Kết quả thử nghiệm bột kít thử nhanh aflatoxin B1 và M1

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
VIỆN THÚ Y

&
QUY TRÌNH ĐỀ TÀI

Tên quy trình: Quy trình chế tạo KIT phát hiện nhanh Aflatoxin B1
trong thức ăn chăn nuôi và Aflatoxin M1 trong sữa tươi

Thuộc đề tài: “Nghiên cứu chế tạo KIT phát hiện nhanh Aflatoxin
B1 trong thức ăn chăn ni và Aflatoxin M1 trong sữa tƣơi.”

Chủ trì đề tài: TS. Phạm Thị Ngọc
Đơn vị chủ trì: Viện Thú y

HÀ NỘI - 2019
1


I.

QUY TRÌNH CHẾ TẠO KIT PHÁT HIỆN NHANH AFLATOXIN B1 TRONG
THỨC ĂN CHĂN NI (AFB1)
1.1. Mục đích

Aflatoxin là các chất trao đổi bậc 2 có độc tính gây ung thư được tạo ra bởi hai loài

nấm mốc chủ yếu là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus có mặt trong các loại
nơng sản thực phẩm như lạc, hạt ngô, ngũ cốc, và thức ăn chăn nuôi. Trong số các
aflatoxin được đề cập thì aflatoxin B1 là loại phổ biến nhất và có mặt trong hơn 75% các
mẫu thực phẩm và thức ăn chăn ni được kiểm tra có nhiễm Aflatoxin (Hussein et al.,
2001; Cullen et al., 1993; Ayub et al., 1997). Đây là nhóm độc tố nấm mốc nguy hiểm
nhất gây độc cho người và động vật, có thể gây bệnh cấp tính (tổn thương gan, viêm gan,
phù nề, hoại tử xuất huyết) hoặc ung thư biểu mơ mãn tính (ung thư gan, phổi, thận và ức
chế miễn dịch), thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong. Cơ quan Nghiên cứu
Ung thư Quốc tế (IARC) đã phân loại Aflatoxin B1 là hợp chất gây ung thư quan trọng
nhất (nhóm 1), đặc biệt liên quan đến ung thư gan, cũng như khả năng gây quái thai, gây
đột biến.
Tại Việt Nam, nhiều cuộc kiểm nghiệm cho thấy sự có mặt của aflatoxin trong các
mẫu nông sản ở Việt Nam rất cao từ 60% - 65%, đặc biệt ở ngô. Sự có mặt của các loại
độc tố, nhất là Aflatoxin, nhiễm vào thức ăn chăn ni (TĂCN) và ngũ cốc, có thể gây
ảnh hưởng rất lớn đối với người tiêu dùng, người chăn ni và người sản xuất TĂCN.
Hiện nay có rất nhiều phương pháp đã được phát triển để phát hiện Aflatoxin B1với
độ nhạy cao như TLC, HPTLC, HPLC, LC-MS/MS, FTIR, RIA, ELISA, SPR, điện hóa,
và que thử miễn dịch (Ordaz et al., 2013; Liu et al., 2013; Arduini et al., 2007; Sobolev et
al., 2007). Đa số các phương pháp địi hỏi người phân tích phải có kỹ năng tốt, phải tiền
xử lý mẫu, tốn thời gian và sử dụng thiết bị đắt tiền, chỉ phù hợp để thực hiện phân tích
aflatoxin trong điều kiện phịng thí nghiệm. Những năm gần đây phương pháp que thử
miễn dịch với nhiều ưu điểm như dễ dàng thao tác, tiết kiệm thời gian phân tích, phù hợp
sử dụng ngồi hiện trường đã được chú trọng phát triển để tiếp cận nhiều đối tượng người
tiêu dùng. Do đó, việc tạo được que thử nhanh với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, sử dụng

2

tại hiện trường là cần thiết. Que thử được thiết kế dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch
cạnh tranh nhằm phát hiện sự có mặt của độc tố aflatoxin B1 trong thức ăn chăn nuôi.
1.2. Phạm vi áp dụng
Quy trình được áp dụng cho các cơ sở chăn ni và cơ sở chế biến thức ăn cho gia
súc, gia cầm.
1.3. Định nghĩa các chữ viết tắt

