Đề tài : Nghiên cứu công nghệ nuôi cấy và thu nhận tetrodotoxin từ một số chủng vi khuẩn phân lập từ cá nóc độc việt nam

6

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Bùi Thị Thu Hiền

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY VÀ THU NHẬN
TETRODOTOXIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN
LẬP TỪ CÁ NĨC ĐỘC VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ: CƠNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Bùi Thị Thu Hiền

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY VÀ THU NHẬN
TETRODOTOXIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP
TỪ CÁ NĨC ĐỘC VIỆT NAM

Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học
Mã số:

62 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS. TS. Khuất Hữu Thanh
2. GS. TS. Phạm Quốc Long

Hà Nội – 2013


LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Những số liệu và kết
quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố.
Hà Nội, ngày 03 tháng 03 năm 2013
Nghiên cứu sinh

Bùi Thị Thu Hiền

i


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình nghiên cứu, học tập và hồn thành Luận án này, tơi đã nhận được
sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của hai người thầy đáng kính là PGS.TS. Khuất Hữu Thanh Đại học Bách Khoa Hà Nội, GS.TS. Phạm Quốc Long - Viện Hóa học các hợp chất thiên
nhiên. Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn tới hai thầy.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ
Thực phẩm - ĐHBKHN đã giảng dạy, chỉ bảo và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trau dồi kiến
thức chuyên môn và cuộc sống.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Shigeru SATO - Đại học
Kitasato, Nhật Bản đã truyền đạt cho tôi kiến thức và quy trình cơng nghệ tách chiết, tinh
sạch độc tố Tetrodotoxin; TS. Đào Thị Lương, TS. Trịnh Thành Trung -Viện Vi sinh và

Cơng nghệ Sinh học, ĐHQGHN; KS. Hồng Thị Oanh, ThS. Nguyễn Hữu Hoàng, ThS.
Bùi Trọng Tâm, ThS. Phạm Thị Điềm -Viện Nghiên cứu Hải sản đã cùng tôi thực hiện một
số nội dung của Luận án này.
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Hải
sản, Lãnh đạo Phòng, các anh chị em trong Phịng Nghiên cứu Cơng nghệ Sau thu hoạch,
Công nghệ Sinh học Biển đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi về thời gian và vật chất để tôi hồn
thành Luận án này.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng kính u và biết ơn tới gia đình, bố mẹ, chồng, con
và các anh chị em, bạn bè đã thực sự động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập
tại Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội.
Hà Nội, ngày 03 tháng 03 năm 2013
Nghiên cứu sinh

Bùi Thị Thu Hiền

ii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
TT

Chữ viết tắt

Nội dung viết tắt

1

ADN

Acid Deoxyribo Nucleic

2

Anhy-TTX

Anhydro Tetrodotoxin (dẫn xuất anhydro của TTX)

3

ARN

Acid Ribo Nucleic

4

CBS

Chất bổ sung

5

C-NMR

Carbon Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng

6
7
8
9

dATP
dCTP
dGTP
dNTP

hưởng từ hạt nhân cacbon 13)
Deoxyadenosine triphosphate
Deoxycytidine triphosphate
Deoxyguanosine triphosphate
Deoxyribonucleotide triphosphate

10

dTTP

Deoxythymidine triphosphate

11

Epi-TTX

Epi-Tetrodotoxin (dẫn xuất epi của TTX)

12

FLD

Fluorescence Detector- Detecto huỳnh quang

13

FISH

Flourescent in situ hybridization (Kỹ thuật lai phân tử đánh

14

1H-1H COSY

dấu huỳnh quang)
1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy (Phổ học
tương quan giữa 2 vị trí H)
Hetero nuclear Multiple Bond Connectivity (Tương tác giữa

15

HMBC

16

H-NMR

17

HPLC

High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng cao áp)

18

IgM

Immunoglobulin M

19

KKT

Kháng kháng thể

20

KN

Kháng nguyên

21

KT

Kháng thể

22

LB

Luria Broth

23

LC-MS

Liquid chromatography–mass spectrometry (Sắc ký khối phổ)

24

LC-MS/MS

hidro với cacbon bên cạnh)
Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng
hưởng từ hạt nhân proton)

Liquid chromatography–mass spectrometry/mass spectrometry
(Sắc ký khối phổ/khối phổ)

iii


25

MB

Marine Broth

26

MSD

Mass Spectrum Detector (Detecto phổ khối lượng)

27

MU

Mouse unit (Đơn vị chuột)

28

NOESY

Nuclear Overhauser and Exchange Spectroscopy (Phổ trao đổi
hiệu ứng Overhauser hạt nhân)

29

µCP

Micro contact printing

30

µFN

Micro fluidics networks

31

µM

Micro Mol

32

OD

Optical Density (Mật độ quang)

33

ORI

Ocean Research Institute medium

34

PCR

Polymerase Chain Reaction

35

TCBS

Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose

36

TTX

Tetrodotoxin

37

TTXs

Tetrodotoxin và các dẫn xuất
+

38

TTX-s Na

39

TTX-r Na+

Kênh điện thế Na+ nhạy cảm TTX
Kênh điện thế Na+ kháng TTX

iv


MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...............................................................iii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ................................................................................. ix
MỞ ĐẦU................................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .................................................................................................. 2
1.1. TETRODOTOXIN........................................................................................................... 2
1.1.1. Công thức phân tử, cấu tạo hóa học của TTX .......................................................... 2

1.1.2. Đặc tính của TTX...................................................................................................... 4
1.1.3. Cơ chế gây độc của TTX........................................................................................... 5
1.1.4. Ứng dụng của TTX.................................................................................................... 7
1.2. NGUỒN THU NHẬN TTX.............................................................................................. 9
1.2.1. TTX từ động vật biển ................................................................................................... 9
1.2.2. TTX từ vi sinh vật biển............................................................................................... 15
1.3. CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH TTX TỪ CÁ NÓC ............................... 20
1.3.1. Tổng hợp TTX theo phương pháp hóa học ............................................................. 20
1.3.2. Tách chiết và tinh sạch TTX từ cá nóc ................................................................... 21
1.4. THU NHẬN VÀ TINH SẠCH TTX TỪ VI SINH VẬT................................................... 24
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 26
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ............................................... 26
2.1.1. Đối tượng................................................................................................................ 26
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu ................................................................................................. 26
2.1.3. Hóa chất và mơi trường nghiên cứu ....................................................................... 27
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................................. 28
2.2.1. Phương pháp xác định độc tố của 3 lồi cá nóc độc bằng HPLC ......................... 28
2.2.2. Phương pháp phân tích, xác định tính chất của TTX từ cá nóc Việt Nam làm tiền
đề kiểm chứng tính chất TTX từ vi sinh vật ...................................................................... 28
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh TTX .... 29
2.2.4. Phương pháp phân loại các chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh TTX................ 30
2.2.5. Nghiên cứu xây dựng quy trình ni cấy vi khuẩn sản sinh TTX ........................... 33
2.2.6. Tối ưu hóa điều kiện nuôi vi khuẩn sinh TTX theo đường dốc của Box-Wilson .... 34
2.2.7. Nghiên cứu xây dựng quy trình cơng nghệ tách chiết và tinh sạch TTX từ dịch nuôi
vi khuẩn............................................................................................................................. 36
2.2.8. Phương pháp phân tích xác định độc tính của TTX từ vi sinh vật ......................... 39
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................................... 41
3.1. PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT ĐỘC TỐ TTX CỦA CÁ NĨC
ĐỘC VIỆT NAM.................................................................................................................. 41
3.1.1. Lựa chọn mẫu vật để phân lập vi sinh vật từ cá nóc độc ....................................... 41

