Nghiên cứu môi trường chọn lọc phân lập vi khuẩn phân giải cellulose

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
-------------------------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG CHỌN LỌC
PHÂN LẬP VI KHUẨN PHÂN GIẢI CELLULOSE

HÀ NỘI – 2023


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
-------------------------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG CHỌN LỌC
PHÂN LẬP VI KHUẨN PHÂN GIẢI CELLULOSE

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thu Hoài

Lớp

: K64CNSHA

Mã sinh viên

: 642223

Giảng viên hƣớng dẫn

: ThS. Nguyễn Quốc Trung

HÀ NỘI – 2023


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan tồn bộ số liệu và kết quả đƣợc trình bày trong bài khóa
luận này là hoàn toàn trung thực. Kết quả thu thập đƣợc đều trong q trình
nghiên cứu trực tiếp của tơi dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Nguyễn Quốc Trung,
giảng viên bộ môn SHPT & CNSH Ứng dụng, khoa Công nghệ Sinh học, Học
viện Nông nghiệp Việt Nam.
Tôi xin cam đoan mọi thơng tin đƣợc tham khảo trong bài khóa luận này
đều đƣợc ghi rõ nguồn gốc tại mục tài liệu tham khảo.
Hà Nội, ngày 13 tháng 2 năm 2023
Sinh viên

Nguyễn Thu Hoài

i


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng tới ban Giám đốc Học
viện, thầy cô Khoa Công nghệ sinh học và các thầy, cô đã tạo điều kiện về cơ sở

vật chất và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, rèn luyện, nghiên cứu tại
Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Nguyễn Quốc Trung,
giảng viên bộ môn SHPT & CNSH Ứng dụng và các thầy cô bộ môn, khoa
Công nghệ Sinh học đã tận tình hƣớng dẫn trong suốt quá trình nghiên cứu, thực
hiện và hồn thành khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, anh chị em, bạn bè đã chỉ
dạy, góp ý và động viên trong suốt q trình em thực tập khóa luận này.
Trong q trình thực tập khóa luận, nhận thấy vốn hiểu biết, kinh nghiệm
và kiến thức cịn nhiều hạn chế. Do đó, bài khóa luận này khơng thể tránh khỏi
những thiếu sót, hạn chế và chƣa thể hoàn thiện một cách tốt nhất.
Em rất mong nhận đƣợc sự nhận xét, ý kiến đóng góp và phê bình của
thầy cơ để bài báo cáo đƣợc hồn thiện hơn.
Lời cuối cùng, em xin kính chúc quý thầy cô nhiều sức khỏe, thành công
và hạnh phúc.
Em xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 13 tháng 2 năm 2023
Sinh viên

Nguyễn Thu Hoài

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ iv
DANH MỤC HÌNH .............................................................................................. v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................ vi
TÓM TẮT .......................................................................................................... viii
Chƣơng I: MỞ ĐẦU ............................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề....................................................................................................... 1
1.2. Mục đích ......................................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu ........................................................................................................... 2
Chƣơng II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................... 3
2.1. Tổng quát về cellulose và quá trình phân giải cellulose ................................ 3
2.2. Vi sinh vật phân giải cellulose ....................................................................... 5
2.2.1. Nấm ............................................................................................................. 5
2.2.2. Xạ khuẩn ..................................................................................................... 5
2.2.3. Vi khuẩn ...................................................................................................... 6
2.3. Chế phẩm vi sinh phân giải cellulose............................................................. 7
2.3.1. Một số chế phẩm vi sinh phân giải cellulose tiêu biểu ............................... 7
2.3.2. Chế phẩm vi sinh là gì ? ............................................................................ 10
2.3.3. Cơ chế hoạt động....................................................................................... 10
2.3.4. Vai trò ........................................................................................................ 11
2.3.5. Ứng dụng ................................................................................................... 11
2.4. Các nghiên cứu về môi trƣờng chọn lọc vi khuẩn phân giải cellulose ........ 11
2.5. Các môi trƣờng phân lập vi khuẩn, xạ khuẩn phân giải cellulose ............... 13
Chƣơng III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 16

iii


3.1. Vật liệu ......................................................................................................... 16
3.1.1. Nguyên liệu ............................................................................................... 16
3.1.2. Địa điểm thực hiện .................................................................................... 16
3.1.3. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................... 17
3.1.4. Hóa chất..................................................................................................... 17

