nghiên cứu chế tạo kit phát hiện nhanh aflatoxin b1 trong thức ăn chăn nuôi

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
VIỆN THÚ Y

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI CẤP BỘ

Tên đề tài:NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KIT PHÁT HIỆN NHANH
AFLATOXIN B1 TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI VÀ AFLATOXIN
M1 TRONG SỮA TƢƠI

Cơ quan chủ quản: Bộ Nơng nghiệp và Phát triển Nơng thơn
Cơ quan chủ trì: Viện Thú y
Chủ nhiệm đề tài: Phạm Thị Ngọc
Thời gian thực hiện: 36 tháng

HÀ NỘI – 2020



DANH SÁCH NHỮNG NGƢỜI THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

TT

Họ và tên

Cơ quan/tổ chức

1

TS. Phạm Thị Ngọc

Viện Thú y

2

Ths. Trƣơng Thị Quý Dƣơng

Viện Thú y

3

TS. Nguyễn Thị Bích Thủy

Viện Thú y

4

TS. Nguyễn Thị Lan Anh

Viện Thú y

5

TS. Nguyễn Thị Thu Hằng

Viện Thú y

6

BSTY. Trần Thị Nhật

Viện Thú y

7

PGS.TS. Trƣơng Quốc Phong

ĐHBK HN

8

PGS.TS. Khuất Hữu Thanh

ĐHBK HN

9

TS. Nguyễn Tiến Thành

ĐHBK HN

10

ThS. Đỗ Thị Thu Hà

ĐHBK HN

11

KTV. Nguyễn Hồng Minh

12

ThS. Trần Thị Thu Hằng

Viện Thú y
Viện Thú y

Chữ ký


Tóm tắt kết quả thực hiện đề tài
Nƣớc ta là một nƣớc nhiệt đới với khí hậu nóng ẩm nên sẽ là điều kiện thuận lợi
cho các loài nấm mốc phát triển, trong đó có lồi Aspergillus flavus có khả năng
sinh độc tố Aflatoxin cao. Do đó nguy cơ nhiễm độc tố này trong chuỗi các sản
phẩm nông sản, thức ăn chăn nuôi, sữa và các sản phẩm từ vật ni là rất cao. Vì
Aflatoxin là một độc tố nguy hiểm nên việc kiểm tra sự có mặt của độc tố này trong
các sản phẩm nêu trên là rất cần thiết. KIT thử nhanh dạng que thử là một trong số
các công cụ hữu hiệu đƣợc sử dụng để phát hiện Aflatoxin. Phƣơng pháp này có
nhiều tính năng ƣu việt nhƣ nhanh, đơn giản, có thể sử dụng tại hiện trƣờng, giá
thành thấp hơn các phƣơng pháp khác. Tuy nhiên, hiện nay chúng ta hoàn toàn phải
nhập ngoại loại sinh phẩm này. Nghiên cứu tạo que thử nhanh có khả năng phát
hiện Aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi và sữa tƣơi là một hƣớng nghiên cứu mới tại
Việt Nam và là một bƣớc đột phá trong ứng dụng công nghệ nano kết hợp với hóa
sinh miễn dịch để tạo que thử nhanh. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng xây
dựng quy trình và tự sản xuất kháng nguyên, kháng thể đạt yêu cầu để tạo que thử.
Từ đó, chế tạo đƣợc que thử phát hiện đƣợc 5ppb Aflatoxin B1 trong thức ăn chăn
nuôi và 5ppb Aflatoxin M1 trong sữa tƣơi với độ nhạy và đô đặc hiệu cao. Việc tự
sản xuất đƣợc các thành phần quan trọng của que thử sẽ giúp chủ động đƣợc nguồn
nguyên vật liệu, kiểm soát chất lƣợng đầu vào, giảm chi phí sản xuất dẫn tới giảm
giá thành đƣợc sản phẩm.

1


MỤC LỤC
MỤC LỤC .............................................................................................................. 2
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... 6
ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................................... 1
MỤC TIÊU ĐỀ TÀI ................................................................................................ 3
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN ....................................................... 4
1.1.

Lịch sử phát hiện Aflatoxin ............................................................................................ 4

1.2.

Điều kiện sản sinh Aflatoxin .......................................................................................... 5

1.3.

Đặc điểm của Aflatoxin ................................................................................................. 6

1.3.1.

Cấu trúc hóa học và phân loại................................................................................. 6

1.3.2.

Tính chất hóa học và tính chất vật lý ...................................................................... 9

1.3.3.

Sự chuyển hóa và bài tiết Aflatoxin ......................................................................10

1.3.4.

Độc tính của Aflatoxin ..........................................................................................13

1.4.

Tình hình nhiễm độc Aflatoxin trên thế giới và ở Việt Nam ..........................................15

1.4.1.

Trên thế giới .........................................................................................................15

1.4.2.

Tại Việt Nam ........................................................................................................16

1.5.

Quy định hiện hành về Aflatoxin ..................................................................................19

1.6.

Các phƣơng pháp loại bỏ và kiểm sốt Aflatoxin ..........................................................19

1.7.

Các dung mơi tách chiết Aflatoxin ................................................................................21

1.8.

Các phƣơng pháp phát hiện Aflatoxin ...........................................................................21

1.8.1.

Phƣơng pháp sắc kí ...............................................................................................21

1.8.2.

Phƣơng pháp quang phổ ........................................................................................24

1.8.3.

Phƣơng pháp miễn dịch .........................................................................................25

1.8.4.

Phƣơng pháp que thử sắc kýmiễn dịch...................................................................28

1.9.

Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nƣớc về que thử ...................................................30

1.9.1.

Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc. .........................................................................30

1.9.2.

Tình hình nghiên cứu trong nƣớc...........................................................................32

2


Đặc tính que thử .......................................................................................................33

1.10.
1.10.1.

Hạt nano vàng (GNPs) ..........................................................................................33

1.10.2.

Cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng......................................................................33

1.10.3.

Sắc ký miễn dịch cạnh tranh. .................................................................................34

1.10.4.

Miếng thấm mẫu ...................................................................................................35

1.10.5.

Miếng cộng hợp ....................................................................................................36

1.10.6.

Màng ....................................................................................................................36

1.10.7.

Miếng thấm hút .....................................................................................................36
Que thử phát hiện Aflatoxin ......................................................................................37

1.11.
1.11.1.

Cộng hợp Aflatoxin với chất mang ........................................................................37

1.11.2.

Aflatoxin B1 .........................................................................................................38

1.11.3.

CMO ....................................................................................................................39

1.11.4.

Chất mang ............................................................................................................39

1.11.5.

Các phƣơng pháp tạo cộng hợp hapten AFB1 và BSA ...........................................42

CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 47
2.1.

