TÌM HIỂU VÀ THU NHẬN ENYME SACCHARASE TỪ VI SINH VẬT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA: KHOA HỌC ỨNG DỤNG
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ĐỀ TÀI: TÌM HIỂU VÀ THU NHẬN ENYME SACCHARASE
TỪ VI SINH VẬT.
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
Nhóm SV thực hiện:
Nguyễn Duy Tuyến
Trần Công Phúc
Vũ Đức Tâm
Lê Thị Thoan
Lê Thị Minh Thư
MỤC LỤC
I KHÁI NIỆM VỀ ENZYME SACCHARASE
I.1 Đặc tính cấu tạo enzyme Saccharase
I.1.1 Khái niệm enzyme Saccharase
I.1.2 Phân loại enzyme Saccharase
I.1.3 Cấu tạo và phân tử lượng enzyme Saccharase
I.1.4 Tính chất của enzyme Saccharase
I.2 Cơ chế tác dụng của enzyme Saccharase
I.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme.
I.4 Nguồn thu nhận enzyme Saccharase
I.5 Ứng dụng của enzyme Saccharase
II QUÁ TRÌNH THU NHẬN ENZYME SACCHARASE
II.1 Sơ đồ thu nhận
II.2 Giải thích sơ đồ
II.3 Đánh giá hoạt tính enzyme saccharase trong thực
nghiệm.
I. . KHÁI NIỆM VỀ ENZYME SACCHARASE:
I.1 Đặc tính cấu tạo của enzyme Saccharase:
I.1.1 Khái niệm:

Enzyme Saccharase( α, D fructosfulrannoside
fructohydrolase)- (EC 3.2.1.26), là enzyme xúc tác trong quá trình
thủy phân Saccharose và phân cắt liên kết glycoside.
Saccharase được phát hiện đầu tiên vào năm 1883 và được nghiên
cứu vào năm 1909 bởi Sorensen.
Enzyme Saccharase phân bố rộng rãi ở động thực vật, đặc biệt là ở
vi sinh vật.
I.1.2 Phân loại:
Từ nguồn thu nhận khác nhau thì enzyme Saccharase tồn tại ở
các dạng khác nhau:
− Ở động vật:
Năm 1871, Páchutin đã phát hiện sự tồn tại của enzyme
Saccharase trong ruột động vật ở dạng glucosido. Hay có ở trong
mật ong, hoạt động như một glucosido- invertase, không thủy phân
raffinnose mà thủy phân melezitose và matose.
− Ở thực vật bậc cao:
Từ năm 1950, nhận thấy có sự hiện diện của enzyme
Saccharase trong cơ quan của thực vật.
− Ở vi khuẩn:
Vi khuẩn Saccharolytic clotridia tồn tại ở dạng glucosido-
invertase và dạng β fructosfulranosidase.
− Ở nấm:
Điển hình ở Aspergillus oryzae được xem như là một glucoside-
invertase. Ngoài ra chúng cũng có mặt hầu hết trong các nấm men
công nghiệp: men bia, men sản xuất rượu, men bánh mì…
Bản tóm tắt đặc tính của enzyme Saccharase:
T
Opt
:nhiệt độ tối thích PH
Opt :

:PH tối thích
Đặc tính Giá trị
Trọng lượng phân tử 270
PH
opt
4,5
PH bền 2,5-8
T
opt
75
o
C
T
O
bền 10-75
0
c
Km 5,25Mm (PH 4,5)
Chất tăng hoạt Cu
2+
,ca
2+
, K
+
,Cd
2+
Chất kìm hãm Hg
2+
, sodium,dodecylsunfate
Cơ chất saccrose

Tính xúc tác Đặc hiệu cơ chất.
− Enzyme Saccharase nằm ở bên trong lẫn bên
ngoài tế bào nên để thu nhận enzyme Saccharase chúng ta phải
chiết tách, tinh sạch để thu được chế phẩm như mong muốn.
I.1.3 Cấu tạo và phân tử lượng:
− Cấu tạo:

_ Phân tử lượng:
Saccharase thu nhận từ nấm men Saccharomyces cerevisiae có
trọng lượng phân tử 270000 Daltons( ngoại bào), 135000
Daltons( nội bào).
I.1.4 Tính chất của enzyme Saccharase:
Tính đặc hiệu về cơ chất: Saccharase xúc tác cho phản
ứng thủy phân Saccharase tạo thành đường khử( đường nghịch
đảo), gồm đường glucose và fructose.
Cấu trúc không gian của enzyme saccharase
I.2 Cơ chế tác dụng của enyme Saccharase:
Cơ chế tác dụng của enzyme như sau:
Bản chất trong cơ chế tác dụng của enzyme là là khả năng hoạt
hóa cơ chất để cơ chất tham gia hoạt hóa mạnh hơn.
Khi enzyme tham gia xúc tác thì năng lượng cần thiết cho phản
ứng nhỏ hơn rất nhiều so với khi không có enzyme.
E +S →ES→P +E
Trong đó : E: enzyme
S: cơ chất
ES: Enzyme cơ chất
P: sản phẩm
Cơ chế tác dụng của enzyme Saccharase gồm 3 giai đoạn:
− Giai đoạn một: E+S →ES. Liên kết với nhau bằng các liên
kết yếu( liên kết hidro, tương tác tĩnh điện, tương tác Vander

