Nghiên cứu tác dụng ức chế vi khuẩn và đánh giá hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa của hạt bí ngô

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC


KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ VI KHUẨN VÀ
ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG POLYPHENOL, HOẠT
TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA
HẠT BÍ NGƠ

HÀ NỘI – 2023


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC


KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ VI KHUẨN
VÀ ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG POLYPHENOL,
HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA
HẠT BÍ NGƠ
Người thực hiện

: Lê Thị Phương Oanh

Mã số sinh viên

: 645673

Lớp

: K64CNSHA

Khoa

: Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn

: PGS.TS. Nguyễn Thanh Hải
: TS. Nguyễn Thị Thanh Hà

Bộ môn

: CNSH Thực vật

HÀ NỘI – 2023
2


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi, có sự hỗ trợ từ
Giảng viên hướng dẫn là PGS.TS Nguyễn Thanh Hải và TS. Nguyễn Thị Thanh
Hà. Các số liệu, hình ảnh, bảng biểu và kết quả trong đề tEthanol là trung thực,
khách quan; chưa từng được cơng bố trong bất cứ cơng trình nghiên cứu nào
trước đây.

Tôi cam đoan rằng những tài liệu tham khảo sử dụng trong khố luận đều
được trích dẫn một cách đầy đủ, đồng thời ghi rõ ràng về nguồn gốc trong danh
mục tài liệu kham khảo của khoá luận theo quy định của nhà trường.
Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm
về nội dung báo cáo của mình.

Hà Nội, ngày 3 tháng 1 năm 2023
Sinh viên

Lê Thị Phương Oanh

i


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt
Nam, thầy cô bộ mơn Cơng nghệ sinh học thực vật cùng tồn thể các thầy cô
trong khoa Công nghệ sinh học đã xây dựng chương trình đào tạo phù hợp, giúp
em có cơ hội học tập trong mơi trường bổ ích cũng như tạo điều kiện để em
được học hỏi, nghiên cứu và hồn thành khố luận tốt nghiệp này.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Thanh
Hải và TS. Nguyễn Thị Thanh Hà đã tận tình hướng dẫn, luôn quan tâm, ủng hộ
và tạo điều kiện tốt nhất để em có thể hồn thành khố luận tốt nghiệp của mình.
Trong suốt thời gian làm khố luận cùng với sự hướng dẫn của thầy cô, em
không chỉ học hỏi được những bài học, kinh nghiệm quý giá liên quan đến q
trình nghiên cứu mà cịn trau dồi thêm được nhiều kĩ năng, kiến thức bổ ích
trong cuộc sống.
Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các anh chị, các bạn và các em
tại địa điểm thực tập – Bộ môn Nội - Chẩn - Dược - Độc chất, khoa Thú y đã
nhiệt tình giúp đỡ, đồng hành và động viên em trong suốt thời gian làm khoá

luận tại đây.
Cuối cùng, em xin gửi tới gia đình, bạn bè và những người yêu thương em
một lời cảm ơn sâu sắc. Cảm ơn vì đã ln dành sự quan tâm, sẵn sàng chia sẻ,
đặt niềm tin tuyệt đối để em có động lực và tinh thần tốt trong suốt q trình học
tập, nghiên cứu.
Kính chúc thầy cơ, gia đình và mọi người thật nhiều sức khoẻ, hạnh phúc
và thành công!
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 3 tháng 1 năm 2023
Sinh viên

Lê Thị Phương Oanh

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... ii
MỤC LỤC ........................................................................................................ iii
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................... vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... ix
TÓM TẮT KHÓA LUẬN .................................................................................. x
PHẦN I: MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................. 1
1.2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 3
1.3. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 3
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4
2.1. Giới thiệu về hạt bí ngơ .............................................................................. 4

2.1.1. Đặc điểm .................................................................................................. 4
2.1.2. Phân bố .................................................................................................... 4
2.1.3. Thành phần hóa học.................................................................................. 5
2.1.4. Tác dụng................................................................................................... 5
2.2. Nhu cầu sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược tự nhiên trên thế giới ....... 6
2.3. Tình hình các nghiên cứu tác dụng của dịch chiết hạt bí ngơ ...................... 8
2.3.1. Nghiên cứu ở nước ngoài ......................................................................... 8
2.3.2. Nghiên cứu trong nước ........................................................................... 10
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................... 11
3.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 11
3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu........................................................... 11
3.1.2. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................. 11
3.1.3. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị ...................................................................... 11
3.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 12
iii


3.2.1. Phương pháp chiết xuất dược liệu........................................................... 12
3.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết dược liệu trên
vi khuẩn

....................................................................................................... 17

3.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol ........................................ 19
3.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa...................................... 22
3.2.5. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................... 28
4.1. Kết quả đường kính vịng vơ khuẩn của các loại dịch chiết hạt bí ngơ trước
và sau khi tác dụng nhiệt .................................................................................. 29
4.1.1. Kết quả đường kính vịng vơ khuẩn của các loại dich chiết hạt bí ngơ khi
chưa tác dụng nhiệt .......................................................................................... 29

4.1.2. Kết quả đường kính vịng vơ khuẩn của các loại dịch chiết hạt bí ngơ đã
xử lý nhiệt ....................................................................................................... 37
4.1.3. So sánh kết quả đường kính vịng vơ khuẩn của các loại dịch chiết hạt bí
ngơ khi chưa và đã xử lý nhiệt.......................................................................... 45
4.2. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số của các dịch chiết dược
liệu

............................................................................................................. 46

4.2.1. Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết hạt bí ngơ ........... 46
4.3. Kết quả xác định hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết hạt bí ngơ ... 47
4.3.1. Kết quả xác định khả năng chống oxy hóa của dịch chiết hạt bí ngơ ...... 47
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................... 52
5.1. Kết luận ..................................................................................................... 52
5.2. Kiến nghị................................................................................................... 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 53
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 57