3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 18
3.2.1. Lấy mẫu ..................................................................................................... 18
3.2.2. Pha loãng ................................................................................................... 18
3.2.3. Phân lập vi khuẩn phân giải cellulose ....................................................... 18
3.2.4. Phƣơng pháp nhuộm lugol ........................................................................ 20
3.2.5. Phƣơng pháp định danh............................................................................. 21
Chƣơng IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 24
4.1. Kết quả phân lập vi sinh vật trong chế phẩm BIOFIT – Composting trên
môi trƣờng nền ISP4 ............................................................................... 24
4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chất chống nấm fluconazole ............... 25
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của cơ chất CMC ....................................... 27
4.4. Kết quả nhuộm lugol .................................................................................... 30
4.5. Kết quả xác định các chủng vi khuẩn phân lập bằng môi trƣờng chọn
lọc ............................................................................................................ 31
4.5.2. Quan sát kính hiển vi................................................................................. 34
4.6. Kết quả định danh ........................................................................................ 35
CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................... 39
5.1. Kết luận ........................................................................................................ 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 40

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Một số chế phẩm vi sinh phân giải cellulose tiêu biểu ......................... 8
Bảng 2.2. Những môi trƣờng sử dụng để phân lập vi khuẩn, xạ khuẩn phân
giải cellulose ....................................................................................... 14
Bảng 3.1. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ........................................................... 17
Bảng 3.2. Thành phần mơi trƣờng ISP4.............................................................. 18
Bảng 3.3. Thành phần cho quá trình PCR........................................................... 22

Bảng 3.4. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR. .................................................... 22
Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chất chống nấm fluconazole ...... 25
Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của cơ chất CMC.............................. 28
Bảng 4.3. Quan sát hình thái khuẩn lạc............................................................... 32
Bảng 4.4. Kết quả nhuộm Gram và quan sát kính hiển vi .................................. 34

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc cellulose .................................................................................. 3
Hình 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn phân giải cellulose ................................... 24
trên mơi trƣờng ISP4 ........................................................................................... 24
Hình 4.2. Kết quả nhuộm lugol ........................................................................... 31
Hình 4.3. Mẫu khuẩn lạc cần làm thuần ............................................................. 31
Hình 4.4. Thực hiện tách chiết DNA vi khuẩn đã phân lập ................................ 36
Hình 4.5. Kết quả điện di tổng số 7 mẫu vi khuẩn đã phân lập .......................... 36
Hình 4.6. Thực hiện PCR sản phẩm đã tách chiết .............................................. 37
Hình 4.7. Điện di sản phẩm PCR ........................................................................ 37

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
bp

Base pair

CIA

Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1)

CMC

Carboxymethyl Cellulose

CTAB

Cetrimonium Bromua

DNA

Acid Deoxyribonucleic

EDTA

Acid Ethylen Diamine Tetra Acetic

HAB

Hex adecyltrimetyl Ammonium bromid

ISP

International Streptomyces Project

PCR

Polymerase Chain Reaction

TAE

Tris – Acetate EDTA

TE

Tris – EDTA

vii


TĨM TẮT
Cellulose có trong sinh khối là nguồn dinh dƣỡng vô cùng dồi dào cho
các sinh vật khác nhƣng lƣợng cellulose lớn lại bị xử lý bằng cách đốt vừa gây ô
nhiễm vừa làm giảm giá trị dinh dƣỡng mà chúng đem lại. Để lƣợng chất thải
cellulose đạt giá trị cao nhất cần sự trợ giúp phân giải của các vi sinh vật phân
giải chúng nhƣ: nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn. Tuy nhiên, việc sử dụng vi khuẩn làm
nguồn phân giải cellulose hấp dẫn hơn do tính đa dạng, tốc độ tăng trƣởng
nhanh của chúng và khả năng chống chịu, tạo enzyme ổn định trong điều kiện
khắc nghiệt. Nghiên cứu này nhằm xác định môi trƣờng chọn lọc phù hợp để
phân lập vi khuẩn phân giải cellulose. Sử dụng chế phẩm BIOFIT- Composting
làm mẫu phân lập. Tiến hành các nghiên cứu ảnh hƣởng của chất chống nấm
fluconazole và cơ chất CMC đến môi trƣờng phân lập vi khuẩn phân giải
cellulose. Kết quả thu đƣợc nồng độ chất chống nấm fluconazole phù hợp là 100
mg/L, nồng độ cơ chất CMC nên sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn phân giải
cellulose là 12,5g/L. Sử dụng phƣơng pháp nhuộm lugol là phƣơng pháp phù
hợp nhất để xác định khuẩn lạc có hoạt tính enzyme cellulase. Kết quả sàng lọc
đƣợc 7 chủng vi khuẩn phân giải cellulose bằng môi trƣờng chọn lọc.

