chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú

Chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú
I. Tổng Quan:
1. Khái Niệm Về Collagenase :
Collagenase là enzyme có khả năng thủy phân liên kết peptit dạng
poly-L như prolin đặc trưng trong vùng xoắn của collagen ở trạng thái tự
nhiên của cơ chất không biến tính.Trong khi đó, các protein khác có thủy
phân hạn chế collagen tự nhiên nhưng chỉ tại phần cuối của chuỗi xoắn có
ở ngoài vùng xoắn đặc trưng của collagen, không có khả năng tấn công các
liên kết trong vùng xoắn cua collagen.
2. Đặc điểm cấu tạo của collagenase và một số tính
chất cơ bản:
Nhìn chung , các collagenase là các protein co KLPT lớn và có cấu
trúc phân tử không giống nhau. Những năm về sau , phương pháp xác định
kích thước phân tử của enzyme chủ yếu là phương pháp điện di trên gel
polyarcylamide khi có mặt SDS hoặc phương pháp lọc gel được tiến hành
với enzyme ở trạng thái tinh khiết. Phân tử collagenase có thể được tạo nên
bởi các dưới – đơn vị. Collagenase A với KLPT 100 kDa được phát hiện bao
gồm 4 dưới – đơn vị không có hoạt tính enzyme với trọng lượng mỗi phần là
25 kDa, Vibrio B- 30 bao gồm 2 dưới – đơn vị có KLPT không giống nhau
24 kDa và 28 kDa .
- độ bền của enzyme :
Đa số các enzyme đã được công bố có pH hoạt động trong khoảng trung
tính hoặc hơi kiềm ( pH 7-8). Tuy thế, khả năng hoạt động của chúng cũng
GVHD :Nguyễn Thị Thu Sang 1

Chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú
không vượt quá mức pH trung tính. Collagenase từ B.alvei DC – 1 được
phát hiện là hoạt động trong vùng pH axit yếu cho tới trung tính (4.5 -7 ).
Đây là enzyme đầu tiên trong số các collagenase đã biết có khả năng hoạt
đông trong vùng axit yếu. Nhiệt độ hoạt động thích hợp cùa các collagenase
thường là dưới 40 - 42.4

o
C. Các enzyme này hầu như bị giảm hoạt tính khi
tăng nhiệt độ lên trên 45
o
C .Đặc biệt trong trường hợp của collagenase từ
Vibrio B -30, enzyme này bị mất tới 94% hoạt tính khi tăng nhiệt độ tới
45
o
C.
- Tính đặc hiệu của enzyme :
Hầu hết các collagenase có tính đặc hiệu cao đối với collagen. Đa phần
các enzyme bắt buộc không kèm hoạt tính với các casein hoặc hemoglobin,
trừ trường hợp enzyme từ Pseudomonas sp, hai hoạt tính collagenase và
caseinase luôn đi kèm.
Collagenase từ vi khuẩn có khả năng phân cắt tích cực hơn so với các
enzyme của mô.Clostridiopeptidase A có thể tác dụng tại 200 điểm trên một
chuỗi xoắn α trong khi colagenase của nòng nọc cóc chỉ có khả năng phân
cắt chuỗi xoắn tại một điểm duy nhất .
II. Đối tượng nghiên cứu :
Tôm sú là mặt hàng tôm phổ biến nhất ở Việt Nam, được chế biến dễ
dàng, dưới nhiều dạng sản phẩm khác nhau. Hương vị tôm sú ngon và đậm
đà hơn các loại tôm khác.
Tôm sú còn gọi là tôm cỏ, tôm nương, tôm sú rằn, thuộc lớp giáp xác,
bộ mười chân, họ tôm he, giống tôm he. Loài tôm sú có tên khoa học là
GVHD :Nguyễn Thị Thu Sang 2

Chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú
Penaeus monodon, tên thương mại là Black Tiger Shrimp. Tôm sú được
đánh bắt và nuôi trồng hàng đầu thế giới. Theo thống kê của tổ chức Lương
thực Nông nghiệp Thế Giới ( Food Agriculture Organization - FAO ), sản

lượng tôm sú năm 1997 chiếm 52% sản lượng tôm nuôi trồng toàn thế giới,
với tốc độ tăng trưởng trung bình 2%/ năm. Trong các vùng nuôi tôm chủ
yếu trên thế giới, Đông Nam Á là vùng dẫn đầu chiếm 53,7% tổng sản lượng
tôm toàn thế giới trong tổng số 54 quốc gia có ngành công nghiệp nuôi tôm
phát triển ( thống kê của FAO năm 1997).
Hiện nay, ở Việt Nam tôm sú là một trong 5 loại tôm được nuôi trồng
phổ biến và quan trọng nhất đối với nền kinh tế Việt Nam.
- Tôm sú (Black tiger shrimp)- penaeus monodon.
- Tôm thẻ (Banana shrimp) – penaeus merguiensis.
- Tôm chân trắng (White leg shrimp) – penaeus vannamei.
- Tôm Nhật Bản (Giant fresh water prawn).
- Tôm càng xanh (Giant fresh water prawn).
1. Đặc điểm sinh học :
Tôm sú là loài sống ở nơi chất đáy là bùn pha cát với độ sâu từ ven bờ
đến 40m nước và độ mặn 5 – 34%. Tôm sú có đặc điểm sinh trưởng nhanh ,
trong 3 – 4 tháng có thể đạt cỡ bình quân 40- 50 gam. Tôm trưởng thành tối
đa với con cái có chiều dài 220 – 250mm, trọng lượng 100 – 300gam. Con
đực dài 160 – 210mm, trọng lượng 80 – 200 gam. Tôm có tính ăn tạp, thức
GVHD :Nguyễn Thị Thu Sang 3

Chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú
ăn ưa thích là thịt các loài nhuyễn thể, giun nhiều tơ ( Polycheacta) và giáp
xác.
- Thành phần dinh dưỡng của tôm:
Thành phần dinh dưỡng trong 100g sản phẩm ăn được
Thành phần chính Muối khoáng Vitamin
Kcal g mg Mg
Calories
Moisture protein Lipid Glucid Ash Ca P Iron A B1 B2 PP
82 79,2 17,6 0,9 0,9 1,4 79 184 1,6 20 0,04 0,08 2,3

Tôm sú được chế biến chủ yều dạng sản phẩm :
+ Tôm sơ chế đông lạnh tươi : Nguyên con và bóc vỏ.
+ Tôm chế biến sẵn : Sản pẩm giá trị gia tăng và các phẩm phối chế
khác.
2. Vùng phân bố :
Tôm sú phân bố rộng từ Bắc đến Nam, từ ven bờ đến vùng có độ sâu
40m. Vùng phân bố chính là vùng biển các tỉnh Trung Bộ.
3. Mùa vụ :
Tôm sú khai ngoài biển sản lượng hạn chế, mùa đánh bắt từ tháng 1 đến
tháng 11. Tôm nuôi thì khai thác rải rác từ tháng 4 đến tháng 9. Chính vụ sản
lượng cao nhất vào các tháng 5, 6 và 7.
4. Hình thức nuôi :
GVHD :Nguyễn Thị Thu Sang 4

Chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú
Thâm canh (công nghiệp) (TC), bán thâm canh (BTC) và quảng cảnh
cải tiến (QCCT). Tôm sú nuôi trong các ao đầm nước lợ ở cả vùng cao và
vùng trung triều. Một số nơi nuôi sen kẽ vụ lúa, vụ tôm và nuôi chung với
cá rô phi, cua và rong câu. Khu vực phía Bắc nuôi QCCT và BTC là chủ
yếu. Miền trung nuôi BTC và TC. Các tỉnh phía Nam nuôi BTC và QCCT.
III. Phương pháp chiết tách và thu nhận:
1. Phương pháp trích ly enzyme:
Enzyme là loại protein được tạo thành trong tế bào, phần lớn chúng
tồn tại trong tế bào. Các enzyme này thường không có khả năng di chuyển
qua màng tế bào. Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phá vỡ màng tế bào
bằng nhiều phương pháp. Các phương pháp phá vỡ tế bào thường được sử
dụng để phá vỡ tế bào như:
- Phương pháp cơ học :nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như
bột thủy tinh, cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa,….
- Phương pháp vật lý : dùng sóng siêu âm.