Vật liệu, hóa chất và thiết bị. .........................................................................................47

2.1.1.

Vật liệu .................................................................................................................47

2.1.2.

Hóa chất ...............................................................................................................47

2.1.3.

Các kháng thể sử dụng ..........................................................................................48

* Kháng thể cho tạo que thử .................................................................................. 48
* Kháng thể cho ELISA và Dot-blot ....................................................................... 48
2.1.4.
2.2.

Thiết bị .................................................................................................................48

Phƣơng pháp nghiên cứu ..............................................................................................49

2.2.1.

Phƣơng pháp gắn AF-CMO...................................................................................49

2.2.2.

Phƣơng pháp loại CMO dƣ....................................................................................50

2.2.3.

Phƣơng pháp sắc kí bản mong TLC .......................................................................50

2.2.4.

Phƣơng pháp quang phổ hồng ngoại FT-IR ...........................................................51
3


2.2.5.

Phƣơng pháp gắn AFB1-CMO với BSA/KLH và AFM1-CMO với BSA/KLH ......52

2.2.6.

Phƣơng pháp dot-blot ............................................................................................53

2.2.7.

Phƣơng pháp sản xuất kháng thể. ..........................................................................55

2.2.8.

Phƣơng pháp tinh sạch kháng thể kháng AFbằng sắc ký ái lựcProtein A. ...............55

2.2.9.

Phƣơng pháp điện di SDS – PAGE........................................................................56

2.2.10.

Phƣơng pháp ELISA gián tiếp ...............................................................................57

2.2.11.
hợp

Phƣơng pháp tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng và cố định trên miếng cộng
57

2.2.12.

Phƣơng pháp cố định protein và kháng thể lên màng .............................................58

2.2.13.

Phƣơng pháp phân tích mẫu bằng que thử .............................................................59

2.2.14.

Phƣơng pháp chiết mẫu .........................................................................................59

2.3.

Địa điểm nghiên cứu .....................................................................................................60

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 61
3.1.

Nghiên cứu tạo phức cộng hợp Aflatoxin với protein chất mang....................................61

2.3.1.

Nghiên cứu điều kiện gắn AFB1-CMO .................................................................62

3.1.2.

Nghiên cứu điều kiện gắn AFB1-CMO với BSA ....................................................70

3.1.3.

Kết quả gắn AFB1-KLH, AFM1-BSA và AFM1-KLH ..........................................76

3.2.

Nghiên cứu tạo kháng thể đặc hiệu Aflatoxin B1 và M1. ...............................................77

3.2.1.
Nghiên cứu gây đáp ứng miễn dịch tạo và thu nhận kháng huyết thanh kháng AFB1
và AFM1. .............................................................................................................................77
3.2.2.

Tinh sạch kháng thể kháng AFB1 và AFM1. ..........................................................80

3.2.3.

Đánh giá đặc tính của kháng thể tinh sạch .............................................................85

3.3.

Nghiên cứu chế tạo các thành phần KIT thử. .................................................................89

3.3.1.

Nghiên cứu chế tạo dung dịch kéo vàng. ...............................................................89

3.3.2.

Nghiên cứu điều kiện chế tạo que thử phát hiện Aflatoxin B1 ................................90

3.3.3.

Nghiên cứu điều kiện chế tạo que thử phát hiện Aflatoxin M1 ............................. 110

3.3.4.

Tăng cƣờng độ tín hiệu vạch và giảm thời gian đọc kết quả. ................................ 126

3.4.

Nghiên cứu chế tạo và xác định thông số của KIT. ...................................................... 130
4


3.4.1.

Nghiên cứu chế tạo thử nghiệm KIT .................................................................... 130

3.4.2.

Nghiên cứu xây dựng quy trình sử dụng KIT. ...................................................... 131

3.4.3.

Đánh giá một số thông số KIT. ............................................................................ 139

3.5.

Nghiên cứu thử nghiệm KIT. ...................................................................................... 155

3.5.1.

Nghiên cứu thử nghiệm tại phịng thí nghiệm. ..................................................... 155

3.5.2.

Kiểm nghiệm que thử. ......................................................................................... 156

CHƢƠNG VI: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................... 161
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 162

5


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AF

:

Aflatoxin

AFB1

:

Aflatoxin B1

AFB2

:

Aflatoxin B2

AFG1

:

Aflatoxin G1

AFG2

:

Aflatoxin G2

AFM1

:

Aflatoxin M1

AFM2

:

Aflatoxin M2

BICP

:

5 –Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt

BSA

:

Bovine Serum Albumine

CMC

:

1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)

CMO

:

O–(Carboxymethyl) hydroxylamine hemihydrochloride

DCC

:

dicyclohexylmethanediimine

EDC

1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
:

hydrochloride

ELISA

:

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

FCA

:

Freund’s Complete Adjuvant

FIA

:

Freund’s Incomplete Adjuvant

FPLC

:

Fast protein liquid chromatography

GNP

:

Gold Nanoparticles (hạt nano vàng)

HPLC

:

High – performance liquid chromatography

Ig

:

Immunoglobulin

KLH

:

Keyhole Limpet Hemocyanin

LFA

:

Lateral Flow Immunoassay

NHS

:

N-hydroxysulfosuccinimide

PAGE

:

Polyacrylamide Gel Electrophoresis

PBS

:

Phosphate Buffered Saline

PrA

:

Protein A

TLC

:

Thin Layer Chromatography

WHO

:

World Healthy Organization


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1. Sơ đồ tạo cộng hợp AFB1-BSA ...................................................................................................62
Hình 3.2. Sắc ký bản mỏng sản phẩm tối ƣu gắn AFB1-CMO theo tỷ lệ AFB1: CMO ..................................64
Hình 3.3. Sắc ký bản mỏng sản phẩm tối ƣu nồng độ AFB1. KC, Kiểm chứng-AFB1; đƣờng chạy 4-1 là kết
quả phản ứng ở các nồng độ 1, 2, 4, 8 mM tƣơng ứng. ................................................................................65
Hình 3.4. Sắc ký bản mỏng sản phẩm tối ƣu gắn AFB1-CMO theo nhiệt độ (1. 70 oC, 2. 80 oC, 3. 90 oC, 4.
100 oC, 5. 110 oC) .......................................................................................................................................66
Hình 3.5. Sắc ký bản mỏng sản phẩm tối ƣu gắn AFB1 - CMO theo thời gian .............................................66

