểm
1.3 Đặc điểm sinh lý sinh thái
1.4 Phân loại
1.5 Gía trị sử dụng
2.Giới thiệu về enzyme protease từ mủ
mít.
2.1 Định nghĩa enzym protease
2.2 Phân loại enzym protease
2.3 Ứng dụng enzym protease trong
mủ mít
3.Tinh sạch enzyme protease
II.Qui trình thu nhận

1.Sơ đồ qui trình.
2.Giải thích qui trình.
III.Kết quả
IV.Ứng dụng
2
Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít
I- TỔNG QUAN
1. Giới thiệu về cây mít:
1.1 Nguồn gốc:
Cây mít có tên khoa học là Artocarpus heterphyllus
thuộc họ dâu tằm Moraceae,gốc ở dãy núi Ghats phía
nam Ấn Độ và từ đó đã lan khắp Ấn Độ,philippine.Nó
là cây trồng phổ biến ở : Bangladesh ,Sri Lanka,
Indonesia, Brazil và Việt Nam…Quả mít được coi là
loại quả quốc gia của bangladesh.
1.2 Đặc điểm:
-Mít thuộc loại cây lớn,thường xanh quanh năm ,có thể
cao từ 8 đến 15 m ,đường kính gốc đạt đến 1.5m và sống
đến 100 năm.
- Lá mít mọc cách, hình trứng, đầu lá phình to và hơi
nhọn, cạnh đáy thon, khi còn non lá có 3 thùy, lá dày,
cứng, mặt trên của lá màu xanh thẫm, nhẵn, không có
lông, mặt dưới của lá hơi thô, màu xanh nhạt. Mặt lá rộng
từ 1-12cm, dài 8-15cm.
- Rễ cọc của cây mít phát triển từ khi cây còn nhỏ, đánh
cây đi trồng dễ làm chết cây non. Ở cây già bộ rễ phát
triển mạnh có khi nổi lên mặt dất bám chắc cho nên chống
gió bão tốt.
-Mít có hoa đơn tính đồng chu. Hoa đực hay cái sinh cùng
một chùm, chung một cuống rất to khỏe. Mỗi chùm gồm

nhiều hoa, không có cánh, dính vào nhau thành những
cụm hoa có đực riêng cái riêng. Hoa đực rụng sớm còn
hao cái sau khi đã thụ phấn lớn lên thành một quả phức
3
Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít
hợp, mỗi múi là một quả con. Qủa sinh ra trên cây thân
chính hoặc ở chân những cành lớn, cay già quả có khuynh
hướng mọc thấp thậm chí mọc cả ở những rễ ăn nổi trên
mặt đất.
- Quả mít hình bầu dục hay hình tròn, quả to kích thước
khoảng (30-60) cm x (20-30) cm, trọng lượng 4.5-27.3kg ;
một số giống nhỏ hơn nặng từ 1.4-4.5kg ; vỏ dày và ghồ
ghề có nhiều gai nhọn. Khi chưa chín vỏ quả có màu xanh,
khi quả bắt đầu chín vỏ chuyển từ màu lục sang màu nâu.
Bên trong có nhiều múi ăn được , ngọt, thơm, giòn. Qủa
4
Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít
mít có các thảnh phần cấu tạo gồm: vỏ, xơ, múi, hạt, cùi,
lõi.
1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh thái:
Mít trồng ở nước ta bao gồm nhiều loại với chất lượng quả
khác nhau, nhưng có những đặc điểm sinh thái chung gần
giống nhau như:
- Thích nghi dễ dàng ở vùng khí hậu ấm áp, không sống
được ở nơi có nhiệt độ thấp. Có khả năng chịu được khô
hạn nhưng trong trường hợp đó cây sinh trưởng kém, ra
hoa kết trái kém.
- Có thể sống được trên nhiều vùng đất đai khác nhau.
- Ở nơi đất tốt mít sinh trưởng và phát triển nhanh, bảo tồn
được những đặc tính tốt của cây mẹ.