v


3.1.2. Nghiên cứu xác định tính chất TTX từ mẫu cá nóc độc Việt Nam.......................... 43
3.2. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SẢN SINH TTX TỪ CÁ
NÓC ĐỘC VIỆT NAM......................................................................................................... 48
3.2.1. Phân lập và lựa chọn các chủng vi sinh vật từ 3 lồi cá nóc độc .......................... 48
3.2.2. Lựa chọn các chủng vi khuẩn sinh TTX từ các loại mơ khác nhau của cá nóc độc49
3.2.3. Nghiên cứu khả năng sinh TTX của các chủng vi sinh vật thu được...................... 51
3.2.3. Phân loại các chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh TTX ................................... 52
3.3. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NI CẤY VI KHUẨN SẢN SINH TTX ... 59
3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ...................................................................... 59
3.3.2. Ảnh hưởng của pH nuôi cấy ................................................................................... 61
3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy ........................................................................... 63
3.3.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy.......................................................................... 64
3.3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung mô trứng cá nóc độc vào mơi trường ni cấy ........ 64
3.3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống ............................................................................... 65
3.3.7. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy thích hợp .................................................................. 66
3.4. TỐI ƯU HĨA ĐIỀU KIỆN NI CẤY CHỦNG M37 SẢN SINH TTX....................... 67
3.4.1. Chọn miền khảo sát ................................................................................................ 67
3.4.2. Thiết lập mô hình .................................................................................................... 69
3.4.3. Tối ưu hóa khả năng sinh độc tố TTX của chủng M37 theo phương pháp lên dốc
của Box-Wilson................................................................................................................. 72
3.4.4. Kiểm định mơ hình tối ưu khả năng sinh TTX của chủng M37 bằng thực nghiệm 73
3.5. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ TÁCH CHIẾT VÀ TINH
SẠCH TTX TỪ DỊCH NUÔI VI KHUẨN M37.................................................................... 76
3.5.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình cơng nghệ tách chiết TTX ngoại bào từ dịch nuôi vi
khuẩn M37 ........................................................................................................................ 76
3.5.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình cơng nghệ tinh sạch TTX từ dịch độc tố thô chứa
TTX tách chiết từ dịch nuôi vi khuẩn................................................................................ 77

3.6. KIỂM TRA CHẾ PHẨM TTX TỪ VI SINH VẬT .......................................................... 89
3.6.1. Kiểm tra chế phẩm TTX từ vi sinh vật .................................................................... 89
3.6.2. Thử nghiệm độc tính cấp của TTX thu nhận từ dịch nuôi chủng vi khuẩn M37..... 90
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................................ 92
1. KẾT LUẬN....................................................................................................................... 92
2. KIẾN NGHỊ ..................................................................................................................... 92
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .............................................................. 93
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................... 94
PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 102

vi


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Vi khuẩn sinh TTX phân lập từ một số loài sinh vật biển ................................... 16
Bảng 3.1. Hàm lượng độc tố TTX trong các mô của cá thể cái ở 3 lồi cá nóc độc Việt
Nam...................................................................................................................................... 41
Bảng 3.2. Hàm lượng độc tố TTX trong các mô của cá thể đực ở 3 lồi cá nóc độc Việt
Nam...................................................................................................................................... 42
Bảng 3.3. Số liệu phổ 1H và 13C NMR cùng các tương tác xa H-C của TTX ...................... 47
Bảng 3.4. Số lượng các chủng vi sinh vật phân lập trên 4 loại mơi trường từ 3 lồi cá nóc
............................................................................................................................................. 48
Bảng 3.5. Số lượng vi sinh vật phân lập từ 4 mơ của 3 lồi cá nóc độc ............................. 49
Bảng 3.6. Số lượng các chủng vi sinh vật sinh TTX phân lập từ 4 mơ của 3 lồi cá nóc độc
............................................................................................................................................. 50
Bảng 3.7. Kết quả phân tích định lượng hàm lượng TTX có trong dịch ni cấy của 24
chủng ................................................................................................................................... 51
Bảng 3.8. Kết quả phân loại một số chủng vi khuẩn sản sinh TTX hàm lượng cao............ 52
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến sinh tổng hợp TTX. 60
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh TTX..................... 61

Bảng 3.11. Hàm lượng TTX của dịch nuôi cấy trong điều kiện chỉnh pH ban đầu và chỉnh
pH trong quá trình ni....................................................................................................... 62
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của đệm điều chỉnh pH môi trường đến khả năng sinh TTX.......... 63
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh TTX ............................... 63
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh TTX .............................. 64
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ mơ trứng cá nóc độc bổ sung vào môi trường nuôi cấy
............................................................................................................................................. 65
Bảng 3.16. Sinh trưởng của chủng vi khuẩn M37 trong quá trình lên men ở các tỷ lệ cấp
giống khác nhau. ................................................................................................................. 66
Bảng 3.17. Sinh trưởng và sinh tổng hợp TTX của chủng M37 trong quá trình lên men ở
các tốc độ khuấy khác nhau................................................................................................. 67
Bảng 3.18. Mức và khoảng biến thiên của các yếu tố thực nghiệm (TN)............................ 68
Bảng 3.19. Bảng ma trận thực nghiệm với biến X............................................................... 69
Bảng 3.20. Ma trận thực nghiệm ở tâm phương án. ........................................................... 70
Bảng 3.21. Ước lượng tính ý nghĩa các hệ số theo tiêu chuẩn Student............................... 71
Bảng 3.22. Bảng tối ưu hóa theo đường dốc của Box - Wilson .......................................... 73
Bảng 3.23. Thử nghiệm lên men sinh tổng TTX .................................................................. 74
Bảng 3.24. Kết quả phân tích TTX trên HPLC của các mẫu tách chiết ngoại bào với các
tỷ lệ % axit axetic khác nhau so với thể tích dịch nổi ......................................................... 76
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của các thành phần dịch giải hấp đến việc thu hồi độc tố TTX ..... 78
Bảng 3.26. Kết quả phân tích định tính và định lượng các phân đoạn giải hấp theo tỷ lệ
than hoạt tính/mẫu độc tố thơ.............................................................................................. 79
Bảng 3.27. Kết quả định tính TTX từ phần dịch rửa than hoạt tính của các thí nghiệm .... 80
vii