Hình 3.6. Sắc ký bản mỏng sản phẩm tối ƣu chiết loại bỏ CMO dƣ theo tỷ lệ nƣớc: ethylacetate. KC. AFB1;
1. AFB1-CMO trong NaOH 0.1M;2. Pha nƣớc, chiết 1:1;3. Pha nƣớc, chiết 1:2;4. Pha nƣớc, chiết 1:3;5. Pha
ethylacetate, chiết 1:1, 6. Pha ethylacetate, chiết 1:2;7. Pha ethylacetate, chiết 1:3. ......................................68
Hình 3.7. Phổ sắc ký lỏng HPLC của AFB1(A) và AFB1-CMO (B) ............................................................69
Hình 3.8. Kết quả phân tích FT-IR của AFB1 (đƣờng liền) và AFB1-CMO (đƣờng nét đứt) ........................70
Hình 3.9. Phân tích dot blot sản phẩm từ các phản ứng cộng hợp AFB1-CMO với BSA với tỷ lệ nồng độ
khác nhau (10:1, 20:1, 30:1, 40:1 và 50:1); AFB1-BSA, chất chuẩn. ...........................................................72
Hình 3.10. Phân tích dot-blot sản phẩm tối ƣu nồng độ EDC/sulfo-NHS gắn AFB1-BSA ............................73
Hình 3.11. Phân tích dot blot sản phẩm từ phản ứng gắn AFB1-CMO với BSA ở các điều kiện đệm pH khác
nhau: đệm actate pH 4,5 (Ace); đệm phosphate pH 7,4 (PBS) và đệm carbonate pH 9,5 (Car). ....................74
Hình 3.12. Phân tích dot blot sản phẩm phản ứng gắn AFB1-CMO với BSA ở 25oC và 37oC. BSA, bovine
serum albumin; B1-BSA, cộng hợp chuẩn ..................................................................................................75
Hình 3.13. Phân tích dot blot sản phẩm phản ứng gắn AFB1-CMO với BSA theo thời gian khác nhau 0,5;
1,0; 2,0; 3,0 và 4,0 giờ................................................................................................................................75
Hình 3.14. Kết quả kiểm tra sản phẩm gắn Aflatoxin với protein chất mang bằng dot blot. BSA, Bovine
serum albumin; KLH, Keyhole limpet hemocyanin; AFB1-BSA, sản phẩm gắn AFB1 với BSA; AFB1-KLH,
sản phẩm gắn AFB1 với KLH; AFM1-BSA, sản phẩm gắn AFM1 với BSA; AFM1-KLH, sản phẩm gắn
AFM1 với KLH .........................................................................................................................................76
Hình 3.15.Biểu đồ ELISA về quá trình gây đáp ứng miễn dịch ở thỏ bằng AFB1-KLH. B1-45, Kháng huyết
thanh kháng lại AFB1 ở loạt tiêm 45 µg AFB1-KLH; B1-75, Kháng huyết thanh kháng lại AFB1 ở loạt tiêm
75 µg AFB1-KLH; KLH-45, Kháng huyết thanh kháng lại AFB1 ở loạt tiêm 45 µg KLH; KLH-75, Kháng
huyết thanh kháng lại AFB1 ở loạt tiêm 75 µg KLH. ...................................................................................78
Hình 3.16.Biểu đồ ELISA về q trình gây đáp ứng miễn dịch ở thỏ bằng AFM1-KLH. M1-45, Kháng huyết
thanh kháng lại AFM1 ở loạt tiêm 45 µg AFM1-KLH; M1-75, Kháng huyết thanh kháng lại AFM1 ở loạt
tiêm 75 µg AFM1-KLH; KLH-45, Kháng huyết thanh kháng lại AFM1 ở loạt tiêm 45 µg KLH; KLH-75,
Kháng huyết thanh kháng lại AFM1 ở loạt tiêm 75 µg KLH. .......................................................................79
Hình 3.17. Sắc ký đồ tinh sạch IgG từ huyết thanh thỏ sử dụng cột Protein A-Sepharosevới thể tích gel 1 ml,
tốc độ 1 ml/phút. ........................................................................................................................................81

Hình 3.18. Phổ điện di protein tinh sạch kháng thể kháng AFB1.1-Thang protein chuẩn (Intron, Hàn Quốc),
2-Huyết thanh, 3- Protein khơng bám cột (đỉnh 1, Hình 3.17), 4-Phân đoạn sau khi đẩy bằng glycine (đỉnh 2,
Hình 3.17) .................................................................................................................................................82
Hình 3.19.Sắc ký đồ tinh sạch IgG từ huyết thanh thỏ sử dụng cột Protein A-Sepharosevới thể tích gel 1 ml,
tốc độ 1 ml/phút. ........................................................................................................................................83
Hình 3.20. Phổ điện di protein tinh sạch kháng thể kháng AFM1. M - Thang protein chuẩn (Intron, Hàn
Quốc), 1-Huyết thanh, 2- Protein khơng bám cột (đỉnh 1, Hình 3.19), 3-Phân đoạn sau khi đẩy bằng glycine
(đỉnh 2, Hình 3.19) .....................................................................................................................................84
Hình 3.21. Đánh giá tính đặc hiệu của kháng thể kháng AFB1 tinh sạch. (a) Đánh giá tính đặc hiệu của kháng
thể kháng AFB1 tinh sạch (Anti-AFB1) với AFB1-BSA bằng ELISA (Anti-KLH: kháng thể kháng KLH,
Anti-AFB1: kháng thể kháng AFB1; (b) ELISA so sánh tính đặc hiệu của kháng thể kháng AFB1 tinh sạch và
kháng thể kháng AFB1 chuẩn (thƣơng mại); (c) Dot-blot so sánh tính đặc hiệu của kháng thể kháng AFB1
tinh sạch và kháng thể kháng AFB1 chuẩn (thƣơng mại). ............................................................................86
Hình 3.22. Đánh giá tính đặc hiệu của kháng thể kháng AFM1 tinh sạch (Anti- AFM1) với AFM1-BSA bằng
ELISA (Anti-KLH: kháng thể kháng KLH, Anti- AFM1: kháng thể kháng AFM1).......................................87
Hình 3.23.. Kết quả ELISA so sánh tính đặc hiệu của kháng thể kháng AFM1 tinh sạch và kháng thể kháng
AFM1 chuẩn (thƣơng mại)..........................................................................................................................88
Hình 3.24. Kết quả Dot-blot so sánh tính đặc hiệu của kháng thể kháng AFM1 tinh sạch và kháng thể kháng
AFM1 chuẩn (thƣơng mại)..........................................................................................................................89
Hình 3.25. Kết quả điều chế hạt nano vàng. A, hình ảnh dung dịch hạt nano vàng sau điều chế; B, phổ hấp
thụ của dung dịch nano vàng; C, hình ảnh TEM của hạt nano vàng. ............................................................90
Hình 3.26.Kiểm tra hoạt động của que thử với điều kiện thiết lập ban đầu ...................................................91
Hình 3.27. Xác định hàm lƣợng kháng thể kháng AFB1 cộng hợp với GNPs thích hợp. a) Màu sắc của dịch
cộng hợp ở các hàm lƣợng kháng thể khác nhau; b) Que thử với các hàm lƣợng kháng thể cộng hợp với hạt
nano vàng khác nhau; c) Kiểm tra đồng thời mẫu âm tính và dƣơng tính (5ppb) ở nồng độ kháng thể trong
miếng cộng hợp là 5ng. ..............................................................................................................................92
Hình 3.28. Xác định pH thích hợp tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng..............................................94
Hình 3.29. Phản ứng tạo cộng hợp giữa kháng thể và hạt nano vàng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. .....95
Hình 3.30. Xác định thời gian phản ứng cộng hợp kháng thể và hạt nano vàng ............................................96
Hình 3.31. Ảnh hƣởng của các cơng thức đệm cộng hợp đến tín hiệu que thử ..............................................97

