Nghiên cứu tuyển chọn giống đông trùng hạ thảo (cordyceps militaris) giàu hợp chất cordycepin

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
~~~~~***~~~~~

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN GIỐNG ĐÔNG TRÙNG
HẠ THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) GIÀU HỢP
CHẤT CORDYCEPIN

Hà Nội, tháng 02 năm 2023


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
~~~~~***~~~~~

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN GIỐNG ĐÔNG TRÙNG
HẠ THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) GIÀU HỢP
CHẤT CORDYCEPIN

Sinh viên thực hiện

:

Nguyễn Anh Tuấn

Mã sinh viên

:

645341

Giảng viên hướng dẫn :

TS. Nguyễn Thanh Hảo

Địa điểm thực hiện

Viện nghiên cứu Vi tảo
và Dược mỹ phẩm

:

Hà Nội, tháng 02 năm 2023


LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của bản thân tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai cơng bố
trong bất kì cơng trình nghiên cứu nào khác.
Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước Học viện và
Hội đồng.
Hà Nội, ngày tháng

năm 2022

Sinh viên

Nguyễn Anh Tuấn

i


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa luận, ngồi sự nỗ lực và cố gắng của bản thân, tôi
đã nhận được giúp đỡ, động viên tích cực từ các cá nhân, tập thể.
Trong thời gian thực tập tại Viện nghiên cứu Vi tảo và Dược mỹ phẩm
– Học viên Nông nghiệp Việt Nam tôi đã nhận được sự quan tâm, chỉ bảo tận
tình của các Thầy, cơ và cán bộ tại viện thí nghiệm. Cùng với sự cố gắng, nỗ
lực của bản thân và những bài học kinh nghiệm tôi đã hồn thành khóa luận
tốt nghiệp của mình.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ
sinh học cùng tồn thể các Thầy, Cơ đã truyền đạt cho tôi những kiến thức chuyên
ngành, kỹ năng làm việc trong phịng thí nghiệm và những bài học q báu trong
suốt thời gian học tập, rèn luyện tại Học viện Nơng nghiệp Việt Nam.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thanh Hảo đã tận
tình giúp đỡ, hướng dẫn, quan tâm và tạo mọi điều kiện cho tơi trong suốt q
trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Mặc dù đã cố gắng hồn thiện luận văn bằng sự nhiệt tình, năng lực của
mình, tuy nhiên khơng thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được
những đóng góp của q thầy cơ và các bạn để tơi có thể hồn thành khóa
luận được tốt nhất.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2022
Sinh viên

Nguyễn Anh Tuấn

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii
MỤC LỤC ....................................................................................................... iii
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................... 1
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 2
2.1. Mục tiêu tổng quát ..................................................................................... 2
2.2. Mục tiêu cụ thể ........................................................................................... 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn....................................................................... 3
3.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 3
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 3
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4
1.1. Giới thiệu chung về nấm Cordyceps militaris ........................................... 4
1.1.1. Phân loại nấm Cordyceps militaris ......................................................... 4
1.1.2. Đặc điểm sinh học của Cordyceps militaris ........................................... 5
1.1.3. Giá trị dược liệu của Cordyceps militaris ............................................... 6
1.2. Đặc điểm sinh sản nấm Cordyceps militaris.............................................. 9
1.3. Chọn giống nấm bằng phương pháp lai đơn bào tử ................................. 11
1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chọn giống ................................... 11
1.3.1. Quy trình chọn giống nấm bằng phương pháp lai bào tử đơn .............. 13
1.4 KỸ THUẬT NUÔI CẤY ĐƠNG TRÙNG HẠ THẢO ........................... 14

1.4.1. Ảnh hưởng của mơi trường dinh dưỡng/cơ chất ................................... 14
1.4.1.1. Ảnh hưởng của nguồn carbon ............................................................ 14
iii


1.4.1.2. Ảnh hưởng của nguồn nito ................................................................. 15
1.4.1.3. Ảnh hưởng của nguồn khoáng chất ................................................... 16
1.4.2. Ảnh hưởng của các thành phần bổ sung ............................................... 17
1.4.2.1. Ảnh hưởng của axit béo và dầu thực vật............................................ 17
1.4.2.2. Ảnh hưởng của hormon sinh trưởng .................................................. 18
1.5. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy ....................................... 18
1.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ ........................................................................ 20
1.6. Tình hình nghiên cứu của nấm Cordyceps militaris ................................ 21
1.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 21
1.6.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ........................................................ 23
PHẦN II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 27
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 27
2.2. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................. 28
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 28
2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 29
2.4.1. Phương pháp phân lập bào tử đơn bội .................................................. 29
a. Nghiên cứu thu bào tử đơn bội từ nấm đông trùng hạ thảo ........................ 29
b. Nghiên cứu phân lập bào tử theo phương pháp Teik-khiang Goh.............. 29
c. Nghiên cứu phân lập bào tử theo phương pháp của Zhang ........................ 29
2.4.2. Nghiên cứu nhân nhanh bào tử đơn bội ................................................ 30
2.4.3. Nghiên cứu lai bào tử đơn dịng tạo dịng hữu tính và cảm ứng hình
thành stroma .................................................................................................... 30
2.4.4. Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng và hình thái các tổ hợp lai thu được31
2.4.5. Xác định hàm lượng Cordycepin có trong các tổ hợp lai nghiên cứu .. 31