Cụm từ đầy đủ

Chữ viết tắt
AFB1

Aflatoxin B1

AFM1

Aflatoxin M1

ELISA

Enyme Link Immunoglobin Sandwich Assay

FTIR

Fourier transform infrared

HPTLC

High-performance thin layer chromatography

LC-MS/MS

Liquid Chromatography - Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry

RIA

Radioimmunoassaay

SPR

Surface Plasmon Resonance

TĂCN

Thức ăn chăn nuôi

TLC

Thin layer chromatographic

1.4. Trang thiết bị và nguyên vật liệu
1.4.1. Trang thiết bị
3


TT

Thiết bị

Hãng sản xuất

1

Máy phun mẫu CAMAG Liomat 5

2

Máy cắt que thử AUTOKUN

3

Kim phun mẫu

Hamilton

4

Cân kỹ thuật TE 612

Sartorius, CHLB Đức

5

Cân phân tích CPA 324S

Sartorius, CHLB Đức

6

Tủ cấy vơ trùng Class II Type A2

ESCO

7

Tủ lạnh sâu -20oC

Sanyo, Nhật Bản

8

Tủ lạnh sâu -80oC

Sanyo, Nhật Bản

9

Micropipette các loại

Biohit

10

Máy đo pH

Mettler Toledo

11

Máy ly tâm eppendorf

Eppendorf 5415C, CHLB Đức

12

Máy khuấy từ

Taitex, Nhật Bản

13

Máy votex Delta Mixer

Taitex, Nhật Bản

14

Tủ sấy nhiệt

4

CAMAG


1.4.2. Ngun vật liệu
Các hóa chất chính được mua từ các hãng Sigma-Aldrich (Mỹ), Merck (Đức),
Thermo Scientific (Mỹ), Bio-rad (Mỹ):

TT
1

Tên hóa chất

TT

Hạt nano vàng điều chế kích thước

16

40 nm

Tên hóa chất
Kháng thể thỏ kháng AFB1 trong
đệm 1X PBS, pH 7,4
Kháng thể dê kháng IgG thỏ (Arista

2

Đệm 1X PBS, pH 7,4

17

3

10% BSA trong đệm sodium borate

18

Đệm 50 mM Tris-HCl, pH 7,2

4

Glycerol

19

Dung dịch 0,1 M Glycine, pH 2,7

5

Đệm Sodium Borate

20

Dung dịch 1 M Tris-HCl, pH 9,0

6

Sucrose

21

Protein A sepharose bead

7

CMO

22

Dung môi hexane

8

Protein KLH, BSA

23

Dung dịch Acrylamide

9

AFB1

24

Dung dịch 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8

10

Dung môi Ethyl acetate

25

Dung dịch 1,5 M Tris-HCL, pH 8,8

11

Miếng cộng hợp (conjugate pad)

26

10% APS, TEMED, 10% SDS

12

Miếng thấm mẫu (sample pad)

27

Đệm chạy: Tris-HCl, Glycine

28

Eppendorf các cỡ

13

Màng nitrocellulose (Nitrocellulose
membrane)

Biologicals, Mỹ)

14

Vỏ nhựa (plastic housing)

29

Đầu tip các cỡ

15

Miếng thấm hút (adsorption pad)

30

Ống lấy mẫu,....