Hình 3.32. Kết quả thử nghiệm các loại vật liệu khác nhau làm miếng cộng hợp .........................................98
Hình 3.33. Nhiệt độ cố định cộng hợp ........................................................................................................99
Hình 3.34. Thời gian sấy miếng cộng hợp................................................................................................. 100
Hình 3.35. Ảnh hƣởng của vật liệu màng đến kết quả nghiên cứu.............................................................. 101
Hình 3.36. Tối ƣu hóa hàm lƣợng kháng thể cố định lên vạch kiểm tra ...................................................... 102
Hình 3.37. Thay đổi thể tích phun AFB1-BSA trên màng Nitrocellulose .................................................... 103
Hình 3.38. Xác định nhiệt độ xử lý màng nitrocellulose ............................................................................ 104
Hình 3.39. Xác định thời gian sấy màng nitrocellulose ở 37oC .................................................................. 105
Hình 3.40. Xác định hàm lƣợng kháng thể cố định trên vạch kiểm chứng .................................................. 106


Hình 3.41.Kết quả về độ lặp lại của que thử đối với mẫu âm tính với AFB1 (Mũi tên đỏ: vạch phun kháng thể
kháng kháng thể thỏ, mũi tên đen: vạch phun kháng nguyên AFB1-BSA) .................................................. 107
Hình 3.42. Kết quả về độ lặp lại của que thử đối với mẫu dƣơng tính với AFB1 ......................................... 107
Hình 3.43. Đánh giá ngƣỡng phát hiện của que thử ................................................................................... 108
Hình 3.44. Các mẫu nguyên liệu và thức ăn chăn nuôi (DDGS: bã rƣợu khô, 6410: cám chim cút, 2100: cám
gà thịt, 1100: cám lợn cai sữa) .................................................................................................................. 109
Hình 3.45. Kết quả que thử que thử với 7 âm tính và mẫu dƣơng tính AFB1 .............................................. 109
Hình 3.46.Kiểm tra hoạt động của que thử với điều kiện thiết lập ban đầu ................................................. 110
Hình 3.47.Màu sắc của dụng dịch công hợp tại các nồng độ kháng thể AFM1 khác nhau ........................... 111
Hình 3.48.Kết quả thử que với các hàm lƣợng kháng thể cộng hợp với hạt nano vàng khác nhau ............... 111
Hình 3.49.Kiểm tra đồng thời mẫu âm tính và dƣơng tính (5ppb) ở nồng độ kháng thể trong miếng cộng hợp
là 5ng....................................................................................................................................................... 112
Hình 3.50.Xác định pH thích hợp tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng............................................. 113
Hình 3.51.Phản ứng tạo cộng hợp giữa kháng thể và hạt nano vàng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. .... 114
Hình 3.52.Xác định thời gian phản ứng cộng hợp kháng thể và hạt nano vàng ........................................... 115
Hình 3.53.Ảnh hƣởng của các cơng thức đệm cộng hợp đến tín hiệu que thử............................................. 116
Hình 3.54.Kết quả thử nghiệm các loại vật liệu khác nhau làm miếng cộng hợp ........................................ 117
Hình 3.55.Nhiệt độ cố định cộng hợp ....................................................................................................... 118
Hình 3.56.Thời gian sấy miếng cộng hợp.................................................................................................. 119

Hình 3.57.Ảnh hƣởng của vật liệu màng đến kết quả nghiên cứu............................................................... 120
Hình 3.58.Tối ƣu hàm lƣợng kháng thể cố định lên vạch kiểm tra ............................................................. 121
Hình 3.59.Thay đổi thể tích phun AFM1-BSA trên màng Nitrocellulose .................................................... 121
Hình 3.60.Xác định nhiệt độ xử lý màng nitrocellulose ............................................................................. 123
Hình 3.61.Xác định thời gian sấy màng nitrocellulose ở 37oC ................................................................... 123
Hình 3.62.Xác định hàm lƣợng kháng thể cố định trên vạch kiểm chứng ................................................... 124
Hình 3.63.Kết quả về độ lặp lại của que thử đối với mẫu âm tính và dƣơng tính đối với AFM1 (Mũi tên đỏ:
vạch phun kháng thể kháng kháng thể thỏ, mũi tên đen: vạch phun kháng nguyên AFM1-BSA) ................. 125
Hình 3.64.Đánh giá ngƣỡng phát hiện của que thử .................................................................................... 126
Hình 3.65.Miếng cộng hợp kháng thể kháng AFB1 và tín hiệu vạch tƣơng ứng khi thay đổi thể tích vàng
tham gia cộng hợp theo chiều tăng dần 50µl - 100µl - 200µl - 400µl. ........................................................ 127
Hình 3.66.Giảm thời gian đọc tín hiệu que aflatoxin M1 ........................................................................... 128
Hình 3.67.Miếng cộng hợp kháng thể kháng M1 và tín hiệu vạch tƣơng ứng khi thay đổi thể tích vàng tham
gia cộng hợp theo chiều tăng dần 50µl - 100µl - 200µl - 400µl. ................................................................. 129
Hình 3.68.Cân bằng hai vạch loại cộng hơp 400µl AuNP .......................................................................... 130
Hình 3.69.Cân bằng hai vạch loại cộng hợp 300µl AuNP .......................................................................... 130
Hình 3.70.Sơ đồ quy trình chiết Aflatoxin................................................................................................. 132
Hình 3.71.Que thử và vạch tín hiệu khi sử dụng các miếng thấm mẫu khác nhau. ...................................... 134
Hình 3.72.Dung mơi chiết methanol và ethyl acetate. ................................................................................ 135
Hình 3.73.Sơ đồ quy trình chiết Aflatoxin M1 .......................................................................................... 137