2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................... 32
PHẦN III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 33
3.1. Nghiên cứu phân lập bào tử từ 3 chủng nấm nghiên cứu ........................ 33
iv


3.2. Nghiên cứu khả năng lai của bào tử đơn bội ........................................... 37
3.3. Đánh giá đặc điểm hình thái, sinh trưởng và khả năng tích lũy cordycepin
của các tổ hợp lai ............................................................................................. 39
3.3.1. Đặc điểm sinh trưởng hệ sợi các tổ hợp lai trên môi trường rắn .......... 39
3.3.2. Đặc điểm sinh trưởng hệ sợi các tổ hợp lai trên mơi trường lỏng ........ 40
3.3.3. Đánh giá đặc điểm hình thái quả thể của các tổ hợp lai ....................... 42
3.4. Xác định hàm lượng cordycepin các tổ hợp lai thu được ........................ 44
3.5. Đặc điểm của tổ hợp lai tiềm năng được tuyển chọn............................... 45
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 47
4.1

Kết luận ............................................................................................. 47

4.2

Kiến nghị ........................................................................................... 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 49

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các chất có hoạt tính sinh học trong nấm C. militaris ...................... 7

Bảng 2.1. Danh sách các đơn vị cung cấp nguồn giống C. militaris .............. 27
Bảng 3.1. Hiệu quả phân lập bào tử bằng 3 phương pháp khác nhau............. 33
Bảng 3.2. Ưu nhược điểm của các phương pháp phân lập bào tử .................. 36
Bảng 3.3. Kết quả lai của 3 bào tử đơn bội trên môi trường PDA, gạo lứt, gạo
lứt và nhộng (-) tổ hợp lai khơng hình thành quả thể, (+) tổ hợp lai có hình
thành quả thể ................................................................................................... 38
Bảng 3.4. Đường kính khuẩn lạc và khối lượng sinh khối khô của các tổ hợp
lai thu được trong môi trường dịch thể ........................................................... 40
Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái quả thể của các tổ hợp lai ................................ 43
Bảng 3.6. Đặc điểm lựa chọn tổ hợp lai .......................................................... 46

vi


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. C. militaris được thu nhận ngồi tự nhiên ........................................ 4
Hình 1.2. Mặt cắt dọc quả thể chứa các bào tử của nấm C. militaris ............... 5
Hình 1.3. Các dạng bào tử của nấm C. militaris ............................................. 10
Hình 2.1. Ảnh 3 chủng giống bố mẹ ............................................................... 27
Hình 3.1. Biểu đồ phân lập bào tử nấm đông trùng hạ thảo bằng 3 phương
pháp khác nhau ................................................................................................ 35
Hình 3.2. Đặc điểm hệ sợi các tổ hợp lai trên môi trường PDA ..................... 38
Hình 3.3. Đặc điểm hình thái của 3 tổ hợp lai trên môi trường gạo lứt và
nhộng vào thời kì bắt đầu nhú sợi ................................................................... 39
Hình 3.4. Biểu đồ đường kính khuẩn lạc và khối lượng sinh khối khô của các
tổ hợp lai thu được trong môi trường dịch thể ................................................ 41
Hình 3.5. Hệ sợi các tổ hợp lai trên mơi trường ni cấy PDA...................... 41
Hình 3.6. Hình ảnh 3 tổ hợp lai đã phát triển đầy đủ ...................................... 42
Hình 3.7. Hình ảnh quả thể của 3 tổ hợp lai ................................................... 44