- Phương pháp hóa hoc : dùng các loại dung môi, butylic, aceton,
glycerol, ethylacetate.
Quá trình trích ly enzyme từ đầu tôm sú còn chịu sự tác động của các
yếu tố như : tỷ lệ dung môi trích, nhiệt độ, thời gian, pH.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly enzyme collagenase:
Tỷ lệ dung môi với mẫu : mẫu mô động vật có nhiều thành phần khác nhau,
ngoài protein của enzyme và các thành phần enzyme khác đặc biệt là hàm
GVHD :Nguyễn Thị Thu Sang 5

Chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú
lượng lipit nhiều, ảnh hưởng đến quá trình trích ly, ở tỷ lệ thích hợp sẽ trích
ly được những protein – enzyme collagenase ra ngoài mô nhiều hơn.
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình trích ly, hầu hết
enzyme collagenase động vật rất dễ biến tính hay giảm hoạt tính khi tăng
nhiệt độ, hay ở nhiệt độ thích hợp enzyme hoạt động mạnh hay thủy phân
protein lẫn nhau. Thường nhiệt độ ly trích enzyme collasgenase từ mô động
vật ở nhiệt độ không quá 5
o
C.
Thời gian trích ly: đối với enzyme collagenase từ nguồn động vật dễ
bị phân hủy vì hoạt tính collagenase mạnh và có sự hỗ trợ của các enzyme
thủy phân khác có trong mô mẫu khi để ở thời gian lâu, hay thời gian ngắn
thì quá trình hòa tan của enzyme từ mô tế bào mẫu. Chính vì vậy thời gian
trích ly enzyme từ mô mẫu cần phụ thuộc loại mô mẫu và dung môi trích ly.
pH là yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme trong quá trình trích ly, có
những enzyme acid cần phải trích ly ở pH acid, thu protein của enzyme đó
cao hơn, còn enzyme kiềm thì ngược lại.
2. Thu Và Bảo Quản Mẫu :
Đầu làm nguyên liệu thu chế phẩm enzyme được tách từ tôm sú tươi,
cỡ 41 – 50 con/kg. Đầu nếu được dùng ngay, được ướp đá xay kết hợp với

muối và bảo quản < 4 giờ ( nhiệt độ 0
o
C, nếu cần bảo quản lâu hơn thì cho
đầu vào trong các túi PE, bảo quản ở -20
o
Cđể dùng dần trong các lần thí
nghiệm.
GVHD :Nguyễn Thị Thu Sang 6

Chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú
3. Qui trình chiết tách và thu nhận dịch chiết collagenase
từ đầu tôm sú







Sơ đồ: Quy trình tách chiết tinh sạch và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng hoạt động của
Enzyme collagenasa từ mẫu đầu tôm sú
GVHD :Nguyễn Thị Thu Sang 7

Nghiền mịn
Trích ly
(khuấy, 0-4
o
C,60 phút)
Tủa dịch chiết
(4

o
C,70 phút)
Tinh sạch bằng sắc ký lọc gel
Đầu tôm sú
Ly tâm lạnh
(6000v/ph,4
o
C, 15 phút)
Thu Chế phẩm thô (CPT)
Ly tâm
Nước cất
(1/5)
Thu dịch chiết enzym thô
(DC)
Chế phẩm
collagenase bán tinh
khiết
- Xác định hoạt tính collagenase
- Xác định hàm lượng protein
- Tủa cồn tỷ lệ 1/4
- Tủa Acetone tỷ lệ 1/3
- Tủa muối ở 60%
- Xác định hoạt tính collagenase
- Xác định hàm lượng protein
- Khảo sát yếu tố ảnh hưởng
- Xác định hoạt tính collagenase
- Xác định hàm lượng protein
Chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú
a) Nghiền mịn:
Nghiền nhuyễn đầu bằng cối inox với cát thạch anh đã làm sạch.dùng