Hình 3.74.Tối ƣu tỷ lệ dung mơi chiết ...................................................................................................... 138
Hình 3.75. Thử nghệm 3 mẫu thức ăn chăn nuôi trên que thƣơng mại ....................................................... 140
Hình 3.76. Quá trình chiết mẫu G221. ...................................................................................................... 141
Hình 3.77. Mẫu G221 xác định 5pp .......................................................................................................... 141
Hình 3.78. Mẫu G221 xác định 10ppb ...................................................................................................... 142
Hình 3.79. Quá trình chiết mẫu S900 ........................................................................................................ 142
Hình 3.80. Mẫu S900 xác định 5ppb......................................................................................................... 143
Hình 3.81. Mẫu S900 xác định 10ppb ....................................................................................................... 144

Hình 3.82. Quá trình chiết mẫu A128 ....................................................................................................... 144
Hình 3.83. Mẫu A128 xác định 5ppb ........................................................................................................ 145
Hình 3.84. Mẫu A128 xác định 10ppb ...................................................................................................... 145
Hình 3.85. Quá trình chiết mẫu Bảng 3.9.Chiết mẫu Vinamilk 5ppb.......................................................... 146
Hình 3.86. Mẫu Vinamilk 5ppb ................................................................................................................ 147
Hình 3.87. Mẫu Mẫu Vinamilk 10ppb ...................................................................................................... 148
Hình 3.88. Mẫu Dalatmilk 5ppb ............................................................................................................... 149
Hình 3.89.: Mẫu Dalatmilk 10ppb ............................................................................................................ 150
Hình 3.90. Mẫu TH truemilk 5ppb............................................................................................................ 151
Hình 3.91. Mẫu TH truemilk 10ppb .......................................................................................................... 152
Hình 3.92. Thử que Aflatoxin B1 sau các thời gian bảo quản .................................................................... 154
Hình 3.93. Thử que Aflatoxin M1 sau các thời gian bảo quản ................................................................... 154
Hình 3.94. Thức ăn chăn ni G221 (a) trƣớc,(b) sau khi nhiễm nấm A. flavus và (c) A. oryzae………….151
Hình 3.95. Thử que Aflatoxin B1 với mẫu nhiễm nấm (a) sinh độc tố và (b) không sinh độc tố aflatoxin B1
................................................................................................................................................................ 156


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Lượng Aflatoxin trong nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam. ____________________ 18
Bảng 1. 2: Mức giới hạn về Aflatoxin B1 trong thức ăn chăn nuôi và Aflatoxin M1 trong sữa của các quốc
gia trên thế giới[74]. ___________________________________________________________________ 19
ảng 3.1. Điều kiện thiết lập ban đầu để tối ưu gắn AFB1-CMO _________________________________ 63
ảng 3.2. Đặc điểm vật liệu sử dụng làm miếng cộng hợp que thử _______________________________ 98
ảng 3.3. Đặc điểm vật liệu sử dụng làm màng lai ___________________________________________ 101
ảng 3.4.Đặc điểm các vật liệu sử dụng làm miếng thấm mẫu. _________________________________ 133
ảng 3.5.Tối ưu tỷ lệ dung môi chiết ______________________________________________________ 138
ảng 3.6 Mẫu thức ăn chăn nuôi ________________________________________________________ 139
ảng 3.7.Mẫu sữa ____________________________________________________________________ 140
ảng 3.8 Chiết mẫu Vinamilk 5ppb ______________________________________________________ 147
ảng 3.9.Chiết mẫu Vinamilk 10ppb _____________________________________________________ 148

ảng 3.10 Chiết mẫu Dalatmilk 5ppb_____________________________________________________ 149
ảng 3.11.Chiết mẫu Dalatmilk 10ppb____________________________________________________ 150
ảng 3.12 Chiết mẫu TH truemilk 5ppb ___________________________________________________ 151
ảng 3.13.Chiết mẫu TH truemilk 10ppb __________________________________________________ 152
ảng 3.14. Kết quả về độ đặc hiệu của bộ kít Aflatoxin B1 ____________________________________ 157
ảng 3.15. kết quả về độ đặc hiệu của bộ kít Aflatoxin M1 _____________________________________ 158
ảng 3.16. đánh giá giới hạn phát hiện của bộ kít ___________________________________________ 159


ĐẶT VẤN ĐỀ
Aflatoxin là chất chuyển hóa thứ cấp sản sinh bởi nấm mốc, chủ yếu là các
chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus [57], đƣợc tìm thấy trong một
loạt các nông sản nhƣ hạt ngô, lạc, gạo, ngũ cốc[40, 64]. Đây là nhóm độc tố nấm
mốc nguy hiểm nhất gây độc cho ngƣời và động vật, có thể gây bệnh cấp tính (tổn
thƣơng gan, viêm gan, phù nề, hoại tử xuất huyết) hoặc ung thƣ biểu mơ mãn tính
(ung thƣ gan, phổi, thận và ức chế miễn dịch), thậm chí với liều lƣợng cao có thể
dẫn tới tử vong [8, 45, 71]. Con ngƣời tiêu thụ đồng thời trực tiếp các sản phẩm
nơng sản có Aflatoxin và các sản phẩm sữa, trứng, thịt từ động vật ăn phải
Aflatoxin do thức ăn chăn ni bị nhiễm nấm mốc, nên sự tích tụ Aflatoxin cuối
cùng đều ở con ngƣời. Cho đến nay đã có hơn 20 loại Aflatoxin đƣợc tìm thấy, các
nhóm quan trọng nhất gồm AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 [63]. Cơ quan Nghiên cứu
Ung thƣ Quốc tế (IARC) đã phân loại AFB1 là hợp chất gây ung thƣ quan trọng
nhất (nhóm 1), đặc biệt liên quan đến ung thƣ gan [41], cũng nhƣ khả năng gây quái
thai, gây đột biến [46, 52].
Vấn đề nhiễm Aflatoxin là toàn cầu và đặc biệt ảnh hƣởng đến các quốc gia
đặc trƣng bởi điều kiện môi trƣờng và thời tiết thuận lợi cho ô nhiễm và tăng trƣởng
của nấm mốc trong thu hoạch và bảo quản nông sản. Theo đánh giá của Đại học
Georgia, Mĩ, ƣớc tính rằng 25% cây lƣơng thực trên thế giới bị nhiễm độc tố nấm,
và hơn 4,5 tỷ ngƣời và số lƣợng động vật không xác định đƣợc tiếp xúc với
Aflatoxin [17]. Tại Việt Nam, nhiều cuộc kiểm nghiệm cho thấy sự có mặt của