Hình 3.8. Hàm lượng cordycepin của 3 tổ hợp lai (mg/100g) ........................ 45

vii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CÁC KÝ HIỆU
Mb

mega base pair

kb

kilo base pair

CHỮ VIẾT TẮT
CTAB

Cetyltrimethyl-ammonium bromide

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic ac

NCBI

National Center for Biotechnology

MT

Môi trường

PDA

Potato - D-Glucose – Agar

PD

Potato - D-Glucose

WA

Water – Agar

SD/S

Spore drop/shooting

C. militaris

Cordyceps militaris

Stroma

Quả thể nấm

1


Tóm tắt đề tài

Từ 3 mấu nấm đơng trùng hạ thảo lấy từ 3 cơ sở nghiên cứu : Đại học khoa
học tự nhiên, Viện di truyền nông nghiệp Việt Nam, Trung tâm xét nghiệm
ADN NAVOGEN. Sau khi nghiên cứu lai 3 giống nấm với nhau, thu được 3
chủ con lai có hàm lượng cordycepin cao. Trong đó con lai giữa 2 chủng nấm
của Đại học khoa học tự nhiên và viện di truyển nông nghiệp Việt Nam mang
lại con lại với lượng cordycepin cao, tốc độ sinh trưởng 0,84cm/ngày. Hàm
lượng cordycepin thu được trên 50cm2 hũ nuôi là 8,67mg/hũ. Đặc điểm của
con lai có màu cam đậm, đầu trịn phình ra ở đình, thân stroma thẳng số lượng
stroma là 72±00, đường kính khuẩn lạc nhỏ và có khối lượng sinh khố khơ
cao. Ngồi ra, cịn đánh giá được phương pháp phân lập tối ưu nhất là
phương pháp của Zhang, phương pháp này giúp chúng ta có thể khống chế và
chọn lựa những bào tử bào tử tốt nhất, phương pháp này cịn giúp cho tổ hợp
lai ít bị nhiêm vi sinh vật gây hại cho sự phát triển của con lai. Chọn ra được
môi trường tối ưu để tiến hành lai bào tử đơn ở nấm C. militaris có chứa 20g
gạo lứt, 4g nhộng tằm và 64ml dịch (20g sucrose, 20g peptone, 1g
MgSO4.7H2O; 0,5g KH2PO4 pha trong 1l nước cất).

2


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cordyceps là chi nấm có nhiều hoạt chất dược liệu quý hiếm với hoạt
tính sinh học cao (Che, Z.M và cộng sự.;2003). Đến nay, đã có hơn 400 lồi
Cordyceps được tìm thấy và mơ tả, tuy nhiên chỉ có 36 lồi được đưa vào khai
thác, nuôi trồng (Sengupta và cộng sự.;1999)( Wang, G.D.;1995). Trong số
đó, Cordyceps militaris là lồi nấm ký sinh mang dược liệu quý và sử dụng
rộng rãi trong y học cổ truyền Trung Quốc và một số nước Châu Á (Zheng và
cộng sự.;2011).
C. militaris có nhiều hoạt chất chống oxi hóa bao gồm cordypolisaccarid,

adenine,

3’-amino-3’-deoxyadenosine,

homocitrullyl

aminoadenosine,

cordycepic acid và D-mannitol có hiệu quả trong việc phịng chống bệnh tiêu
hóa, tim mạch, hen suyễn, tiểu đường (Zheng và cộng sự.;2011). Ngồi ra,
nhóm chất polysaccharide được chiết xuất từ hệ sợi nấm C. militaris giúp
ngăn ngừa và tăng khả năng hạ đường huyết thông qua các cơ chất liên quan
đến glucose, glicose -6-phosphate dehydrogenase (Yokoyama và cộng
sự.;2003). Với đặc tính dược liệu có nhiều hoạt tính sinh học được ứng dụng
rộng rãi, C. militaris ngày càng được ni trồng và phát triển nhanh chóng với
quy mơ lớn.
Tuy nhiên, hiện nay tại Việt Nam q trình chọn giống các loại nấm ăn,
nấm dược liệu và C. militaris chủ yếu thơng qua sinh sản vơ tính để ni cấy,
nhân giống và bảo tồn. Trong q trình phát triển C. militaris sinh sản lượng
lớn bào tử vơ tính có cùng đặc điểm di truyền. Khi các bào tử này phát triển
hình thành quả thể, chúng kết hợp vật liệu di truyền với nhau và các vật liệu
di truyền cùng di truyền từ mẫu nấm mẹ, đều này vô tình làm giống nấm C.
militaris dễ bị thối hóa.