Bảng 3.28. Kết quả định tính và định lượng TTX với các thí nghiệm thay đổi tốc độ dịng
chảy qua cột sắc ký.............................................................................................................. 82
Bảng 3.29. Kết quả phân tích hàm lượng TTX của dịch giải hấp từ than hoạt tính ........... 83
Bảng 3.30. Kết quả phân tích TTX có trong dịch giải hấp với các mẫu ở pH khác nhau... 83

Bảng 3.31. Định lượng TTXs có trong dịch giải hấp ở nồng độ axit axetic khác nhau ...... 84
Bảng 3.32. Kết quả định lượng các phân đoạn dịch giải hấp khi tiến hành tinh sạch
trên cột sắc ký theo tỷ lệ gel Bio-gel P2/mẫu khác nhau..................................................... 85
Bảng 3.33. Kết quả phân tích hàm lượng TTX sau khi tinh sạch bằng sắc ký Bio-gel P2.. 85
Bảng 3.34. Hàm lượng TTX trong các phân đoạn chứa độc từ cột Bio-Rex 70 (H+) ......... 86
Bảng 3.35. Tỷ lệ chuột chết ở các lô chuột......................................................................... 90

viii


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của TTX................................................................................... 2
Hình 1.2. Cấu trúc dạng Hemilactal của họ TTX.................................................................. 3
Hình 1.3. Cấu trúc dạng lacton của họ TTX ......................................................................... 3
Hình 1.4. Hai dạng tautome của Tetrodotoxin...................................................................... 3
Hình 1.5. Cấu trúc dạng 4,9-anhydro của họ TTX................................................................ 4
Hình 1.6. Sự khác biệt về cấu trúc của nhóm độc tố TTX ..................................................... 5
Hình 1.7. Màng với các kênh ion và ion natri đã bị hydrat hóa và TTX............................... 6
Hình 1.8. Một số lồi cá nóc biển chứa độc tố Tetrodotoxin .............................................. 10
Hình 1.9. Một số động vật biển khác chứa Tetrodotoxin .................................................... 11
Hình 1.10. Một số động vật trên cạn chứa Tetrodotoxin .................................................... 11
Hình 1.11. Cá nóc vằn Takifugu oblongus [6] .................................................................... 13
Hình 1.12. Cá nóc xanh chấm cam Torquigener pallimaculatus [6].................................. 14
Hình 1.13. Cá nóc đầu thỏ mắt to Lagocephalus lunaris [6].............................................. 15
Hình 2.1. Buồng trứng của cá nóc Torquigener pallimaculatus trong mùa sinh sản ........ 26
Hình 2.2. Phân tích TTX trên hệ thống HPLC .................................................................... 28
Hình 3.1. Sắc kí đồ của TTX từ cá nóc ................................................................................ 44
Hình 3.2. Sắc kí đồ của TTX chuẩn ..................................................................................... 44
Hình 3.3. Phổ khối lượng của TTX...................................................................................... 45
Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của TTX ........................................................................................ 45

Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của TTX ......................................................................................... 46
Hình 3.6. Phổ COSY của TTX ............................................................................................ 46
Hình 3.7. Phổ HMBC của TTX............................................................................................ 46
Hình 3.8. Cấu trúc TTX ở dạng Hemilactal ........................................................................ 48
Hình 3.9. Tỷ lệ % các chủng vi sinh vật phân lập được từ 3 lồi cá nóc độc đã lựa chọn . 49
Hình 3.10. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M3& M28 ............................................. 53
Hình 3.11. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M6......................................................... 54
Hình 3.12. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M8......................................................... 54
Hình 3.13. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M10....................................................... 55
Hình 3.14. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M19....................................................... 56
Hình 3.15. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M30....................................................... 57
Hình 3.16. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M37....................................................... 57
Hình 3.17. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M43....................................................... 58
Hình 3.18. Phổ khối của TTX tách từ cá nóc độc................................................................ 89
Hình 3.19. Phổ khối của TTX tách chiết từ vi sinh vật........................................................ 89
Hình 3.20. Phương trình tương quan tỷ lệ chuột chết với liều uống TTX ........................... 91
ix


MỞ ĐẦU
Tetrodotoxin (TTX) là một độc tố sinh học cực mạnh được chiết xuất chủ yếu từ cá
nóc độc, động vật biển và một số chủng vi sinh vật. Trong những năm gần đây, TTX đã
được nghiên cứu sử dụng làm thuốc gây tê, gây mê,... ở nhiều nước như Canada, Mỹ,
Trung Quốc.... Ở nước ta, Dư Đình Động và cộng sự nghiên cứu thành công việc sử dụng
TTX kết hợp với bài thuốc dân tộc cổ truyền để làm thuốc cai nghiện, đã được tiến hành
thử nghiệm trên các bệnh nhân cho kết quả khả quan [9].
Những năm trước đây, để đáp ứng được nhu cầu của thị trường, một số nghiên cứu
đã sinh tổng hợp TTX theo phương pháp hoá học. Tuy nhiên, giá thành của sản phẩm TTX
tổng hợp hóa học cao, độ tinh sạch thấp, khơng kinh tế bằng phương pháp tách chiết TTX
trực tiếp từ cá nóc độc. Vì vậy, TTX được tách chiết chủ yếu từ cá nóc độc hoặc động vật

biển. Do hàm lượng TTX từ cá nóc độc rất thấp (100kg trứng cá nóc độc mới tách chiết
được 1g TTX) nên giá thành của TTX rất cao. Hơn nữa, trữ lượng của các lồi cá nóc độc
ngày càng giảm, trong khi nhu cầu tiêu thụ TTX lại ngày càng tăng [93].
Gần đây, các nghiên cứu thu nhận TTX từ vi sinh vật đã mở ra một triển vọng mới
trong công nghệ sinh học. Hướng nghiên cứu cho phép chủ động sản xuất TTX trong
phịng thí nghiệm hoặc ở quy mơ cơng nghiệp, độ tinh sạch cao, giảm được giá thành,...
Xuất phát từ ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề
tài “Nghiên cứu công nghệ nuôi cấy và thu nhận Tetrodotoxin từ một số chủng vi
khuẩn phân lập từ cá nóc độc Việt Nam”.
* Mục tiêu nghiên cứu:
Xây dựng được quy trình cơng nghệ từ phân lập, ni cấy, tách chiết và xác định
tính chất, độc tính TTX của vi khuẩn.
* Nội dung nghiên cứu:
- Phân lập và lựa chọn chủng vi sinh vật sản sinh TTX từ cá nóc độc Việt Nam.
- Xây dựng quy trình cơng nghệ ni cấy vi khuẩn sinh TTX.
- Xây dựng quy trình cơng nghệ tách chiết và tinh sạch TTX từ dịch nuôi cấy vi khuẩn.
- Xác định tính chất và độc tính của TTX từ dịch ni cấy vi khuẩn.
* Những đóng góp mới của Luận án:
Lần đầu tiên ở Việt Nam, nghiên cứu có hệ thống về TTX từ vi khuẩn (từ phân lập,
nuôi cấy, tách chiết, tinh sạch và xác định tính chất của TTX từ vi khuẩn).