viii

Chƣơng I: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Khoảng một nửa hợp chất carbon trong sinh khối (biomass) trên mặt đất
là cellulose, chiếm tới 35 – 50% khối lƣợng khô sinh khối thực vật. Tất cả sản
phẩm sinh khối sẽ đƣợc khoáng hóa nhờ hệ thống enzyme đƣợc cung cấp bởi vi
sinh vật. Hệ thống enzyme phân giải cellulose thƣờng chậm và khơng hồn tồn.
Tuy nhiên, trong khoảng thời gian ngắn (48 giờ) hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bị có
thể phân giải 60 – 65% cellulose. Hơn thế nữa, nhờ hệ thống vi sinh vật trong
đƣờng ruột mà loài mối có thể tiêu hóa đến 90% cellulose của gỗ. Cịn trong hệ
thống sinh học phức tạp nhƣ rễ cây hoặc những mảnh vỡ thực vật trong đất,
cellulose có thể đƣợc phân hủy trong khoảng thời gian lâu hơn (Schwarz, 2001).
Hệ vi sinh vật phân giải cellulose có thể lên men hiếu khí hoặc kỵ khí, bình nhiệt
hoặc ái nhiệt, bao gồm: nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn đƣợc tìm thấy nhiều trong:
đất, nƣớc, đƣờng tiêu hóa một số động vật… nơi cung cấp lƣợng cellulose dồi
dào để vi sinh vật phân giải và phát triển. Sau khi thu hoạch các sản phẩm nơng
nghiệp thì phế phụ phẩm cịn tồn đọng rất nhiều trên đồng ruộng. Với phế phẩm
giàu cellulose này, một lƣợng rất ít đƣợc sử dụng để trồng nấm hay làm thức ăn
gia súc, phần lớn đƣợc xử lý theo phƣơng pháp truyền thống là đốt trực tiếp trên
đồng ruộng, điều này gây ra nhiều hậu quả nhƣ góp phần ơ nhiễm khơng khí,
phá hủy hệ sinh thái đất và đất ngày càng bạc màu. Một biện pháp nhằm tận
dụng rơm rạ có hiệu quả hơn đó là sử dụng vi khuẩn có khả năng phân giải
cellulose giúp phân giải rơm rạ thành phân hữu cơ bón cho đất, góp phần cải
thiện độ phì nhiêu đất. Vì lẽ đó mà các nhà nhà nghiên cứu tiến hành phân lập
các vi khuẩn phân giải cellulose để tạo ra các chế phẩm sinh học có thể xử lý
vấn đề trên. Tuy nhiên ở các nghiên cứu trƣớc đó chƣa chỉ ra đƣợc môi trƣờng
chọn lọc cho việc phân lập vi khuẩn phân giải cellulose nên đề tài: “Nghiên cứu

1

môi trƣờng chọn lọc vi khuẩn phân giải cellulose” đƣợc thực hiện nhằm mục
tiêu tối ƣu hóa phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải cellulose.
1.2. Mục đích
Nghiên cứu xác định môi trƣờng chọn lọc phù hợp để phân lập vi khuẩn
phân giải cellulose.
1.3. Yêu cầu
Xác định phƣơng pháp chuẩn bị và pha loãng mẫu để phân lập.
Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất chống nấm fluconazole đến môi trƣờng
phân lập vi khuẩn phân giải cellulose.
Nghiên cứu ảnh hƣởng của cơ chất CMC đến môi trƣờng phân lập vi
khuẩn phân giải cellulose.
Tiến hành phân lập vi khuẩn phân giải cellulose từ chế phẩm BIOFIT–
Composting sử dụng môi trƣờng chọn lọc.

2


Chƣơng II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quát về cellulose và quá trình phân giải cellulose
Cellulose là một polysaccharide đƣợc trùng hợp từ các gốc β-D-glucose
(khoảng 3000 đơn vị glucose trở lên) bằng các liên kết β -1, 4glycoside. Cellulose là hợp chất hữu cơ có nhiều nhất trong tự nhiên chiếm
khoảng 33% trong thành phần cấu trúc cơ bản của thực vật (90% trong bông,
50% trong gỗ,…). Tuy nhiên, con ngƣời khơng tiêu hóa đƣợc, cellulose là nguồn
thức ăn cho động vật ăn cỏ nhƣ: trâu, bò, ngựa,.. và các lồi mối, mọt cơn
trùng,…Sở dĩ chúng tiêu hóa đƣợc cellulose là nhờ hệ thống vi sinh vật phân
giải cellulose bên trong dạ dày và ruột của chúng. Nhờ khả năng tự dƣỡng dƣới
ánh sáng của thực vật mà cellulose trở thành một nguyên liệu thô vô cùng dồi
dào hấp dẫn để sản xuất nhiều sản phẩm hàng hóa quan trọng trong cơng nghiệp.

Cellulose có cấu trúc mạch thẳng, dạng sợi rất bền nên khó bị phân hủy (Heidi
Lynn & cs., 2012). Chính vì vậy, phần lớn chất thải cellulose thƣờng đƣợc xử lý
bằng cách đốt sinh khối, không chỉ giới hạn ở các nƣớc đang phát triển mà còn
đƣợc coi là một hiện tƣợng toàn cầu. Với sự trợ giúp của hệ thống enzyme phân
giải cellulose, cellulose có thể đƣợc chuyển đổi thành glucose, một sản phẩm đa
năng, trong một quy trình thuận lợi về mặt sinh học và rẻ hơn nhiều.