1


Trên thế giới, các giống nấm C. militaris mới có thể được tạo ra bằng
phương pháp gây đột biến với tác nhân UV, hóa học kết hợp với chọn lọc
(Yokoyama và cộng sự;.2003). Dựa vào phương pháp này, có thể tạo ra

những tính trạng hồn tồn mới, tuy nhiên, hiệu suất thu được những tính
trạng này tương đối thấp và kỹ thuật thực hiện tương đối khó khăn (Park và
cộng sự.;2009).
Đến nay, đã xác định được khả năng hình thành các tổ hợp lai mới thông
qua con đường lai tạo giữa hai dòng bào tử đơn với các gen MAT1-2 và
MAT1-1(Kamble và cộng sự.;2012). Tại Hàn Quốc và Trung Quốc đã có một
số nghiên cứu tạo được các chủng nấm C. militaris với đặc điểm sinh trưởng
và hàm lượng cordycepin cao vượt trội so với các chủng ban đầu thông qua
con đường lai bào tử hữu tính (Tang và cộng sự.;2018). Tuy nhiên, hiện nay
tại Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào trong lĩnh vực này.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài
“Nghiên cứu tạo giống nấm Cordyceps militaris bằng phương pháp lai
bào tử đơn”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu tổng quát
- Tạo được chủng giống nấm C. militaris bằng phương pháp lai bào
tử đơn.
- Nghiên cứu tuyển chọn giống nấm đơng trùng hạ thảo có nhiều
hợp chất cordcepin.
2.2. Mục tiêu cụ thể
- Nghiên cứu phân lập bào tử đơn từ quả thể nấm C. Militaris và lai hai
đơn bào tử.
- Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng lai của bào tử in
vitro và khả năng tạo hình thành stroma.

2


- Đánh giá đặc điểm sinh trưởng, hình thái và hàm lượng cordycepin của
các tổ hợp lai.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học
Cung cấp kết quả nghiên cứu, cho dữ liệu khoa học có tính logic và hệ
thống về kỹ thuật lai tạo giống nấm C. militaris bằng phương pháp lai đơn
bào tử.
Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học cho nghiên cứu về tạo giống có
chất lượng tốt nhất trên đối tượng nấm C. Militaris.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học vững chắc, để phát triển kỹ thuật
tạo giống nấm bằng phương pháp lai đơn bào tử. Tạo nguồn giống có hiệu
suất cao ở quy mơ cơng nghiệp.
Tạo nguồn giống có chất lượng cao là nguồn nguyên liệu phục vụ cho
q trình ni trồng nấm C. militaris.

3


PHẦN I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về nấm Cordyceps militaris
1.1.1. Phân loại nấm Cordyceps militaris
Nấm Cordyceps militaris được gọi nấm Đông trùng hạ thảo hay Nhộng
trùng thảo. Loại nấm này được các nhà khoa học phát hiện ra vào năm 1878,
nấm ký sinh trên ấu trùng của các lồi cơn trùng thuộc chi Thitarodes là lồi
nấm được sử dụng phổ biến hiện nay (Shih và cộng sự.;2007).
Nấm C. militaris thường phân bố ở các vùng núi có độ cao từ 2000m đến
3000m và được phân bố khắp nơi trên thế giới, C. militaris thuộc (Tang và
cộng sự.;2018):
Ngành: Ascomycota
Lớp: Ascomycotes

Bộ: Hypocreales
Họ: Clavicipitaceae
Chi: Cordyceps
Lồi: Cordyceps militaris

Hình 1.1. C. militaris được thu nhận ngoài tự nhiên

4


1.1.2. Đặc điểm sinh học của Cordyceps militaris
Nấm Cordyceps militaris được chú trọng nghiên cứu nhiều nhất trong tất
cả các loài thuộc chi Cordyceps (Kobayasi, Y.;1941). Sự đa dạng về hình thái
và khả năng thích nghi của lồi này ở nhiều sinh cảnh khác nhau có thể là
nguyên do khiến nấm C. militaris được tìm thấy ở nhiều vùng địa lý và sinh
thái trên trái đất. Đây là lồi có phổ vật chủ rất đa dạng, trong đó, phổ biến
nhất trong tự nhiên là ấu trùng của các lồi cơn trùng thuộc bộ cánh cứng
(Coleoptera), bộ cánh màng (Hymenoptera), và bộ hai cánh (Diptera). Ví dụ
như Ips sexdentatus, Lachnosterna quercina, Tenebrio molitor (thuộc bộ cánh
cứng), Cimbex similis (thuộc bộ cánh màng), và Tipula paludosa (thuộc bộ
hai cánh).

Hình 1.2. Mặt cắt dọc quả thể chứa các bào tử của nấm C. militaris
Bào tử nấm C. militaris thuộc nhóm bào tử nang. Các nang bào tử dài từ
300-510µm, chiều rộng 4µm. Các bào tử nang hình sợi khơng màu và phân
đoạn, kích thc 3,5-6 ì 1- 1,5àm. Khi quan sỏt di kớnh hiển vi các bào tử
có hình oval, có đường kính 3 µm (Stringer và cộng sự.;2005).