- Mít phát triển nhanh trong những năm đầu (từ 1-4 tuổi),
những năm sau cây chậm lớn về chiều cao, to nhanh về
đường kính, mít có khả năng tái sinh chồi mạnh khi cây
còn dưới 5-6 tuổi.
- Mít ra hoa kết quả từ 4-5 tuổi, chậm nhất là 7 tuổi. Mít ra
hoa từ tháng 1-2, quả chín từ tháng 6-8.
1.4 Phân loại:
Theo đặc điểm:2 loại
5
Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít
-Mít thường (Artocapus herterophylluss Lam) :
trồng phổ biến ở cả miền Bắc và miền Nam,búp và lá non
không có lông,trái to,vài kg dến 20kg. Bao gồm nhiều loại
khác nhau như mít mật,mít nghệ,mít dừa…
-Mít tố nữ (Artocarpus interger thumb) : trái nhỏ hơn
mít thường và múi thường dính vào với lõi,vỏ có xơ dính
liền có thể mổ bằng một nhát dao dọc rồi tách khỏi múi dễ
dàng.Trái tuy nhỏ chỉ khoảng 1-2kg nhưng cây rất sai có
sai có đến hàng trăm trái.
1.5 Giá trị sử dụng:
-Mít trước hết dùng để ăn quả: hạt mít chứa nhiều tinh bột,
thành phần glucid trong múi mít chủ yếu là đường hòa tan
và cellulose.
-Mít thường -Mít tố nữ
6
Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít
-Nó có thể sử dụng làm keo dính đáy tàu, thuyền. Đồng
thời, mủ mít cũng có hoạt tính tương tự như papain từ mủ
đu đủ.
-Đặc biệt trong ngành công nghiệp chế biến sữa,lượng

renin được sản xuất hiện chưa đáp ứng được nhu cầu thực
tế, xu hướng sử dụng protease thực vât ( mủ mít,hạt
mít…) ngày càng phát triển.
2.Sơ lược về enzyme protease trong mủ
mít
2.1 Định nghĩa enzyme protease:
Protease là nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân liên
kết peptide giữa các L-acid amin,là liên kết chủ yếu trong
phân tử protein hay peptide. Protease còn có tên gọi khác
như :proteinase hay C-N hydrolase.
2.2 Phân loại enzym protease:
a. Dựa vào nguồn thu nhận enzyme:
-Protease động vật: pepsin, tripsin, chymotripsin
-Protease thực vật: papain, bromelin, ficin…
-Protease vi sinh vật: subtilisin, protease vi sinh vật…
b. Dựa vào sự phân bố enzyme:
-Protease nội bào (endoprotease) :các enzyme hoạt
động chủ yếu bên trong tế bào như: catepsin,…
-Protease ngoại bào(exoprotease): các enzyme này
hoạt động ở các mô,các cơ quan đặc hiệu ngoài tế bào như
pepsin, chymotrypsin,…
c. Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các liên
kết peptide trong phân tử protein:
-Endopeptidase(proteinase):chủ yếu phân giải các
liên kết peptide nằm trong phân tử protein tạo thành những
7
Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít
đoạn peptide có trọng lượng phân tử nhỏ (polypeptide
mạch ngắn, pepton…)
-Exopeptidase (polypeptidase): chủ yếu phân cắt liên

kết peptide ở hai đầu mạch.
d. Dựa vào các nhóm chức trong trung tâm hoạt
động:
-Protease serin: Trung tâm hoạt động có nhóm (-OH)
như: tripsin, subtilopeptidase
-Protease cystein: Trung tâm hoạt động có nhóm (-
SH) như papain, bromelin,…
-Protease acid: trung tâm hoạt động có nhóm (-
COOH) như pepsin, renin,…
-Protease kim loại:trung tâm hoạt động có các nguyên
tố kim loại: cacboxypeptidase A,…
e. Dựa vào thành phần amino acid và vùng pH tối ưu
của protease:
-Protease acid: pepsin, renin,… hoạt động ở vùng
acid.
-Protease kiềm: Trypsin,chymotrypsin,… hoạt động ở
vùng pH kiềm.
-Protease trung tính: amylase,papain,… hoạt động ở
vùng pH trung tính.
2.3 Ứng dụng của enzyme protease trong mủ mít:
Khả năng thay thế renin của enzym protease mủ mít
trong công nghệ chế biến sữa:
Công nghệ chế biến các sản phẩm từ sữa không thể
không sử dụng các chế phẩm enzym. Có thể nói, các chế
phẩm enzym đóng vai trò quyết định để tạo ra các sản
phẩm sữa. Thông thường để chế biến các sản phẩm từ sữa
người ta sử dụng enzym renin thu nhận từ dạ dày bê.
Trong 10 năm trở lại đây xu hướng sử dụng enzym
protease thực vật ngày càng phát triển như papain từ nhựa
cây đu đủ, bromelin từ trái dứa hoặc ficin từ cây sung đã

8
Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít
được nghiên cứu nhiều trên thế giới. Nhưng hiện nay
enzym protease từ mủ mít chỉ có một công trình nghiên
cứu tại Ai Cập. Nơi mà có những thử nghiệm đầu tiên và
tìm thấy một vài ứng dụng của enzym protease trong lĩnh
vực sản xuất bơ, phomai….