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Sự thay đổi giá trị OD theo nồng độ chất chuẩn acid chlorogenic .... 21
Bảng 3.2: Hoạt tính chống oxy hóa của chất chuẩn VTME xác định theo
phương pháp sử dụng DPPH tại các nồng độ khác nhau (AA%)....... 24
Bảng 3.3: Hoạt tính chống oxy hóa của chất chuẩn trolox xác định theo
phương pháp sử dụng ABTS tại các nồng độ khác nhau (AA%)....... 27
Bảng 4.1: Đường kính vịng vơ khuẩn của dịch chiết hạt bí ngơ aceton khi
chưa tác dụng nhiệt........................................................................... 30
Bảng 4.2: Đường kính vịng vơ khuẩn của dịch chiết hạt bí ngơ DW khi chưa

tác dụng nhiệt ................................................................................... 30
Bảng 4.3: Đường kính vịng vơ khuẩn của dịch chiết hạt bí ngơ ethanol khi
chưa tác dụng nhiệt........................................................................... 31
Bảng 4.4: Đường kính vịng vơ khuẩn của dịch chiết hạt bí ngơ ethyl acetat
khi chưa tác dụng nhiệt ..................................................................... 33
Bảng 4.5: Đường kính vịng vơ khuẩn của dịch chiết hạt bí ngơ methanol khi
chưa tác dụng nhiệt........................................................................... 34
Bảng 4.6: Đường kính vịng vơ khuẩn của dịch chiết hạt bí ngơ hexan khi
chưa tác dụng nhiệt........................................................................... 35
Bảng 4.7: Đường kính vịng vơ khuẩn của dịch chiết hạt bí ngơ aceton khi tác
dụng nhiệt......................................................................................... 39
Bảng 4.8: Đường kính vịng vơ khuẩn của dịch chiết hạt bí ngơ ethanol khi tác
dụng nhiệt......................................................................................... 40
Bảng 4.9: Đường kính vịng vơ khuẩn của dịch chiết hạt bí ngơ hexan khi tác
dụng nhiệt......................................................................................... 41
Bảng 4.10: Đường kính vịng vơ khuẩn của dịch chiết hạt bí ngơ methanol khi
tác dụng nhiệt ................................................................................... 42
Bảng 4.11: Đường kính vịng vơ khuẩn của dịch chiết hạt bí ngơ DW khi tác
dụng nhiệt......................................................................................... 43
Bảng 4.12: Đường kính vịng vơ khuẩn của dịch chiết hạt bí ngơ ethyl acetat
khi tác dụng nhiệt ............................................................................. 44
Bảng 4.13: Khả năng chống oxy hóa của dịch chiết đo bằng thuốc thử DPPH . 47
Bảng 4.14: Khả năng chống oxy hóa các dịch chiết đo bằng thuốc thử ABTS.. 49
v


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Cây và hạt bí ngơ ................................................................................ 4
Hình 3.1: Li tâm và lọc loại bỏ cặn dược liệu trong các dung mơi hữu cơ ........ 13
Hình 3.2: Lọc dược liệu trong dung môi nước cất 2 lần.................................... 13

Hình 3.3: Máy cơ quay chân khơng .................................................................. 14
Hình 3.4. A: Dầu trong dịch chiết với các dung môi hữu cơ ............................. 15
Hình 3.5: Dịch chiết dược liệu thu được sau khi hồ cao .................................. 15
Hình 3.6: Dịch chiết dược liệu được pha loãng ở các nồng độ khác nhau ......... 16
Hình 3.7: Dược liệu hạt bí ngơ đã sơ chế.......................................................... 17
Hình 3.8: Khuẩn lạc G. philus trên mơi trường ni cấy MHA ........................ 17
Hình 3.9. Nhỏ dược liệu tại các nồng độ khác nhau trên môi trường nuôi cấy
khuẩn (MHA) ................................................................................... 18
Hình 3.10: Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết hạt bí ngơ ............................ 19
Hình 3.11: Cơ chế của phản ứng chuyển màu trong xác định hàm lượng
polyphenol tổng số, sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu's phenol ...... 20
Hình 3.12: Mối tương quan giữa nồng độ của acid chlorogenic (mg/ml) với
mức độ gia tăng giá trị đo mật độ quang ........................................... 21
Hình 3.13. Sự thay đổi màu sắc của dung dịch Folin-Ciocalteu tạo ra bởi hàm
lượng polyphenol của axit cholorogenic (chất chuẩn) tại các nồng
độ khác nhau (mg/ml) ....................................................................... 22
Hình 3.14: Cơ chế của phản ứng chuyển màu trong xác định hoạt tính chống
oxy hóa sử dụng thuốc thử DPPH ..................................................... 23
Hình 3.15: Mối tương quan giữa hàm lượng chất chuẩn VTM E (mg/ml) và
khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH ..................................................... 24
Hình 3.16: Sự thay đổi màu sắc của dung dịch DPPH tạo ra bởi hoạt tính
chống oxy hóa của VTME (chất chuẩn) tại các nồng độ khác nhau
(mg/ml) ............................................................................................ 25

vi


Hình 3.17: Cơ chế của phản ứng chuyển màu trong xác định hoạt tính chống
oxy hóa sử dụng thuốc thử ABTS ..................................................... 26
Hình 3.18: Mối tương quan giữa hàm lượng chất chuẩn trolox (mg/ml) và khả