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. TETRODOTOXIN
Tetrodotoxin (TTX) là một chất độc sinh học, có hoạt tính sinh học cao, có bản chất
phi protein, khó bị phá hủy bởi nhiệt; là một hợp chất hữu cơ dị vịng, có cấu trúc lưỡng
cực, có liên kết nội phân tử với hemilactal và được phân loại như là một hợp chất
aminohydroquinazoline [23].

1.1.1. Công thức phân tử, cấu tạo hóa học của TTX
Tên tiếng Anh: Tetrodotoxin.
Công thức phân tử : C11H17N3O8.
Khối lượng phân tử: 319,28 g.mol−1

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của TTX

Các dẫn xuất tạo ra từ TTX: anhydrotetrodotoxin, 4-epitetrodotoxin, 6epitetrodotoxin, nor-tetrodotoxin, quinazolin, axit tetrodoic, ....
TTX được tách chiết đầu tiên từ loài cá nóc Nhật Bản, sau đó được tìm thấy ở
nhiều lồi cá nóc và một số lồi sinh vật khác. Cấu trúc của TTX được xác định lần đầu
tiên năm 1964 bởi Goto, Tsuda và Woodward [24, 74, 78].
Một số các nhà khoa học đã tiến hành tổng hợp TTX bằng con đường hóa học,
nhưng sản phẩm thu được có chất lượng chưa ổn định, độ tinh sạch không cao. Cùng với
sự phát triển của khoa học, các thiết bị phân tích hiện đại ra đời, các dẫn xuất của TTX đã
lần lượt được xác định cấu trúc và mối tương quan giữa cấu trúc và độc tính của chúng
[84].
Năm 1988, Yasumoto và cộng sự nghiên cứu cấu trúc của TTX tách chiết được từ
sa giông, cho thấy trên phổ NMR sự tồn tại ở 2 dạng tautome là hemilactal và lacton của
TTX. Giữa 2 dạng tautome này có sự chuyển hóa lẫn nhau (hình 1.4). Tỷ lệ giữa 2 tautome
tùy thuộc vào cấu trúc của từng dẫn xuất TTX [90].
2


Hình 1.2. Cấu trúc dạng Hemilactal của họ TTX

Hình 1.3. Cấu trúc dạng lacton của họ TTX

Hình 1.4. Hai dạng tautome của Tetrodotoxin

3

Hình 1.5. Cấu trúc dạng 4,9-anhydro của họ TTX

Theo Yamashita M.Y, phương pháp phân tích TTX có hiệu quả hiện nay là sử dụng
sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) có nối ghép detector huỳnh quang (FLD) hoặc detector
phổ khối lượng. Công cụ đắc lực nhất trong xác định cấu trúc TTX là phổ cộng hưởng từ
hạt nhân… [82].
1.1.2. Đặc tính của TTX
1.1.2.1. Tính chất hóa lý của TTX
a) Dạng tồn tại:
TTX tồn tại ở dạng tinh thể hoặc dạng bột màu trắng, có khối lượng phân tử
M=319,28 Da. Ở trạng thái tự do TTX tồn tại dạng hydrat C11H17O8N3.1/2 H2O (M =
328,28) [2, 82].
b) Nhiệt độ nóng chảy:
Tetrodotoxin có bản chất phi protein, không bị nhiệt phá huỷ, nấu chín hay phơi
khơ, sấy, độc chất vẫn tồn tại. Đun sơi (100oC) sau 6 giờ độc tính TTX bị giảm một nửa;
Muốn phá hủy hồn tồn độc tính TTX cần phải đun sôi ở 200oC trong 10 phút [1]. TTX
không bị nóng chảy ở nhiệt độ 2000C, khi tăng nhiệt độ TTX chuyển sang màu sẫm
(khoảng 2200C trở lên) nhưng vẫn khơng bị nóng chảy [35; 82].
c) Độ hịa tan:
TTX không tan trong dung môi hữu cơ, tan trong axit lỗng, tan nhẹ trong nước.
TTX khơng bền trong mơi trường kiềm và môi trường axit mạnh. Trong môi trường axit,
TTX chuyển thành hợp chất axit hydroclotetrodoic C11H17O8N3HCl; trong môi trường
4


kiềm, TTX chuyển thành hợp chất không no là axit anhydrotetrodoic C11H19O9N3. TTX thể
hiện tính bazơ yếu pKa = 8,76 [82].
d) Hấp thụ ánh sáng:

TTX không hấp thụ ánh sáng hồng ngoại với λ=1690-2000 cm-1, không hấp thụ cực
đại ở bước sóng trên 220 nm trong vùng tử ngoại [82].
1.1.2.2. Một số đồng phân phổ biến của TTX
TTX có rất nhiều đồng phân khác nhau, như: 4 epi-TTX, 6 epi-TTX, anhydro-TTX,
deoxy-TTX, axit tetrodotoic,.... Hoạt tính sinh học của các đồng phân của TTX có sự khác
nhau. Trong hỗn hợp TTX tách chiết được thường gồm TTX và hai đồng phân epi-TTX và
anhydro-TTX [74].
a) Epi-Tetrodotoxin (Epi-TTX):
Epi-TTX là một dạng dẫn xuất của TTX thuộc nhóm độc tố TTX, được tìm thấy
qua phân tích HPLC, có khối lượng phân tử là 319,28g/mol. Công thức phân tử là
C11H17N3O8 giống với TTX, điểm khác biệt là liên kết của nhóm OH- tại vị trí C4 có hướng
quay khác với cấu trúc của TTX. Epi-TTX khơng có độc tính như TTX [74, 101].
b) AnhydroTetrodotoxin (Anhy-TTX):
Anhy-TTX cũng là một dẫn xuất của TTX, theo các đỉnh trong biểu đồ phân tích
HPLC thì Anhy-TTX xuất hiện sau TTX và dẫn xuất 4 – Epi-TTX. Khối lượng phân tử là
301,253 g/mol và công thức phân tử là C11H15N3O7. Khác với cấu trúc TTX tại vị trí C4 và
C9 cùng liên kết với một nhóm OH-, anhy-TTX lại có cấu trúc tại 2 vị trí đó gắn với
ngun tử O. Anhy-TTX có độc tính kém hơn TTX [74, 102].