5


1.5. Quy trình chế tạo
1.6.1. Sơ đồ quy trình chế tạo Kit

AFB1 - KLH

Gây miễn dịch
tạo kháng thể

Tinh sạch kháng
thể

Tạo phức cộng
hợp kháng thể
thỏ - hạt nano
vàng

- Vật chủ: thỏ (2,0 - 2,5 kg)
- Liều tiêm: 0,75µg AFB1-KLH

+ 0,5ml tá dược
- Thời gian: 70 ngày

AFB1
- Cột: Protein A-Sepharose
- Tốc độ: 1ml/phút
- Đệm: 50mM Tris, pH 7,2

Kháng thể dê
kháng IgG
thỏ

Tạo cộng hợp
AFB1-BSA

Cố định lên màng
nitrocellulose

Tạo miếng cộng
hợp
37oC
30 phút

BSA

Tạo que thử

T – 0,045 µg/vạch
C – 0,15 µg/vạch
37oC, 20 phút

QUE THỬ

SƠ ĐỒ QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ

6


1.5.2. Tạo phức cộng hợp Aflatoxin B1 với BSA
Quá trình tạo phức cộng hợp AFB1-BSA gồm hai giai đoạn.
Giai đoạn 1 gắn AFB1 với CMO, điều kiện gắn AFB1-CMO ở nồng độ 0,27 µg
AFB1/µl trong dung mơi MeOH : H2O : Pyridine (4:1:1) với tỷ lệ AFB1 : CMO là 1:3, ở
nhiệt độ 90oC, trong 2 giờ sau đó để qua đêm, cô quay loại bỏ dung môi ở 65oC, 150 mbar
trong 1 giờ. Chiết AFB1-CMO bằng tỷ lệ nước : ethylacetate tỷ lệ 1:1.
Giai đoạn 2, gắn phức hợp AFB1-CMO với BSA, điều kiện phản ứng gắn AFB1BSA như sau: tỷ lệ AFB1 : BSA là 40:1, nồng độ EDC/sulfo-NHS 10mM, đệm phản ứng
là đệm bicacbonate pH 9,5, ở nhiệt độ 25oC trong 2 giờ.
1.5.3. Gây miễn dịch tạo kháng thể
Kháng nguyên AFB1 được gắn cộng hợp với protein KLH hòa trong đệm PBS 1X,
pH 7,4 và tá dược (0,75µg/500µl) rồi tiêm dưới da thỏ. Việc gây miễn dịch được thực
hiện với 4 lần tiêm, trong đó lần tiêm đầu tiên sử dụng tá dược toàn phần FCA, các lần
tiêm sau chúng tơi sử dụng tá dược khơng tồn phần FIA. Khoảng cách giữa các lần tiêm
là 2 tuần. Lấy máu toàn bộ vào ngày 84 đối với thỏ sau đó trích ly lấy huyết thanh.
1.5.4. Tinh sạch kháng thể
Tinh sạch kháng thể đa dòng kháng Aflatoxin B1 từ huyết thanh của thỏ sử dụng sắc
ký ái lực với chất giá là Protein A – sepharose 4B (Invitrogen – Mỹ) trên hệ thống tinh
sạch tự động Akta FPLC (GE Healthcare, Mỹ).
-

Cân bằng cột bằng 10 lần thể tích cột với đệm 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.

-

Nạp 1 ml huyết thanh chứa kháng thể lên cột.

-

Rửa giải thành phần không bám cột bằng đệm 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.

-

Thôi kháng thể IgG ra khỏi cột bằng dung dịch glycine pH 2,7.

-

Trung hịa dịch kháng thể bằng đệm Tris-HCl, pH 9,0.

-

Cơ đặc kháng thể và đổi đệm bằng cột Amicon 30K.

-

Kiểm tra độ sạch của kháng thể bằng điện di trên gel polyacrylamide SDS-PAGE
(Laemlli 1970).

7


-

Định lượng hàm lượng kháng thể bằng phương pháp Bradford. Bảo quản kháng thể
ở -20oC để phục vụ nghiên cứu tạo que thử.
1.5.5. Tạo phức cộng hợp kháng thể đa dòng thỏ với hạt nano vàng

-

Chuẩn pH của dung dịch nano vàng về giá trị 7,5 bằng 0,2 M K2CO3.

-

Bổ sung kháng thể đa dòng thỏ kháng Aflatoxin B1 vào dung dịch nano vàng (30
ng kháng thể + 1,5µl AuNP) và ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút.

-

Bổ sung dung dịch BSA đạt nồng độ cuối cùng là 1%, tiếp tục ủ trong thời gian 15
phút

-

Rửa phức cộng hợp kháng thể và hạt nano vàng (Ab-AuNP).

-

Hòa tan phức Ab-AuNP trong đệm CB.
1.5.6. Tạo miếng cộng hợp

-

Chuẩn bị miếng thấm kích thước 3 x 4,5 mm.

-

Ngâm miếng thấm trong dung dịch phức Ab-AuNP.

-

Sấy khô miếng thấm: 37oC, 30 phút.
1.5.7. Cố định lên màng nitrocellulose

-

Phức cộng hợp AFB1-BSA và kháng thể đa dòng kháng IgG thỏ được phun lên
màng nitrocelllulose ở hai vị trí vạch kiểm tra (T-line) và vạch kiểm chứng (C-line)
tương ứng.

-

Sấy khô màng: 37oC, 30 phút
1.5.8. Tạo que thử

-

Gắn màng nitrocellulose đã được cố định kháng thể lên thanh đỡ.