Aflatoxin trong các mẫu nơng sản ở Việt Nam rất cao từ 60% - 65%, đặc biệt ở ngô
[4]. Hiện nay khuynh hƣớng phát triển chăn nuôi của nƣớc ta theo quy mô công
nghiệp, để nâng cao hiệu quả và lợi nhuận của chăn nuôi cần bảo quản tốt thức ăn
chăn nuôi (TĂCN) và các nguyên liệu sản xuất TĂCN do TĂCN chiếm tỷ trọng
lớn, khoảng 65-75% giá thành sản xuất thịt, sữa, trứng [2]. Sự có mặt của các loại
độc tố, nhất là aflatoxin, nhiễm vào TĂCN và ngũ cốc, có thể gây ảnh hƣởng rất lớn

1


đối với ngƣời tiêu dùng, ngƣời chăn nuôi và ngƣời sản xuất TĂCN. Vì vậy cần xác
định sự có mặt của aflatoxin trong TĂCN để có biện pháp xử lý kịp thời.
Khơng những thế, chất chuyển hóa của AFB1 là Aflatoxin M1 (AFM1) có thể
có trong sữa và các sản phẩm sữa khi cho con bú hoặc các động vật có vú khác ăn
thức ăn bị ơ nhiễm. Ngƣời ta ƣớc tính rằng khoảng 1% - 3% đến 6% AFB1 trong
thức ăn có mặt dƣới dạng AFM1 trong sữa trong vịng vài giờ sau khi ăn bữa ăn bị ơ
nhiễm đến hai ngày sau khi ngừng cho ăn. Sữa là một loại thực phẩm giàu dinh
dƣỡng, và nó là nguồn cung cấp các chất dinh dƣỡng và vi lƣợng cần thiết cho sự
tăng trƣởng, phát triển và duy trì sức khỏe của con ngƣời. Tuy nhiên, sự hiện diện
của AFM1 sẽ biến sữa và các sản phẩm sữa thành nguồn gây bệnh. Chính vì vậy,
việc phát hiện sự có mặt của AFM1 trong sữa và các sản phẩm từ sữa rất cần thiết.
Hiện nay có rất nhiều phƣơng pháp đã đƣợc phát triển để phát hiện Aflatoxin
với độ nhạy cao nhƣ TLC, HPTLC, HPLC, LC-MS/MS, FTIR, RIA, ELISA, SPR,
điện hóa, và que thử miễn dịch. Đa số các phƣơng pháp địi hỏi ngƣời phân tích
phải có kỹ năng tốt, phải tiền xử lý mẫu, tốn thời gian và sử dụng thiết bị đắt tiền,
chỉ phù hợp để thực hiện phân tích Aflatoxin trong điều kiện phịng thí nghiệm.
Những năm gần đây phƣơng pháp que thử miễn dịch với nhiều ƣu điểm nhƣ dễ
dàng thao tác, tiết kiệm thời gian phân tích, phù hợp sử dụng ngồi hiện trƣờng đã
đƣợc chú trọng phát triển để tiếp cận nhiều đối tƣợng ngƣời tiêu dùng. Do đó,
chúng tơi đã thực hiện đề tài ―Nghiên cứu chế tạo KIT phát hiện nhanh Aflatoxin

B1 trong thức ăn chăn nuôi và Aflatoxin M1 trong sữa tƣơi‖ để có thể cung cấp
cơng cụ tiện lợi cho việc kiểm tra nhanh Aflatoxin ngoài hiện trƣờng.

2


MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Chế tạo thành công KIT phát hiện nhanh Aflatoxin B1 trong thức ăn chăn nuôi
và Aflatoxin M1 trong sữa tƣơi; sử dụng đơn giản, tiện lợi tại hiện trƣờng.
Mục tiêu cụ thể:
- Xây dựng đƣợc quy trình chế tạo, bảo quản và sử dụng KIT phát hiện nhanh
Aflatoxin B1 trong thức ăn chăn nuôi và Aflatoxin M1 trong sữa tƣơi.
-

Chế tạo 1000 KIT có độ nhạy, độ đặc hiệu ≥ 90%, giới hạn phát hiện ≥ 5
ppb, kết quả phát hiện 3-5 phút,giá thành sản phẩm thấp hơn sản phẩm cùng
loại nhập khẩu.

3


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN
1.1.

Lịch sử phát hiện Aflatoxin
Vào cuối những năm 1950 và đầu những năm 1960, hơn 100 000 con gà tây ở

các trang trại chăn nuôi ở Anh bị chết một cách bí ẩn, chỉ trong vòng một vài tháng
kể từ khi xuất hiện các triệu chứng bất thƣờng, ngƣời ta gọi là bệnh ―Gà tây X‖
[7].Những cuộc giải phẫu bệnh thú y đã cho thấy, những con vật này chết là do ăn

bột lạc Brazin, loại thức ăn thƣờng đƣợc dùng cho các trang trại chăn ni. Ngay
sau đó, nhiều nghiên cứu chỉ ra bột lạc Brazin bị nhiễm một loại độc tố có nguồn
gốc từ thực vật, cụ thể là độc tố nấm. Năm 1961 lần đầu tiên các nhà khoa học đã
phân lập đƣợc nấm Aspergillus flavus và xác định nó là một trong các lồi nấm có
khả năng tiết ra độc chất này. Loại độc tố này sau đó đƣợc đặt theo tên của chủng
nấm này là Aflatoxin (AF) vào năm 1962 [24].
Năm 1966 - 1969, tại Mỹ, nghiên cứu các bệnh nhiễm AF là nguyên nhân gây
viêm gan ở chó, ngộ độc ngô mốc ở lợn và chất gây ung thƣ mạnh trong cá hồi [53,
54]. Cũng trong những năm này, mối liên hệ giữa Aflatoxin và bệnh gan ở ngƣời
cũng đã đƣợc thực hiện.
Năm 1974, một ổ dịch viêm gan do AF gây ra đã đƣợc báo cáo ở các bang
Gujrat và Rajasthan ở Ấn Độ, dẫn đến ƣớc tính có 106 ca tử vong [46]. Các ổ dịch
kéo dài trong 2 tháng và đƣợc giới hạn ở những ngƣời có lƣơng thực chính là ngơ.
Các mẫu ngơ đã đƣợc thử nghiệm và phân tích cho thấy các mẫu chứa Aspergillus
flavus [16, 46]. Các triệu chứng trong làng bao gồm cổ trƣớng và phù nề của vùng
ngoại biên thấp hơn, cả hai triệu chứng của bệnh xơ gan và các bệnh gan khác. Bởi
vì Aflatoxin gây ra mối đe dọa nghiêm trọng nhƣ chất gây ung thƣ, IARC đã đặt
Aflatoxin B1 vào danh sách các chất gây ung thƣ ở ngƣời vào năm 1988. Đây là một
số nghiên cứu dịch tễ học đƣợc thực hiện ở châu Á và châu Phi đã chứng minh mối
liên quan tích cực giữa AF và tế bào gan. Một đợt bùng phát Aflatoxin khác ảnh
hƣởng đến cả ngƣời và chó đã đƣợc báo cáo ở Tây Bắc Ấn Độ năm 1974 [16]. Một
đợt bùng phát phơi nhiễm Aflatoxin chính sau đó đƣợc ghi nhận ở Kenya vào năm
4


