NGHIÊN CỨU VÀ THU NHẬN ENZYM PROTEASE TỪ CÁC CHỦNG NẤM SỢI Ở RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐



Trần Thị Nhã Uyên


NGHIÊN CỨU VÀ THU NHẬN ENZYM PROTEASE TỪ CÁC
CHỦNG NẤM SỢI Ở RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ


CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT.
Mã số: 604240


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
TS. TRẦN THANH THỦY





TP. Hồ Chí Minh , tháng 7 – năm 2010
MỞ ĐẦU
Lí do chọn đề tài.
Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản
của sinh vật mà còn có vai trò rất lớn trong công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, kĩ thuật phân

tích, công nghệ gen và bảo vệ môi trường. Do có khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực
mà ngành công nghiệp enzyme đã đem lại lợi nhuận to lớn cho nhiều nước. Ở Việt Nam, ngành
công nghệ enzyme vẫn chưa thật sự
phát triển. Mỗi năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn các
enzyme để ứng dụng vào sản xuất công, nông nghiệp, giải quyết ô nhiễm MT…
Trong các loại enzyme, protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất. Năm 1995, tổng doanh
thu từ enzyme này ở các nước châu Âu lên đến 187,2 triệu USD, cao nhất trong các loại enzyme.
Protease được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược
phẩm, nông nghiệp…Nguồ
n protease chủ yếu hiện nay thu được từ VSV, đặc biệt là các chủng NS
thuộc chi Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces, Mucor.
Việc nghiên cứu và phân lập các chủng NS trong tự nhiên để thu nguồn protease mới có giá
trị là vấn đề đang được khoa học quan tâm nghiên cứu. Để thu được nguồn protease mới có giá trị
cần phải phân lập các chủng mới có trong tự nhiên. Một trong những hướng nghiên cứu mà khoa
học đang quan tâm là tìm các chủng VSV mới có đặc tính ưu việt từ RNM. Chính
điều kiện sống
khắc nghiệt ở RNM tạo ra nhiều cơ hội tìm thấy các nguồn gen VSV quí hiếm, trong đó có NS sinh
protease.
Ở nước ta, RNM Cần Giờ là nơi HST phong phú, đa dạng. Tuy nhiên, những nghiên cứu về
đa dạng sinh thái của RNM Cần Giờ chủ yếu tiến hành ở hệ động thực vật. VSV, trong đó NS là
một đối tượng được phân bố rộng rãi và có giá trị kinh tế chỉ mới
được quan tâm nghiên cứu trong
thời gian gần đây. NS ở RNM Cần Giờ có nhiều đặc tính quí báu như khả năng chịu đựng được điều
kiện sống khắc nghiệt, khả năng sinh nhiều enzyme ngoại bào, trong đó có protease. Do RNM Cần
Giờ có thảm TV dày đặc, xác động thực vật bị phân hủy tạo thành nguồn cơ chất cho các chủng NS
sinh các enzyme ngoại bào.
Cho đến hiện nay, các công trình nghiên cứu về NS ở RNM Cần Gi
ờ vẫn còn thưa thớt, trong
đó vẫn chưa có công trình nghiên cứu về khả năng sinh protease của các chủng NS.
Chính vì những lí do trên mà tôi chọn đề tài “Nghiên cứu và thu nhận enzyme protease từ

các chủng NS ở RNM Cần Giờ”.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: các chủng NS phân lập tại 5 xã Long Hòa, Lí Nhơn,
Tam Thôn Hiệp, An Thới Đông, Bình Khánh ở RNM Cần Giờ.
Địa điểm nghiên cứu: PTN Vi sinh-Trường Đại học Sư Phạm Thành Phố H
ồ Chí Minh.
Mục tiêu của đề tài: Tìm ra một số chủng NS có khả năng sinh protease mạnh từ RNM Cần
Giờ và nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu nhận protease.
Nhiệm vụ của đề tài:
 Phân lập các chủng NS từ RNM Cần Giờ.
 Tuyển chọn các chủng NS có khả năng sinh protease cao.
 Nghiên cứu đặc điểm hình thái và một số đặc tính sinh học của các ch
ủng NS tuyển
chọn.
 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện MT đến ST và hoạt độ protease của các chủng
NS được tuyển chọn, từ đó tìm ra MT tối ưu để nuôi cấy NS thu protease.
 Thu nhận các chế phẩm enzyme bán tinh khiết.






CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. RNM Cần Giờ.
1.1.1. Đặc điểm của RNM Cần Giờ.
1.1.1.1. Vị trí địa lý, điều kiện tự nhiên.
Về vị trí địa lý: RNM Cần Giờ có tọa độ 10°22’ – 10°40’ vĩ độ Bắc và 106°46’ – 107°01’
kinh độ Đông. Tổng diện tích khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là 75.740 ha, trong đó vùng lõi
4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha và vùng chuyển tiếp 29.880 ha [43].

Hình 1.1. RNM Cần Giờ [43]
Nằm cách trung tâm thành phố Hồ Chí Minh khoảng 70km, RNM Cần Gi
ờ giáp tỉnh Đồng
Nai ở phía Bắc, giáp biển Đông ở phía Nam, giáp tỉnh Tiền Giang và Long An ở phía Tây, giáp tỉnh
Bà Rịa-Vũng Tàu ở phía Đông [43].
RNM Cần Giờ phát triển trên một nền đất đầm mặn mới, do phù sa sông mang đến và lắng
đọng tạo thành nền đất. Đất được tạo ra bởi tổng hợp các quá trình lắng tụ trầm tích đất sét, phèn
hóa và nhiễm mặn. Cho đến nay các lớp đất sâu chưa kết chặ
t nên không có khả năng tạo thành đất
nền rắn chắc, hàm lượng lưu huỳnh dạng khử khá cao với một lượng muối cao không có lợi cho
nông nghiệp[17].

Địa hình: huyện Cần Giờ có địa hình thấp trũng, không bằng phẳng, phân cắt bởi mạng lưới
sông ngòi uốn khúc. Nhìn chung, địa hình huyện Cần Giờ có 6 dạng: dạng cao 2- 10 m, dạng chỉ
ngập vào những tháng có nước lớn (tháng 11, 12) trong năm và 4 dạng còn lại đều ngập triều ở các
mức độ khác nhau [9].
Cần Giờ nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới xích đạo, hướng gió chính là Tây Nam, mùa mưa
bắt đầu muộn và kế
t thúc sớm hơn so với các địa phương khác trong vùng (từ tháng 5 đến tháng 10),
mùa khô từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau [30]. Nhiệt độ trung bình khoảng 25
0
C - 29