-

Gắn miếng thấm cộng hợp vào một đầu của màng nitrocellulose.

-

Gắn miếng thấm mẫu gối lên miếng thấm cộng hợp.

-

Gắn miếng thấm hút vào đầu kia của màng nitrocellulose.

-

Lắp toàn bộ thành phần que thử được tạo ra như trên vào hộp chứa.

8


Tài liệu tham khảo
1. Hussein H.S., Brasel J.M. (2001), “Toxicity, metabolism, and impact of mycotoxins
on humans and animals”, Toxicology, 167(2), pp. 101–134.
2. Cullen J.M., Newberne P.M., Eaton D., and Groopman J. (1993), “Acute
hepatotoxicity of aflatoxins”, in The Toxicology of Aflatoxins: Human Health,
Veterinary and Agricultural Significance, pp. 3–26.
3. Ayub M., Sachan D. (1997), “Dietary factors affecting aflatoxin bi carcinogenicity,”
Malaysian Journal of Nutrition, (3), pp. 161–197.
4. Ordaz, J. J., Fente, C. A., Vázquez, B. I., Franco, C. M., & Cepeda, A. (2003).
Development of a method for direct visual determination of aflatoxin production by
colonies

of

the

Aspergillus

flavus

group. International

Journal

of

Food

Microbiology, 83(2), 219-225.
5. Arduini, F., Errico, I., Amine, A., Micheli, L., Palleschi, G., & Moscone, D. (2007).
Enzymatic spectrophotometric method for aflatoxin B detection based on
acetylcholinesterase inhibition. Analytical Chemistry, 79(9), 3409-3415.
6. Sobolev, V. S. (2007). Simple, rapid, and inexpensive cleanup method for
quantitation of aflatoxins in important agricultural products by HPLC. Journal of
agricultural and food chemistry, 55(6), 2136-2141.
7. Liu, B. H., Hsu, Y. T., Lu, C. C., & Yu, F. Y. (2013). Detecting aflatoxin B1 in foods
and feeds by using sensitive rapid enzyme-linked immunosorbent assay and gold
nanoparticle immunochromatographic strip. Food Control, 30(1), 184-189.
9


II. QUY TRÌNH CHẾ TẠO KIT AFLATOXIN M1 TRONG SỮA TƢƠI (AFM1)
2.1. Mục đích
Aflatoxin là các chất trao đổi bậc 2 có độc tính gây ung thư được tạo ra bởi hai loài
nấm mốc chủ yếu là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus có mặt trong các loại
nơng sản thực phẩm như lạc, hạt ngô, ngũ cốc, và thức ăn chăn ni. Trong số các

aflatoxin được đề cập thì Aflatoxin B1 là loại phổ biến nhất và có mặt trong hơn 75% các
mẫu thực phẩm và thức ăn chăn nuôi được kiểm tra có nhiễm Aflatoxin (Hussein et al.,
2001; Cullen et al., 1993; Ayub et al., 1997). Đây là nhóm độc tố nấm mốc nguy hiểm
nhất gây độc cho người và động vật, có thể gây bệnh cấp tính (tổn thương gan, viêm gan,
phù nề, hoại tử xuất huyết) hoặc ung thư biểu mơ mãn tính (ung thư gan, phổi, thận và ức
chế miễn dịch), thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong. Cơ quan Nghiên cứu
Ung thư Quốc tế (IARC) đã phân loại Aflatoxin B1 là hợp chất gây ung thư quan trọng
nhất (nhóm 1), đặc biệt liên quan đến ung thư gan, cũng như khả năng gây quái thai, gây
đột biến.
Tại Việt Nam, nhiều cuộc kiểm nghiệm cho thấy sự có mặt của aflatoxin trong các
mẫu nông sản ở Việt Nam rất cao từ 60% - 65%, đặc biệt ở ngơ. Sự có mặt của độc tố
aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi (TĂCN) và ngũ cốc, khơng chỉ gây độc đối với vật
ni mà cịn ảnh hưởng nghiêm trọng tới người tiêu dùng thông qua các sản phẩm từ vật
nuôi ăn phải độc tố như: sữa, trứng, thịt,.... Cụ thể, Aflatoxin M1 và M2 là các sản phẩm
được hydroxyl hóa của Aflatoxin B1 và B2 tương ứng. Hai loại Aflatoxin này có mặt
trong sữa bị khi bị ăn phải thức ăn có chứa Aflatoxin B1 và B2. Người ta ước tính rằng
khoảng 1% - 3% đến 6% AFB1 trong thức ăn có mặt dưới dạng AFM1 trong sữa trong
vòng vài giờ sau khi ăn bữa ăn bị ô nhiễm đến hai ngày sau khi ngừng cho ăn. Sữa là một
loại thực phẩm giàu dinh dưỡng, và nó là nguồn cung cấp các chất dinh dưỡng và vi
lượng cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển và duy trì sức khỏe của con người. Tuy
nhiên, sự hiện diện của AFM1 sẽ biến sữa và các sản phẩm sữa thành nguồn mang độc tố.
Vì vậy, cần phát hiện sự có mặt của Aflatoxin M1 trong sữa và các sản phẩm từ sữa.
Hiện nay có rất nhiều phương pháp đã được phát triển để phát hiện Aflatoxin M1
với độ nhạy cao như TLC, HPTLC, HPLC, LC-MS/MS, FTIR, RIA, ELISA, SPR, điện
hóa, và que thử miễn dịch (Ordaz et al., 2013; Liu et al., 2013; Arduini et al., 2007;
10