Hình 2.1. Cấu trúc cellulose
Nguồn: (Heidi Lynn & cs., 2012)

3


Quá trình phân giải cellulose về cơ bản là quá trình sinh học đƣợc kiểm
sốt và xử lý bởi các enzyme của hệ thống cellulase. Hệ thống enzym cellulase
bao gồm ba loại enzym hòa tan ngoại bào: 1, 4- β -endoglucanase, 1, 4- βexoglucanase,

và β-glucosidase

( β-

D-

glucoside

glucohydrolase

hay

cellobiase). Endoglucanase chịu trách nhiệm phân cắt ngẫu nhiên các liên kết β1, 4- glycosid dọc theo chuỗi cellulose. Exoglucanase cần thiết cho sự phân cắt

đầu không khử của chuỗi cellulose và tách các sợi sơ cấp từ cellulose tinh thể,
và β- 1, 4- glucosidase thủy phân cellobiose và cellodextrin tan trong nƣớc thành
glucose. Chỉ có sức mạnh tổng hợp của ba loại enzyme trên mới có thể thủy
phân hồn tồn cellulose thành glucose hoặc khống hóa triệt để thành H2O và
CO2.
Nguồn chiết xuất enzyme phân giải cellulose phù hợp nhất là từ hệ vi sinh
vật đƣợc tìm thấy trong ruột của các sinh vật phát triển mạnh nhờ sinh khối
cellulose làm thức ăn chính của chúng nhƣ: các lồi cơn trùng nhƣ mối
( Isopteran ), mọt sách ( Lepidoptera ) hay trâu, bò, dê,ngựa, v.v., đƣợc phát hiện
có hệ vi sinh vật cộng sinh tổng hợp trong ruột chịu trách nhiệm tiêu hóa thức ăn
cellulose. Nhiều vi sinh vật đã đƣợc báo cáo với các hoạt động phân giải
celulose bao gồm nhiều chủng vi khuẩn và nấm, cả hiếu khí và kỵ
khí. Chaetomium,

Fusarium

Myrothecium,

Trichoderma, Penicillium,

Aspergillus, v.v., là một số loài nấm đƣợc báo cáo sản sinh enzyme phân giải
cellulose. Các loài vi khuẩn phân giải cellulose nhƣ: Trichonympha,
Clostridium,

Actinomycetes,

Bacteroides

succinogenes,

Butyrivibrio

fibrisolvens, Ruminococcus albus, và Methanobrevibacter ruminantium,…
Enzyme thủy phân cellulose do khả năng ứng dụng rộng rãi của nó đã
đƣợc sử dụng trong các quy trình cơng nghiệp khác nhau nhƣ: nhiên liệu sinh
học (cồn sinh học), quá trình metan hóa sinh học ba pha: quản lý chất thải nông
nghiệp và thực vật; nghiên cứu tách đối xứng và liên kết phối tử. Các dẫn xuất

4


cellulose khác đƣợc sử dụng làm chất kết dính, chất nổ, chất làm đặc cho thực
phẩm và trong lớp phủ chống ẩm.
2.2. Vi sinh vật phân giải cellulose
Đã có rất nhiều nghiên cứu lớn, nhỏ tiến hành phân lập các loài vi sinh vật
sinh enzyme phân giải cellulose và đánh giá khả năng phân giải cellulose của
chúng. Các vi sinh vật phân giải cellulose chủ yếu đƣợc phân lập từ hệ tiêu hóa
của động vật ăn cỏ nhƣ: trâu, bị, dê, cừu và một số lồi cơn trùng dùng cellulose
làm nguồn thức ăn chính nhƣ: mối, mọt, bọ cánh cứng. Ngồi ra, chúng cịn tồn
tại trong phân ủ, phân hữu cơ, bùn từ nƣớc thải.
2.2.1. Nấm
Nấm là sinh vật có cơ chế sinh hóa độc đáo trong phân giải cơ chất tạo
những sản phẩm bậc hai đặc biệt, đây là nhóm đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong
trong lĩnh vực phân hủy cellulose. Các enzyme phân giải cellulose từ nấm hầu
hết có hoạt lực cao và dƣờng nhƣ khơng có cấu trúc vật lý phức tạp nhƣ enzyme
này từ vi khuẩn.
Một số lồi có vai trị quan trọng trong quy trình phân hủy cellulose ở
nhiều môi trƣờng khác nhau nhƣ: Acremonium spp., Chaetomium spp.,
Trichoderma

reesei,

Trichoderma

viride,

Penicillium

pinophilum,

Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani, Talaromyces emersonii,
Trichoderma koningii, Fusarium oxysporium, Aspergillus niger, Aspergillus
terreus and Rhiropus oryzae.
2.2.2. Xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là vi khuẩn gram (+) có dạng sợi nhƣ nấm.
Chúng là những vi sinh vật hiếu khí tồn tại ở khắp mọi nơi trong tự nhiên. DNA
của xạ khuẩn bao gồm rất nhiều G và C (chiếm khoảng 57-75%). Chúng chiếm
ƣu thế trong đất phèn khơ. Xạ khuẩn cịn đƣợc biết đến nhiều bởi các sản phẩm
chuyển hóa bậc hai, nổi bật là các loại kháng sinh nhƣ: streptomycin,