1981 [49, 55]. Từ những phát hiện ban đầu này, các nghiên cứu chuyên sâu đã cho
thấy nguy cơ tiếp xúc với Aflatoxin gây ra các vấn đề nghiêm trọng cho sức khỏe
con ngƣời và động vật trên toàn thế giới. Khám phá này cũng giúp nâng cao nhận
thức về mối nguy hiểm tiềm tàng của nấm mốc trong các ca ngộ độc thức ăn. Các
nghiên cứu khác sau đó còn chỉ ra rằng, Aflatoxin còn đƣợc nhiều chủng nấm khác

nhƣ A. Parasiticus, A. Nomius và A. niger.
1.2.

Điều kiện sản sinh Aflatoxin
Aflatoxin đƣợc sinh ra từ các loài nấm thuộc chi Aspergillus, chủ yếu là

Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus (Hình 1.1). Ngồi ra nó cũng đƣợc
sinh ra từ một số ít loài thuộc chi Penicillium. Aspergillus phân bố rộng rãi trong tự
nhiên, sinh trƣởng dễ ràng trong đất, thực vật mục nát và ngũ cốc đang bị giảm sức
đề kháng vi sinh vật và nó xâm nhập tất cả các loại chất hữu cơ trong điều kiện độ
ẩm cao (ít nhất là 7%) và nhiệt độ cao. Nấm Aspergillus sản sinh Aflatoxin trong
điều kiện nhiệt độ từ 8 - 37 độ , tối ƣu ở 25-28 độ; độ ẩm tƣơng đối 83-88% (độ ẩm
càng cao càng thuận lợi). Khí hậu nhiệt đới nóng ẩm nhƣ ở nƣớc ta tạo điều kiện
thuận lợi cho nấm mốc Aspergillus phát triển và sản sinh Aflatoxin.
Chúng có thể tạo khuẩn lạc và gây nhiễm vào các loại hạt trƣớc khi thu hoạch,
trong thu hoạch và trong q trình bảo quản. Các loại nơng sản thƣờng bị nhiễm
Aflatoxin là ngũ cốc (ngô, kê, lúa miến, gạo, lúa mì), hạt có dầu (lạc, đậu tƣơng, hạt
hƣớng dƣơng, hạt bông), gia vị (ớt, hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ, gừng) và các loại
quả hoặc hạt khác nhƣ hạt dẻ, dừa…. Chính vì thế, khi sử dụng các nông sản nhiễm
nấm mốc này làm thực phẩm hoặc chế biến thức ăn chăn ni thì rất nguy hiểm.
Cho đến nay đã có hơn 20 loại Aflatoxin đƣợc tìm thấy, trong đó Aflatoxin B1 là
độc nhất. Sau khi Aflatoxin B1 vào cơ thể động vật có vú, ngồi việc trực tiếp
chuyển hóa gây độc gan, gây ung thƣ thì chúng tiếp tục chuyển hóa thành AFM1 bài
tiết qua sữa. Chính vì vậy AFM1 cịn đƣợc gọi là ―độc tố sữa‖. Mặc dù tính độc
AFM1 chỉ bằng 10% tính độc của AFB1 nhƣng khả năng gây ung thƣ, gây đột biến
và các nguy cơ suy giảm hệ miễn dịch, chậm lớn tiếp tục ảnh hƣởng sức khỏe ngƣời
5


tiêu dùng khi họ sử dụng sữa và các sản phẩm sữa, nhất là trẻ em. AFM1 lần đầu

đƣợc phát hiện có trong sữa. Tỷ lệ Aflatoxin từ thức ăn nhiễm vào sữa ở bị sữa
trung bình là 1 – 2%. Tuy nhiên, bò tiêu thụ một lƣợng thức ăn lớn, tỷ lệ mang
AFM1 vào sữa có thể đạt 6,2%.

Aspergillus flavus

Aspergillus parasiticus
Hình 1.1. Nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus và các bào tử nấm được nhìn
dưới kính hiển vi, độ phóng đại 600 lần [75, 76].
1.3.

Đặc điểm của Aflatoxin

1.3.1. Cấu trúc hóa học và phân loại
Aflatoxin là một độc chất thuộc nhóm mytocoxin, có khả năng gây ngộ độc,
tổn thƣơng gan và ung thƣ cho động vật và con ngƣời nếu tiêu thụ thƣờng xuyên.Có
khoảng 20 chất chuyển hóa nấm liên quan đến Aflatoxin đƣợc sản xuất chủ yếu bởi
loài Aspergillus flavus, A. nomus và A. Parasiticus, trong đó 6 loại điển hình bao
6


gồm AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, AFM1 và AFM2 [28]. Chúng là các phân tử
difuranocoumarins với hai chuỗi cấu trúc hóa học quan trọng bao gồm chuỗi
difurocoumarocyclopentenone (AFB1, AFB2, AFM1, AFM2 và aflatoxicol) và chuỗi
difurocoumarolactone (AFG1, AFG2). Chữ ―B‖ và ―G‖ đề cập đến màu huỳnh
quang xanh lam (Blue) và xanh lục (Green) đƣợc tạo ra bởi Aflatoxin dƣới ánh sáng
tia cực tím trên bản sắc ký lớp mỏng, trong khi số chỉ số 1 và 2 cho biết các hợp
chất lớn và nhỏ, tƣơng ứng. AFM1 và AFM2 là các chất chuyển hóa tƣơng ứng của
AFB1 và AFB2 xuất hiện trong dịch cơ thể [33, 36].

Hình 1.2. Cấu trúc 2 nhóm Aflatoxin điển hình và G [19].
Aflatoxin B1 và B2 đƣợc sinh ra bởi nấm A. flavus và A. parasiticus, còn
Aflatoxin G1 và G2 đƣợc sinh ra bởi nấm A. parasiticus. Cấu trúc của chúng đƣợc
khám phá bởi nhóm nghiên cứu của Büchi vào năm 1963 (AFB1 và AFG1), năm
1965 (AFB2 và AFG2) [9, 10]. Nhóm nghiên cứu này cũng đã làm sáng tỏ hồn tồn
hóa học lập thể của Aflatoxin nhóm B và G bằng sự phân dã hóa học. Về mặt cấu
trúc, những hợp chất Aflatoxin gồm 5 vịng, có một vịng furo furan (B và C), một
7


vòng thơm 6 cạnh (A), một vòng lactone 6 cạnh (D) và một vòng pentanone 5 cạnh
hoặc một vòng lactone sáu cạnh (E). Các Aflatoxin nhóm B có một vịng
cyclopentane trong khi đó nhóm G có chứa vịng lactone [33]. Trong số các
Aflatoxin đƣợc đề cập thì Aflatoxin B1 là loại phổ biến nhất và có mặt trong hơn
75% các mẫu thực phẩm và thức ăn chăn nuôi đƣợc kiểm tra có nhiễm Aflatoxin
[12, 25, 37].