0
C, nhiệt độ
thấp nhất là 18,8
o
C, cao nhất là 35
o
C. Biên độ dao động nhiệt trong ngày từ 5-7
o
C [30]. Độ ẩm trung
bình từ 73% đến 85%. Lượng mưa trung bình hàng năm từ 1.000 – 1.402 mm [66]. Độ mặn dao
động từ 1,8%-3% [2]. Độ mặn cũng thay đổi tùy theo mùa. Vào mùa khô có độ mặn cao hơn vào
mùa mưa. Độ mặn có ảnh hưởng rất lớn đến sự phân bố khu hệ SV ở RNM nói chung và NS nói
riêng.
Chế độ thủy triều: Cần Giờ chịu tác động của chế độ bán nhật triều không đều của biển
Đông. M
ỗi tháng có khoảng 2 ngày nhật triều không đều xuất hiện 2-3 ngày trước, giữa và cuối
tháng âm lịch. Biên độ triều tương đối lớn từ 3- 4m. Thời gian có biên độ triều lớn từ tháng 6- 8.
Mực nước trung bình cao nhất thường xuất hiện vào tháng 10, 11 và thấp nhất vào tháng 6, 7 [9].
Đất đai: toàn bộ huyện Cần Giờ thuộc loại đất phèn mặn gồm hai loại: đất phèn mặn theo
mùa và đất phèn mặn thường xuyên. Đất phèn mặn theo mùa n
ằm ở phía Bắc huyện Cần Giờ. Đất
thịt, giàu mùn, chứa nhiều xác hữu cơ dưới môi truờng yếm khí, chất dinh dưỡng khá, phản ứng của
đất từ chua đến rất chua, pH ở độ sâu của tầng sinh phèn xuống tới 2,4-2,7. Tuy nhiên vào mùa lũ,
mặn được đẩy ra xa, nước được pha loãng trong thời gian dài 4-5 tháng. Đất phèn mặn thường
xuyên chiếm phần lớn diện tích Cần Giờ. Đất thịt trung bình, nhiều mùn nhão l
ẫn xác hữu cơ bán
phân giải, bị ngập triều thường ngày, giàu dinh dưỡng, độ pH từ 5,8-6,5 [66].
1.1.1.2. Khu hệ SV ở RNM Cần Giờ.
RNM Cần Giờ là HST trung gian giữa HST thủy vực với HST trên cạn, HST nước ngọt và
HST nước mặn. Rừng Cần Giờ nhận một lượng lớn phù sa từ sông Đồng Nai, cùng với ảnh hưởng

của biển kế cận và các đợt thủy triều nhờ đó hệ TV n
ơi đây rất phong phú với trên 150 loài và trở
thành nguồn cung cấp thức ăn, nơi trú ngụ cho rất nhiều loài thủy sinh, cá cùng với các ĐV có
xương sống khác. Hệ ĐV cũng rất đa dạng gồm khu hệ chim có khoảng 120 loài, ĐV thủy sinh
không xương sống với trên 700 loài, khu hệ cá trên 130 loài, khu hệ ĐV có xương sống có 9 loài
lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài có vú [44].
Chính hệ động thực vật đa dạng ở RNM Cần Giờ trở
thành nguồn thức ăn phong phú cho
các VSV bao gồm nấm men, NS, VK và xạ khuẩn. Nhờ vào khả năng tiết ra các enzyme ngoại bào
như amylase, protease, kitinase, cellulase,…chúng phân hủy tinh bột protein, kitin,…. có trong xác
động thực vật và giáp xác làm nguồn thức ăn. Và bản thân xác động thực vật bị phân hủy trở thành
nguồn mùn là lượng thức ăn dồi dào cho hệ TV và các SV phù du.
Trung tâm MERD đã nghiên cứu khu hệ VSV ở RNM thuộc các tỉnh Nam Định và Thái
Bình (2001). Kết quả phân lập được 69 chủng nấm men, 55 chủng xạ khuẩn. Nhiều chủng có hoạt
tính enzyme ngoại bào cao, có khả năng sinh KS và phân giải dầu mạnh [13].
Riêng ở RNM Cần Giờ ch
ưa có nhiều công trình nghiên cứu về nấm men và xạ khuẩn. Qua
phân tích các mẫu đất ở RNM Cần Giờ, các nhà khoa học đã phát hiện có vi khuẩn Bacillus
thuringiensis sinh nhiều tinh thể hình cầu có tác dụng tiêu diệt ấu trùng muỗi rất cao. Kết quả thí
nghiệm của nhóm nghiên cứu Mai Thị Hằng và Trần Thị Mỹ Hạnh cho thấy các chủng VSV này có
khả năng diệt các loại ấu trùng muỗi từ 60-100% sau 36 giờ, có chủng diệt đượ
c 100% ấu trùng
muỗi sốt rét Anopheles minimus, muỗi gây sốt xuất huyết Aedes aegypti và muỗi Culex
quinquefasciatus gây bệnh chân voi [61].
NS ở RNM chiếm số lượng lớn, rất phong phú và đa dạng. Khi lá còn ở trên cây đã có một số
loài nấm sống trên đó, một số chui sâu vào biểu bì, một số sống trên mặt lá. Khi lá rụng xuống, sau
24 giờ ngập nước triều đầu tiên, lá đã bị các VSV phân hủy, lúc đầu là chi Phytophora thuộc lớ
p
Nấm tảo, rồi đến Fusarium và Penicillium thuộc lớp Nấm bất toàn. Sau tuần thứ 2 và thứ 3, các
nấm tảo nhường chỗ cho các loài VSV khác. Tất cả các mô xốp được phân huỷ nhanh nhất, còn các

hợp chất cellulose và lignin bị phân hủy cuối cùng. Trong quá trình phân hủy, lượng đạm trên các
mẩu lá tăng 2 – 3 lần so với ban đầu (Kaushik và Hynes, 1971). Khi phân tích, so sánh các loại acid
amin có trong lá tươi và lá phân huỷ, Casagrade (1970) đã thấy sự tăng tổng số các acid amin trên
bề mặ
t lá và trong thành phần lá phân hủy cao hơn hẳn lá tươi. Một số acid amin như α –
aminobyturic, α, γ diaminnobutyric và α, ε diamino pimonic cùng các loại acid citruline, ortrithine,
cystein là các sản phẩm được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của VSV [51].
Các nghiên cứu VSV trong RNM ven biển đồng bằng sông Hồng và Cần Giờ (2001-2003) đã
chứng minh được một điều: ở các hệ sinh thái RNM này có tới 83/199 chủng nấm có khả năng phân
giải dầu mỏ ở các mức độ khác nhau. Nghiên cứ
u về RNM ở Nam Định và Thái Bình của trung tâm
MERD cũng phân lập được 605 chủng NS [13].
Ở RNM Cần Giờ, tác giả Khưu Phương Yến Anh đã phân lập được 312 chủng NS, trong đó
bao gồm các loài nấm thuộc các chi Penicillum, Aspergilus, Mucor, Tricoderma (2007) [1]. Tác giả
Võ Thị Bích Viên đã phân lập được 476 chủng NS trong đó có 266 chủng thuộc chi Aspergillus và
Penicillium (2009) [32].
1.1.2. Vai trò của RNM Cần Giờ.
RNM Cần Giờ được mệnh danh là "lá phổi xanh" của TP.HCM với vai trò quan trọng trong
đ
iều hòa khí hậu. Nhờ những đặc trưng riêng như tầng tán dày, hệ thống rễ chằng chịt... RNM được
đánh giá là một “bức tường xanh” vững chắc chống gió bão, sóng thần, xói lở, làm sạch MT ven
biển, hạn chế xâm nhập mặn, bảo vệ nước ngầm, tích lũy cacbon, giảm khí CO
2
,...