Walls) phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt
hóa thấp.
− Giai đoạn 2: cơ chất bị biến đổi dẫn đến sự kéo căng và phá
vỡ các liên kết đồng hóa trị.
− Giai đoạn 3: sản phẩm được hình thành enzyme được giải
phóng ra dưới dạng tự do.
I.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc của phản ứng
enzyme:
I.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme:
− Trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phản ứng
phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme:
V=k [E]
V: vận tốc phản ứng
[E]: nồng độ enzyme
− Tuy nhiên khi nồng độ quá lớn thì vân tốc không
còn phụ thuộc tuyến tính nữa.
I.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất:
− Mô hình Michaelis –Menten
theo cơ chế:
E +S ↔ES → PE
Với [S]: nồng độ cơ chất
K
m
: hằng số phân ly biểu kiến của ES
Phương trình Michaelis-Menten: V=V
max
[S]/(km+[S])
I.3.3 Ảnh hưởng của chất kìm hãm:
− Trong các phản ứng enzyme một số chất như ion
kim loại nặng, các chất vô cơ, hữu cơ với nồng độ cao sẽ kìm hãm

tốc độ phản ứng của enzyme, các chất này có thể kìm hãm thuận
hay nghịch hoặc không thuận nghịch bao gồm:
− Các chất kìm hãm cạnh tranh.
− Các chất kìm hãm không cạnh chanh
− Kìm hãm bởi sản phẩm của phản ứng
− Kìm hãm do thừa cơ chất.
I.3.4 Ảnh hưởng cuả nhiệt độ và pH lên hoạt tính của
enzymes Saccharase:
− Enzyme bị ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc bởi
nhiệt độ. Mỗi enzyme có nhiệt độ tối ưu riêng và một khoảng ph
nhất định.Nếu nhiệt độ và pH không thích hợp sẽ gây biến tính hay
làm giảm hoạt tính của protein.
I.3.5 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa:
− Các chất kích hoạt làm tăng độ xúc tác của
enzyme. Chúng có thể là các ion kim loại hay các chất hữu cơ. Các
chất này thường kết hợp với các phân tử enzyme làm thay đổi cấu
tạo không gian của nó theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác. Ví
dụ như tác dụng của anion clo, brom,iot, đến hoạt độ của các α
amylase động vật. Tác dụng của một số ion kim loại như Mn
2+
,
Zn
2+
…., đối với các hoạt độ của các protease.
I.4 Nguồn thu nhận enzyme Saccharase: ngoài những
dữ liệu trên, ta còn có bảng sau:
I.5 Ứng dụng của enzyme Saccharase:
− Enzyme saccharase được ứng dụng trong quá
trình sản xuất đường ngịch đảo, là enzyme thủy phân có tác dụng
làm tăng độ hòa tan và vị ngọt, không tạo màu như trường hợp

thủy phân bằng acid. Khả năng giữ ẩm tốt nên được dùng trong
công nghệ sản xuất mứt kẹo mềm, nhân socola, kẹo viên, bánh qui
Nguồn thu nhận Phân tử lượng
Cây mía 218 Kda
Hoa lan 450 Kda
Trái đào 400 Kda
Saccharase Cerevisiae 270 Kda
kem nhân trái cây…) mật ong nhân tạo, kem, rượu mùi …. chế
phẩm enzyme saccharse được sử dụng trong siro thượng phẩm
thức uống không có cồn có giá trị dinh dưỡng và độ ẩm cao, giảm
chi phí về đường cho các đơn vị sản xuất. Trong sản xuất nước
uống không cồn, khi pha chế siro cần chuyển hóa một phần
saccharose để tăng độ ổn định và ngăn ngừa độ kết tinh của của
saccharose. Ngoài ra, enzyme saccharase còn có khả năng phân
giải một số trisaccarit và tetrasacarit, chúng tách phân tử glucose
và fructose ở đầu và cuối mạch ra.
C
12
H
22
O
11
+H
2
O →C
6
H
12
O
6