Sobolev et al., 2007). Đa số các phương pháp đòi hỏi người phân tích phải có kỹ năng tốt,
phải tiền xử lý mẫu, tốn thời gian và sử dụng thiết bị đắt tiền, chỉ phù hợp để thực hiện

phân tích aflatoxin trong điều kiện phịng thí nghiệm. Những năm gần đây phương pháp
que thử miễn dịch với nhiều ưu điểm như dễ dàng thao tác, tiết kiệm thời gian phân tích,
phù hợp sử dụng ngồi hiện trường đã được chú trọng phát triển để tiếp cận nhiều đối
tượng người tiêu dùng. Do đó, việc tạo được que thử nhanh với độ nhạy và độ đặc hiệu
cao, sử dụng tại hiện trường là cần thiết. Que thử được thiết kế dựa trên nguyên lý sắc ký
miễn dịch cạnh tranh nhằm phát hiện sự có mặt của độc tố Aflatoxin M1 trong sữa và các
sản phẩm từ sữa.
2.2. Phạm vi áp dụng
Quy trình được áp dụng cho các cơ sở chăn ni và cơ sở chế biến thức ăn cho gia
súc, gia cầm.
2.3. Định nghĩa các chữ viết tắt
Cụm từ đầy đủ

Chữ viết tắt
AFB1

Aflatoxin B1

AFM1

Aflatoxin M1

ELISA

Enyme Link Immunoglobin Sandwich Assay

FTIR

Fourier transform infrared

HPTLC

High-performance thin layer chromatography

LC-MS/MS

Liquid Chromatography - Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry

RIA

Radioimmunoassaay

SPR

Surface Plasmon Resonance

TĂCN

Thức ăn chăn nuôi

TLC

Thin layer chromatographic

11


2.4. Trang thiết bị và nguyên vật liệu
2.4.1. Trang thiết bị

TT

Thiết bị

Hãng sản xuất

1

Máy phun mẫu CAMAG Liomat 5

2

Máy cắt que thử AUTOKUN

3

Kim phun mẫu

Hamilton

4

Cân kỹ thuật TE 612

Sartorius, CHLB Đức

5

Cân phân tích CPA 324S

Sartorius, CHLB Đức

6

Tủ cấy vơ trùng Class II Type A2

ESCO

7

Tủ lạnh sâu -20oC

Sanyo, Nhật Bản

8

Tủ lạnh sâu -80oC

Sanyo, Nhật Bản

9

Micropipette các loại

Biohit

10

Máy đo pH

Mettler Toledo

11

Máy ly tâm eppendorf

Eppendorf 5415C, CHLB Đức

12

Máy khuấy từ

Taitex, Nhật Bản

13

Máy votex Delta Mixer

Taitex, Nhật Bản

14

Tủ sấy nhiệt

2.4.2. Nguyên vật liệu

12

CAMAG

Các hóa chất chính được mua từ các hãng Sigma-Aldrich (Mỹ), Merck (Đức),
Thermo Scientific (Mỹ), Bio-rad (Mỹ):