[51].
RNM có vai trò trong vấn đề giảm ô nhiễm từ chất thải rắn. Trong những năm qua, Trung
tâm nghiên cứu hệ sinh thái RNM đã phát hiện nhiều VSV có khả năng phân giải các chất thải khó
phân hủy có trong nước, làm sạch nước và biến thành thức ăn cho tôm cá. Nhờ đó phát hiện thêm
khả năng ngăn ngừa ô nhiễm môi trường của RNM. Khi có rừng, dưới tán rừng nhiệt độ thấp, lá cây

rụng tạo thành mùn, vi sinh vật hoạt độ
ng rất tốt, quá trình phân giải chất hữu cơ diễn ra hiệu quả.
Nhưng khi rừng mất đi thì ánh nắng chiếu thẳng vào, nhiệt độ sẽ tăng cao và thiếu nước vào mùa
khô, làm cho đất phèn tiềm tàng trước được ém sẽ hoạt động trở lại, làm cho đất chua, nhiều acid
[53].
Bên cạnh đó, những chất thải rắn trong sinh hoạt, y tế, công nghiệp, nông nghiệp cùng với
các hóa chất dư thừa từ
nội địa theo sông ra RNM được giữ lại và nhờ VSV phân hủy, biến chúng
thành thức ăn cho hệ SV ở đây và làm trong sạch nước biển [51].
RNM Cần Giờ có vai trò nhất định đối với nền kinh tế. Theo Giáo sư Phan Nguyên Hồng,
hiện nay người dân Việt Nam mới chỉ biết tận dụng một phần rất nhỏ lợi ích từ RNM mang lại. Nếu
biết cách khai thác hợp lý đi đôi với bảo v
ệ rừng, đây quả thực là một nguồn tài nguyên không phải
quốc gia nào cũng có được [54].
1.2. Đặc điểm của NS sinh protease.
1.2.1. Đặc điểm hình thái.
NS là VSV nhân thực, tế bào không có diệp lục tố, sống dị dưỡng, vách tế bào cấu tạo chủ
yếu là kitin, có hay không có cellulose và một số thành phần khác có hàm lượng thấp [55].
Sợi nấm có ngăn vách (đa bào) hay không có ngăn vách (đơn bào). Sợi nấm thường là một
ống hình tr
ụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài. Đường kính của sợi nấm thường từ 3-
5µm, có khi đến 10µm thậm chí đến 1mm. Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục cm. Các sợi
nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn. Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh
có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm khí sinh xù xì như bông. Trên MT đặc và trên
một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế
bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển
thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là KL nấm [55].

Hình 1.2. Sợi nấm có vách ngăn [55] Hình 1.3. Sợi nấm không có vách ngăn [55]

Hệ sợi của NS một số ăn sâu vào cơ chất gọi là khuẩn ty cơ chất hay khuẩn ty dinh dưỡng,
một số mọc ra ngoài bề mặt cơ chất gọi là khuẩn ty khí sinh. Những khuẩn ty khí sinh là những lông
tơ màu trắng, mọc thành lớp sợi mềm và dần dần sẽ có một số sợi phát triển thành cơ quan sinh sản
đặc bi
ệt mang bào tử. Màu sắc bào tử sẽ đặc trưng cho màu sắc NS khi già [23].
1.2.2. Cấu tạo của tế bào NS
 Thành tế bào NS
Thành tế bào NS có cấu tạo bản mỏng và cấu tạo sợi [7].
Thành tế bào NS dày khoảng 2
μm
, nhưng rất chắc chắn [7].
Thành sợi nấm gồm nhiều bản mỏng chồng chất lên nhau nhờ đó mà vững và chịu được sức
ép các chất lỏng và rắn ở bên trong mà không bị rách hay nứt vỡ [7].
Mỗi bản mỏng gồm có phần nền không có cấu tạo đặc biệt, trên phần nền có các sợi nhỏ xếp
sát vào nhau và song song nhau. Điều đặc biệt là các sợi ở một bản m
ỏng song song với nhau nhưng
các sợi trên hai bản mỏng liên tiếp lại xếp chéo nhau, do đó làm cho vách sợi nấm rất mỏng nhưng
rất vững chắc [7].
Về thành phần hóa học, các hợp chất hóa học có chủ yếu ở vách sợi nấm cũng là những phân
tử có dạng sợi. Thảnh phần quan trọng ở vách sợi nấm là kitin. Một hợp chất gluxit khác cũng phổ
biến ở nhiều NS là glucan. Có th
ể coi kitin và glucan là khung của vách sợi nấm [7].
Vách sợi nấm không những che chở và bảo vệ, mà còn đảm đương một loạt các chức năng
khác: nhận thức ăn, chế biến thức ăn, thải chất bã, trao đổi khí,….
Để hoàn thành nhiệm vụ đó, ngoài kitin, glucan, còn có hàng rào lipit, protit và một loạt các

enzyme. Ngay trong vách sợi nấm còn có các sản phẩm trao đổi chất khác nhau của sợi nấm, các
chất thải như acid oxalit, acid xitric, các chất độc hại
đối với các VSV khác ở xung quanh như các
KS, các độc tố. Mặt ngoài của vách sợi vi nấm còn có phủ chất dính, chất dính này sẵn sàng dính
chặt vào những con amip, những con giun tròn bé tẹo, sau đó các vi nấm này ăn thịt con mồi bằng
cách mọc ra các sợi nấm đặc biệt xuyên qua vỏ con mồi và hút dần các chất dinh dưỡng trong con
mồi [7].
 Màng nguyên sinh, chất nguyên sinh.
Chất nguyên sinh là một dung dịch keo, thường trong suốt không màu, luôn chuyển động từ
phần sợi n
ấm già đến phần non, hoặc từ sợi nấm sinh dưỡng đến các sợi nấm phân hóa làm nhiệm
vụ sinh sản [6].
Chất nguyên sinh được bao bọc bởi màng nguyên sinh. Màng dày trung bình 7.10
-3