5

C. militaris kí sinh trên sâu non, có thân hình trụ dài 2-5cm, phần đầu có
dạng hình chùy với thân thường có màu vàng sẫm hoặc cam tươi và chủ yếu
xuất hiện nhiều vào mùa hè. Chu kỳ sống của lồi nấm bắt đầu từ sự hình
thành bào tử được giải phóng và xâm nhập vào vật chủ nhờ các yếu tố tự
nhiên như gió, nước và động vật.... Khi tiếp xúc với vật chủ bào tử bắt đầu
nảy mầm thành các ống được gọi là sợi nấm giúp chúng bám lên vật chủ. Sợi
nấm bắt đầu tiết ra các enzyme như lipase, chitinase, protease để phá vỡ lớp
vỏ ngoài của vật chủ và xâm nhập vào bên trong cơ thể chúng. Sau đó, hệ sợi
nấm hút dinh dưỡng và sinh trưởng mạnh đến khi chiếm toàn bộ cơ thể và gây
chết vật chủ. Khi gặp điều kiện môi trường thuận lợi, thường vào giai đoạn
cuối mùa hè hoặc vào mùa thu, quả thể bắt đầu phát triển ra ngoài vật chủ và
phát tán bào tử bắt đầu một chu kỳ mới (Kamble và cộng sự.;2008).
1.1.3. Giá trị dược liệu của Cordyceps militaris
Trong sinh khối của C. militaris có từ 17 đến 19 loại acid amin khác
nhau, bao gồm D-mannitol, lipid, và cũng chứa nhiều nguyên tố vi lượng với
hàm lượng P là cao nhất. Đặc biệt, các chất có hoạt tính sinh học cao đã đảm
bảo dược tính cao của lồi nấm này, trong đó có cordiceptic acid, cordycepin,
adenosine, hydroxyethyl adenosine, nhóm hoạt chất HEAA. Các dược chất
này có hoạt tính ức chế miễn dịch, kháng oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn,
hạ lipid trong máu, hạ đường huyết, chống lão hóa, bảo vệ hệ thần kinh và
kháng ung thư kháng đột biến anti-metastatic (Tang và cộng sự.;2018).
C. militaris chứa nhiều loại vitamin, như A, B2, B12, C, E, K và khoảng
25 - 30 % protein, 8% chất béo, đường mannitol. Ngồi ra trong quả thể nấm
C. militaris cịn chứa nhiều acid béo không no, chiếm đến 70% acid béo tổng
số, trong đó lượng acid linoleic trong quả thể chiếm 61,3% và 21,5% trong
sinh khối nấm. Lượng acid béo no, acid palmitic, chiếm 24,5% trong quả thể
và 33,0% trong sinh khối (Kobayasi, Y.;1941). Adenosine và cordycepin là

6

hai hợp chất có dược tính cao của nấm C. militaris. Adenosine chiếm 0,06%
sinh khối nấm. Đối với hợp chất cordycepin, trong quả thể có hàm lượng cao
gấp 3 lần so với hệ sợi (0,97% so với 0,36%) (Kobayasi,1941). Các
polysaccharide CPS-1 và CPS-2 được tách chiết từ nấm C. militaris cho thấy,
chúng có thành phần là các đường monosaccharide, mannose và galactose
(Yan và cộng sự.;2008).
Bảng 1.1. Các chất có hoạt tính sinh học trong nấm C. militaris
Hợp chất có hoạt tính sinh học
Cordycepin
Cordycepic acid
N-acetylgalactosamine
Adenosine
Ergosterol and ergosteryl esters
Hypoxanthine
Bioxanthracenes
Acid deoxyribonuclease
Polysaccharide exopolysaccharide
Chitinase
Macrolides (C10H14O4)
Cicadapeptins and myriocin
Superoxide dismutase
Protease
Naphthaquinone
Cordyheptapeptide
Dipicolinic acid
Fibrynolytical enzyme
Lectin
Cordymin

Tài liệu tham khảo
Cunningham et al. (1950)
Chatterjee et al. (1957)
Kawaguchi et al. (1986
Guo et al. (1998)
Yuan et al. (2007)
Huang et al. (2003)
Isaka et al. (2001)
Ye et al. (2004)
Yu et al. (2007, 2009), Xiao et
al. (2010), Yan et al. (2010)
Lee and Min (2003)
Rukachaisirikul et al. (2004)
Krasnoff et al. (2005)
Wanga et al. (2005)
Hattori et al. (2005)
Unagul et al. (2005)
Rukachaisirikul et al. (2006)
Watanabe et al. (2006)
Kim et al. (2006)
Jung et al. (2007)
Wonga et al. (2011)