5


gentamicin, rifamycin và erythomycin. Xạ khuẩn rất quan trọng trong công
nghiệp dƣợc phẩm và nông nghiệp.
Streptomyces là giống chủ đạo trong xạ khuẩn, đây cũng là vi sinh vật sản
sinh enzyme phân giải cellulose rất đƣợc quan tâm nghiên cứu. Một số loại đáng
chú ý thuộc giống này nhƣ: Streptomyces reticuli, Streptomyces drozdowiczii,
Streptomyces lividans.
Thermoactinomyces đƣợc tìm thấy trong trầm tích đại dƣơng

Streptosporangium đƣợc tìm thấy trong quặng apatit cũng có khả năng phân giải
cellulose.
2.2.3. Vi khuẩn
Các loài vi khuẩn phân giải cellulose bao gồm: Clostridium, Bacteroides
sucinogenes,

Butyrivibrio

Methanobrevibacter

fibrisolvens,

ruminatium,

Ruminococcus

Siphonobacter

albus,

aquaeclarae,

Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans, Ochrobactrum cytisi,
Ochrobactrum haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia riboflavia, Labrys
neptuniae, Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter freundii và
Pseudomonas nitroreduces. Các loài này phần lớn là vi sinh vật kị khí, chúng
đƣợc phân lập từ ruột của các loài động vật sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn.
Trong lòng đất ngƣời ta cũng phân lập đƣợc các vi khuẩn gram (+) hiếu
khí nhƣ: Brevibacillus, Paenibacillus, Bacillus và Geobacillus. Đối với các loài
ƣa ấm, PH và nhiệt độ tối ƣu cho enzyme carbonmethyl cellulase của chúng hoạt

động là 5,5 và 55°C còn đối với các dòng ƣa nhiệt là 5,0 và 75°C.
Hiện nay, phần lớn các cellulase trong phịng thí nghiệm và thƣơng mại
thu đƣợc từ nấm: chủ yếu là Trichoderma, Aspergillus và Penicillium do hoạt
tính enzyme và khả năng thủy phân cao của chúng. Tuy nhiên, cellulase có
nguồn gốc vi khuẩn hấp dẫn hơn do tính đa dạng tự nhiên và tốc độ tăng trƣởng
cao của vi khuẩn tiết ra chúng. Quan trọng hơn, vi khuẩn sống trong nhiều hốc
mơi trƣờng khác nhau có khả năng chọn lọc các chủng phân giải tế bào có khả

6


năng chống lại các áp lực môi trƣờng cực cao. Hơn nữa, những chủng này
thƣờng tạo ra các enzyme ổn định trong điều kiện khắc nghiệt. Nhiều chi vi
khuẩn đƣợc mô tả trong tài liệu là những nhà sản xuất cellulase ngoại bào, bao
gồm: Acetivibrio, Alteromonas, Bacillus, Clostridium, Cellulomonas và
Ruminococcus. Chi Bacillus vẫn đƣợc nghiên cứu nhiều nhất và đƣợc trích dẫn
nhiều nhất. Các lồi thuộc chi này đƣợc phân lập từ nhiều loại môi trƣờng khác
nhau cho phép chúng chống lại các áp lực lý hóa và do đó chúng là những loài
sản xuất đầy hứa hẹn tạo ra các enzym phân hủy cellulose ƣa kiềm, ƣa nhiệt, ƣa
lạnh, ƣa axit và ƣa mặn. Bacillus spp. là một trong những vi khuẩn hấp dẫn nhất
trong công nghệ sinh học công nghiệp; đặc biệt, đối với việc sản xuất cellulase,
chúng thƣờng đƣợc ni cấy dễ dàng và nhanh chóng, có rất ít yêu cầu về dinh
dƣỡng và tạo ra một lƣợng lớn enzyme. Ngoài ra, gần đây ngƣời ta đã nỗ lực rất
nhiều để xác định các chủng Bacillus chịu đƣợc môi trƣờng cực khắc nghiệt: ƣa
mặn, ƣa nhiệt, ƣa lạnh, ƣa axit và ƣa kiềm, ƣa khô và các gen của chúng liên
quan đến việc sản xuất cellulase.
2.3. Chế phẩm vi sinh phân giải cellulose
2.3.1. Một số chế phẩm vi sinh phân giải cellulose tiêu biểu
Trên thực tế, hiện nay có rất nhiều loại chế phẩm vi sinh đã và đang
đƣợc sử dụng ngày càng rộng rãi. Các chế phẩm đƣợc sử dụng trong trồng trọt,

chăn nuôi và xử lý mơi trƣờng đem lại lợi ích kinh tế cao và môi trƣờng xanh –
sạch – đẹp.