năng bắt gốc tự do ABTS2+ ............................................................... 27
Hình 3.19: Sự thay đổi màu sắc của dung dịch ABTS tạo ra bởi hoạt tính
chống oxy hóa của chất chuẩn trolox tại các nồng độ khác nhau
(mg/ml) ............................................................................................ 28
Hình 3.20: Máy quang phổ so màu 722 Ultra Violet - Visibility Spectrum,
cơng ty Jinghua, Trung Quốc ............................................................ 28
Hình 4.1: Đánh giá sự ảnh hưởng của DMSO theo các nồng độ (hình A) và
pH của DMSO (hình B) đến sự phát triển của vi khuẩn .................... 29
Hình 4.2: Vịng vơ khuẩn của dịch chiết hạt bí ngơ chưa tác dụng nhiệt
ethanol trên vi khuẩn S. aureus tại nồng độ 2g/ml ............................ 32
Hình 4.3: Vịng vơ khuẩn của dịch chiết hạt bí ngơ chưa tác dụng nhiệt
ethanol trên vi khuẩn Sal tại nồng độ 2g/ml ...................................... 32
Hình 4.4: Vịng vơ khuẩn của dịch chiết hạt bí ngơ chưa tác dụng nhiệt -ethyl
acetat trên vi khuẩn G. philus ........................................................... 33
Hình 4.5: Vịng vơ khuẩn của dịch chiết hạt bí ngơ chưa tác dụng nhiệt methanol trên vi khuẩn B. sub .......................................................... 34
Hình 4.6: Vịng vơ khuẩn của dịch chiết hạt bí ngô chưa tác dụng nhiệt -hexan
trên vi khuẩn G. philus tại nồng độ 2 g/ml ........................................ 35
Hình 4.7: Biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn khơng tn theo quy luật về nồng
độ (đường kính vịng vơ khuẩn tại nồng độ 2 < nồng độ 1; 0.5 g/ml) 37
Hình 4.8: Dịch chiết hạt bí ngơ đã tác dụng nhiệt khơng có hoạt tính kháng
khuẩn trên E. coli ATCC 85922, E. coli ATCC 35218, P. seudo, Sal 38
Hình 4.9: Kích thước vịng vơ khuẩn (mm) của dịch chiết hạt bí ngơ đã tác
dung nhiệt - aceton trên vi khuẩn B. sub tại nồng độ 2 g/ml.............. 39
Hình 4.10: Kích thước vịng vơ khuẩn (mm) của dịch chiết hạt bí ngơ đã tác
dung nhiệt - ethanol trên vi khuẩn B. sub tại nồng độ 2 g/ml ........... 40
vii


Hình 4.11: Kích thước vịng vơ khuẩn (mm) của dịch chiết hạt bí ngơ đã tác
dung nhiệt - hexan trên vi khuẩn B. sub tại nồng độ 0,5 g/ml........... 41

Hình 4.12: Kích thước vịng vơ khuẩn (mm) của dịch chiết hạt bí ngơ đã tác
dung nhiệt - methanol trên vi khuẩn B. sub ...................................... 42
Hình 4.13: Kích thước vịng vơ khuẩn (mm) của dịch chiết hạt bí ngơ đã tác
dung nhiệt - DW trên vi khuẩn B. sub .............................................. 43
Hình 4.14: Kích thước vịng vơ khuẩn (mm) của dịch chiết hạt bí ngơ đã tác
dung nhiệt - ethyl acetat trên vi khuẩn B. sub tại nồng độ 0,5 g/ml ... 44
Hình 4.15: Polyphenol trong các dịch chiết hạt bí ngơ nồng độ 100 mg/ml ...... 47
Hình 4.16: Hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết dược liệu hạt bí ngô
chưa xử lý nhiệt nồng độ 200mg/ml không làm đổi màu thuốc thử
DPPH ............................................................................................... 48
Hình 4.17: Hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết hạt bí ngơ đã xử lý
nhiệt nồng độ 200 mg/ml làm đổi màu thuốc thử DPPH ................... 49
Hình 4.18: Hoạt tính chống oxy hố của dịch hạt bí ngơ khi chưa và đã tác
dụng nhiệt với dung mơi hexan nồng độ 200 mg/ml ......................... 49
Hình 4.19: Hoạt tính chống oxy hố của dịch hạt bí ngô khi chưa và đã tác
dụng nhiệt với dung môi DW ở nồng độ 200 mg/ml ......................... 50

viii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Viết đầy đủ

ATCC

American Type Culture Collection

DMSO

Dimethyl Sulfoxide

DPPH

1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl

ABTS

2,2’-Azino-Bis-3
Ethylbenzothiazoline-6-Sulfonic Acid

VTME

Vitamin E

CGA

Acid chlorogenic

DW

Distillerd Water (nước cất 2 lần)

B. subtilis, B. sub

Bacillus subtilis

E. coli

Eschrichia Coli

G. philus

Geobacillus stearothermophilus

Pseudo, P. aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa

S. aureus

Staphylococcus aureus

Sal

Salmonela

TSA

Tryptone Soya Agar

TSB

Tryptone Soya Broth

MHA

Mueller Hinton Agar

MHB

Mueller Hinton Broth

BSA

Bovine Serum Albumin (Albumin
huyết thanh bò)

LC 50

Nồng độ gây chết trung bình

IC 50

Nồng độ ức chế tối đa một nửa

ix


TĨM TẮT KHĨA LUẬN
Mục đích: Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết hạt bí ngơ trên
một số chủng vi khuẩn; đánh giá hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy
hố của các dịch chiết; tìm ra dung mơi chiết xuất mang hiệu quả cao nhất; đánh
giá sự ảnh hưởng của nhiệt độ.
Phương pháp: Chiết xuất dược liệu bằng hệ thống cơ quay chân khơng,
xác định hoạt tính kháng khuẩn theo nguyên lý khuyếch tán trên đĩa thạch, xác
định hàm lượng polyphenol sử dụng thuốc thử Folin-ciocalteu, xác định hoạt
tính chống oxy hoá sử dụng thuốc thử DPPH và ABTS, xử lý số liệu bằng phần
mềm excel.

Kết quả: Dịch chiết hạt bí ngơ có tác dụng kháng khuẩn trên 9 chủng vi
khuẩn thí nghiệm, dịch chiết với dung mơi ethanol biểu hiện hoạt tính kháng
khuẩn phổ biến nhất và tốt nhất trên S. aureus ATCC 25923 tại nồng độ 2g/ml
với đường kính vịng vơ khuẩn 16,54 mm. Dịch chiết hạt bí ngơ đã tác dụng
nhiệt làm mất tác dụng kháng khuẩn trên 4 chủng và giảm tác dụng trên 5 chủng
vi khuẩn. Đường kính vịng vơ khuẩn lớn nhất với dịch chiết aceton trên B.sub
tại nồng độ 2 g/ml mang giá trị 6,58 mm, sau đó là dịch chiết với dung môi
ethanol tại nồng độ 2g/ml mang giá trị 6,30 mm. Dịch chiết với dung môi DW
trước và sau khi tác dụng nhiệt đều biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn kém nhất.
Do phương pháp nghiên cứu chưa phù hợp nên chưa xác định được hàm lượng
polyphenol. Hoạt tính chống oxy hoá được xác định khi đã tác dụng nhiệt lên hạt
bí ngơ và sử dụng thuốc thử DPPH, mang giá trị cao nhất (0,122mg/100mg dược
liệu) khi chiết xuất với dung mơi ethanol.
Kết luận: Hạt bí ngơ có tác dụng kháng khuẩn và phù thuộc vào nồng độ,
dung môi, chủng vi khuẩn. Dịch chiết với dung môi ethanol cho thấy khả năng
ức chế vi khuẩn hiệu quả nhất, đặc biệt đối với S. aureus. Khi tác dụng nhiệt,
dịch chiết với dung mơi này cũng mang hoạt tính chống oxy hố lớn nhất.