H
O

-

-

-

O

H
O
H
O O O
HH
O
+
N
4 H
N
H
O
H

O
10
9 H
O
O
OH
11 7 8OH8a
N2
H
1 + NH2
N 2
H
O
HO
6 5 4a 4 H
N3

H
OH HO

4-epiTTX

TTX

O

9 H
O
O OO
H

O
H

N
4 H
N
H

+ NH2

Anhy-TTX

Hình 1.6. Sự khác biệt về cấu trúc của nhóm độc tố TTX

1.1.3. Cơ chế gây độc của TTX
Sự vận chuyển những ion natri vào tế bào thần kinh là yếu tố cần thiết cho tính dẫn

truyền xung trong sợi thần kinh, xung bị kích thích và được dẫn truyền dọc theo sợi trục.
Thơng thường tế bào sợi trục thần kinh có nồng độ ion K+ cao, nồng độ Na+ thấp và có
điện thế âm. Sự kích thích có hiệu quả dẫn đến luồng ion Na+ từ ngoài màng tế bào đi vào
5


trong làm phát sinh điện thế hoạt động dương ở màng tế bào. Sự khử cực lan truyền dọc
theo dây thần kinh, dòng ion Na+ qua màng tế bào chiếm kênh ion Na+ (một kênh chọn lọc
những ion natri hơn là những ion kali theo thứ tự cường độ), giúp dẫn truyền tín hiệu qua
rron thần kinh [37].
Kênh Na+ được cấu tạo từ một chuỗi peptid đơn với bốn tiểu đơn vị lặp, mỗi đơn vị
bao gồm 6 xoắn xuyên màng (hình 1.7). Các lỗ xuyên màng được tạo thành khi 4 tiểu đơn
vị cuộn gấp trong một bó, với tâm là lỗ xuyên màng [37].

Hình 1.7. Màng với các kênh ion và ion natri đã bị hydrat hóa và TTX

TTX gắn với vị trí lỗ mở của kênh ion bên ngoài tế bào, một vài phân tử TTX gắn
với vị trí lỗ màng mở của kênh ion, tạm thời làm mất khả năng vận chuyển của kênh ion
[47]. Có hai loại kênh điện thế natri khác nhau trong tế bào của các mô con người: kênh
điện thế Na+ nhạy cảm TTX (kênh TTX-s Na+) và kênh điện thế natri kháng TTX (kênh
TTX-r Na+). TTX gắn với kênh TTX-s Na+ với một liên kết có ái lực 5-15 nanomolar,
trong khi kênh TTX-r Na+ liên kết TTX với ái lực thấp micromolar. Tế bào chứa những
kênh TTX-r Na+ có chủ yếu là ở trong mô tim, trong khi những tế bào thần kinh chứa
những kênh TTX-s Na+ chiếm ưu thế lúc nghỉ ngơi của con người. Các kênh TTX-s bị bất
hoạt nhiều hơn kênh TTX-r ở điện thế nghỉ. Trong khi kênh vận chuyển ion natri của tế
bào mơ cơ có xu hướng đối kháng với TTX thì tế bào thần kinh lại rất nhạy cảm với TTX
[65, 70].
Với một số lượng đủ lớn, TTX bám giữ lấy phức hợp kênh Na+, chiếm giữ những
vị trí nhận ở kênh Na+, ngăn khơng cho ion natri có cơ hội vào kênh cho đến khi nó khuếch
tán chậm rồi ngừng hẳn, làm rối loạn hoạt động khử cực của màng tế bào thần kinh (thay

đổi đột ngột điện thế màng), và tác động dọc theo dây thần kinh làm phong bế dẫn truyền
các xung động thần kinh. TTX phong bế chọn lọc lên các kênh vận chuyển ion natri do vậy
ngăn chặn dẫn truyền tín hiệu trên các sợi thần kinh vận động và cảm giác dẫn đến liệt.
Thực tế TTX ngăn cản sự vận chuyển những ion natri vào bên trong màng tế bào thần kinh
và mô cơ ở nồng độ thấp 10-7-10-9 M [68, 73].
Khi nghiên cứu tế bào của chuột, cho thấy dưới tác dụng của TTX, màng tế bào bị
khử cực và kênh vận chuyển ion natri bị đóng, làm cho q trình truyền thơng tin cũng như
q trình trao đổi chất của tế bào bị dừng lại. TTX có tác dụng trực tiếp vào sợi trục của tế
6


bào thần kinh cơ, rồi đến khớp nối của tế bào thần kinh và tác dụng vào trung tâm sợi cơ.
Sự tiếp nhận cholinergic trên các hạch độc lập, tuyến thượng thận khơng bị tác động bởi
TTX, chúng có phản ứng bình thường với acetylcholin khi có mặt TTX. Điều này cho thấy
trước tiên TTX tác dụng vào tế bào thần kinh vận động tiếp đó mới tác động đến tế bào
thần kinh cảm giác. Khi sử dụng TTX ở nồng độ cao sẽ làm mất khả năng phản xạ của thần
kinh đối với những kích thích mạnh. Các kênh dẫn truyền của tế bào thần kinh chỉ bị ngăn
cản ở nồng độ TTX cao hơn 1µM. Ở các tế bào tim, tác dụng kìm hãm của TTX có hiệu
quả khi tác dụng ở nồng độ thấp hơn tùy thuộc vào con đường đưa TTX vào tế bào. Đối
với tế bào thần kinh của vỏ não trong môi trường nuôi cấy, kênh vận chuyển ion natri bị
ngừng hoạt động ở ngay nồng độ thấp hơn 0,1 µM [2].
Nếu tetrodotoxin là một độc tố mạnh, tại sao lại không gây độc cho vật chủ? Các
nghiên cứu cho thấy, kênh vận chuyển Na+ trong vật chủ có cấu tạo khác với những động
vật khác, ở vật chủ kênh Na+ không nhạy cảm với độc tố TTX. Điều đó được chứng minh
ở một trong các lồi cá nóc: gen mã hóa protein của kênh ion natri bị đột biến làm thay đổi
trình tự axit amin làm cho kênh này không nhạy cảm với tetrodotoxin. Đột biến điểm này
có lợi cho cá nóc, cho phép cá nóc kết hợp chặt chẽ với vi sinh vật cộng sinh, sử dụng độc
tố do vi sinh vật sinh ra vào mục đích phịng vệ [77, 81].
1.1.4. Ứng dụng của TTX
Trong những năm gần đây, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu tìm hiểu, khai thác và

sử dụng các chất có hoạt tính sinh học cao từ sinh vật biển như: prolactin, oxytoxin,
progesteron, estrion, các axit amin, aldosteron,... và đặc biệt là các chất độc sinh học
(biotoxin) phục vụ nền kinh tế quốc dân.
TTX là một trong số các chất độc sinh học có hoạt tính sinh học cao (là chất độc
thần kinh rất mạnh), không chỉ được sử dụng trong khoa học để nghiên cứu sự vận chuyển
ion Na+ qua màng tế bào, mà còn được sử dụng để điều chế thuốc gây tê, gây mê và thuốc
kích thích sự hoạt động của hệ tuần hồn, điều trị một số bệnh hiểm nghèo như các bệnh
về tim mạch, ung thư, HIV-AIDS, làm thuốc cai nghiện...
1.1.4.1. Một số ứng dụng của TTX
Thứ nhất, Tetrodotoxin (TTX) có tác dụng kích thích hoạt động của hệ tuần hồn,
làm thay đổi nhịp tim, thay đổi trương lực của thành mạch, dẫn đến sự thay đổi huyết áp.
Sử dụng TTX với liều lượng 1,3.10-3 mg/kg có hiệu quả phịng ngừa các trạng thái xơ cứng
động mạch. TTX còn được sử dụng để bào chế các loại thuốc đặc trị chữa bệnh huyết áp,
rối loạn nhịp tim [19].
Thứ hai, TTX làm giảm tính thấm của màng tế bào đối với việc vận chuyển ion Na+
mà khơng ảnh hưởng đến q trình vận chuyển ion K+, trong khi đó các thuốc gây tê khác
lại có tác dụng đối với cả 2 kênh vận chuyển này. Điều này rất có ý nghĩa trong việc
nghiên cứu sinh lý màng tế bào [28].
7