3. Các phương pháp tinh sạch và độ tinh sạch:
-Tủa cồn
-Tủa aceton
-Tủa sunfat amon
-Sắc kí lọc gel
-Sắc kí trao đổi ion trên DEAE-cellulose
II- QUI TRÌNH THU NHẬN
1. Thu nhận:
-Cách tiến hành lấy mủ: lau cuống trái ,dao và hũ nhựa
đựng mủ bằng bông tẩm cồn. Hủ nhựa để trong thùng
đá, dùng dao inox cắt đứt phần cuống trái, khi hết mủ
tiếp tục cắt cách vết cắt trước khoảng 1-2cm, làm như
thế cho đến khi vết cắt tiếp xúc với ruột trái mít. Mủ thu
nhận được bảo quản lạnh và đưa về phòng thí nghiệm
để giữ lạnh trong tủ đông.
Sơ đồ qui trình:
9
Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít
Giải thích qui trình
• Hòa tan
-Đối với mủ tươi: cân khối lượng mủ và hoà tan đệm
phosphat 0.05M pH 7.5 đã làm lạnh theo tỉ lệ: 1g mủ:

10ml đệm. Khuấy bằng đũa khuấy trong 15 phút và thực
hiện trong tủ lạnh (2
o
C)
Mủ mít
Hòa tan
Đệm phosphat
0.05 M pH
7.5
Lọc thu dịch
trích ly
B
ã
Sắc ký trao đổi ion trên DEAE-Cellulose
Enzym Protease
Tủa acetoneTủa cồn
Tủa (NH
4
)
2
SO
4
Sắc ký lọc gel
Điện di
10
Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít
-Đối với mủ đông khô: hòa tan mủ bằng đệm phosphat
theo tỉ lệ 20mg: 3ml đệm phosphat 0.05M pH 7.5 .
-Đệm phosphat 0.05M pH 7.5 được pha như sau
-Dung dich mononatri orthophosphat 0.05M: cân 7.8005g

NaH
2
PO
4
.12H
2
O hòa tan và định mức đến 1000ml bằng
nước cất(dung dịch a)
-Dung dịch đinatri hydrophosphat: 17.907g
NaH
2
PO
4
.12H
2
O hòa tan và định mức đến 1000ml bằng
nước cất (dung dịch b)
-Trộn 80ml dung dịch a, 420ml dung dịch b(tỉ lệ dung dịch
a: dung dịch b là 16:84)và định mức đến 1000ml thu dung
dịch đệm phosphat 0.05M pH7.5 (nếu đo pH không phù
hợp phải dùng dung dịch hoặc dung dịch b chỉnh pH).
• Lọc: Dùng giấy lọc thô để tách riêng phần không
tan,dung dịch sau lọc tiếp tục tinh sạch. Thực hiện trong tủ
lạnh (2
o
C)
• Tinh sạch
 Tinh sạch theo phương pháp tủa sunfat amon
[(NH
4

)
2
SO
4
]:
Sunfat amon là muối trung tính có khả năng gây tủa
thuận nghịch thường được sử dụng nhiều trong phòng thí
nghiệm để tủa protein, enzyme nhờ khả năng không gây
biến tính và có độ hòa tan cao. Dung dịch protein và
enzyme khi bổ sung (NH
4
)SO
4
các ion NH
4
+
và SO
4
-2
sẽ
trung hòa điện tích của protein hoặc enzym ,các phân tử
mất điện tích không còn đẩy nhau mà liên kết lại thành
tủa.
-Sau khi tủa ,protein và enzyme thu được còn giữ lại một
lượng nhỏ muối (NH
4
)
2
SO
4

do vậy phải loại muối nhờ quá
trình thẩm tích qua màng bán thấm (túi cetophan).
Quy trình tủa sunfat amon (NH
4
)
2
SO
4
như sau:
11
Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít
Giải thích một số công đoạn:
-Tủa (NH
4
)
2
SO
4
: muối để lạnh và cho từ từ vào dịch trích
ly, khuấy đều nhẹ để tránh biến tính protein. Quá trình tủa
được tiến hành ở nhiệt độ 2
0
C, thời gian tủa 30phút
-Ly tâm: khi tủa hình thành tiến hành ly tâm tủa với tốc
độ 4000vòng/phút trong 10 phút, thu tủa. Trong quá trình
ly tâmnhiệt độ tăng cùng với thời qian nên cần làm lạnh
dịch kỹ trước khi ly tâm.
-Hòa tan tủa: tủa được hòa tan trong đệm phosphat 0.05M
pH 7.5
Dịch trích ly