TT
1

Tên hóa chất

TT

Hạt nano vàng điều chế kích thước

16

40 nm

Tên hóa chất
Kháng thể thỏ kháng AFM1 trong
đệm 1X PBS, pH 7,4
Kháng thể dê kháng IgG thỏ (Arista

2

Đệm 1X PBS, pH 7,4

17

3

10% BSA trong đệm sodium borate

18

Đệm 50 mM Tris-HCl, pH 7,2

4

Sucrose

19

Dung dịch 0,1 M Glycine, pH 2,7

5

Đệm Sodium Borate

20

Dung dịch 1 M Tris-HCl, pH 9,0

6

CMO

21

Protein A sepharose bead

7

Protein KLH

22

Dung dịch Acrylamide

8

AFM1

23

Dung dịch 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8

9

Dung môi Chloroform

24

Dung dịch 1,5 M Tris-HCL, pH 8,8

10

Miếng cộng hợp (conjugate pad)

25

10% APS, TEMED, 10% SDS

11

Miếng thấm mẫu (sample pad)

26

Đệm chạy: Tris-HCl, Glycine

27

Eppendorf các cỡ

12

Màng nitrocellulose (Nitrocellulose
membrane)

Biologicals, Mỹ)

13

Vỏ nhựa (plastic housing)

28

Đầu tip các cỡ

14

Miếng thấm hút (adsorption pad)

29

Ống lấy mẫu,....

15

Na2SO4

30

Protein BSA

13


2.5. Quy trình chế tạo
2.5.1. Sơ đồ quy trình chế tạo Kit

AFM1 - KLH

Gây miễn dịch
tạo kháng thể

Tinh sạch kháng
thể

Tạo phức cộng

hợp kháng thể
thỏ - hạt nano
vàng

- Vật chủ: thỏ (2,0 - 2,5 kg)
- Liều tiêm: 0,75µg AFM1KLH + 0,5ml tá dược
- Thời gian: 70 ngày

- Cột: Protein A-Sepharose
- Tốc độ: 1ml/phút
- Đệm: 50mM Tris, pH 7,2

Kháng thể dê
kháng IgG
thỏ

Cố định lên màng
nitrocellulose

Tạo miếng cộng
hợp
37oC
30 phút

Cộng hợp AFM1BSA

Tạo que thử

T – 0,04 µg/vạch
C – 0,2 µg/vạch

37oC, 20 phút

QUE THỬ

SƠ ĐỒ QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ
14


1.5.2. Tạo phức cộng hợp Aflatoxin M1 với BSA
Quá trình tạo phức cộng hợp AFM1-BSA gồm hai giai đoạn.
Giai đoạn 1 gắn AFM1 với CMO, điều kiện gắn AFM1-CMO ở nồng độ 0,27 µg
AFM1/µl trong dung mơi MeOH : H2O : Pyridine (4:1:1) với tỷ lệ AFM1 : CMO là 1:3, ở
nhiệt độ 90oC, trong 2 giờ sau đó để qua đêm, cô quay loại bỏ dung môi ở 65oC, 150 mbar
trong 1 giờ. Chiết AFM1-CMO bằng tỷ lệ nước : ethylacetate tỷ lệ 1:1.
Giai đoạn 2, gắn phức hợp AFM1-CMO với BSA, điều kiện phản ứng gắn AFM1BSA như sau: tỷ lệ AFM1 : BSA là 40:1, nồng độ EDC/sulfo-NHS 10mM, đệm phản ứng
là đệm bicacbonate pH 9,5, ở nhiệt độ 25oC trong 2 giờ.
2.5.3. Gây miễn dịch tạo kháng thể
Kháng nguyên AFM1 được gắn cộng hợp với protein KLH hòa trong đệm PBS 1X,
pH 7,4 và tá dược (0,75µg/500µl) rồi tiêm dưới da thỏ. Việc gây miễn dịch được thực
hiện với 4 lần tiêm, trong đó lần tiêm đầu tiên sử dụng tá dược toàn phần FCA, các lần
tiêm sau chúng tơi sử dụng tá dược khơng tồn phần FIA. Khoảng cách giữa các lần tiêm
là 2 tuần. Lấy máu toàn bộ vào ngày 84 đối với thỏ sau đó trích ly lấy huyết thanh.
2.5.4. Tinh sạch kháng thể
Tinh sạch kháng thể đa dòng kháng Aflatoxin M1 từ huyết thanh của thỏ sử dụng
sắc ký ái lực với chất giá là Protein A – sepharose 4B (Invitrogen – Mỹ) trên hệ thống
tinh sạch tự động Akta FPLC (GE Healthcare, Mỹ).
-

Cân bằng cột bằng 10 lần thể tích cột với đệm 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.