Thứ ba, TTX được dùng để điều chế thuốc gây tê, gây mê trong phẫu thuật. Ngoài
những tác dụng gây tê giống thuốc: novocain, procain, cocain, TTX có nhiều ưu điểm hơn
ở khả năng gây tê tại chỗ và tác dụng mạnh hơn nhiều so với thuốc gây tê khác. Ví dụ: để
kìm hãm hoạt động của hệ thần kinh bằng cocain phải cần đến nồng độ 500mg, trong khi
đó TTX chỉ cần 0,03mg (hiệu quả tác dụng của TTX mạnh gấp 60.000 lần cocain) [33].
Thứ tư, TTX còn được dùng như thuốc giảm đau, khi sử dụng TTX với liều lượng
rất nhỏ có khả năng cắt cơn đau của những bệnh nhân ung thư gan ở giai đoạn cuối. Công
ty International Wex Technologies (Canada) đã sử dụng TTX để chế ra Tectin (thuốc giảm
đau), Tocudin (thuốc gây tê), và Tetrodin (thuốc cai nghiện ma túy) - một vài loại thuốc

giúp bệnh nhân ung thư vượt qua được những cơn đau hoặc giúp con nghiện heroin cắt
cơn. Các thử nghiệm ban đầu khi sử dụng thuốc cho kết quả khả quan. Theo các chuyên
gia, các thuốc này có thể ngăn chặn tế bào thần kinh chuyển tín hiệu đau đến não, chúng
khác với các thuốc giảm đau khác ở chỗ nó khơng gây ra tác dụng phụ như morphin,
khơng xung đột với các loại thuốc khác và cũng không gây nghiện [71].
Ở Việt Nam đã nghiên cứu thành công biệt dược Thiên Thanh Hoàn sử dụng cho
cai nghiện ma tuý. Mỗi viên nhộng Thiên Thanh Hồn có chứa tối đa 0,1 miligam TTX và
một số vị thuốc Đông y khác [9].
Thứ năm, nghiên cứu của Lesort cho thấy TTX có khả năng liên kết với protein của
HIV, đặc biệt là gp-120, gp-120 là thụ thể hay móc bám của HIV gắn được vào thụ thể tế
bào người, đặc biệt là những tế bào Lympho T có thụ thể CD4, từ đó hệ gen của HIV khơng
được chuyển vào trong tế bào... dẫn đến hệ gen của HIV không thể gắn được vào hệ gen
của người và không làm tan tế bào người. Vì vậy, người bị nhiễm HIV khơng thể phát triển
thành AIDS được. Đây chính là tín hiệu đáng mừng cho quá trình đi tìm thuốc điều trị căn
bệnh thế kỷ HIV-AIDS [34].
1.1.4.2. Một số tác dụng có hại của TTX
TTX khơng chỉ có tác dụng có lợi, cũng như nhiều biệt dược khác, nếu sử dụng
không đúng cách, đúng liều lượng hoặc đúng mục đích TTX sẽ trở thành độc dược, có tác
hại khơn lường đến sức khoẻ con người, có thể gây tử vong.
Đối với hệ thần kinh của người và động vật, TTX có khả năng ngăn chặn điện thế
hoạt động của sợi trục thần kinh dẫn đến sự thay đổi điện tích Na+ trên bề mặt của tế bào
thần kinh, làm cho điện thế hoạt động của cơ bị ức chế và hệ thống thần kinh bị suy yếu.
Tùy vào liều lượng độc tố TTX nhiều hay ít mà gây ra hậu quả khác nhau, nhẹ thì gây cảm
giác chống váng, nơn mửa, co giật giữ dội, sau đó bất tỉnh vài ngày, nặng thì rối loạn hô
hấp và gây tử vong... [50, 59].
Khi tác dụng vào tế bào thần kinh, TTX giống như xung điện gây kích thích mạnh,
làm hưng phấn quá mức dẫn đến ion Na+ được kích thích tạo ra với một lượng dư thừa
trong tế bào. Ion Na+ không được vận chuyển ra ngoài tế bào và tập trung nhiều ở phần đầu
mút dây thần kinh, dẫn đến ảnh hưởng tới phản ứng truyền dẫn xung của tế bào thần kinh
8

cảm giác, đồng thời làm cho màng tế bào bị khử cực, làm đóng kênh vận chuyển ion, gây
ức chế hệ thống thần kinh [58].
Nhìn chung, tác dụng có lợi của TTX đối với con người khá rõ và nổi bật. TTX đã và
đang được sử dụng rộng rãi trong y dược, nhu cầu sử dụng TTX không chỉ ở Việt Nam mà
trên thế giới cũng ngày càng tăng. Hiện nay, lượng TTX được tách chiết, tinh chế từ động
vật biển, đặc biệt là cá nóc cịn ít. Do vậy, hướng nghiên cứu thu nhận TTX từ vi sinh vật
có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao.
1.1.4.3. Triển vọng ứng dụng TTX ở Việt Nam
TTX là thành phần quan trọng trong các liệu pháp cai nghiện, chữa ung thư, HIV
hoặc sử dụng làm thuốc giảm đau. Những nhóm liệu pháp này tạo ra nhu cầu sử dụng TTX
rất lớn ở Việt Nam, đòi hỏi một nguồn cung cấp TTX dồi dào. Theo thống kê 6 tháng đầu
năm 2012 của Bộ Lao động – Thương binh và Xã hội Việt Nam, có 171.400 người nghiện
ma tuý đã được quản lý hồ sơ trong cả nước, con số thực tế khoảng hai lần số liệu thống
kê, nghĩa là có khoảng gần 350.000 người nghiện ma túy trong cả nước [1]. Giả sử để cai
nghiện cho số người nghiện này; mỗi người sử dụng 02 viên thuốc biệt dược Thiên Thanh
Hoàn trong một ngày và quá trình điều trị kéo dài trong 10 ngày thì nhà sản xuất phải sử
dụng ít nhất 650 gam TTX để phối trộn cùng một số vị thuốc Đông y. Để sản xuất một
lượng TTX như vậy, cần có ít nhất 65 tấn trứng cá nóc độc, hay khoảng 6.500 tấn cá nóc
độc (trứng chiếm khoảng 5-10% trọng lượng cá nóc) [6, 9]. Đây là vấn đề khó có thể thực
hiện thành cơng ở nước ta.
Trữ lượng cá nóc trên tồn vùng biển Việt Nam (theo ước tính năm 2005 là khoảng
37.387 tấn). Trong đó họ cá nóc Tetraodontidae chiếm khoảng 84,7% tổng trữ lượng. Đây
là nguồn nguyên liệu tiềm tàng để tách chiết TTX. Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu này đang
bị chia sẻ bởi việc thu mua của các thương gia Trung Quốc và Hàn Quốc, trong khi Chính
phủ Việt Nam vẫn chưa gỡ bỏ lệnh cấm khai thác, buôn bán, vận chuyển và chế biến cá
nóc. Bởi vậy, việc thu mua, xử lý và chiết xuất TTX từ một lượng lớn cá nóc 6.500 tấn là
hầu như không thể thực hiện, xét về mặt kinh tế và xã hội. Rõ ràng, bên cạnh nguồn
nguyên liệu triển vọng là cá nóc, cần tìm kiếm những nguồn nguyên liệu khác để sản xuất