7


Bảng 2.1. Một số chế phẩm vi sinh phân giải cellulose tiêu biểu
STT
1

Hình ảnh

Tên chế phẩm và
Thành phần vi sinh
cơng bố
nguồn gốc
Chế phẩm vi sinh xử Bacillus sp.,
lý chất thải hữu cơ

Saccharomyces sp.,

EMZEO đƣợc cung

Lactobacillus sp.,

cấp bởi Công ty

Actinomyces.

TNHH Công Nghệ

sinh học Đức Bình
2

Phân vi sinh vật

Trichoderma spp.,

TRICHODERMA

Bacillus subtilis.

đƣợc cung cấp bởi
Công ty TNHH Điền
Trang

3

Chế phẩm vi sinh

Bacillus subtilis,

phân giải xenlulo

Nitrosomonas spp.,

BIOFIT Composting Cellulomonas spp.,
đƣợc cung cấp bởi

Saccharomyces

Công ty TNHH Sao

cerevisiae,

Vàng MEKONG

Trichoderma spp.

8


4

Chế phẩm sinh học

Trichoderma sp.,

HLC 01

Bacillus.

TRICHODERMA
BACILLUS (Vi nấm
– Enzyme) đƣợc
cung cấp bởi Công
ty cổ phần HLC Hà
Nội
5

Chế phẩm vi sinh xử Bacillus subtillis,

lý phế thải hữu cơ

Bacillus licheniformis,

EMUNIV

Bacillus bategarium,
Lactobacillus
acidophilus,
Lactobacillus
planetarium,
Streptomyces sp.,
Saccharomyces
cerevisiae.

6

Phân bón hữu cơ vi

Azotobacter sp.,

sinh SƠNG GIANH

Aspergillus sp.,

VS-01 đƣợc cung

Bacillus sp.

cấp bởi Công ty cổ

phần Tổng Công ty
Sông Gianh

9


7

TRICHOMIX-DT

Trichoderma spp.,

phân bón hữu cơ vi

Streptomyces spp.,

sinh Tricho-Organic

Bacillus subtilis.

đƣợc cung cấp bởi
Công ty TNHH Điền
Trang

2.3.2. Chế phẩm vi sinh là gì ?
Chế phẩm vi sinh cịn đƣợc gọi là chế phẩm sinh học hay men vi sinh có
tên khoa học là Probiotic. Chúng là tập hợp các dòng vi sinh vật lợi khuẩn, có
khả năng phân hủy các chất thải hữu cơ gây ô nhiễm môi trƣờng thành các chất
dinh dƣỡng hay bổ sung dinh dƣỡng từ những vi khuẩn hay vi nấm có lợi.
Những vi sinh vật này vẫn còn sống trong chế phẩm và hoạt động trở lại khi

chúng ta sử dụng.
2.3.3. Cơ chế hoạt động
Các vi sinh vật có lợi trong chế phẩm cạnh tranh thức ăn, tiêu diệt các vi
sinh vật có hại cho đối tƣợng sản xuất, hạn chế, loại bỏ các mầm bệnh nguy
hiểm cho con ngƣời và vật ni. Trong q trình sinh trƣởng và phát triển, nhiều
loại vi sinh vật tiết ra các enzyme phân giải chất hữu cơ, protein, lipit,…có trong
rác thải, nƣớc thải góp phần làm sạch nguồn nƣớc và tạo ra phân hữu cơ làm
tăng nguồn dinh dƣỡng cho nhu cầu của đối tƣợng sản xuất nâng cao hiệu quả
sản xuất nơng nghiệp.
Các lồi vi sinh vật này khi sử dụng làm thức ăn chăn nuôi sẽ tăng cƣờng
hệ miễn dịch, kích thích tiêu hóa và tăng khả năng tăng trƣởng, phát triển. Từ
đó, nâng cao hiệu quả chăn nuôi.