x


PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, xu hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật đang
ngày càng được ưa chuộng. Theo tổ chức Thực vật Quốc tế (FBI, 2014), trên thế
giới đã phát hiện được 265.000 loài thực vật, chứa khoảng 5 triệu hợp chất hố
học. Trong số đó có ít nhất 6.000 lồi được dùng làm thuốc. Cho tới nay đã có
khoảng 1.300 cây được nghiên cứu một cách có hệ thống về thành phần hóa học
và mang lại giá trị to lớn. Tuy nhiên, nó chỉ chiếm 0,5% so với số lượng các lồi
thực vật sẵn có. Để đáp ứng nhu cầu và xu thế của thị trường, việc tìm ra các

hoạt chất mới có nguồn gốc từ thực vật là vấn đề cấp thiết đặt ra cho các nhà
nghiên cứu.
Đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu về các hoạt chất trong thảo dược
chứng minh được hiệu quả đối với các vi khuẩn như: các hợp chất phenolic có
trong cây hương thảo như carnosol, axit carnosoic, rosmanol, rosmadial,
epirosmanol, rosmadiphenol, axit rosmarinic... có khả năng chống oxy hố (B.
Bozin và cộng sự, 2007)), tinh dầu hương thảo có thể chống lại tất cả các chủng
vi khuẩn gram âm (đặc biệt là E. coli) và một số chủng gram dương (O. Y.
Celiktas và cộng sự, 2007); allicin có trong tỏi có tác dụng ức chế sự sinh trưởng
của vi khuẩn, trị bệnh sán lãi, giun kim, một số bệnh nấm ngoài da (Sarkar và
cộng sự, 2006); flavonoid trong hành tây giúp kích thích sản xuất các chất chống
oxy hóa, do đó có đặc tính kháng khuẩn và tăng cường miễn dịch mạnh mẽ
(suckhoedoisong.vn); rau diếp cá chứa decanoyl-acetaldehyd có tác dụng kháng
khuẩn như: ức chế tụ cầu vàng, phế cầu, liên cầu, E. coli, trực khuẩn bạch hầu
gây các bệnh lý nhiễm khuẩn nguy hiểm,… (Phạm Ngọc Khôi và Phùng Thanh
Sơn, 2017), dân gian thường dùng để thanh nhiệt, giải độc, kháng viêm, tăng
cường sức đề kháng của cơ thể. Sử dụng các loại thảo dược có tác dụng kháng
khuẩn thay thế thuốc kháng sinh là sự lựa chọn thơng minh vì chúng có nguồn
gốc từ thiên nhiên và giúp hạn chế hiện tượng kháng kháng sinh. Theo đó, nó
1


liên quan tới một loạt các lợi ích như: sẵn có trong tự nhiên, dễ phân huỷ sinh
học, ít tác dụng phụ, hạn chế việc ảnh hưởng tới môi trường, an tồn vệ sinh cho
người và vật ni, mang lại các lợi ích kinh tế,…
Một số nghiên cứu khoa học hiện đại đã chứng minh rằng cơ thể động vật
hay con người thường lưu giữ các hợp chất có tính chống oxy hóa cao như
gluthathione, vitamin E, vitamin C,... Khi hàm lượng các chất chống oxy hóa
trong cơ thể giảm xuống sẽ làm tăng nguy cơ hủy hoại các tế bào. Tuy nhiên,
những ảnh hưởng bất lợi của các tác nhân có liên quan đến gây chết tế bào này

có thể được ngăn ngừa bằng cách bổ sung chế độ ăn giàu thực phẩm có chứa
chất chống oxy hóa (các loại đậu, rau và trái cây tươi...) với tác dụng có lợi cho
sức khỏe con người. Các chất chống oxy hóa tự nhiên như các hợp chất
polyphenol có khả năng loại bỏ gốc tự do, ngăn chặn quá trình oxy hóa rất hiệu
quả. Ngồi ra, so với việc sử dụng các chất chống oxy hóa tổng hợp, các hợp
chất chiết suất từ tự nhiên có khả năng kháng oxy hóa cịn mang lại lợi ích an
tồn, khơng gây tác dụng phụ không mong muốn, không độc hại đến môi trường
cũng như con người và có thể được sử dụng trong y học, thực phẩm, dược
phẩm... Với những ưu điểm trên, các sản phẩm được chiết xuất từ thảo dược
thiên nhiên ngày càng khẳng định được vị thế của nó - là sự lựa chọn hàng đầu
vì sự an tồn sức khoẻ.
Trong dân gian, người ta thường ăn hạt bí ngơ có tác dụng tẩy trừ giun
sán, tiêu chảy, chữa sâu răng, củng cố hệ miễn dịch,… Bên cạnh đó cịn cải
thiện làn da và điều trị mụn trứng cá. Qua đó, có thể nhận thấy tác dụng kháng
khuẩn và chống oxy hố trong hạt bí ngơ đã được con người biết đến từ lâu. Đó
là dược liệu có tiềm năng to lớn trong việc nghiên cứu, bào chế và phát triển các
sản phẩm dược và mỹ phẩm gần gũi với thiên nhiên và thay thế các chất kháng
sinh tổng hợp hiện nay. Vì vậy, tơi lựa chọn thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác
dụng ức chế vi khuẩn và đánh giá hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy
hố của dịch chiết từ dược liệu hạt bí ngơ”.