μm
, cấu
tạo chủ yếu bởi các phân tử lipit và protein. Thành phần lipit có thể chiếm tới 40% và protein chiếm
38% trọng lượng khô của màng [6].
 Các bào quan.
Mạng lưới nội chất.
Có dạng bọng đài nối liền với màng nhân của tế bào. Người ta cũng tìm thấy mạng nội sinh
chất có dạng bản mỏng đồng tâm dính vào màng chất nguyên sinh hay tự do trong chất nguyên sinh
hoặc dính vào bộ máy Golgi [7].
Bộ máy Golgi
Bộ máy Golgi có dạng m
ột cái túi nhỏ gấp nếp với các bọng nhỏ hình cầu ở xung quang
thành túi. Kiểu cấu tạo bộ máy Golgi này giống như ở các TV bậc cao[7].
Ty thể
Ty thể của tế bào vi nấm tương tự như ty thể của TV và ĐV. Tuy nhiên, số lượng ty thể ở

nấm ít hơn, ty thể dẹt hơn và gồ ghề hơn ở TV [7].
Không bào và các thể ẩn nhập.
Không bào thường có hình cầu, hình trứng. Ở
ngọn các sợi nấm hầu như không có không
bào, càng xa phần ngọn, số lượng không bào càng giảm nhưng kích thước càng lớn, ép chặt chất
nguyên sinh và nhân tế bào vào sát thành tế bào.
Dịch không bào thay đổi tùy theo tuổi và trạng thái sinh lý của tế bào. Dịch không bào chứa
các chất điện giải hòa tan: Na, K…một số chất hữu cơ ở trạng thái hòa tan hoặc trạng thái keo
(protein, glucid,….), các sắc tố và một số vật thể ẩn nhập [7].
Nhân tế bào NS
Nhân tế bào NS nói chung có kích thước rất nhỏ, phần lớn có đường kính 2-3
μm
, hình cầu
hoặc hình trứng [6].
Số lượng nhân trong tế bào không ổn định. Ở các sợi nấm ngăn vách số lượng nhân ở mỗi
đoạn sợi nấm giữa 2 vách ngăn có thể là 1,2 hoặc nhiều hơn. Số lượng nhân ở mỗi tế bào còn thay
đổi tùy điều kiện sống [7].
Nhân của tế bào NS là nhân thực. Nhân có vai trò chủ yếu là mang thông tin di truyền chứa
trong ADN, điều khiển tổng hợp các protein
đặc trưng ở mỗi loài, điều khiển tổng hợp enzyme, các
hoạt động của enzyme và nhiều hoạt động khác của tế bào [7].
1.2.3. Các hình thức sinh sản.
NS sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính.
 Sinh sản vô tính
Hình thức sinh sản vô tính đơn giản nhất là bằng mẩu sợi: một đoạn sợi nấm rơi vào cơ chất
mới gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành hệ sợi nấm mới [23].
Ngoài sinh sản vô tính bằng mẩu sợi, NS còn sinh sản bằng bào tử (bào tử kín, bào tử trần).
Đây là hình thức sinh sản vô tính phổ biến ở NS [23].
Có hai dạng bào tử vô tính là bào tử kín và bào tử
trần [23].

 Sinh sản hữu tính
Sinh sản hữu tính xảy ra khi có sự kết hợp giữa hai giao tử đực và cái có trải qua giai đoạn
giảm phân. Quá trình sinh sản hữu tính trải qua 3 giai đoạn:
• Tiếp hợp tế bào chất với sự hòa hợp 2 tế bào trần của 2 giao tử.
• Tiếp hợp nhân với sự hòa hợp 2 nhân của 2 tế bào giao tử để tạo một nhân nhị bội.
• Giảm phân: giai
đoạn này hình thành 4 bào tử đơn bội qua sự giảm phân từ 2n NST (nhị bội)
thành n NST (đơn bội) [55].









1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến ST và hoạt độ protease của NS.
1.2.4.1. Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến nồng độ các chất hòa tan trong MT nuôi cấy, MT lên men và hoạt
động xúc tác các phản ứng sinh hóa trong mỗi tế bào VSV, các phản ứng này chỉ xảy ra ở nhiệt độ
nhấ
t định [18].
Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển của NS là từ 2
o
C đến 5
o
C, tối ưu từ 22
o
C đến 27

o
C và
nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35
o
C đến 40
o
C, cá biệt có một số loài có thể sống
sót ở 0
o
C và ở 60
o
C [55].
Để thu protease từ NS, nhiệt độ nuôi cấy được giữ ở 29-31
o
C trong khoảng thời gian 10-18
giờ, sau đó giảm nhiệt độ xuống 24 -25
o
C [21].
Với nhiệt độ trung bình là 25,8
o
C, RNM Cần Giờ có điều kiện nhiệt độ thuận lợi cho sự phát
triển của NS.
1.2.4.2. Độ ẩm.
Hình 1.4. Bào tử
kín [57]
Hình 1.5.
Bào tử trần
Hình 1.6. Quá trình
tiếp hợp [57]
Mỗi loài NS thích ứng với một khoảng độ ẩm tương đối [6].

Độ ẩm tối ưu để nuôi cấy NS là 50-60%, nếu độ ẩm < 60%, hoạt tính enzyme sẽ giảm [6].
Độ ẩm môi trường cần duy trì trong quá trình sản xuất. Độ ẩm cao làm giảm độ thoáng khí
của MT, độ ẩm thấp kìm hãm sự phát triển và sự tạo enzyme của VSV [19], [23].
Trong sản xuất protease, độ ẩm của MT nuôi cấy được duy trì khoảng 50-55% [21].
1.2.4.3. pH
pH
ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và khả năng hoạt hóa của VSV, mỗi loài VSV chỉ
thích hợp ở một khoảng pH nhất định [20].
Nói chung, NS có thể phát triển tốt ở MT acid (pH=6) nhưng pH tối ưu là 5 - 6,5, một số loài
phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9 (Ingold, 1967) [57].
pH của MT có ảnh hưởng đến tỷ lệ giữa các protease được tổng hợp. Nếu giữ pH luôn có giá
trị xác đị
nh trong suốt quá trình nuôi cấy, VSV sẽ tạo thành mạnh mẽ một dạng protease xác định
chiếm ưu thế trong MT.
pH của nước biển ở RNM Cần Giờ vào thời điểm thu mẫu là 7,02. pH đất trung bình 5,8-6,5.
Ở tầng mặt, do ảnh hưởng của nước biển, pH có thể cao hơn giá trị trung bình. Nhìn chung pH ở
đây thuận lợi cho sự phát triển của NS.
1.2.4.4. Nguồn dinh dưỡng
NS không có diệp lục tố nên chúng cần được cung c
ấp dinh dưỡng từ bên ngoài (nhóm dị
dưỡng), một số sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh (sống ký sinh trong cơ thể ĐV hay TV)
hay hoại sinh trên xác bã hữu cơ. Cũng có một số nhóm nấm rễ hay địa y sống cộng sinh với nhóm
TV nhất định [55].
Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm được xếp
theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca. Nếu các nguyên tố này hiện
diện trong các nguồn th
ức ăn vô cơ đơn giản thì sẽ được nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn
hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzyme ngoại bào thích hợp để cắt các
đại phân tử này thành những phân tử nhỏ để dễ hấp thu vào trong tế bào [55].
+Ảnh hưởng của nguồn C.

