Bài tập 12

Bài tập 12.1: Xây dựng quy trình xác định hoạt độ enzym nattokinase trong một chế
phẩm viên uống chứa nattokinase (nhóm tự chọn chế phẩm)
Sản phẩm lựa chọn: NattoEnzym

Chọn đơn vị tính

Hộp
Vỉ
Viên

Danh mục

Thần kinh não

Dạng bào chế

Viên nang

Quy cách

Hộp 3 Vỉ x 10 Viên

Xuất xứ thương
hiệu

Việt Nam

Nhà sản xuất

DƯỢC HẬU GIANG

Thành phần

Nattokinase, Microcrystalline cellulose, Magnesi stearat

Mô tả ngắn

NattoEnzym hỗ trợ hoạt huyết, tăng tuần hồn máu, giảm nguy cơ hình
thành cục máu đông, giảm nguy cơ xây xẩm mặt mày do lưu thông máu
kém. Hỗ trợ giảm nguy cơ tắc mạch, đột quỵ do huyết khối.

. Phương pháp chiết tách, tinh sạch và kết tinh enzym nattokinase từ NattoEnzym
3.1.Chiết tách enzym nattokinase
Loại bỏ nang mềm, thu lấy phần dịch lỏng.
Chiết xuất phân đoạn ethanol và kết tủa nattokinase:

Thêm hai lần thể tích ethanol 50% vào dịch lỏng, lắc ở 200 vòng/phút và 37 oC trong 1 giờ. Sau khi ly tâm ở 10000
vịng/phút trong 10 phút, phần nổi phía trên được thu thập và ethanol được thêm vào phần nổi phía trên để đạt được
nồng độ cuối cùng là 75% để kết tủa nattokinase.
3.2. Kết tinh enzym nattokinase
Tiến hành kết tinh enzym nattokinase trong dung dịch (NH 4)2SO4. Quá trình kết tinh có thể tiến hành từ từ kéo dài
vài ngày thậm chí hàng tuấn nếu muốn nhận được các tinh thể tinh khiết hơn.
Thêm muối (NH4)2SO4 vào dung dịch enzym nattokinase đậm đặc cho đến khi làm vẫn đục nhẹ dung dịch. Sau đó
đặt dung dịch vào một nơi, đồng thời tăng rất từ từ nồng độ muối trong dung dịch.


Có thể tiến hành tăng nồng độ muối theo nhiều cách, thêm dung dịch muối đậm đặc hơn vào dung dịch enzym
nattokinase theo từng giọt, thêm muối qua màng bán thấm hoặc có thể cho bay hơi chậm chạp dung dịch enzym
nattokinase.Trong q trình kết tinh có thể thay đổi chỉ số pH hoặc nhiệt độ. [1]
4. Xác định hoạt độ enzym
Phương pháp: Quang phổ hấp thụ phân tử

4.1 Nguyên tắc của phương pháp
Dưới tác dụng của thrombin, fibrinogen dạng hịa tan chuyển thành fibrin khơng hịa tan, Nattokinase thúc đẩy q
trình giáng hóa fibrin tạo các sản phẩm giáng hóa của fibrin (FDP).
Phân tích gián đoạn: cho Nattokinase tác dụng với cơ chất sau một khoảng thời gian xác định thì làm ngừng phản
ứng enzyme bằng acid tricloacetic 0,2M và sau đó đo lượng cơ chất cịn lại bằng phương pháp đo độ hấp thụ của dd
ở bước sóng 275nm [7].
4.2. Cách tiến hành
Nattokinase được hòa tan và pha loãng với dung dịch pha loãng (2mM Calci sulfat dihydrate (CaSO 4.2H2O) +
10mM NaCl và 0,005%Triton X-100). Với cả mẫu trắng và mẫu thử, ủ 1,4mL đệm Natri borat 50mM với 0,4mL
dung dịch fibrinogen 0,72% trong 5 phút.
Sau đó, thêm 0,1mL thrombin 20U/mL vào hai ống và trộn đều.
Sau 10 phút, thêm 0,1mL dung dịch nattokinase vào mẫu thử và ủ với thời gian 60 phút và nhiệt độ 40°C. Thêm
2,0mL acid tricloacetic 0,2M để dừng phản ứng, thêm 0,1mL dung dịch nattokinase vào mẫu trắng và ủ thêm 20
phút. Các mẫu được li tâm với tốc độ 6000rpm trong 5 phút và độ hấp thụ của dịch nổi trên bề mặt được đo ở bước
sóng 275nm so với nước cất.
Hoạt tính tiêu sợi huyết của nattokinase được tính theo cơng thức sau:

Trong đó:

AT

:

độ hấp thụ của dung dịch mẫu

AB

:

độ hấp thụ của dung dịch trắng

T

:

thời gian phản ứng (phút)

V

:

thể tích dịch chiết nattokinase (mL)

m

:

khối lượng mẫu thử (g)

D

:

hệ số pha loãng


Một đơn vị (1FU) của hoạt độ nattokinase được định nghĩa là lượng enzym làm tăng độ hấp thụ của dịch lọc ở bước
sóng 275nm thêm mỗi 0,01 phút trong các điều kiện quy định. [6]
Đo lượng hoạt động được thực hiện trong ba lần lặp lại. Hoạt độ được đo lường được so sánh với hoạt độ được gắn
nhãn để ước lượng chất lượng của sản phẩm.