Tủa (NH
4
)
2
SO
4
Để yên 30 phút
nhiệt độ 2
0
C
Ly tâm thu tủa
Hòa tan tủa
Thẩm tích
Dịch
protease
Dịc
h
Đệm phosphat
0.05M ph7.5
12
Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít
-Thẩm tích: dịch enzym trên được thẩm tích loại muối
trong túi Celophan đối dung dịch đệm phsphat 0.05M pH
7.5 có khuấy để rút ngắn thời gian thẩm tích. Quá trình
được thực hiện ở nhiệt độ thấp (4
0
C) và kết thúc khi dịch
thẩm tích không cho kết tủa trắng với BaCl
2
1%, Sau đó,

dịch enzym được đông khô
 Tinh sạch theo phương pháp tủa cồn
Protein được bao bọc bởi lớp vỏ hydrat, cồn là dung
môi hữu cơ háo nước nên khi bổ sung cồn vào dung dịch
có chứa enzym hòa tan, nó sẽ bóc lớp vỏ hydrat gây tủa
protein
Cách thực hiện: enzym rất dễ biến tính với dung môi
hữu cơ nên trước khi tủa cần làm lạnh dung dịch chứa
protein và enzym, cồn ở nhiệt độ -4
0
C. Rót cồn chảy theo
thành cốc để tránh biến tính enzym. Để lạnh cho đến khi
xuất hiện tủa, tiến hành ly tâm 4000v/phút trong 10 phút.
Thu tủa, để bay hơi tự nhiên trong tủ lạnh.
 Tinh sạch theo phưong pháp tủa acetone
Acetone cũng là tác nhân tủa protein và enzym. Khác
với muối trung tính,acetone là dung môi hữu cơ háo nứơc,
khi bổ sung acetone vào dung dịch có chứa enzym hòa tan,
nó sẽ hút lớp áo nước của phân tử enzym, do vậy cá
enzym kết với nhau tủa xuống.
Sắc kí lọc gel
Phương pháp dùng chất rây phân tử (lọc gel - gel
filtration)
Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về
kích thước hình dạng và phân tử lượng của enzyme có
trong hỗn hợp để tách chúng ra.
Để đảm bảo cho việc tách enzyme được tốt, chất rây
phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein
13
Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít

enzyme. Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền
với các yếu tố về cơ học cũng như sinh học
Tóm lại bằng phương pháp lọc rây phân tử người ta
thể tách các chất có trọng lượng phân tử khác nhau có
trong hỗn hợp Người ta có thể dùng kỹ thuật này để loại
muối thay cho quá trình thẩm tích
 Sắc kí trao đổi ion trên DEAE-cellulose :
Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác
nhau về điện tích tổng số của các protein enzyme. Hay nói
cách khác, phương pháp này được dựa trên cơ sở của phản
ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc
dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion.
Để tách enzyme protease từ mủ mít ra khỏi hỗn hợp
Qua Sắc kí trao đổi ion các enzyme khác nhau sẽ
được chiết ra khỏi cột theo từng phần chiết khác nhau
trong đó chứa phần chiết có enzyme cần thu với nồng độ
cao nhất.
 Điện di :
Điện di là quá trình phần tử tích điện chuyển động
nhờ một điện trường di qua một hỗn hợp chất.
Trong điện di, chất mang được tạo thành từ nhiều
chất khác nhau : giấy Cellullose-acetate, gel
poliacrylamide, gel agarose, tinh bột Và cũng có rất
nhiệu loại điện di : điện di ống, lớp mỏng hoặc tờ mỏng
(trong bài này ta sử dụng điện di poliacrylamide).
Phương pháp điện di được dùng để kiểm tra độ tinh
sạch protein sau khi qua quá trình tách chiết và tinh chế.
Ngoài ra nó còn được dùng để xác định gián tiếp trọng
lượng phân tử của mẫu vừa tách.
Nguyên tắc :