2


1.2. Mục đích nghiên cứu
 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết hạt bí ngơ trên một số
chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến như: Escheria coli, Staphylococcus aureus,
Bacillus

subtilis,

Samolnella,

Pseudomonas

aeruginosa,

Geobacillus

stearothemophilus.
 Đánh giá hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của dịch
chiết hạt bí ngơ.
 Tìm ra dung mơi thích hợp để thu được dịch chiết hạt bí ngơ có khả
năng kháng khuẩn mạnh, hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa cao.
 Đánh giá sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng kháng khuẩn, hàm
lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết hạt bí ngơ.

1.3. Ý nghĩa của đề tài
Kết quả của đề tài có ý nghĩa quan trọng trong việc:
 Tuyển chọn dược liệu theo mục đích, bao gồm: khả năng kháng khuẩn,
hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hố.
 Tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có, tiềm năng về đất đai, khí hậu,…
giúp tiết kiệm chi phí sản xuất và khơng lãng phí nguồn tài ngun thiên nhiên.
 Là cơ sở cho các đề tài nghiên cứu dược liệu tiếp theo.
 Mang lại tiềm năng ứng dụng trong y học, dược phẩm, mỹ phẩm vào
đời sống hàng ngày. Tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có, tiềm năng về đất đai,
khí hậu,… giúp tiết kiệm chi phí sản xuất và khơng lãng phí nguồn tài ngun
thiên nhiên.
 Góp phần khắc phục hiện tượng kháng kháng sinh và chống oxy hoá
của các chất tổng hợp hiện nay. Qua đó, mang đến cho người tiêu sản phẩm chất

lượng cao, cải thiện sức khoẻ, bảo vệ mơi trường, mang lại lợi ích kinh tế cho
người sản xuất,…
 Cung cấp thêm thông tin về điều kiện bảo quản để hoạt chất trong dược
liệu được đảm bảo nhất.
3


PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về hạt bí ngơ
Tên gọi khác: Hạt bí đỏ, bù rợ, má ứ (Thái), nam qua tử, phặc đeng
(Tày), plắc ropual (K’ho), nhấm (Dao).
Tên khoa học: Cucurbita moschata Duchesne.
Họ: Bí (Cucurbitaceae).

Hình 2.1: Cây và hạt bí ngơ
2.1.1. Đặc điểm
Cây thảo, sống một năm. Thân có góc cạnh mọc bị hay leo nhờ tua
cuống, có lơng dày, thường có rễ ở những đốt. Lá đơn, mọc so le, có cuống dài;
phiến lá hình trứng rộng hoặc gần trịn, chia thuỳ nơng, đầu trịn hoặc hơi nhọn,
mép có răng cưa, hai mặt lá có nhiều lơng mềm, đơi khi có những đốm trắng ở
mặt trên; tua cuốn phân nhánh. Hoa vàng, có kích thước lớn. Quả to, cùi dày,
thường tròn bẹt hay tròn dài, có rãnh sâu, có lơng như gai; cuống quả có 5 cạnh,
hơi phình rộng ở chỗ đính. Hạt màu trắng xám, hình trứng, dài 7 - 15 mm, rộng
8 - 9 mm, dày 2 mm.
2.1.2. Phân bố
Chi Cucurbita L. có khoảng 25 lồi, nguồn gốc ở châu Mỹ. Trong đó, có
5 lồi là cây trồng.
Ở Việt Nam, các lồi bí ngơ đều là các lồi cây trồng quen thuộc khắp từ
Bắc chí Nam. Cây được trồng gần như quanh năm, thích nghi cao với điều kiện
4

khí hậu nhiệt đới nóng và ẩm, nhiệt độ từ 18 - 25oC. Hiện nay, cây Bí ngơ khơng
chỉ được trồng ở các vùng nhiệt đới mà còn mở rộng trồng tại các tỉnh vùng núi
cao (Sa Pa - Lào Cai, Phố Bảng - Hà Giang) nhiệt độ từ 18 - 220C vào mùa vụ
xuân hè ấm áp.
2.1.3. Thành phần hóa học
Dầu béo (30 - 53%); phytosterol (spinasterol, ergostenol, campesterol,
stigmasterol, clerosterol và isofucosterol ); các terpen. Thành phần chính trong
dầu hạt gồm: acid linoleic (35 - 68%), acid oleic (15 -48%). Chất khơng xà
phịng hố đặc trưng là squalen (39 - 46%). Ngồi ra cịn có một ít amino acid
(cucurbitin, γ-aminobutyric acid, ethylasparagin, citrullin). Trong đó, squalen và
cucurbitin được xem là chất đánh dấu.
2.1.4. Tác dụng
- Theo Đông y, hạt bí ngơ có tính ấm, ăn vào có vị béo, bùi, hạt bí ngơ
dùng để trị giun sán, sâu răng.
- Theo y học hiện đại, chiết xuất hạt bí ngơ có tác dụng: Kháng khuẩn:
Các lingnan trong hạt bí bao gồm lariciresinol, medioresinol, và pinoresinol có
đặc tính kháng khuẩn và đặc biệt là chống virus. Do đó người ta thường ăn hạt
bí ngơ có tác dụng tẩy trừ giun sán. Chống oxy hóa: Hạt bí ngơ có chứa các chất
chống oxy hóa như carotenoid và vitamin E. Các chất chống oxy hóa này giúp
giảm viêm và bảo vệ tế bào khỏi các gốc tự do có hại, nhờ đó giúp cơ thể chống
lại nhiều bệnh tật. Chống ung thư: bổ sung chiết xuất hạt bí ngơ trong chế độ
dinh dưỡng giúp làm giảm nguy cơ mắc các bệnh ung thư dạ dày, ung thư vú,
phổi, tuyến tiền liệt và ruột kết. Hoạt chất lignans trong bí ngơ cịn vai trị quan
trọng trong việc ngăn ngừa và điều trị ung thư vú. Ngồi ra cịn có tác dụng tốt
cho tim mạch, giảm lượng đường trong máu, cải thiện chất lượng tinh trùng, cải
thiện giấc ngủ, giảm stress, chăm sóc và làm đẹp da,…
Các loại dịch chiết cũng đã được nghiên cứu và cho thấy nhiều cơng dụng
như: Dầu bí đỏ ức chế Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumanii,