dung môi( nước cất, dung dịch muối sinh lý, đệm phosphat, đệm Tris – HCl)
với các tỉ lệ khác nhau, khuấy đảo liên tục ở điêu kiện nhiệt độ 0-4
o
C trong
60 phút để chiết rút enzyme, ly tâm lạnh ở 4
o
C, tốc độ 6000 vòng/phút trong
15 phút để loại bỏ phần cặn, thu dịch chiết ( DC). Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ
dung môi và loại dung môi chiết lấy mẫu. Từ đó chọn dung môi và tỷ lệ
thích hợp chiết enzyme.
b) Dịch chiết ezyme thô (DC):
Dung dịch chiết có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của enzyme. Tiến hành tách
chiết enzyme collagenase từ mẫu đầu tôm sú bằng các dung môi: nước cất,
nước muối sinh lý, đệm photphate 0,1M, pH 7,0 và đệm Tris – HCl 0,05M,
pH 7,5 cùng với các tỷ lệ khối lượng mẫu/dung môi (w/v) khác nhau, được
giữ ở 4 C bằng đá vụn, khuấy liên tục trên máy khuấy từ trong 6o phút. Ly
tâm lạnh ở 4
o
C với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC.
- Nước cất: tỷ lệ mẫu/dung môi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7.
- Nước muối sinh lý: tỷ lê mẫu/dung môi (w/v)
- Đệm photphate 0,1M pH 7,0 : tỷ lệ mẫu/dung môi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3;
1/4; 1/5; 1/6; 1/7.
- Đệm Tris – HCl 0,05M pH =7,5: tỷ lệ mẫu/dung môi :1/1; 1/2; 1/3;
1/4; 1/5; 1/6; 1/7.
GVHD :Nguyễn Thị Thu Sang 8

Chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú
☺Xác định hoạt tính collagenase và hàm lượng protein của
từng DC:

Bảng số liệu:
Dung môi chiết HT collagenase
( UI/g)
HL protein
(mg/g)
HTR
(UI/mg)
Nước (1/5) 40,39 33,86 1,19
Muối sinh lý (1/5) 36,48 30,50 1,20
Đệm P (1/4) 38,34 25,31 1,51
Tris-HCL (1/3) 39,70 26,61 1,49
Dựa vào số liệu trên ta thấy rằng khả năng chiết của dung môi khác
nhau ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính của collagenase và hàm lượng protein
của DC. Kết quả khảo sát cho thấy chiết với dung môi nước (1/5) sẽ cho DC
có hoạt tính collagenase và hàm lượng protein cao nhất.
c) Tủa dịch chiết:
DC thu được thường chứa rất nhiều protein và các hợp chất không
mong muốn, nồng độ enzyme cần thiết thấp. DC có thể cô đặc ở nhiệt độ
thấp để làm tăng nồng độ enzyme, hoặc được bổ sung tác nhân gây kết tủa
protein để loại bỏ một số chất không mong muốn, sau đó hòa tan enzyme
trong một thể tích nhỏ dung dịch đệm thích hợp.
Để kết tủa protein cho muc đích tinh sạch, người ta thường dùng dung
môi hữu cơ như :athenol hay acetone hoặc muối trung tính.
Các dung môi hữu cơ khi thêm vào dung dịch nước sẽ làm giảm hằng
số điện môi của dung dịch, do đó làm thay đổi tính tan của protein và
GVHD :Nguyễn Thị Thu Sang 9

Chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú
dẫn đến làm kết tủa protein. Sự kết tủa có thể có tính chọn lọc 1 phần,
nghĩa là các protein khác nhau có thể được kết tủa bằng các nồng độ

khác nhau của dung môi.
Quá trình kết tủa của collagenase muốn đạt được hiệu suất cao mà
không làm giảm hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của CPT cần
phải tiến hành trong điều kiện lạnh 0 – 4 C, tỷ lệ hay nồng độ tác nhân
tủa và điều kiện tủa thích hợp.
☺Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ
DC:
Mỗi loại tác nhân tủa thường có khả năng làm kết tủa collagenase ở
những nồng độ khác nhau và có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme sau khi kết
tủa.Tiến hành tủa collagenase từ DC bằng các tác nhân với các nồng độ
trong thời gian 70 phút, ở nhiệt độ 4 C.Ly tâm lạnh 4
o
C, tốc độ 6.000
vòng/phút trong 15 phút thu cặn tủa( DCT). Hòa CPT với dung dịch đệm
phosphate 0,1M, pH 7,0 được đưa về cùng thể tích nhất định ( một lượng ít
nhất có thể).
- Tủa bằng ethanol (cồn 96
o
) được làm lạnh, nồng độ tủa theo tỷ lệ
DC/cồn (v/v) : 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7.
- Tủa bằng acetone được làm lạnh, nồng độ tủa theo tỷ lệ DC/acetone
(v/v) : /1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6.
- Tủa bằng muối (NH
4
)
2
SO
4
,nồng độ tủa theo nồng độ muối bão
hòa(%): 30; 40; 50; 60; 70; 80.