Nguồn C có vai trò quan trọng đối với VSV và là cơ chất cần thiết cho quá trình trao
đổi chất
sơ cấp và thứ cấp [18].
NS có khả năng đồng hóa nhiều nguồn C khác nhau: các hidrat cacbon, các acid hữu cơ,
lipit…Nhiều loại NS còn có khả năng đồng hóa các chất hữu cơ rất bền hoặc chất độc đối với nhiều
SV khác [6].
Các loài NS thường không có những đòi hỏi nghiêm ngặt về các loại thức ăn cacbon. Tuy
nhiên, có thể là loại hợp chất này đồng hóa tốt hơn loại hợp ch
ất khác.
Nhiều loài NS thuộc bộ Mucorales chỉ đồng hóa được sacarose sau khi đã thủy phân nó
thành glucose. Trong khi đó, Chaethocladium hesseltinum lại có thể đồng hóa trực tiếp sacarose mà
không cần thủy phân trước [6].
Nguồn C tự nhiên thường được dùng trong nuôi cấy NS là bột mì, bột đậu tương, cám và
nước chiết của chúng. Nồng độ gluxit thích hợp cho quá trình tổng hợp protease cũng thay đổi tùy
loài VSV.
Có nhiều chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn C thích hợp đối với NS sinh
protease có hoạ
t lực cao [64]. Các nguồn C có tác dụng đến sự tổng hợp protease của NS có thể theo
thứ tự:
Đối với A. flavus: fructose→ glucose→ sacarose→ ramnose→ manose→ galactose→
arabinora→ lactose.
Đối với A. awamori: fructose→ manit→ sacarose→ arabinose→ manose→ galactose→
lactose.
Đối với A. oryzae: fructose→ sacarose→ maltose→ glucose→ manit→ arabinose→
galactose.
Thảm thực vật dày đặc là nguồn cacbon chủ yếu cho khu hệ NS ở RNM C
ần Giờ. Theo
Snedaker (1978), lượng lá rơi của cây RNM ở nam Florida là 10.000 – 14.000 kg khô/ha/năm. Kết
quả nghiên cứu ở rừng đước Cà Mau cho thấy lượng rơi là 9.719,9 kg/ha/năm, riêng lá chiếm
79,71%. Hàng năm rừng đước Cà Mau cung cấp cho hệ sinh thái RNM ở đây 8.400 – 12.000 kg

lá/ha/năm (tính theo trọng lượng khô) (Trí, Hồng, 1984) [13].
+Ảnh hưởng của nguồn N.
Nguồn N ảnh hưởng rất lớn đến quá trình ST và ảnh hưởng đặc biệt đến quá trình sinh
protease vì nguồn N đóng vai trò là ch
ất cảm ứng của enzyme này.
NS có thể sử dụng cả nguồn N vô cơ và hữu cơ. Các nguồn N hữu cơ thường dùng là pepton,
casein, bột đậu nành, cao nấm men…Trong các nguyên liệu này đều có chứa acid amin tự do. Các
acid amin làm tăng hoặc giảm quá trình tổng hợp protease như cystein kìm hãm khả năng sinh
protease acid của Aspergillus. Khi sử dụng phối hợp nguồn N vô cơ và hữu cơ làm tăng đáng kể quá
trình tổng hợp protease [27].
Đối với m
ột số loài NS như A. oryzae, A. awamori, A. niger, A. flavus trên MT có các nguồn
N hữu cơ hoạt độ protease acid cao. Trên môi trường Czapek (trong đó NaNO
3
được thay bằng
casein) thì hoạt lực protease của NS được tăng lên 3,5 lần. Khi thay tinh bột bằng glucose và bổ
sung pepton hoạt lực enzyme tăng 6 lần. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt độ enzyme được
nâng cao khi trong MT có đồng thời cả nguồn N hữu cơ và N vô cơ. Cho thêm vào MT có cám mì,
bột đậu tương đã tách chất béo các nguồn N vô cơ và hữu cơ thì hoạt lực protease tăng 22- 74%.
Còn trường hợp dùng các nguồn N vô cơ duy nhất trong MT sẽ dẫn đến ngừng hoạt độ protease nói
chung [64].
Các acid amin có ảnh hưởng rõ rệt tới hoạt độ enzyme của VSV. Glyxin, alanin, metionin và
lơxin có tác dụng làm tăng hoạt lực protease của chủng đột biến A. oryzae 251- 90 từ 6- 9% và
nguyên chủng A. oryzae 132- 63 tới 7- 24%. Nhiều acid amin có tác dụng ức chế hoạt độ enzyme
như acid glutamic, izolơxin và valin ức chế tổng hợp enzyme ở B. megaterium tới 60% [62].
RNM C
ần Giờ có nguồn N dồi dào từ các xác động thực vật bị phân hủy. Tất cả các mô xốp
được phân huỷ nhanh nhất, còn các hợp chất cellulose và lignin bị phân huỷ cuối cùng. Trong quá
trình phân huỷ, lượng đạm trên các mẩu lá tăng 2 – 3 lần so với ban đầu (Kaushik và Hynes, 1971).
Năm 1977, Untawale ở Viện Hải dương học Ấn Độ đã nghiên cứu sự biến đổi của các thành phần

hoá học của lá mấm lưỡi đòng (
Avicennia officilalis) từ khi còn non cho tới khi lá bị phân huỷ, thấy
hàm lượng protein tăng lên rất cao [13].
+Ảnh hưởng của các nguyên tố khoáng [6].
Photpho: thường chiếm tỉ lệ cao nhất trong thành phần khoáng của NS. Nguyên tố photpho
tham gia vào cấu tạo của nhiều chất hữu cơ quan trọng trong tế bào NS: nucleotit,
nucleoprotein…..Photpho còn có mặt trong nhiều coenzyme quan trọng như ADP, ATP, NAD,
FAD…
Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần một số acid amin (cystin, cystein….), lưu huỳnh cũng
có mặt trong nhiều coenzyme quan trọng như
CoA, biotin…
Kali: tham gia vào quá trình trao đổi glucid và ảnh hưởng đến nhiều quá trình trao đổi khác.
Magie: mang tính chất là một cofacto đối với nhiều enzyme. Magie tham gia vào quá trình
hoạt hóa khoảng 80 enzyme trong tế bào.
Canxi: đóng vai trò là cầu nối trung gian giữa nhiều thành phần quan trọng trong tế bào.
Canxi còn ảnh hưởng đến sự hình thành cấu trúc không gian ổn định của ribosom, nhân.
Sắt: tham gia vào kết cấu porphirin của các hệ thống enzyme chuyển vận electron.
1.2.5. Các phương pháp nuôi cấy NS thu nhận protease [19, 25, 64]
1.2.5.1. Nuôi cấy bề mặt.
Phương pháp này rấ
t thích hợp để nuôi cấy các loại NS thu nhận enzyme do khả năng phát
triển nhanh, mạnh của NS nên ít bị tạp nhiễm. Trong MT này, NS phát triển bao phủ bề mặt hạt chất
dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng MT đã được tiệt trùng, làm ẩm.
Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia là trấu. Cám, trấu, có
bề mặt tiếp xúc lớn, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gây
ảnh hưởng xấu đến sự phát
triển của NS. Tỉ lệ các chất phụ gia phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu
không được thấp hơn 20%. Có thể bổ sung thêm nguồn N vô cơ, N hữu cơ và các chất kích thích ST
như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu.
+ Ưu điểm: chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chế

phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và
làm sạch enzyme.
Tốn ít năng lượng. Thiế
t bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện qui mô gia đình,
trang trại cũng như ở qui mô lớn.
Nuôi cấy trong điều kiện vô trùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy nếu có nhiễm trùng
phần nào, khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó.
+ Nhược điểm: phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hóa, tự động hóa, cần diện
tích nuôi lớ
n, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều.
1.2.5.2. Nuôi cấy chìm.
VSV được nuôi cấy trong môi trường lỏng với cơ chất chủ yếu trong đa số trường hợp là tinh
bột. Chỉ có một số ít giống VSV dùng nguồn cơ chất cacbon là đường glucose, saccharose. Thực tế,
trong một số trường hợp đường hóa sơ bộ tinh bột trước khi thanh trùng. Khi đó đường maltoza
được tạo thành là chất cảm
ứng tốt, môi trường thường giảm độ nhớt nên dễ dàng cho quá trình
khuấy trộn và sục khí.
Phương pháp nuôi cấy bề sâu đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu: MT dinh
dưỡng, thao tác nuôi cấy…
+ Ưu điểm: dễ cơ khí hóa, tự động hóa, năng suất cao, dễ tổ chức sản xuất.
Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng VSV đột biến có hoạt độ enzyme cao, lựa chọn tối
ưu
thành phần MT, các điều kiện nuôi cấy tối ưu, enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo điều kiện
vệ sinh, vô trùng.
+ Nhược điểm: do thu được canh trường và nồng độ enzyme thấp nên khi tách thu hồi
enzyme sẽ có giá thành cao. Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị
nhiễm hàng loạt gây thiệt hại lớn.
1.2.5.3.Thu nhận protease.
Cho canh trường sau nuôi cấy vào dung dị
ch muối hoặc dung môi hữu cơ theo tỉ lệ thích hợp,

khuấy đều, lắc trên máy lắc trong một thời gian xác định, lọc hoặc ly tâm thu lấy dịch trong. Trong
sản xuất thường dung nước máy để chiết rút với thể tích gấp hai lần thể tích MT, tiến hành chiết rút
enzyme trong một giờ. Tiến hành theo phương pháp này cho kết quả rất tốt.
Trong trường hợp nuôi cấy theo phương pháp bề sâu, trước hết cần làm lắng t
ế bào VSV
hoặc ly tâm để tách sinh khối khỏi dung dịch enzyme. Quá trình này là một giai đoạn quan trọng
nhất và khó nhất trong kĩ thuật sản xuất chế phẩm enzyme.
1.3. Protein và protease
1.3.1. Protein.
1.3.1.1. Khái niệm.
Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là axít
amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide. Các chuỗi này có thể
xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein
[63].







Hình 1.7. Hình mô phỏng cấu trúc không gian của myoglobin [63]
1.3.1.2. Cấu trúc của protein
Protein là một hợp chất đại phân tử được tạo thành từ rất nhiều các đơn phân là các acid
amin. Acid amin được cấu tạo bởi ba thành phần: một là nhóm amin (-NH
2
), hai là nhóm cacboxyl
(-COOH) và cuối cùng là nhóm R quyết định tính chất của acid amin [15].

Hình 1.8. Cấu trúc chung của acid amin.
Có 4 bậc cấu trúc của protein
Cấu trúc bậc một: Các acid amin nối với nhau bởi liên kết peptide hình thành nên chuỗi
polypetide. Đầu mạch polypeptide là nhóm amin của acid amin thứ nhất và cuối mạch là nhóm
cacboxyl của acid amin cuối cùng. Cấu trúc bậc một của protein thực chất là trình tự sắp xếp của
các acid amin trên chuỗi polypeptide. Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì trình
t
ự các acid amin trên chuỗi polypeptide sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong chuỗi polypeptide,
từ đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tính chất cũng như vai trò của
protein. Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các acid amin có thể dẫn đến sự biến đổi cấu trúc và
tính chất của protein [15, 63].
Cấu trúc bậc hai: là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptide trong không gian. Chuỗi
polypeptide thường không
ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp β,
được cố định bởi các liên kết hyđro giữa những acid amin ở gần nhau [15, 63].
Cấu trúc bậc ba: Các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau thành từng búi có
hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein. Cấu trúc không gian này có vai trò quyết định đối
với hoạt tính và chức năng của protein. Cấu trúc này lại đặc biệt phụ thuộc vào tính chất của nhóm -
R trong các mạch polypeptide. Chẳng hạn nhóm -R của cystein có khả năng tạo cầu đisulfur (-S-S-),
nhóm -R của prolin cả
n trở việc hình thành xoắn, từ đó vị trí của chúng sẽ xác định điểm gấp, hay
những nhóm -R ưa nước thì nằm phía ngoài phân tử, còn các nhóm kị nước thì chui vào bên trong
phân tử... Các liên kết yếu hơn như liên kết hyđro hay điện hóa trị có ở giữa các nhóm -R có điện
tích trái dấu [15, 63].
Cấu trúc bậc bốn: Khi protein có nhiều chuỗi polypeptide phối hợp với nhau thì tạo nên cấu
trúc bậc bốn của protein. Các chuỗ
i polypeptide liên kết với nhau nhờ các liên kết yếu như liên kết
hyđro [15].
1.3.1.3. Sự biến tính của protein [29, 63]

Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như tia cực tím, sóng siêu âm, khuấy cơ học... hay tác
nhân hóa học như acid, kiềm mạnh, muối kim loại nặng,... các cấu trúc bậc hai, ba và bậc bốn của
protein bị biến đổi nhưng không phá vỡ cấu trúc bậc một của nó, kèm theo đó là sự thay đổi các tính
chất của protein so với ban
đầu. Đó là hiện tượng biến tính protein. Sau khi bị biến tính, protein
thường có các tính chất sau:
- Độ hòa tan giảm do làm lộ các nhóm kỵ nước vốn đã chui vào bên trong phân tử protein
- Khả năng giữ nước giảm
- Mất hoạt tính sinh học ban đầu
- Tăng độ nhạy đối với sự tấn công của enzyme protease do làm xuất hiện các liên kết
peptide ứng với trung tâm hoạt động của protease.
- Tă
ng độ nhớt nội tại
- Mất khả năng kết tinh.



1.3.2. Protease.
1.3.2.1. Khái niệm.
Protease là loại enzyme tham gia phân giải protein để tạo thành các peptit ngắn và cuối cùng
tạo các acid amin và NH
3
[20].
protease

Hình 1.9. Sơ đồ cơ chế tác động của protease
Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển acid amin
[57].
1.3.2.2 Cấu trúc và cơ chế hoạt động của protease.
a. Trung tâm hoạt động của protease [20, 64].
Trong trung tâm hoạt động của protease VSV ngoài gốc amino acid đặc trưng cho từng nhóm
còn có một số gốc amino acid khác.
+ Serin protease: chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động giữ vai trò đặc
biệt quan trọng đối vớ
i hoạt động xúc tác của enzyme.
+ Cysteine protease: chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động.
+ Aspartic protease: chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động
mạnh ở pH trung tính.
Trung tâm hoạt động của các protease VSV bao gồm một số gốc amino acid và trong một số
trường hợp còn có cả cofactơ kim loại.
Nhiều tác giả đã nghiên cứu trung tâm hoạt động của các tinh thể protease acid của Rhizopus
chinenis cho thấy phân tử các protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở khoảng 20
o
A. Khe
hở này là phần xúc tác của enzyme. Các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy.
Đối với các protease không chứa cystein, trung tâm hoạt động của chúng có tính mềm dẻo
hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphide.