Aeromonas veronii, Escherichia coli, Salmonella enterica, Enterococcus
5


faecalis, Pseudomonas aeruginosa, nhóm sinh học Sorbia, Candida albicans,
Klebsiella pneumoniae và Serratia marcescens ở nồng độ 2,0 % (v/v). (Hammer
và cộng sự, 1999). Chiết xuất bí ngơ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chống lại
cả vi khuẩn gram dương và gram âm (Tadee và cộng sự, 2020). Chiết xuất từ
các bộ phận khác nhau của bí ngơ, chứa các thành phần hoạt tính sinh học, có
tác dụng trị đái tháo đường, kháng khuẩn, hạ đường huyết, chống oxy hóa,
chống ung thư, chống đột biến, điều hòa miễn dịch và các tác dụng khác
(Krimer-Malesevic, 2020). Alabassi và cộng sự (2020) đã chứng minh rằng bí
ngơ là một chất kháng khuẩn và chống oxy hóa mạnh mẽ. Các bộ phận khác
nhau của cây bí ngơ chứa các thành phần kháng sinh khác nhau bao gồm chất
kháng khuẩn và kháng nấm. Một số tác nhân này là các protein như a và ẞmoschins, peptide kháng khuẩn myeloid (Ng và cộng sự, 2002; Xiong, 2000;
Vassiliou và cộng sự, 1998). Gần đây, một loại protein mới gọi là Pr-1 đã được
phân lập từ bí ngơ bởi Park và cộng sự (2010) thể hiện tác dụng kháng nấm
mạnh mà khơng có bất kỳ tác dụng có hại hoặc độc hại nào đối với hồng cầu của
con người. Protein này khá ổn định ở nhiệt độ cao lên đến 70°C. Vỏ, hạt và lá
bí ngơ có đặc tính chống oxy hóa và kháng khuẩn (Dissanayake và cộng sự,
2018). Dầu hạt bí ngơ cho thấy hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn đáng
chú ý (Amin và cộng sự, 2020).

2.2. Nhu cầu sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược tự nhiên trên thế
giới
Dược liệu, thảo dược, thảo mộc là những tên gọi cho các sản phẩm được
chiết xuất hoặc có thành phần có nguồn gốc tự nhiên từ thực vật. Chúng được sử
dụng dưới nhiều hình thức khác nhau, vì giá trị to lớn của chúng trong các lĩnh
vực y tế, dược và mỹ phẩm. Cây thảo mộc sản xuất và chứa nhiều hợp chất hóa
học tác động lên cơ thể và được sử dụng để ngăn ngừa hoặc điều trị bệnh hoặc

tăng cường sức khỏe và hạnh phúc. Thuốc thảo dược đã ngày càng được sử dụng
trên toàn thế giới trong vài thập kỷ qua bằng chứng là thị trường thuốc thảo
dược toàn cầu và quốc gia đang phát triển nhanh chóng. Người ta ước tính rằng
6


khoảng 25% các loại thuốc được kê đơn trên toàn thế giới có nguồn gốc từ thực
vật và 121 hợp chất hoạt động như vậy đang được sử dụng. Trong tổng số 252
loại thuốc trong danh mục thuốc thiết yếu của WHO, 11% là hồn tồn có nguồn
gốc thực vật (Abuzed Sadee và cộng sự, 2023). Gần 80% dân số châu Phi và
châu Á phụ thuộc vào các loại thuốc truyền thống để chăm sóc sức khỏe ban đầu
(Venkateswaran và cộng sự, 2033). Ấn Độ, khoảng 80% dân số nông thôn sử
dụng dược liệu hoặc hệ thống y học bản địa (Kumar và cộng sự, 2022). Khoảng
960 loài thực vật được sử dụng bởi ngành công nghiệp thảo dược Ấn Độ, trong
đó có 178 lồi có khối lượng lớn vượt quá 100 tấn một năm (Konozy và cộng
sự, 2022). Theo ước tính của WHO, nhu cầu cây thuốc hiện nay vào khoảng 14
tỷ USD/năm và đến năm 2050 sẽ là khoảng 5 nghìn tỷ USD. Xu hướng hiện nay
dựa nhiều hơn vào thuốc thảo dược vì giá cao và tác dụng phụ có hại của các
loại thuốc tổng hợp, nên xu hướng này ngày càng gia tăng, không chỉ ở các nước
đang phát triển mà còn ở các nước phát triển.
Bên cạnh vấn đề về sức khoẻ con người, sức khoẻ của các lồi động vật
trong ngành chăn ni cũng là một bộ phận quan trọng có sức ảnh hưởng lớn
đến nền kinh tế quốc dân. Một giải pháp thay thế thân thiện với môi trường để
tăng cường sản xuất, phịng ngừa và điều trị bệnh tật cho vật ni là một thách
thức lớn đối với các nhà dinh dưỡng vật nuôi. Việc sử dụng các hợp chất tự
nhiên như thảo mộc, chế phẩm thảo dược cũng như các loại thực vật khác đã
được con người biết đến từ xa xưa, cho đến nay nó đang ngày càng được ưa
chuộng hơn các hợp chất hóa học để tăng cường sức khỏe tổng thể của động vật
và cũng để đáp ứng mối quan tâm của người tiêu dùng. Các loại thuốc thảo dược
(phần cắt nhỏ, khơ hoặc đơi khi cịn sống của cây, tảo, nấm, địa y,…), chiết xuất

thảo dược hoặc phân lập từ thảo dược (tinh dầu) có thể được sử dụng làm phụ
gia thức ăn thảo dược, phù hợp cho các đặc tính chữa bệnh của nó. Các loại thảo
mộc tăng cường và thêm hương vị trong thức ăn chăn ni và do đó có thể ảnh
hưởng đến cách ăn uống, bài tiết dịch tiêu hóa và tổng lượng thức ăn ăn vào,
tăng trưởng, sản xuất thịt, sữa và trứng. Do đó, họ đã biết nâng cao chất lượng
7


và sự ổn định của các sản phẩm động vật. Các loại thảo mộc, gia vị và hỗn hợp
của chúng cũng được công nhận là chất chống viêm và cũng hoạt động như chất
chống oxy hóa. Một số thí nghiệm trong ống nghiệm đã chứng minh một số
chiết xuất thực vật nhất định thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với vi
khuẩn Gram - và Gram +.