Hình 1.3. Các nhóm Aflatoxin khác[16].
Aflatoxin M1 và M2 là các dẫn xuất hydroxyl hóa của Aflatoxin B1 và B2, thƣờng
đƣợc gọi là ―độc tố sữa‖. Aflatoxin M1 là chất chuyển hóa của Aflatoxin B1 trên
ngƣời và động vật (trong sữa mẹ có thể phơi nhiễm tới mức ng) cịn Aflatoxin M2 là
chất chuyển hóa của Aflatoxin B2 trong sữa của bò đƣợc cho ăn thức ăn nhiễm độc
tố Aflatoxin B2. Trong cấu trúc của chúng có nhóm hydroxy ở điểm giao nhau của
hai vịng furan. Mặc dù là dẫn xuất của Aflatoxin B1 và B2, Aflatoxin M1 và M2 vẫn
giữa đƣợc tính bền nhiệt trong quá trình chế biến sữa [66].
AFM1 là dẫn xuất 4- hydroxyl của AFB1 và đƣợc tạo ra dƣới tác dụng của
Cytochrom P450, từ đó nó có thể đi vào tuần hồn động vật có vú và đƣợc bài tiết
vào sữa của động vật cho con bú. Công thức phân tử của AFM1 là C17H12O7. Khối
lƣợng phân tử là 328,276 g/mol.
8

AFM1 có cấu trúc gồm 5 vịng, có một vịng furo furan (B và C), một vòng thơm 6
cạnh (A), một vòng lactone 6 cạnh (D) và một vòng pentanone 5 cạnh (E). Trong
cấu trúc của chúng có nhóm hydroxy ở điểm giao nhau của hai vòng furan.
Các Aflatoxin đƣợc tìm thấy khác có nhóm hydroxyl thay vì nhóm cacbonyl ở vịng
E (R0, RB1, RB2, H1). Chúng đƣợc hình thành bằng chuyển hóa sinh học hoặc hóa
học với natri borohydride. Ở một số Aflatoxin, vòng D hoặc E mở. Aflatoxin B3 cịn
đƣợc gọi là parasiticol, vì nó là lần đầu tiên phân lập từ Aspergillus parasiticus. Tất
cả các Aflatoxin thể hiện trong Hình 1.3 là các sản phẩm chuyển hóa trao đổi chất
từ Aflatoxin nhóm B.
1.3.2. Tính chất hóa học và tính chất vật lý
1.3.2.1.

Tính chất vật lý

Các Aflatoxin là các tinh thể màu vàng, tan trong các dung môi phân cực nhƣ
chloroform, methanol, acetone, đặc biệt là dimethylsulfoit (dung môi thƣờng đƣợc
sử dụng để đƣa Aflatoxin vào động vật thí nghiệm), chúng có thể tồn tại trong các
dung mơi này nhiều năm nếu đƣợc giữ trong điều kiện lạnh và tránh sáng. Tính tan
của Aflatoxin trong nƣớc dao động từ 10- 20 mg/L. Chúng rất bền với nhiệt, không
bị phá hủy khi đun nấu thông thƣờng hay thanh trùng, dễ bị tia tử ngoại phá hủy,
đun trong nồi áp suất, xử lý bằng các chất oxy hóa. Aflatoxin nhóm B có tính phát
huỳnh quang màu xanh lam, trong khi đó nhóm G lại có khả năng phát huỳnh quang
màu xanh lục dƣới ánh sáng tử ngoại. Do đó, chúng ta có thể dựa vào tính phát
quang này để nhận biết và phân biệt giữa nhóm B và G. AFM1 phát huỳnh quang
mạnh, phát ra ánh sáng xanh tím.
1.3.2.2.

Tính chất hóa học

Trong phân tử Aflatoxin có vịng lactone nên dễ bị thủy phân bởi các bazo mạnh,
nên có thể dùng kiềm để xử lý thực phẩm nhiễm Aflatoxin. Tuy nhiên khi axit hóa
thì các Aflatoxin lại đƣợc tái tạo. Ở nhiệt độ cao sẽ làm mở vòng decarboxylation,
dẫn đến mất mát các nhóm methoxy từ vịng thơm.
9


Nhiều tác nhân oxy hóa nhƣ hypochloride natri, thuốc tím, chlorine, H2O2, ozone,…
phản ứng với Aflatoxin và thay đổi cấu trúc phân tử của chúng, một số phản ứng
làm mất huỳnh quang.
1.3.3. Sự chuyển hóa và bài tiết Aflatoxin
Q trình loại bỏ (trao đổi chất và bài tiết) của các chất hóa học khỏi cơ thể liên
quan đến hai giai đoạn chính. Giai đoạn I chuyển hóa các chất hóa học có liên quan
đến việc bổ sung một nhóm cực nhỏ chứa cả các điện tích dƣơng và âm đƣợc thêm
vào xenobiotics giống nhƣ Aflatoxin bởi q trình oxy hóa, acetyl hóa và thủy phân
và làm cho nó vơ hại. Giai đoạn I chủ yếu đƣợc trung gian bởi các hệ thống enzyme
Cytochrome P450 (CYP450). Chuyển hóa giai đoạn II liên quan đến các phản ứng
liên hợp sulfate, glucuronide, glutathione và amino acid.
Sự chuyển hóa của AFB1 đã đƣợc nghiên cứu bởi Wild và cộng sự, 2002;
Gallagher và cộng sự, 1996; Vondracek và cộng sự, 2001 (Hình 1.4) [31, 69,
70].Aflatoxin trải qua q trình chuyển hóa pha I bởi phản ứng oxy hóa bao gồm
phản ứng epoxid hóa, hydrat hóa, hydroxyl hóa và phản ứng oxy hóa O-demethyl
hóa liên quan đến siêu họ enzyme Cytochrome P450s (CYP450s) để tạo AFB1-exo8,9-epoxide (AFBO), AFB2a, AFM1, AFQ1 và AFP1. AFBO là chất gây ung thƣ
trong khi các chất chuyển hóa khác ít độc hơn và đƣợc liên kết với các phân tử khác
để nhanh chóng bài tiết qua mật và nƣớc tiểu.

10