Hình 1.10.Cấu trúc một số loại protease [58]
H
2
N- CH- CO- NH- CH- CO- …- NH- CH- COOH

R1 R2 RX
H
2
N- CH- COOH + H
2
N- CH- CO … NH- CH- COOH + H
2
O

R1 R2 RX
b. Cơ chế hoạt động của protease [20, 64].
Các protease xúc tác phản ứng theo cơ chế chung:
E + S → E-S →E-S’ + P1 → E+P2
E: enzyme, S: cơ chất, E-S: phức chất enzyme-cơ chất, P: sản phẩm.
Theo các tác giả, cơ chế tác dụng của protease của VSV cũng giống với protease serine động
vật, đều tiến hành theo kiểu xúc tác acid- bazơ.
Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn nhất. Những enzyme này đều có chung một cơ
chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính (Barrett, 1994):
B
ước 1, acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử
C trong nhóm cacboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine.
Bước 2, khử acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H
2
O theo chiều
ngược lại của bước một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho nhóm

amine để tái sinh lại enzyme.
1.3.2.3. Phân loại protease [19,21].
Protease được chia ra làm một số loại dựa trên những đặc điểm riêng của chúng cũng như
cấu tạo trung tâm hoạt động của enzyme.
Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại:
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chu
ỗi polypeptide để
giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải
phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:
+ Serin protease: là những protease chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt
động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Các serine protease
thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặ
c hiệu cơ chất tương đối rộng.
+ Cysteine protease: Các protease chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Các cystein
protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
+ Aspartic protease: Hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin. Các aspartic protease
có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo protease: Metallo protease là nhóm protease được tìm thấy ở VK, NS cũng như các
VSV bậc cao hơn. Các metallo protease thường hoạt động vùng pH trung tính.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản h
ơn thành ba nhóm:
- Protease acid : pH 2-4
- Protease trung tính : pH 7-8
- Protease kiềm : pH 9-11
1.3.2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng protease từ NS ở RNM.
a. Tình hình nghiên cứu.
Hầu như tất cả phản ứng trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của các enzyme -

chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của các nhà
hóa sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác. Các
nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau,
nghiên c
ứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng
dụng enzyme trong thực tế [64].
Đã có nhiều công trình nghiên cứu về protease của NS. Các tác giả M. Kalpana Devi, A.
Rasheedha Banu, G.R. Gnanaprabhal, B.V. Pradeep và M. Palaniswamy đã xác định đặc điểm
protease của Aspergillus niger (2008), Hajji M, Kanoun S, Nasri M và Gharsallah N khảo sát
protease của Aspergillus clavatus (2007), Agarwal D, Patidar P, Banerjee T nghiên cứu khả năng
sinh protease của Penicillium sp.
Từ 1950, khoa học bắt đầu quan tâm nghiên cứu NS ở RNM. Ở Macau và Hồng Kông tìm
được 45 loài nấm mớ
i từ RNM (1994). D. M. Alongi, B. F. Clough, A. I. Robertson đã khảo sát khu
hệ NS ở RNM miền Tây Úc (2005).
Chưa có nhiều nghiên cứu về protease từ NS ở RNM. Trên thế giới có công trình nghiên cứu
của G.L. Maria, K.R. Sridhar và N.S. Raviraja về khả năng sinh enzyme ngoại bào của một số loại
NS (Aspergillus sp, Fusarium sp, Penicillium sp, Trichoderma sp) ở RNM vùng Tây Nam Ấn Độ
(2005), công trình nghiên cứu của K. Kathiresan cũng chứng tỏ khu hệ VSV ở RNM Pichavaram
(thuộc miền Đông Nam Ấn Độ) có khả năng sinh nhiều loại enzyme ngoại bào như
kitinase, L-
asparaginase, cellulase, protease, phosphatase (2000).
Ở Việt Nam, nghiên cứu và thu nhận protease từ NS ở RNM là một vấn đề còn bỏ ngỏ. Theo
các công trình nghiên cứu của MERD về các chủng NS ở RNM Nam Định và Thái Bình cho thấy
60% các chủng NS có khả năng sinh protease, trong đó có 21 chủng có hoạt tính protease rất mạnh
được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu và ứng dụng [13].
Riêng ở RNM Cần Giờ, kết quả nghiên cứu trên hai chủng Penicillium và Aspergillus của tác
giả Võ Thị
Bích Viên cho thấy trong cả ba đợt thu mẫu vào ba thời điểm khác nhau, trên 80% số NS
có khả năng sinh protease [32].

b. Ứng dụng. [21, 25, 64].
Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp thực phẩm,
công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp…
Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một
phần protein trong thịt. Kết quả làm cho thịt có độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn.
Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: Để thuỷ phân sâu sắc và tri
ệt để protein (trong
nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng
rộng, muốn vậy người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của VK, NS, TV với tỷ lệ tổng
cộng 1- 2% khối lượng protein cần thủy phân. Ưu điểm của việc thủy phân protein bởi enzyme là
bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dị
ch
thủy phân.
Trong chế biến thủy sản: hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn
thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme TV (bromelain và papain) và VSV để rút ngắn thời gian
làm và cải thiện hương vị của nước mắm.
Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ
sữa của chúng. Protease từ một số VSV như A. candidus, P. roquerti, B. mesentericus,… được dùng
trong sả
n xuất phomat . Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy... protease làm giảm thời
gian trộn, tăng độ dẻo, độ nhuyễn của bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn cho sản phẩm.
Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của
bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ
cốc, tạo điều kiện x
ử lý bia tốt hơn .
Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần
protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da
các chất nhớt, làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc
da. Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của Đ

V.
Hiện nay, việc đưa các protease tách từ VK (B. mesentericus, B. subtilis), NS (A. oryzae, A. flavus)
và xạ khuẩn (S. fradiae, S. griseus, S. rimosus...) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả
và dần dần chiếm một vị trí quan trọng .
Trong công nghiệp dệt: protease VSV được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo để
sợi được được bóng, dễ nhuộm. Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều
ngành khác nh
ư:
- Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và
sản xuất một số thức ăn kiêng.
- Protease của NS và VK phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn
gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm.
- Điều chế MT dinh dưỡng của VSV để sản xuất vacxin, KS,…
- Sản xuất chất giặt tổng hợp, sản xuất mỹ phẩm,…
1.3.2.5. Một số chế phẩm của protease [19,21, 23].
 Pepsin
Pepsin được thu nhận từ màng nhầy dạ con của heo và bê. Pepsin thường được sử dụng
chung với rennet trong sản xuất phomai và làm thuốc tiêu hóa. Hỗn hợp này hoạt động mạnh ở pH
2-4 và nhiệt độ 50
o
C.
 Rennet
Thường được sản xuất từ bao tử của cừu, bê, người ta thường phối hợp với pepsin để sử dụng
trong công nghiệp chế biến sữa.
 Papain
Papain được thu nhận bằng cách sấy khô mủ cây đu đủ carica papaya. Trong mủ cây đu đủ
có chứa papain, chymopapain, và một lượng nhỏ protease khác.
Papain được ứng dụng nhiều trong sản xuất bánh và công nghiệp chế biến thịt. Ngoài ra,
papain còn
ứng dụng trong y học để làm lành các vết thương ngoài da.