GVHD :Nguyễn Thị Thu Sang 10

Chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú
Tủa bằng Cồn:
Tỉ lệ dịch
enzyme/cồn
1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 1:7
HL protein
(mg/g)
18,70 25,90 23,90 56 41,50 36,30 18,70
HT
collagenase(UI/g)
12,95 26,70 40,79 50,66 50,10 44,20 36,30
HTR (UI/mg) 1,44 0,97 0,59 1,11 0,83 0,82 0,52
Khi tăng thể tích cồn lên thì khả năng của protein cũng tăng. Điều này
có thể giải thích: khi tăng thể tích cồn, làm tăng diện tích tiếp xúc của các
protein trong DC với dung môi cồn , sẽ tách triệt để hơn các phân tử nước
bao quanh các phân tử protein, làm giảm tính tan của protein, làm tăng
khả năng tủa của chúng.Khi tỷ lệ DC/cồn ở 1/4(v/v) thì có hiệu suất thu
hồi protein và hoạt tính collagenase tốt nhất. Hiệu suất này không duy trì
khi tiếp tục tăng lượng cồn lên 1/5, 1/6, và 1/7,khi đó khả năng tủa của
enzyme collagenase sẽ giảm, protein không mong muốn và các tạp chất
kết tủa sẽ tăng ảnh hưởng đến hoạt tính.
Dựa vào bảng số liệu cho thấy tủa cồn với tỷ lệ 1:4 sẽ cho hiệu suất cao
nhất và được sử dụng trong các nghiên cứu tiếp.
Tủa bằng Aceton:
GVHD :Nguyễn Thị Thu Sang 11

Chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú
Tỉ lệ dịch

chiết/aceton
(v/v)
1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6
HL protein
(mg/g)
44,20 48,60 52,90 44,50 41,50 41,30
HT
collagenase
(UI/g)
12,40 17,60 25,90 18,70 19,70 5,20
HTR
(UI/mg)
0,28 0,36 0,49 0,42 0,47 0,13
Khi tăng lượng acetone thì hoạt độ enzyme trong CPT tăng và đạt giá
trị cực đại là 25,90 UI/g và hàm lượng là 52,90mg/g ứng với tỷ lệ DC/aceton
là 1/3. Nếu tiếp tục tăng lượng acetone thì hàm lượng protein và hoạt tính
collagenase trong CPT sẽ giảm.Như vậy, tỷ lệ acetone thích hợp để kết tủa
collagenase trong DC từ đầu tôm sú là 1/3.
Tủa bằng muối (NH
4
)
2
SO
4
:
Nồng độ % sulfat amon
bão hòa với DC
30% 40% 50% 60% 70% 80%
HL protein (mg/g) 43,20 49 50,50 43,10 40,50 35,80
HT collagenase (UI/g) 29,60 39,50 59,30 61,90 50,79

,
45,20
HTR (UI/mg) 0,69 0,81 1,17 1,44 1,25 1,26
Dựa vào bảng số liệu cho thấy nồng độ muối (NH
4
)
2
SO
4
bão hòa 60% thì
CPT của mẫu có hoạt tính collagenase và hàm lượng protein cao nhất so với
các nồng độ muối bão hòa khác.Vì vậy, chọn nồng độ muối bão hòa 60% để
thu hồi CPT sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
GVHD :Nguyễn Thị Thu Sang 12

Chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú
d) Thu nhận chế phẩm Collagenase :
Tiến hành tủa DC bằng các tác nhân trên với tỷ lệ DC/dung môi khác
nhau ở điều kiện 0 – 4 C, thời gian tủa 70 phút, ly tâm lạnh ở 4 C với tốc độ
6.000 vòng/phút trong 15 phút, thu cặn là chế phẩm enzyme thô (CPT).
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tủa và tác nhân từ đó chọn ra nồng độ và
tác nhân thích hợp để tủa DC thu collagenase.
Tác nhân tủa HL protein
(mg/g)
HL collagenase
(UI/g)
HTR (UI/mg)
Cồn (1/4) 50,66 56 1,11
Aceton (1/3) 52,90 25,90 0,49
(NH

4
)
2
SO
4
60% 43,10 61,90 1,44
Bảng: ảnh hưởng của tác nhân tủa đến hoạt tính collagenase và hàm
lượng protein của CPT.
☺ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của
collagenase của CPT:
 Nhiệt độ:
GVHD :Nguyễn Thị Thu Sang 13

Chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú
Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt
tính của enzyme.
Tiến hành xác định hoạt tính của enzyme collagenase CPT của mẫu
đầu tôm sú khi ủ với collagen 1mg/ml , pH 7.0 trong 4 giờ với dãy nhiệt độ
ủ :15; 25; 35; 45; 55; 65; 75
o
C theo phương pháp Hyroxyproline.
Khi tăng nhiệt độ từ 15
o
C đến 35
o
C thì hoạt tính enzyme sẽ tăng. Nếu
tiếp tục tăng nhiệt độ thì hoạt tính enzyme sẽ giảm. Điều này chứng tỏ rằng
collagenase ở đầu tôm sú thích hợp ở 35
o
C.