7


Hiện nay, đã có một số nghiên cứu cơng bố khả năng ứng dụng của
cordycepin chống lại virus SARS-CoV-2. Năm 2020 Verma A.K. và cộng sự
đã chỉ ra mức độ tương tác phân tử thông qua sự liên kết của cordycepin với

protein đích SARS-CoV-2, điều này làm tăng khả năng ức chế đột biến của
virus và các protease chính, từ đó khẳng định tiềm năng điều trị, phịng chống
bệnh (Verma, A. K.;2020).
Hợp chất cordycepin (3’- deoxyadenosine) là một đồng đẳng nucleoside
có hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng ung thư, ngừa sự di căn của tế bào ung
thư và điều hòa miễn dịch (Yokoyama và cộng sự.;2003). Cordycepin ức chế
tăng sinh tế bào ung thư đại tràng qua con đường ức chế sự thối hóa của chất
I-kappa B-alpha trong tế bào và ức chế hoạt tính của NF-Kappa B.
Hoạt chất protein (CMP) có hoạt tính sinh học cao được chiết tách từ
nấm C. militaris có kích thước 12 kDa, pI 5,1. Protein này ức chế khả năng
phát triển của nấm Fusarium oxysporum và gây độc đối với tế bào ung thư
bàng quang (Park và cộng sự.;2009). Các hợp chất dẫn xuất từ nấm được
mong đợi ứng dụng trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột.
Cordycepin ngăn sự biểu hiện của gen T2D chịu trách nhiệm điều hòa bệnh
tiểu đường thông qua việc ức chế các đáp ứng phản ứng viêm phụ thuộc
NF-κB, do đó hy vọng sẽ được ứng dụng như một chất điều hòa miễn dịch
dùng trong điều trị các bệnh về miễn dịch (Tang và cộng sự.;2018).
Dịch chiết các hoạt chất trong C. militaris tự nhiên và ni cấy đều có
tác dụng chống oxy hóa. Chúng ức chế khả năng oxy hóa acid linoleic, khử
hoạt tính của 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DDPH), hydrogen peroxide, gốc
tự do hydroxyl, anion superoxide. Các nghiên cứu cho thấy hợp chất CM-hsCPS2 chứa trong dịch chiết nấm C. militaris có tính kháng DPPH (các gốc
tự do), hoạt tính khử và tạo phức ở nồng độ (8 mg/ml) là 89% và 85% (Shih
và cộng sự.;2007).

8


Enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm C. militaris có hoạt tính gắn
fibrin, do đó xúc tiến việc phân hủy fibrin. Enzyme này có khả năng sử dụng
trong điều trị tan huyết khối tương tự như các enzym fibrinolytic mạnh

khác như nattokinase và enzyme chiết từ giun đất. Khi enzyme này có thể
sản xuất ở quy mơ lớn sẽ là một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các enzyme
fibrinolytic giá thành cao hiện đang được sử dụng cho bệnh tim lão hóa ở
người (Verma, A. K.;2020).
Tính kháng viêm: Để xác định tác dụng kháng viêm của nấm, dịch
chiết từ quả thể nấm C. militaris (CMWE) được thử nghiệm về tác dụng kiểm
sốt lipopolysaccharide (LPS) (chịu trách nhiệm kích thích việc sản xuất
nitric oxide), việc phóng thích yếu tố hoại tử khối u α (TNF-α) và
interleukin-6 (IL-6) của tế bào RAW264,7. Các đại thực bào được xử lý với
nồng độ khác nhau của CMWE làm giảm đáng kể LPS, TNF-α và IL-6 và
mức độ giảm theo nồng độ của dịch chiết. Những kết quả này cho thấy rằng
CMWE có tác dụng ức chế mạnh đến việc sản xuất các chất trung gian gây
viêm của tế bào (Jo và cộng sự;.2010).
1.2. Đặc điểm sinh sản nấm Cordyceps militaris
C. militaris là lồi có 7 nhiễm sắc thể, kích thước nhiễm sắc thể dao
động trong khoảng 2,0 đến 5,7 Mb. C. militaris có kích thước bộ gen khoảng
32,2 mb với 9684 gen mã hóa protein, trong đó có 13,7% chứa các gen đặc
hiệu của loài (Zheng và cộng sự.;2011). Về di truyền học, các tế bào soma C.
militaris phân chia tương tự như các tế bào sinh dưỡng khác (Moore,
R.T.;1964). Các loại nấm Cordyceps sinh sản theo nhiều hình thức khác nhau
gồm sinh sản vơ tính và sinh sản hữu tính. Ngồi ra, nấm C. militaris có hình
thức sinh sản dạng đồng tản (homothallism) và dị tản (heterothallism) (Lin,
X., Heitman, J.;2007)