2.3. Tình hình các nghiên cứu tác dụng của dịch chiết hạt bí ngơ
2.3.1. Nghiên cứu ở nước ngồi
Để đánh giá đúng tiềm năng cũng như hoạt tính của các dược liệu, nhằm
ứng dụng trong phịng trị bệnh ở người và vật ni, trên thế giới đã có nhiều
nghiên cứu nhằm đánh giá hoạt tính ức chế sự phát triển của vi khuẩn, khảo sát
hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của dược liệu.
CS Vidhya và cộng sự (2022) nghiên cứu đặc tính chữa bệnh và hoạt động
dược lý như: chống viêm, chống oxy hóa và chống vi khuẩn của dịch chiết hạt bí
ngơ C. maxima. Họ thực hiện hoạt động quét gốc tự do DPPH và hoạt động
chống vi khuẩn chống lại E. coli, P. aeruginosa, A. bracilences, S. aureus bằng
cách sử dụng chiết xuất nước của hạt C. maxima. Các tế bào ung thư vú MCF-7
đã được sử dụng để thử nghiệm các hoạt động chống ung thư trong ống
nghiệm. Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxy hóa cao của dịch chiết 0,781 ±
0.016 trong 100 μg/ml và hoạt tính chống vi khuẩn cho thấy hoạt tính nổi bật nhất
của dịch chiết chống lại tất cả các vi sinh vật được thử nghiệm. Xét nghiệm MTT
cho thấy giá trị IC50 là 45,40 μg/ml dịch chiết. Hơn nữa, nhuộm Ao/EtBr đã

chứng minh rằng chiết xuất trong methanol của C. maxima có hoạt tính bảo vệ
chống lại các dịng tế bào MCF-7.
Ziaul Amin và M.Jashim Uddin (2020) nghiên cứu đánh giá các hoạt động
chống viêm, chống oxy hóa và chống vi khuẩn của chiết xuất ethanol từ dầu hạt
bí ngơ (Cucurbita maxima Linn.) từ các giống lai và giống bản địa. Các thí
nghiệm đánh giá được thực hiện bằng phương pháp biến tính BSA, DPPH trong
ống nghiệm và phương pháp khuếch tán đĩa tương ứng. Trong nghiên cứu này,
cả hai loại dầu hạt bí ngơ cho thấy các hoạt động chống viêm và chống oxy hóa
8


đều phụ thuộc vào liều lượng. Ở nồng độ 45 μg/ml, dầu hạt bí ngơ bản địa
(IPSO) cho thấy hoạt tính chống viêm cao hơn (p<0,001) so với dầu hạt bí ngơ
lai (HPSO) (IC 50 đối với IPSO là 1,21 ± 0,08 μg/ml và đối với HPSO là 1,66 ±
0,30 μg/ml). Nhưng ở nồng độ 30 μg/ml, IPSO thể hiện hoạt tính chống oxy hóa
đáng kể (p < 0,05) so với HPSO (IC 50 đối với IPSO là 3,72 ± 0,93 μg/mL và đối
với HPSO là 5,73 ± 0,96 μg/ml). Trong thử nghiệm kháng khuẩn, IPSO ở nồng
độ 1000 μg/đĩa cho thấy hiệu quả kháng khuẩn đầy hứa hẹn chống lại tất cả các
vi khuẩn được thử nghiệm với vùng ức chế nằm trong khoảng từ 10,66 ± 0,57
đến 18 ± 1,0 mm. Trong khi đó, cùng nồng độ HPSO thể hiện hoạt tính kháng
khuẩn đầy hứa hẹn chống lại E. coli B-23, Shigella sonnei và E. coli BL21 với
vùng ức chế lần lượt là 9,0 ± 2,0, 14 ± 6,08 và 18,33 ± 5,77 mm. Từ đó cho thấy
dù cả hai loại dầu hạt bí ngơ đều có hoạt tính chống viêm, chống oxy hóa và
chống vi khuẩn, nhưng giống bản địa lại cho kết quả nổi bật hơn.
Nghiên cứu của Rriyanka Dash & Goutam Ghosh (2017) tiến hành
nghiên cứu chiết xuất protein hạt Cucurbita moschata và Lagenaria sicerari, sau
đó thủy phân bằng trypsin để thu hồi peptide kháng khuẩn. Kết quả cho
thấy dịch thủy phân protein hạt của cả hai loại cây này có hoạt tính cao khi
chống lại Acinetobacter baumannii (p < 0,05). Giá trị nồng độ gây chết của dịch
thuỷ phân Lagenaria sicerari và Cucurbita moschata lần lượt là 70 ± 6,2 và

135,6 ± 4,5 μg/mL trong phương pháp đếm khả thi; 73,2 ± 2,9 và 122,9 ± 3,2
μg/mL trong phương pháp độ đục.
Ngoài dược liệu thơ, dược liệu rang hoặc sao cịn cho phép cải thiện các
tính năng cảm quan, dinh dưỡng và an tồn, cũng như điều chỉnh khả năng tiêu
hóa hóa chất thực vật (Samaniego-Sanchéz và cộng sự, 2021). Fatos Rexhepi và
cộng sự (2022) đã thực hiện nghiên cứu nhằm khảo sát chất lượng và hiệu quả
chống oxy hoá của dịch chiết dầu trong hạt bí ngơ khi có và khơng có sự tác dụng
nhiệt. Người ta tiến hành quá trình tác dụng nhiệt từ 80 - 150°C và sau đó xử lý
nhiệt của dầu (220°C trong vòng 10 phút bằng FTIR - hồng ngoại biến đổi) cho cả
2 loại hạt bí ngơ có và khơng có sự tác dụng nhiệt. Kết quả cho thấy ở mẫu đã tác
9