+C
6
H
12
O
6
− Sự thủy phân saccharose với sự có mặt của
saccharase hình thành glucose và fructose dạng vòng.
− Saccharase là loại enzyme đầu tiên được sử dụng
trong qui mô lớn dưới dạng enzyme cố định. Trong thời kì 1941-
1946 người ta đã thay aid bằng enzyme saccharase trong nấm men
để sản xuất siro vàng các tế bào nấm men sẽ tự hủy và sản phẩm
của sụ tự hủy này được làm sạch bằng cách điều chỉnh pH bằng
4,7, sau đó lọc qua lóp calcium sunfat và hấp thụ trong than xương
có chứa enzyme invertase.
II. QUI TRÌNH THU NHẬN ENZYME SACCHARASE:
II.1 Sơ đồ thu nhận enzyme Sacharase:
Nước
Nấm men, bã men
Ly tâm( 4000v/15 phút)
Lọc
Cát
Đệm phosphate
0.1M, ph 7
Nghiền
Thẩm tích đối nước
Sắc kí trao đổi ion
Đông khô
Ly tâm( 4000v/ 5 phút)
Sản phẩm

B
ã
B
ã
B
ã
II.2 Giải thích sơ đồ:
− Nghiền: Saccharase là loại enzyme chủ yếu nằm
trong tế bào. Do đó cần phải phá vở tế bào để thu nhận
enzyme( bằng cách nghiền với cát) đồng thời khi tiến hành chiết
tách cần phải làm lạnh môi trường để tránh sự giảm hoạt tính của
enzyme Saccharase.
− Lọc: Đối với bã men sau khi nghiền phải qua lọc
thô để loại bớt bã nhằm thuận tiện cho các quá trình sau.
− Ly tâm: Dịch enzyme sau khi thu được đem ly
tâm ở 4000v/15 phút mục đích loại bỏ tạp chất.
− Thẩm tích: Trong quá trình tinh sạch enzyme cần
phải thẩm tích để loại bỏ các phân tử hòa tan có kích thước nhỏ
không phải là enzyme mong muốn.
− Đông khô: phương pháp bảo quản các sản phẩm
sinh học: enzyme, protein, các tế bào vi sinh vật được lâu hơn mà
hoạt tính của chúng không bị biến tính. Muốn vậy, chúng ta cần
phải tiến hành đông khô mẫu trước khi khảo sát.Nếu đây là quy mô
CN thì công đoạn này với công đoạn kế tiếp đổi ngược lại.
− Sắc kí trao đổi ion: Trong hổn hợp enzyme thu
được ngoài enzyme, protein mong muốn còn có các protein và các
tạp chất khác do đó phải tách và tinh sạch chúng bằng phương
pháp sắc kí.
II.3 Đánh giá hoạt tính enzyme saccharase trong
thực nghiệm.

dựa vào bảng số liệu thực nghiệm dưới, ta có thể kết luận sau:
hoạt lực enzyme saccharase trong nấm men > bã men
hoạt lực enzyme saccharase trong men khô > men tươi
Với công thức tính hoạt lực như sau:
(V
1
-V
2
) × A × B×10-
3
20 × 2 × a × b × t × m
Trong đó: A:tổng thể tích trong mỗi ống (ml)
B:tổng thể tích enzyme có trong m (g) nguyên liệu (ml)
a:thể tích lấy ra trong mỗi ống để định lượng glucose (ml)
b:thể tích dd enzyme cho vào mỗi ống (ml)
m,t: lần lượt là khối lượng enzyme (g) và thời gian thuỷ
phân tính bằng phút.
Hoạt lực của enzyme saccharase trong nguyên liệu thô:
(mol/g/phút)
Với:
a) Nấm men tươi: men bánh mì đông dạng bột mua ở chợ, hãng
sx tại Thái Lan, chủng Saccharamyces cerevisiae.
b) Nấm men khô: chế phẩm saccharase thu nhận từ men bánh
mì sau khi chiết xuất và đông khô dung dịch.
c) Bã men tươi: bã nấm men thu nhận từ bã men bia của nhà
máy bia Sài Gòn.
d) Bã men khô: chế phẩm saccharase thu nhận từ bã men tươi
sau khi qua chiết xuất và đông khô dung dịch.
Nguyên
liệu

Khối
lượng(g)
V
dd

(ml)
Thể tích
Na
2
S
2
O
3
(ml)

V
1
-V
2
Hoạt lực
mol/g/phút
Nấm men
tươi
20 50 3.133
0.383
Nấm men
khô
0.091 3 6.283 3.688 4.053x10
-3
2.595

Bã men
tươi
110 60 3.166 2.500 4.545x10
-6
0.666
Bã men
khô
0.0667 3 3.516 1.366 2.048x10
-3
2.15