9


Sinh sản vơ tính:
Q trình sinh sản vơ tính ở nấm C. militaris chủ yếu hình thành thơng
qua các sợi nấm đơn bội với các hình thức khác nhau như: phân hạch, bào tử,

phân mảnh…. Sự phân mảnh bao gồm phân tách từ mảnh sợi nấm và phát
triển độc lập, hình thành bằng cách làm dày vách ngăn có nguồn gốc từ một tế
bào lớn hơn các tế bào khác hình thành sợi nấm, sau đó được giải phóng tạo
thành sợi nấm mới. Sinh sản bào tử vơ tính, được hình thành từ sợi nấm
chun biệt gọi là conidiophore có thể xuất hiện đơn độc hoặc được nhóm lại
dưới nhiều hình thức khác nhau. Chúng có thể hình thành trên môi trường
thạch hoặc trong môi trường lỏng. Các bào tử này có khả năng như bào tử
thơng thường tạo điều kiện cho nấm phát tán (Lin, X., Heitman, J.;2007).

Hình 1.3. Các dạng bào tử của nấm C. militaris
(1) – bào tử trịn tạo ra trên mơi trường ni cấy rắn, (2) chồi bào tử tạo
ra trên môi trường nuôi cấy lỏng, (3) – quả thể nấm, (4) – thể quả hình chai,
(5) – thể nang, (6) – các mảnh bào tử, (7) – chu kỳ bào tử được hình thành

10


Sinh sản hữu tính C. militaris:
Khi bước vào giai đoạn sinh sản hệ sợi nấm hình Dikaryon là tế bào
chứa chính xác hai nhân khác biệt về mặt di truyền gồm hai cấu trúc bao gồm
ascogonium (-) và antheridium (+) hai cấu trúc hợp nhất lại với nhau hình
thành plasmogamy tạo ra hợp tử lưỡng bội là các tế bào chứa hai bộ nhiễm
sắc thể (một bộ nhiễm sắc thể từ mẹ và một bộ nhiễm sắc thể thừ bố). Các tế
bào sinh dưỡng có bản chất lưỡng bội tiến hành phân chia bằng nguyên phân
tạo ra các tế bào lưỡng bội giống hệt nhau về mặt di truyền và giảm phân tạo
thành 8 bào tử có mặt di truyền.
1.3. Chọn giống nấm bằng phương pháp lai đơn bào tử
1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chọn giống
Trong q trình lai tạo giống bằng bào tử đơn có nhiều yếu tố ảnh hưởng
đến hiệu quả tạo giống gồm phương pháp bắt bào tử, môi trường nhân giống,

môi trường nuôi cấy, yếu tố di truyền của các bố mẹ.
Về phương pháp phân lập bào tử nó quyết định khả năng thu nhận số
lượng, chất lượng bào tử phân lập được ảnh hưởng đến quá trình chọn lựa đặc
điểm di truyền giới tính của bào tử. Hiện nay có rất nhiều phương pháp phân
lập bào tử khác nhau, chúng có các ưu nhược điểm phù thuộc cho từng loài
nấm.

11


Đặc điểm

Phương pháp
của SD/S

Phương pháp
của Teik-khiang
Goh

Phương pháp
của Zhang

Mẫu vật (quả thể Mẫu nấm, kim Mẫu nấm, kim
Vật liệu, dụng nấm), băng dính thủy tinh, cồn thủy tinh, cồn
cụ
95%
95%, kính hiển
vi
Các bước xử
lý mẫu

Không xử lý

Xử lý mẫu sơ bộ Xỷ lý bào tử
bằng cồn

Xác định dịch
bào tử huyền
phù

Không

Bào tử được giữ Bào tử tách chứa
trên lam kính
trong ống ly tâm
đã được khử
trùng

Cách cấy bào
tử

Q trình ni

Bắt và ni
cấy bào tử

Quả thể tự giải Bào tử được cấy
phóng bào tử đều trên đĩa
theo cơ chế sinh thạch
sản

Mẫu kiểm tra (3- Mẫu kiểm
5 ngày)
theo định kỳ
Bào tử nảy mầm
được bắt ra bằng
cách di chuyển
sợi nấm trên môi
trường thạch

Bào tử được cấy
chuyển
bằng
micropipette đã
khử trùng trên
từng ơ vng
1,5x1,5cm

tra Mẫu kiểm
theo định kỳ

Tìm bào tử nảy
mầm dưới kính
hiển vi rồi bắt
chuyển bào tử
lên mơi trường
mong muốn

tra

Tìm bào tử nảy
mầm dưới kính
hiển vi rồi bắt
chuyển bào tử
lên mơi trường
mong muốn

Ngồi các phương pháp phân lập bào tử, giống nấm là yếu tố ảnh hưởng
đến chất lượng giống của các bào tử. Về mặt di truyền các bào tử có cùng đặc
điểm di truyền, từ một cá thể có khả năng lai tạo cao hơn so với các bào tử có
mặt di truyền khác nhau. Tuy nhiên, yếu tố này làm giảm chất lượng giống do
nguồn giống được tạo ra từ nguồn gen làm giảm đa dạng sinh học, thối hóa