Điều này rất có ý nghĩa trong chế biến tôm và nghiên cứu ứng dụng
enzyme protease của đầu tôm trong công nghệ thực phẩm cũng như các ứng
dụng khác của protease.
 pH:
pH cũng là một trong những yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến
hoạt tính enzyme, mỗi enzyme có một khoảng pH hoạt động thích hợp và
một giá trị pH tối ưu nhất.
Người ta tiến hành thí nghiệm ,ủ collagenase CPT của mẫu đầu tôm
sú với collagen 1mg/ml thay đổi theo dãy pH: 5; 6; 7; 8; 9; 10 trong thời
gian 4 giờ và nhiệt độ thích hợp (với kết quả khảo sát nhiệt độ).Xác định
hoạt tính theo phương pháp Hydroxyproline.
Mỗi enzyme sẽ có một khoảng pH hoạt động tối thích, theo kết quả
thực nghiệm thì collagenase ở đây sẽ có pH opt = 8.
IV. Phương pháp làm sạch enzyme:
GVHD :Nguyễn Thị Thu Sang 14

Chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú
Phương pháp tinh sạch enzyme collagenase bằng sắc ký lọc gel:
Tách các protein của enzyme collagenase trong CPT mẫu đầu của các
tác nhân tủa cồn, acetone, PEG và tủa muối (NH4)2SO4 với nồng độ thích
hợp bằng phương pháp sắc ký lọc gel.
Sử dụng sắc ký bio-rad, kích thước 30 x 1,5 cm; thể tích: 53ml (thể
tích =chiều cao cột x (đường kính /2)2 x 3,14 ( ) = 30 x (1,5/2)2 x 3,14 ).
Cân 4g gel Bio-Gel P100, cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm
phosphate 0,1M pH 7.0 đựng trong cốc. Sau khi thể huyền phù đồng nhất
của các hạt gel hình thành, không cần phải khuấy, hãy để ổn định 12 giờ và
20 C trong suốt quá trình hydrate hóa.
Sau khi quá trình hydrate xảy ra hoàn toàn, gạn bỏ nổi trên bề mặt.
Chuyển dung dịch vào một bình hút chân không có gắn với vòi hút chân
không. Khử khí của dung dịch trong khoảng 10- 15 phút, thỉnh thoảng lắc

nhẹ (xoay) bình.
Để gel ổn định cho đến khi 90-95% số hạt ổn định, gạn hoặc loại lớp nổi
trên bề mặt bẳng cách hút để loại các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để
loại hơn 90% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel.
Gắn phểu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm
làm đầy 20% thể tích cột. Rót đều dung dịch gel vào cột thành một dòng di
chuyển nhẹ tránh làm bắn gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí.
Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 đến 5cm, mở khóa đầu ra của cột
cho đến khi cột nạp đầy gel( packed). Khi cột đã nạp đầy gel, khóa đầu ra
(outlet) của cột và gắn flow adaptor. Mở khóa đầu ra của cột và cho dung
GVHD :Nguyễn Thị Thu Sang 15

Chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú
dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền (106ml) chảy qua cột lúc
điều khiển tốc độ chảy. Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh flow adaptor
xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách dùng
xylanh bơm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor.
Các thông số tinh sạch bằng sắc ký lọc gel áp suất thấp sau:
Gel: sephadex – G100 ( Giới hạn phân tách 5000- 100000 Da).
Cột: 50x1,5cm
Flow adaptor: 1,5cm.
Tốc dộ dòng : 0,14ml/phút.
V mẫu: 2ml.
Phân đoạn : 2ml/phân đoạn.
A 280: Độ hấp thụ protein ở bước sóng 280nm.
V. Ứng dụng:
Việc chiết tách enzyme dựa vào tính chất của chúng: enzyme tan được
trong nước, trong dung dịch nước muối sinh lý, các dung dịch đệm. Dịch
chiết thu được chứa enzyme, protein tạp, các chất hữu cơ vả vô cơ nên phải
tiến hành tinh sạch để thu phế phẩm. Các chế phẩm enzyme được sử dụng

rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau:
1. Trong hóa phân tích để định tính và định lượng các chất
GVHD :Nguyễn Thị Thu Sang 16

Chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú
Dùng enzyme có tác dụng phân giải riêng chất ấy, sau đò dùng một
trong các phương pháp phân tích thông thường để định lượng các chất sau
phản ứng.
2. Trong y học :
Sử dụng enzyme để chữa bệnh, sản xuất các sinh tố và các chất kháng
sinh.
Ví dụ:có thể dùng enzyme để tăng thêm lượng enzyme cho cơ thể, chữa các
bệnh do thiếu bẩm sinh hoặc các nội quan nhân tạo, có thể dùng enzyme để
chữa các bệnh tiêu hóa kém hoặc loại bỏ các phần mô bị hỏng, bị thối ở các
ổ viêm, các vết thương hoặc hòa tan các cục máu đông làm tắc nghẽn mạch
máu
.Ngoài ra cũng có thể dùng enzyme để phân giải thuốc khi cơ thể dị ứng
mạnh với các thuốc này.
Do khả năng phân cắt đặc hiệu collagen, collagenase được dùng như một
công cụ hữu hiệu để phân tách các thành phần cấu trúc trong mô liên kết.
Collagenase còn được sử dụng như một công cụ hiệu quả trong việc phân
tách tế bào trong mạng lưới mô liên kết. Ngoài ra, collagenase có thể được
sử dụng trong nghiên cứu các tiến trình của một số bệnh và cơ chế làm lành
vết thương.Việc sử dụng collagenase có thể dưới dạng thuốc bôi hoặc các
băng vết thương trong điều trị bỏng.
Mới đây, năm 1998, vai trò xúc tác và hướng đích của collagenase trong
việc ngăn chặn việc phát triển các khối u do khả năng phân cắt các trình tự
hexapeptid Pro – Gln - Gly - Mel – Gly tạo thành tripeptid Ile – Mel – Gly
GVHD :Nguyễn Thị Thu Sang 17

Chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú
có độc tính tế bào cao đã được phát hiện. Điều đó có được xem như một khả
năng hứa hẹn cho sản xuất các chế phẩm khác có hoat tính collagenase cao
đề ngăn ngừa các khối u.
Collagenase và các sản phẩm polymer thủy phân của chúng cũng được
sử dụng trong y tế điều chế da thay thế, chỉ phẫu thuật, các vỏ viên thuốc
hay được sử dụng trong công nghiệp hóa chất Bên cạnh các khả năng sử
dụng collagenase cho các mục đích trên , collagenase là một enzyme tiềm
năng trong nhiều lĩnh vực khác như công nghiệp da, công nghiệp mỹ phẩm
trong sản xuất các kem tẩy da chết.
3. Trong công nghiệp da
Collagenase được sử dụng với mục đích tách lông trên da và làm mềm
da nhờ sự thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là một số liên kết
collagen là thành phấn chính làm cho da bị cứng. Kết quả của sự làm mềm là
loại bỏ khỏi da các chất làm nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định,
tính chất được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da.
4. Trong công nghiệp thực phẩm :
- Làm mềm thịt:
Collagenase làm tăng độ mềm thịt bằng cách phân giải cấu trúc xoắn
collagen, làm duỗi mạch protein để đạt được cấu trúc và độ mềm mong
muốn và không kèm theo sự phân giải các sợi miozin làm hương vị của thịt
không bị biến đổi, nâng cao chất lượng thịt, nâng cao giá trị của cácnguyên
liệu thịt.
- Biến hình protein:
GVHD :Nguyễn Thị Thu Sang 18

Chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú
Collagenase được dùng với mục đích biến đổi cấu trúc protein để đạt
được hiệu quả mong muốn, cải thiện khả năng giữ nước, khả năng nhũ
tương hóa, độ bền tạo nhũ, tạo bọt, độ dai…Ngoài ra, sử dụng collgenase

làm giảm tính gây dị ứng của 1 số protein thực phẩm.

GVHD :Nguyễn Thị Thu Sang 19