-

Nạp 1 ml huyết thanh chứa kháng thể lên cột.

-

Rửa giải thành phần không bám cột bằng đệm 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.

-

Thôi kháng thể IgG ra khỏi cột bằng dung dịch glycine pH 2,7.

-

Trung hịa dịch kháng thể bằng đệm Tris-HCl, pH 9,0.

-

Cơ đặc kháng thể và đổi đệm bằng cột Amicon 30K.

-

Kiểm tra độ sạch của kháng thể bằng điện di trên gel polyacrylamide SDS-PAGE
(Laemlli 1970).

-

Định lượng hàm lượng kháng thể bằng phương pháp Bradford. Bảo quản kháng
thể. ở -20oC để phục vụ nghiên cứu tạo que thử.
15

2.5.5. Tạo phức cộng hợp kháng thể đa dòng thỏ với hạt nano vàng
-

Chuẩn pH của dung dịch nano vàng về giá trị 7,5 bằng 0,2 M K2CO3.

-

Bổ sung kháng thể đa dòng thỏ kháng Aflatoxin M1 vào dung dịch nano vàng (60
ng kháng thể + 1µl AuNP) và ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút.

-

Bổ sung dung dịch BSA đạt nồng độ cuối cùng là 1%, tiếp tục ủ trong thời gian 15
phút.

-

Rửa phức cộng hợp kháng thể và hạt nano vàng (Ab-AuNP).

-

Hòa tan phức Ab-AuNP trong đệm CB.
2.5.6. Tạo miếng cộng hợp

-

Chuẩn bị miếng thấm kích thước 3 x 4,5 mm.

-

Ngâm miếng thấm trong dung dịch phức Ab-AuNP.

-

Sấy khô miếng thấm: 37oC, 30 phút.
2.5.7. Cố định lên màng nitrocellulose

-

Phức cộng hợp AFM1-BSA và kháng thể đa dòng kháng IgG thỏ được phun lên
màng nitrocelllulose ở hai vị trí vạch kiểm tra (T-line) và vạch kiểm chứng (C-line)
tương ứng.

-

Sấy khô màng: 37oC, 20 phút.
2.5.7. Tạo que thử

-

Gắn màng nitrocellulose đã được cố định kháng thể lên thanh đỡ.

-

Gắn miếng thấm cộng hợp vào một đầu của màng nitrocellulose.

-

Gắn miếng thấm mẫu gối lên miếng thấm cộng hợp.

-

Gắn miếng thấm hút vào đầu kia của màng nitrocellulose.

-

Lắp toàn bộ thành phần que thử được tạo ra như trên vào hộp chứa.

16


Tài liệu tham khảo
8. Hussein H.S., Brasel J.M. (2001), “Toxicity, metabolism, and impact of mycotoxins
on humans and animals”, Toxicology, 167(2), pp. 101–134.
9. Cullen J.M., Newberne P.M., Eaton D., and Groopman J. (1993), “Acute
hepatotoxicity of aflatoxins”, in The Toxicology of Aflatoxins: Human Health,
Veterinary and Agricultural Significance, pp. 3–26.
10. Ayub M., Sachan D. (1997), “Dietary factors affecting aflatoxin bi carcinogenicity,”
Malaysian Journal of Nutrition, (3), pp. 161–197.
11. Ordaz, J. J., Fente, C. A., Vázquez, B. I., Franco, C. M., & Cepeda, A. (2003).
Development of a method for direct visual determination of aflatoxin production by
colonies

of

the

Aspergillus

flavus

group. International

Journal

of

Food

Microbiology, 83(2), 219-225.
12. Arduini, F., Errico, I., Amine, A., Micheli, L., Palleschi, G., & Moscone, D. (2007).
Enzymatic spectrophotometric method for aflatoxin B detection based on
acetylcholinesterase inhibition. Analytical Chemistry, 79(9), 3409-3415.
13. Sobolev, V. S. (2007). Simple, rapid, and inexpensive cleanup method for
quantitation of aflatoxins in important agricultural products by HPLC. Journal of
agricultural and food chemistry, 55(6), 2136-2141.

17