12


nguồn giống. Mặt khác ở nấm C. militaris khi lai các bào tử có đặc điểm di
truyền hai giống khác nhau, tuy cho tỉ lệ lai tạo thấp nhưng tỉ lệ tìm được
nguồn giống có khả năng phát triển tốt, cho năng suất cao, đặc biệt là khả
năng tích lũy hợp chất thứ cấp cao hơn.
Về yếu tố môi trường ni cấy và phương pháp cấy giống có ảnh hưởng
khơng nhỏ đến q trình lai tạo. Ở mơi trường lai có đủ nguồn dinh dưỡng
giúp hệ sợi nấm có thời gian và dinh dưỡng để sinh trưởng, phát triển tạo điều
kiện cho hệ sợi nấm trao đổi di truyền làm đa dạng di truyền hình thành q
trình lai hữu tính tạo nguồn giống mới.
1.3.1. Quy trình chọn giống nấm bằng phương pháp lai bào tử đơn
Quy trình chọn giống nấm bằng phương pháp lai bào tử có 04 bước
chính bao gồm:
Bước 1: Nuôi và nhân nhanh các bào tử đơn lẻ trên môi trường rắn hoặc
môi trường lỏng nhằm tạo nguồn sinh khối lớn.

Bước 2: Sau khi các bào tử được xác định kiểu gen và nhân nhanh số
lượng, các bào tử có kiểu gen khác nhau được lai với nhau trên môi trường,
nhằm dung hợp gen với nhau, giúp hình thành quả thể và tạo lồi có kiểu gen
từ hai bào tử khác nhau.
Bước 3: Là bước quan trọng cho quá trình chọn giống bằng phương pháp
lai bào tử đơn. Quả thể và giống nấm sau khi lai được đánh giá đặc điểm di
truyền và các đặc điểm hình thái để tuyển chọn giống lai mới có hiệu quả theo
mục đích lai tạo theo con đường hữu tính.

13


1.4 KỸ THUẬT NUÔI CẤY ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO
1.4.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng/cơ chất
1.4.1.1. Ảnh hưởng của nguồn carbon
Nấm đông trùng hạ thảo cần một lượng lớn carbon trong quá trình sinh
trưởng phát triển. Nguồn carbon cung cấp vật chất cho quá trình sinh trưởng,
tổng hợp hợp chuyển hóa năng lượng cho các hoạt động của tế bào. Hàm
lượng carbon chiếm khoảng 50% trọng lượng khô quả thể nắm. Nẩm có sự
khác biệt rất lớn trong việc sử dụng các nguồn carbon khác nhau. Nguồn
carbon thích hợp cho nấm phát triển gồm các monosacharide (arabinose,
xylose, fructose, galactose, glucose) và disacharide (cellobiose, lactose,
maltose, sucrose). Dong và Yao (2005) cho rằng dường như các disaccharide
có tác động mạnh hơn đến sự phát triển của sợi nấm so với các
monosaccharide được thử nghiệm. Các nghiên cứu đã công bố cho thấy
những nguồn carbon có thể sử dụng để ni trồng nấm đông trùng hạ thảo là
các loại đường, tinh bột... trong đó thích hợp nhất là những loại có cấu trúc
phân tử nhỏ (Shrestha và cộng sự.;2012).
Bởi vì ấu trùng đắt tiền và khơng có sẵn (Lin và cộng sự.;2007), ấu
trùng có thể khó xử lý và do đó dễ bị nhiễm vi sinh vật, các giá thể hữu cơ

thay thế đã được thử nghiệm để sản xuất thương mại quả thể C. militaris. Ngũ
cốc có bổ sung một số chất hữu cơ đã được chứng minh là thực phẩm thay thế
tốt cho ấu trùng. Kobayasi (1941) đã ghi nhận sự sản xuất stroma của C.
militaris trên nền gạo. Kể từ đó, gạo được sử dụng làm ngun liệu chính để
nuôi cấy nấm C. militaris. Độ xốp của môi trường tạo quả thể ảnh hưởng đến
sự phát triển của sợi nấm và năng suất quả thể. Độ xốp tăng theo kích thước
hạt và giảm theo tỷ lệ nước trong quá trình chuẩn bị mơi trường cơ chất. Khi
khơng có kẽ hở, các sợi nấm hầu như chỉ phát triển trên bề mặt giá thể và do
đó khơng thể hấp thụ đủ dinh dưỡng từ giá thể. Các kẽ cho phép sợi nấm phát

14