TTX. Hướng nghiên cứu sản xuất TTX từ vi sinh vật là hướng nghiên cứu đang được nhiều
nước trên thế giới nghiên cứu [6].

1.2. NGUỒN THU NHẬN TTX
1.2.1. TTX từ động vật biển
Trên thực tế, TTX có ở nhiều động vật khác nhau như: bạch tuộc đốm xanh, ếch,
cua Xanthid, ốc biển, cá bống vân mây, cá nóc, nhuyễn thể,.... TTX được phát hiện đầu
tiên vào năm 1950 từ trứng của lồi cá nóc ở Nhật Bản và được gọi là spheroidine [91].
Sau đó độc tố spheroidine được đổi tên là TTX và được các nhà độc tố học dùng làm tên
chung cho đến ngày nay.
9


Từ cuối những năm 1960 trở đi, TTX được tách từ nhiều nguồn khác nhau ở các
loài động vật khác nhau. Trong một thời gian dài, nguồn gốc TTX là vấn đề còn nhiều bàn
cãi. Năm 1964, khi Mosher và cộng sự đã tách được độc tố tarichatoxin từ sa giơng và một
số lồi sinh vật khác và chứng minh tarichatoxin chính là TTX [49]. Năm 1966,
Trishananda và cộng sự đã công bố 4 trường hợp bị ngộ độc thực phẩm do ăn phải trứng
sam ở Thái Lan, điều này sau đó được khẳng định do trứng sam có chứa TTX [73]. Năm
1976, TTX cịn được tìm thấy ở da ếch (Atelopus chiriquiensis) thuộc Costa Rica [31, 60],
ở loài bạch tuộc xanh (Hapalochlaena maculosa, Octopus maculosus), cá nóc biển [27, 66,
67, 69].

Tetraodon sp

Arothron meleagris

Fugu sp

Fugu sp

Fugu sp

Fugu sp

Hình 1.8. Một số lồi cá nóc biển chứa độc tố Tetrodotoxin

Một số động vật biển khác cũng chứa Tetrodotoxin gồm sao biển (Astropecten
scoparius), cua xanthid mắt đỏ (Eriphia.sp.), cua hình móng ngựa (Carcinoscorpius
rotundicauda), 2 loài cua Philippine (Zosimus aeneus và Atergatis floridus), một số ốc sên
biển, động vật thân mềm (Nassarius sp) [15, 23, 39, 57, 90].

Cua xanthid mắt đỏ
(Eriphia.spp)

Bạch tuộc tua xanh
Australia
(Hapaloclaena maculosa)

Cá bống

10


Ốc tù và

Sao biển

Tảo độc

Nhuyễn thể

Sam

Vi khuẩn

Hình 1.9. Một số động vật biển khác chứa Tetrodotoxin

Ngoài sinh vật biển, một số sinh vật trên cạn bao gồm ếch Harlequin (Atelopus
sp.), các lồi sa giơng thuộc chi Taricha (Taricha torosas, Taricha rirularis, T.granulosa)
và chi Diemictylus, các lồi thuộc họ Salamandridae (Kì giơng), lồi chân bụng Gastropod
charonia saulinae cũng có chứa TTX [54, 87; 89].

Hai lồi ếch Harlequin (Atelopus sp.)

Sa giơng Taricha granulosa

Hình 1.10. Một số động vật trên cạn chứa Tetrodotoxin

TTX tập trung nhiều ở trong gan, trứng, cơ quan sinh sản, ví dụ ở lồi Spheroides
niphobles (cá nóc Takifugu niphobles hoặc Fugu niphobles) TTX có trong gan (1000µg/g),
trong trứng (400µg/g), trong da (40µg/g). Tuy nhiên, hàm lượng TTX ở cá nóc độc khơng
chỉ phụ thuộc vào lồi, vào từng cơ quan, từng loại mơ mà hàm lượng TTX cịn phụ thuộc
theo mùa, thông thường vào mùa sinh sản và đẻ trứng thì hàm lượng TTX là rất lớn [43].
TTX có ở nhiều động vật khác nhau, nhưng nguồn thu TTX chủ yếu vẫn từ các lồi
cá nóc biển độc. Theo số liệu thống kê của Nguyễn Văn Lệ, trên thế giới có khoảng 246
lồi cá nóc bao gồm cả cá nóc nước mặn và nước ngọt với sản lượng tương đối cao. Ở Việt
Nam có khoảng 60 lồi cá nóc nhưng mới thu thập, mô tả, nhận dạng được 37 lồi cá nóc
nước mặn, trong đó có 7 lồi độc mạnh, 10 lồi độc ở một số mơ, với trữ lượng khoảng
11

40.000 tấn. Đây chính là lý do cá nóc biển độc được chọn là nguyên liệu thu nhận TTX ở
nhiều quốc gia [6].
Mặc dù, cá nóc có trữ lượng lớn, phân bố rộng rãi khắp các vùng biển, nhưng
nguồn nguyên liệu từ cá nóc vẫn phụ thuộc rất nhiều vào tự nhiên. Khơng phải lồi cá nóc
nào cũng chứa hàm lượng độc tố cao, không phải mùa nào, giai đoạn sinh trưởng nào cũng
chứa độc tố [6]. Do đó, việc tìm kiếm nguồn ngun liệu thay thế để có thể chủ động trong
việc sản xuất TTX lại là vấn đề được nhiều nhà khoa học quan tâm hơn cả. Đặc biệt, khi có
nhiều nghiên cứu khẳng định TTX có nguồn gốc từ vi sinh vật sống cộng sinh với các động
vật khác nhau. Đây sẽ là một hướng nghiên cứu tương đối mới cả trên thế giới và ở Việt
Nam.
1.2.1.1. Cá nóc vằn Takifugu oblongus
Họ Tetraodontidae, họ phụ Tetraodontinae
Tên địa phương: Cá nóc, cá nóc hổ, cá nóc trần, cá nóc bơng
Tên tiếng Anh: Lattice blaasop
a) Đặc điểm hình thái:
Gai nhỏ phân bố ở mặt lưng, mặt bụng nối liền với hai bên thân ở phía trước khe
mang và phía sau vây ngực. Gai khơng có ở hai bên bắp đi. Trên cơ thể có đường bên và
đường gờ ngăn cách mặt bên và mặt bụng. Khe miệng thấp hơn rìa trên gốc vây ngực. Trên
đầu và lưng màu nâu với các chấm vàng nhạt lớn nhỏ không đều. Hai bên đầu, lưng có
nhiều vân màu nâu và màu vàng nhạt xen kẽ như da hổ. Phía cuối lưng và trên bắp đi,
các vân này có dạng hình chữ V nằm vắt ngang qua. Vây ngực, vây đi có màu vàng tươi.
Mặt bụng màu trắng [6].
b) Đặc điểm sinh học:
Loài cá nóc vằn Takifugu oblongus có kích thước tương đối lớn, khoảng 15 – 25
cm, chiều dài tối đa 40 cm, ăn tạp, thường sống đáy của vùng nước mặn và lợ, ở các vùng
nước ven bờ, cửa sông và bãi triều. Đồng thời, cũng bắt gặp chúng ở các khu rừng ngập
mặn [6].
c) Phân bố:

Theo số liệu thống kê của Fishbase, lồi cá nóc độc Takifugu oblongus phân bố ở
vùng biển Ấn Độ – Thái Bình Dương: Nam Phi, Ấn Độ, Sri Lanca, Australia, Indonesia,
Malaysia, Philippin, Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Hàn Quốc [99].
Ở Việt Nam: Loài cá nóc vằn Takifugu oblongus thường gặp, phân bố ven bờ biển
từ Bắc vào Nam [6].
d) Tính độc: Theo kết quả phân tích độc tố cho thấy thịt, da, mật, tinh sào độc nhẹ. Gan,
ruột độc mạnh; trứng độc rất mạnh [6].

12


Hình 1.11. Cá nóc vằn Takifugu oblongus [6]

1.2.1.2. Cá nóc xanh chấm cam Torquigener pallimaculatus
Họ Tetraodontidae, họ phụ Tetraodontinae
Tên địa phương: Cá nóc chấm cam, cá nóc mít
Tên tiếng Anh: Rusty spotted toadfish
a) Đặc điểm hình thái:
Gai trên thân nhỏ, tương đối ngắn, nằm sát vào da và thưa. Gai ở mặt lưng, mặt bụng
nối liền với nhau ở hai bên thân phía trước khe mang và phía sau vây ngực, nhưng khơng
có ở khoảng giữa vây lưng và vây hậu môn. Đường gờ ngăn cách mặt bên và mặt bụng nổi
thành cạnh rõ ràng. Mõm tù, cằm thẳng đứng và khe miệng cao hơn hoặc bằng rìa trên gốc
vây ngực. Đầu và mặt lưng có các chấm nâu nhỏ phân bố dày đặc, chúng sắp xếp tạo ra
một số hoa trịn, màu trắng, có kích thước lớn hơn chúng. Các hoa đó phân bố rải rác và
khá đều trên mặt lưng. Dọc hai bên thân có một số chấm nâu lớn, phân bố rải rác và không
xếp thẳng hàng trên nền xám nâu. Rìa sau vây đi màu đen [6].
b) Đặc điểm sinh học:
Cá nóc Torquigener pallimaculatus có chiều dài thường bắt gặp khoảng 13 – 18
cm, tối đa là 22 cm. Loài này sống ở đáy, ven bờ và là loài ăn tạp [6].
c) Phân bố:

Theo số liệu thống kê của Fishbase, lồi cá nóc độc Torquigener pallimaculatus phân
bố ở vùng biển nhiệt đới và thường gặp ở vùng biển Tây Thái Bình Dương như : vùng Tây
bắc Australia, ở quanh đảo Chesterfield, New Caledonia. Ngoài ra, chúng cũng được tìm
thấy ở Papua New Guinea [100].
Ở Việt Nam: Loài Torquigener pallimaculatus thường gặp ở vùng biển ven bờ
Trung bộ. Vùng biển đơng Nam bộ ít gặp hơn [6].
d) Tính độc: Theo kết quả phân tích độc tố cho thấy mật, tinh sào độc nhẹ; thịt, da độc
mạnh; còn gan, ruột, trứng độc rất mạnh [6].

13


Hình 1.12. Cá nóc xanh chấm cam Torquigener pallimaculatus [6]

1.2.1.3. Cá nóc đầu thỏ mắt to Lagocephalus lunaris
Họ Tetraodontidae, họ phụ Tetraodontinae
Tên địa phương: Cá nóc, cá nóc đầu thỏ mắt to, cá nóc vàng, cá nóc xanh.
Tên tiếng Anh: Green rough-backed puffer, Rough Golden Toadfish
a) Đặc điểm hình thái:
Thân hình trứng kéo thon dài phía sau. Lưng và bụng có gai nhỏ. Gai ở mặt lưng
phân bố dạng hình bầu dục, bắt đầu từ đỉnh đầu kéo đến tận gốc vây lưng. Mặt bụng thì gai
phân bố từ cằm cho đến phía trước lỗ hậu mơn. Mỗi bên thân có một đường gờ ngăn cách
mặt bên và mặt bụng. Lưng và đầu có màu xám lục. Vây hậu mơn, mặt bụng và hai bên
thân dọc gờ bụng màu trắng. Vây ngực, vây lưng, nửa trên vây đi, phía dưới sau mắt và
dọc hai bên của lưng thân đều có màu vàng tươi, nửa dưới của vây đi có màu xám nhạt.
Lỗ mang màu trắng [6].
b) Đặc điểm sinh học:
Loài cá nóc độc Lagocephalus lunaris có chiều dài dao động từ 10 – 25 cm, tối đa
khoảng 50 cm. Trong đó, nhóm chiều dài 13 – 15 cm chiếm tỷ lệ cao trong sản lượng,
chiều dài thành thục khoảng 25 cm. Đây là lồi cá dữ, ăn tạp, thường có tập tính sống đáy

ở cả vùng nước lợ và nước mặn ven bờ biển hay vùng cửa sông thuộc vùng nước nhiệt đới
[6].
c) Phân bố:
Lồi cá nóc độc Lagocephalus lunaris phân bố ở biển Đỏ, vịnh Petsit, Nam Phi, Sri
Lanca, Ấn Độ, Australia, Indonesia, Malaysia, Philippin, Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc,
Nhật Bản ngồi ra cịn phân bố dọc theo phía đơng thềm lục địa Châu Âu đến phía tây Thái
Bình Dương và ở vùng biển Nam Đại Tây Dương [98].
Ở Việt Nam: Lồi cá nóc độc Lagocephalus lunaris khá thường gặp, phân bố khắp
vùng biển Việt Nam [6].
d) Tính độc: Theo kết quả phân tích độc tố cho thấy da, mật độc nhẹ; nhưng thịt, gan, ruột,
tinh sào độc mạnh; còn trứng độc rất mạnh [6].

14