dụng nhiệt có tỷ lệ chênh lệch trước và sau khi xử lý nhiệt thấp, tương tự với mẫu
chưa tác dụng nhiệt thì có tỷ lệ chênh lệch cao hơn. Nó chứng minh rằng đã có sự
oxy hố, tuy nhiên ở mẫu đã xử lý nhiệt thì giá trị ít biến đổi; ổn định hơn ở nhiệt
độ 90 - 110°C và bão hoà ở 110°C. Quang phổ FTIR của các mẫu dầu thu được từ
quá trình tác dụng nhiệt hạt bí ngơ được sử dụng để hiểu cơ chế thay đổi hố học
của hạt trong q trình xử lý nhiệt và làm chất chỉ thị cho q trình oxy hố lipid.
Từ đó đưa ra kết luận rằng nhiệt độ tốt nhất để rang hạt bí ngơ là 110°C để tạo ra
hiện tượng chống oxy hoá.
2.3.2. Nghiên cứu trong nước
Sao dược liệu là phương pháp dùng sức nóng của lửa để làm dược liệu khô,
vàng xém cạnh hoặc cháy đen. Người ta thường sử dụng chảo gang hoặc nồi đất
để sao dược liệu và tuỳ theo mục đích sử dụng để sao đến mức mong muốn. Sao
thô làm dược liệu bớt tính hàn, có mùi thơm, dễ đi vào tỳ vị, bên cạnh đó cịn
loại bỏ tạp chất, làm dược liệu tinh khiết hơn; làm đẹp thuốc, tạo vị thế hàng hoá
đặc biệt cho vị thuốc; giúp bảo quản thuốc tốt hơn,… Ở Việt Nam, phương pháp
sao thô này đã được sử dụng trong đơng y từ lâu và duy trì cho đến ngày nay.
Các nghiên cứu về công dụng, thành phần, hoạt tính kháng khuẩn,… của dược

liệu sao thơ ở nước ta cũng đã được tiến hành phổ biến hơn, tuy nhiên các
nghiên cứu và so sánh về hạt bí ngơ cũng như hạt bí ngơ sao thơ vẫn cịn hạn
chế. Mong rằng bài nghiên cứu này sẽ góp phần cho mọi người biết đến nhiều
hơn về lợi ích của nó.

10


PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: từ tháng 8/2022- tháng 12/2022
Địa điểm: phịng thí nghiệm bộ môn Nội - Chẩn - Dược - Độc chất, Khoa
Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.1.2. Đối tượng nghiên cứu
a. Nguồn dược liệu
Dược liệu được sử dụng là hạt bí ngơ đã qua sơ chế thành dạng bột mịn
được mua tại cơng ty dược liệu cổ truyền Bình An (làng Nghĩa Trai, huyện Văn
Lâm, Hưng Yên).
b. Các chủng vi khuẩn
9 chủng vi khuẩn: E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 85922, E. coli
ATCC 35218, Bacillus subtilis (B. subtilis) ATCC 6633, Geobacillus
stearothermophilus (G. philus) ATCC 7953, Pseudomonas aeruginosa (P.
seudo) ATCC 9027 và Staphylococcus aureus (S. aureus) ATCC 25023, S.
aureus ATCC 25923 và Salmonella (Sal) ATCC 13311.
Các chủng vi khuẩn được cung cấp bởi Viện Vi sinh vật và Công nghệ
sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội và được nuôi cấy tại bộ môn Nội - Chẩn Dược, Khoa Thú y, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam.
3.1.3. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
 Hóa chất
 Dung mơi ngâm chiết dược liệu: Methanol, ethanol 96%, acetone, ethyl

acetate, hexan, nước cất 2 lần.
 Dung mơi hịa tan dịch chiết dược liệu: Dimethyl Sulfoxide (DMSO)
 Môi trường: Mueller Hinton Agar (MHA), Muller Hinton Broth (MHB),
Tryptone soya agar (TSA), Tryptone soya broth (TSB).
 Muối: NaCl, Na2CO3.
11


 Chất cân bằng pH: NaOH, HCl.
 Thuốc thử: Folin- Ciocalteu′s phenol reagent, DPPH, ABTS.
 Chất chuẩn: Acid chlorogenic, Vitamin E.
 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm
 Máy đo pH
 Máy ly tâm
 Máy vortex
 Nồi hấp tiệt trùng
 Bể ổn nhiệt (water bath)
 Máy khuấy từ
 Máy cô quay chân không RE-501
 Tủ cấy
 Tủ ấm
 Máy quang phổ so màu 722
 Pipet, đầu tip
 Đĩa petri, ống falcon, ống eppendorf, dụng cụ tạo lỗ thạch

3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phương pháp chiết xuất dược liệu
a. Đối với dược liệu chưa sao
– Ngâm dược liệu: Bột dược liệu mịn (kích thước < 0,05 mm) được ngâm
trong 6 loại dung mơi có độ phân cực khác nhau, bao gồm: methanol, ethanol

96%, aceton, ehtyl acetat, hexan, nước cất 2 lần đun sôi với tỉ lệ 1:30 (10g dược
liệu khô ngâm trong 300 ml dung môi). Với các dung môi hữu cơ, hỗn hợp dược
liệu gồm dung môi và dược liệu được stirrer trong 10 phút, sau đó để trong bóng
tối, ngâm trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Với nước cất 2 lần cần tác dụng nhiệt
để hoạt chất được hoà tan trong môi tốt hơn, đun sôi nước cất 2 lần ở 100oC,
trộn với dược liệu với tỉ lệ 1:30 và stirrer trong 30 phút.

12


– Lọc dược diệu: Đối với các dung môi hữu cơ, sau 24 giờ, hỗn hợp sau
khi ngâm được stirrer trong 10 phút rồi đổ vào các ống falcon, sau đó li tâm với
tốc độ 3500 vịng/phút trong 10 phút và lọc lại qua giấy lọc để loại bỏ hết cặn
dược liệu.

Hình 3.1: Li tâm và lọc loại bỏ cặn dược liệu trong các dung môi hữu cơ
Đối với dung môi nước cất 2 lần, sau 30 phút, dùng khăn sạch đã được
ngâm 10 phút trong nước cất 2 lần đun sôi để lọc loại bỏ bã dược liệu, sau đó
thực hiện lặp lại quy trình li tâm và lọc loại bỏ cặn dược liệu tương tự các dung
môi hữu cơ. Do dầu không tan trong nước nên đã bám vào giấy lọc khiến cho
q trình lọc của dung mơi này lâu hơn (khoảng 1 ngày) so với các dung mơi
hữu cơ khác (khoảng 15 - 30 phút).

Hình 3.2: Lọc dược liệu trong dung môi nước cất 2 lần
13