14
Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít
Dưới tác dụng của điện trường, các chất có phân tử
lượng khác nhau có trong mẫu sẽ di chuyển với tốc độ
khác nhau, các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực
dương và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển về cực
âm của điện trường.Sự di chuyển phụ thuộc vào điện tích,
hình dạng, kích thước, thành phần hóa học và lực điện
trường. Khi quá trình phận tách kết thúc,các chất có cùng
phân tử lượng tập trung lại thành dãy(vạch) ngang ở các vị
trí khác nhau trên chất mang. Sau đó những vạch này được
phát hiện nhờ các phương pháp nhuộm màu,
autoradiography, định lượng bằng các phương pháp quét
qua dencitometer.
Tùy thuộc vào trọng lượng phân tử của protein mà sử
dụng gel có nồng độ thích hợp.Nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra
lỗ gel lớn , cho phép phân tách các phân tử sinh học có
kích thước lớn,ngược lại nồng độ cao sẽ cho lỗ gel nhỏ,vì
vậy chỉ có khả năng phân tách những phân tử sinh học có
kích thước nhỏ.
Quá trình điện di chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ, đệm,
pH và sự ổn định của dòng điện
Định lượng và đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm
protein
. Các phương pháp xác định hàm lượng protein
Protein sau khi đã được tách chiết và làm sạch có
thể định lượng được. Nếu protein nghiên cứu là
enzyme thì việc định lượng thông qua xác định hoạt
độ của enzyme (theo quy ước quốc tế: 1 đơn vị hoạt
độ enzyme là lượng enzyme làm chuyển hoá 1 mol 

cơ chất trong 1 phút ở các điều kiện tiêu chuẩn). Như
vậy cứ sau các bước tách chiết và làm sạch protein
người ta thấy tổng lượng protein giảm nhưng hoạt độ
enzyme tăng nghĩa là hoạt độ riêng tăng rất cao.
Protein được coi là sạch nếu những bước tách chiết
15
Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít
và làm sạch sau không làm tăng hoạt độ riêng của
chúng nữa, và chỉ khi đó ta mới hoàn thành việc tách
chiết và làm sạch protein. Nếu protein không phải là
enzyme thì ta có thể định lượng chúng bằng các
phương pháp khác
III.KẾT QUẢ :
Bảng so sánh hiệu suất và độ tinh sạch
Giai đoạn Độ tinh sạch (ŋ) Hiệu suất %
Dịch trích ly 1.0 100
Sunfat amon 40% 2.7 77
Sắc kí lọc gel 4.4 60
Dựa vào các tài liệu tham khảo được, nhóm chúng tôi
đã tổng hợp các bảng số liệu so sánh các hiệu suất và độ
tinh sạch trong các phương pháp tủa. Đối với phương pháp
tủa cồn va aceton cho kết quả thấp, đặc biêt là aceton hầu
như không tạo được tủa( sau 5h). Và kết quả cho thấy với
phương pháp tủa bằng sunfat amon là có kết quả được coi
là tối ưu nhất.
Và đây là bảng so sánh riêng trong phương pháp tủa
bằng sunfat amon với những nồng độ khác nhau.
Độ tinh sạch (ŋ) Hiệu suất thu hồi (%)
16
Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít

Dịch trích ly 1.0 100
(NH
4
)
2
SO
4
40% 2.7 77
(NH
4
)
2
SO
4
50% 2.4 85
(NH
4
)
2
SO
4
60% 1.7 75
Nồng độ
(NH
4
)
2
SO
4
(%)

Khối lượng tủa(g)
Mủ trái bánh tẻ
30 0.1
40 1.8
50 3.3
60 2.8
 Nồng độ 50% bão hòa sunfat amon là nồng độ
thích hợp nhất để tủa tất cả các dạng mủ mít.
 Ở nồng độ 30% bão hòa sunfat amon protease
mủ mít hoàn toàn không tủa.
IV.Ứng dụng:
Enzyme protease từ mủ mít để đông tụ sữa.
Đó là khả năng thay thế rennin trong quá trình đông
tụ sữa sản xuất phomai.
Ưu điểm đáng kể của enzyme này là có nguồn gốc từ
thực vật (mủ mít) không gây vị đắng. Đây là phát hiện vô
cùng quan trọng về khả năng dùng mủ mít thay thế rennin.
17
Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít
18
Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít
TÀI LIỆU THAM KHẢO
- Luận văn tốt nghiệp Thu nhận, chiết suất tinh sạch và
nghiên cứu enzym protease trong hạt mít và mủ mít
của Trần Thị Ngọc Ánh Trường ĐH TĐT.
- Công nghệ enzym của Nguyễn Đức Lượng. NXB ĐH
Quốc Gia.
- Lê Văn Việt Mẫn, công nghệ sản xuất các sản phẩm
từ sữa, NXB Đại hoc Quốc gia TPHCM, 2004
- http:/www.vietnet.com.au/details.php?nid =428

- http:/www.ykhoanet.com/yhoccotruyen/29 269.htm
- />- http ://en.wikipedia.org/wiki/Pandanus
- />s%20amaryllifolius%2002%20(aromatic%20pandan
%20leaf).jpg
- />19