 Ficin
Ficin có nhiều trong nhựa cây sung, được ứng dụng nhiều trong công nghiệp chế biến sữa.

 Protease của VK
Có hai loại protease từ VK được bán trên thị trường thế giới. Hai loại này khác nhau về pH
hoạt động, mức độ hoạt động và cấu trúc của trung tâm hoạt động.
+Protease kiềm
Chế phẩm này có tên thương mại là subtilisin, có khoảng pH hoạt động 7-11, trung tâm hoạ
t
động có chứa serin. Chế phẩm này còn được gọi là enzyme tẩy rửa vì được ứng dụng nhiều trong
sản xuất các chất tẩy rửa.
+Protease trung tính
Protease trung tính là metalloenzyme, hoạt động ở pH 6-9. Chế phẩm này được ứng dụng
trong công nghiệp da, bia và công nghiệp sản xuất protein thủy phân.
 Protease từ NS.
Nhiều chủng NS có khả năng sinh protease mạnh. Một số protease từ NS đã được sản xuất
trên qui mô công nghiệp.



Bảng 1.1. Một số loại NS có khả năng tổng hợp protease mạnh [21]
Chủng nấm sợi Loại protease
A. oryzae
A. awamori
A. niger
A. fumigatus
P. chrysogenum
P. cyaneo fulvum
R. nodous
Protease trung tính, acid và kiềm

Protease acid


Protease acid và kiềm


Nhiều loại nấm sợi có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công
nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium
chysogenum… Các loại NS này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính.
Các loại NS đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3.
Một số NS khác như A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp
protease có khả
năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomát.
Protease từ NS gồm cả protease acid, kiềm và trung tính. Các protease acid và trung tính
được ứng dụng để sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo. Protease kiềm được ứng dụng trong công
nghệ thuộc da.













CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu.
- Các chủng NS được phân lập tại 5 xã Long Hòa, Lý Nhơn, Tam Thôn Hiệp, An Thới Đông,
Bình Khánh ở RNM Cần Giờ, TP. Hồ Chí Minh.
- Các chủng VSV kiểm định: E. coli, B. subtilis được cung cấp từ viện Pasteur.
- Nguyên liệu làm MT thu protease: cám gạo, trấu, bột đậu nành mua từ chợ.
2.2. Hoá chất.
- Các hóa chất có nguồn gốc từ Trung Quốc: K
2
HPO
4
, KH
2
PO
4
, KCl, NaCl, NaOH,
NaNO
3
…
- Các hóa chất có nguồn gốc từ Việt Nam: dầu DO, glucose, pepton, casein, agar, tinh bột,
cồn, nước cất…
- Các hóa chất có nguồn gốc từ Đức: Yeast extract, malt extract…
- Các hoá chất có nguồn gốc từ Nhật Bản: CMC, muối seignet…
2.3. Thiết bị, dụng cụ.
Thiết bị máy móc.
Nồi hấp vô trùng Huxlex (Đài Loan).
Tủ cấy vô trùng ( Việt Nam).
Tủ sấy Memmert (Đức).
Tủ ấm Binder (Đức)

Kính hiển vi Olympus CHL (Nhật Bản).
Tủ
lạnh Hytachi (Nhật Bản).
Máy đo pH Hana (Nhật Bản).
Máy ly tâm Heraeus (Nhật Bản).
Cân phân tích điện tử Scientech (Mỹ).
Máy đo quang phổ UV (Đức).
Máy chụp hình kĩ thuật số Olympus 5.1 (Nhật Bản).
Dụng cụ thí nghiệm: que cấy móc, qua cấy vòng, bình tam giác, ống nghiệm, ống đong, đèn
cồn, que trang, đĩa petri, thước đo, giấy lọc, bông mỡ, bông thấm nước, giấy lọc, khăn lọc, lame,
lammel,…..
2.4. Các MT sử dụ
ng trong thí nghiệm.
- MT phân lập, nuôi cấy, giữ giống và định danh NS
MT1-MT Czapek_Dox cải tiến [19]
NaNO
3
: 3,5g.
K
2
HPO
4
: 1,5g.
MgSO
4
.7H
2
O: 0.5g.
KCl: 0.5g.
FeSO

4
.7H2O: 0.01g.
Glucoza: 20g.
Agar: 20g.
Nước biển: 1000ml.
pH: 6.5.
Khử trùng 1atm/30phút
MT2- MT Zea [19]
Cao nấm men: 4g.
Glucoza: 20g.
Agar: 20g.
Nước biển: 1000ml.
pH: 5,5-6.
Khử trùng 1atm trong 30 phút.
MT3-MT Malt Extra Agar (MEA) [4]
Cao malt: 20g.
Pepton: 1g.
Glucoza: 20g.
Agar: 20g.
Nước biển: 1000ml.
pH: 5,5-6,0.
Khử trùng 1atm trong 30 phút.
- MT nuôi cấy VK kiểm định.
MT4- MT Meat Pepton Agar (MEA) [20]
Pepton: 5g.
NaCl: 5g.
Cao thịt: 5g.
Agar: 20g.
Nước cất: 1000ml.
pH: 7,5.

Khử trùng 1atm, 30 phút.
- MT thử hoạt tính enzyme ngoại bào.
MT5- MT thử hoạt tính amylase [5]
NaNO
3
: 3,5g.
K
2
HPO
4
: 1,5g.
MgSO
4
.7H
2
O: 0.5g.
KCl: 0.5g.
FeSO
4
.7H2O: 0.01g.
Tinh bột tan: 15g.
Agar: 20g.
Nước biển: 1000ml.
pH: 6.5.
Khử trùng 1atm/30phút
MT6- MT thử hoạt tính protease [5]
K
2
HPO
4

: 1,5g.
MgSO
4
.7H
2
O: 0.5g.
KCl: 0.5g.
FeSO
4
.7H2O: 0.01g.
Casein: 15g
Agar: 20g.
Nước biển: 1000ml.
pH: 6.5.
Khử trùng 1atm/30phút
MT7- MT thử hoạt tính cellulase [5]
NaNO
3
: 3,5g.
K
2
HPO
4
: 1,5g.
MgSO
4
.7H
2
O: 0.5g.
KCl: 0.5g.

FeSO
4
.7H2O: 0.01g.
CMC: 10g.
Agar: 20g.
Nước biển: 1000ml.
pH: 6.5.
Khử trùng 1atm/30phút