10


2.3.4. Vai trò
Tiêu diệt vi khuẩn và xử lý các vấn đề liên quan đến ô nhiễm môi trƣờng:
vi khuẩn có lợi cạnh tranh sự sống với các vi khuẩn khác làm tăng khả năng đề
kháng, ngăn chặn mầm bệnh và xử lý rác thải, nƣớc thải,…
Kích thích sự tăng trƣởng và phát triển lành mạnh, cải thiện hệ tiêu hóa:
dinh dƣỡng tạo dƣỡng tạo ra nhờ enzyme tiết ra từ hệ vi sinh vật giúp cây trồng
phát triển toàn diện mà không gây dƣ thừa, ngộ độc đất nhƣ các loại phân hóa
học truyền thống, cịn hệ lợi khuẩn có trong chế phẩm sử dụng làm thức ăn chăn
ni sẽ giúp hệ tiêu hóa của vật ni khỏe mạnh, từ đó vật ni sinh trƣởng,
phát triển tốt, đem lại hiệu quả kinh tế cao.
2.3.5. Ứng dụng
Sử dụng trong nông nghiệp nhằm tăng cƣờng chất dinh dƣỡng, giảm thiểu
ô nhiễm, ngộ độc cây và đất trồng: làm phân bón vi sinh, làm thuốc trừ sâu sinh
học, xử lý nguồn nƣớc,…

Xử lý chất thải sinh hoạt: thơng tắc đƣờng ống thốt nƣớc, bồn cầu,…
Sử dụng trong nuôi trồng thủy sản: tăng cƣờng hệ tiêu hóa, miễn dịch cho
đàn thủy sản, giảm thiểu khí độc, cải thiện tình trạng ơ nhiễm nguồn nƣớc
nuôi,…

Xử lý ao nuôi trồng thủy sản: xử lý, phân hủy chất hữu cơ, tảo, loại

bỏ các khí độc tích tụ dƣới đáy ao ni tơm, cá (H2S, NH3,…). Góp phần cải tạo
mơi trƣờng ni và phịng trừ dịch bệnh cho vật nuôi,…
Sử dụng trong chăn nuôi: thay thế chất kháng sinh để phịng ngừa bệnh
cho vật ni, cải thiện và nâng cao hệ tiêu hóa cho vật ni,…
Xử lý chất thải trong chăn ni: loại bỏ vi khuẩn có hại và mùi hơi (NH3)
có trong phân và nƣớc tiểu của vật nuôi,…
2.4. Các nghiên cứu về môi trƣờng chọn lọc vi khuẩn phân giải cellulose
Balla et al. 2022 đã sử dụng 398 mẫu vi khuẩn phân lập từ các hệ sinh thái
khác nhau ở Algeria để đo hoạt tính trên thang CMC 1%. Có 26 chủng có phản

11


ứng, trong đó có 12 chủng mang hoạt tính mạnh nhất. Dựa vào hoạt động của
enzyme cellulase và sự ổn định dƣới các áp lực khác nhau, nhóm tác giả đã chọn
đƣợc 5 chủng hiệu quả nhất và kiểm tra các tính chất lý hóa của chúng.
Nguyễn Thị Thúy Nga Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã phân lập
đƣợc 25 chủng phân giải cellulose từ 30 mẫu đất. Trong đó, tuyển chọn đƣợc 10
chủng phân giải cellulose mạnh và 2 chủng mạnh nhất (đƣờng kính phân giải
cellulose 25 mm) phù hợp với môi trƣờng dinh dƣỡng PD và Hutchison khơng
có thạch, thời gian ni cấy nhân sinh khối là khoảng 5 – 6 ngày.
Rawway et al. 2018 dựa trên kết quả nghiên cứu trƣớc đó cho biết 177
mẫu (89,16%) phân lập có sản sinh enzyme cellulase và 13 mẫu ( 10,83%) có

biểu hiện âm tính. Trong số 107 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc, 10 chủng có khả
năng sản sinh enzyme cellulase mạnh (2 chủng mạnh nhất là CDB6 và CDB10
với năng suất lần lƣợt là 7,268 và 7,724 U/ml trên FPCase. Hoạt tính tối đa của
thí nghiệm với CMCase là 11,077 U/ml với phân lập CDB6 và 12,151 U/ml với
CDB10.
Li et al. 2020 đã phân lập vi khuẩn phân giải cellulose từ các mẫu phân
của lợn nái bằng môi trƣờng LB rắn và LB lỏng rồi tiến hành đo hoạt tính
carboxymethyl cellulase (CMCase) bằng phƣơng pháp so màu acid
dinitrosalicylic (DNS). Ngồi ra, nhóm tác giả cịn tiến hành định tính (khả năng
chịu nhiệt, khả năng thủy phân tinh bột,…) và định danh chúng bằng giải trình
tự gen 16s.
Kasana et al. 2008 so sánh các cách sàng lọc hoạt tính cellulase bằng
HAB (hex adecyltrimethyl ammonium bromid), Congo Red và Gram’s Iodine
và cho thấy rằng sử dụng Gram’s Iodine cho kết quả nhanh nhất (chỉ mất 3 – 5
phút, nhanh gấp 10 lần so với dùng HBA và Congo Red). Không chỉ vậy, sử
dụng Gram’s Iodine nhuộm cellulase cho vùng sáng rõ ràng, sắc nét và tránh
đƣợc việc sử dụng các hóa chất độc hại. Phƣơng pháp này đƣợc đề xuất sử dụng

12


để sàng lọc số lƣợng lớn vi sinh vật (sử dụng đƣợc cho cả nấm, vi khuẩn và xạ
khuẩn).
Chatterjee et al. 2021 đã phân lập từ đất trên môi trƣờng CMC thu đƣợc
37 chủng vi khuẩn, trong đó có 6 chủng vi khuẩn phân giải cellulose. Nhóm tác
giả tiến hành đo hoạt tính enzyme cellulase bằng phƣơng pháp nhuộm với
Congo Red.
Liang et al. 2014 đã phân lập từ đất bằng môi trƣờng Czapek thu đƣợc
245 chủng vi khuẩn phân giải cellulose, trong đó có 22 chủng có vùng sáng khi
nhuộm bằng Congo Red. Trong 22 chủng ấy, có 3 chủng tạo ra đƣợc CMCase.

Nghiên cứu này cho thấy sự đa dạng của vi khuẩn phân giải cellulose.
Wilson et al. 2011 đã nghiên cứu về sự đa dạng của vi sinh vật phân giải
cellulose và có những phát hiện mới thú vị từ việc áp dụng kỹ thuật gen và
metagenomic, vẫn còn nhiều điều về cơ chế phân giải cellulose mà con ngƣời
chƣa hiểu đƣợc.
2.5. Các môi trƣờng phân lập vi khuẩn, xạ khuẩn phân giải cellulose
Dựa trên các bài báo, bài nghiên cứu khoa học từ trƣớc đến nay, có rất
nhiều môi trƣờng đƣợc các tác giả sử dụng để phân lập vi khuẩn xạ khuẩn. Mỗi
mơi trƣờng lại có những ƣu điểm riêng, phù hợp với từng nhu cầu sử dụng của
cá nhân.
Dƣới đây là một và môi trƣờng hay đƣợc dùng để phân lập vi khuẩn, xạ
khuẩn phân giải cellulose.

13


Bảng 2.2. Những môi trƣờng sử dụng để phân lập vi khuẩn, xạ khuẩn
phân giải cellulose
STT Tên môi trƣờng Thành phần môi trƣờng
1

Môi trƣờng Hans K2HPO4 0,5 g
KH2PO4 0,5 g
(NH4)2SO4 1,0 g
MgSO4.7H2O 0,1 g
CaCl2 0,1 g
NaCl 6,0 g
Cao nấm men 0,1 g
Xenlulo tự nhiên (bột xenlulo, bột giấy v.v…) 10,0 g
Thạch bột 15,0 g

Nƣớc cất vừa đủ 1000 ml, pH = 7,0

2

Môi trƣờng Ken K2HPO4 1,0 g
Knight

NaNO3 0,1 g
KCl 0,1 g
MgSO4.7H2O 0,1 g
Xenlulo tự nhiên (bột xenlulo, bột giấy v.v…) 10,0 g
Thạch bột 15,0 g
Nƣớc cất vừa đủ 1000 ml, pH= 7,0 – 7,2.

3

Môi
Gauze

trƣờng KH2PO4 0,5 g
KNO3 1,0 g
NaCl 0,5 g
MgSO4.7H2O 0,5 g
FeSO4 0,01 g
Xenlulo tự nhiên (bột xenlulo, bột giấy v.v…) 10,0 g

14


Thạch bột 15,0 g

Nƣớc cất vừa đủ 1000 ml, pH: 7,0
4

Môi trƣờng ISP ISP1: Tryptone 5g, cao nấm men 3g, pH = 7.0
(International

ISP2: Cao nấm men 4g, dịch chiết Malt 10g, glucose

Streptomyces

4g, pH = 7.3

Project)

ISP3: Yến mạch 20g, dd muối vi lƣợng 1ml, pH = 7.0
ISP4: Tinh bột 10g, K2HPO4 1g, MgSO4.7H2O 1g,
NaCl 1g, (NH4)2SO4 2g, CaCO3 2g, dd muối vi lƣợng
1ml, pH = 7.0
ISP5: L – asparagin 1g, glyxerin 10g, K2HPO4 1g, dd
muối vi lƣợng 1ml, pH = 7.0
ISP6: Peptone 10g, cao nấm men 1g, xitrat sắt 0,5g,
pH = 7.0
ISP7: Glyxerin 15g, L – tyrosin 0,5g, L – asparagin
1g,
K2HPO4

0,5g,

MgSO4.7H2O

0,5g, NaCl

0,5g,

FeSO4.7H2O 0,01g, dd muối vi lƣợng 1ml, pH = 7.0
Nƣớc cất cho mỗi môi trƣờng là 1000ml.
Trong các môi trƣờng trên, mơi trƣờng ISP4 có nguồn carbon dễ thay thế
nhất nên ở nghiên cứu này, chọn ISP4 làm môi trƣờng nền để phân lập cellulose.

15