Nuôi cấy mô giống cây nần nghệ bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:
“NUÔI CẤY MÔ GIỐNG CÂY NẦN NGHỆ BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN-VITRO”

Hà Nội - 2023


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“NUÔI CẤY MÔ GIỐNG CÂY NẦN NGHỆ BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN-VITRO”

Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS. Khuất Hữu Trung
ThS. Nguyễn Quốc Trung
Sinh viên thực hiện : Kiều Thị Hoa
Mã sinh viên

: 637027

Lớp

: K63CNSHA

Hà Nội - 2023


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc và chân thành tới thầy PGS.TS. Khuất
Hữu Trung (Bộ môn Kỹ thuật di truyền – Viện Di truyền Nông Nghiệp) và ThS.
Nguyễn Quốc Trung (Bộ môn Sinh học phân tử - Học viện nông nghiệp Việt
Nam) đã tận tình dạy bảo và hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em trong
suốt thời gian thực hiện và hồn thành khóa luận tốt nghiệp này.Thầy khơng chỉ
là người truyền đạt những kiến thức vơ cùng bổ ích mà thầy còn bảo ban cho em
những kỹ năng sống cũng như phong cách làm việc rất chu đáo và nhiệt tình. Nhờ
đó, em có những bài học q báu và vơ cùng sâu sắc trong suốt q trình hồn
thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam
đã luôn thuận lợi cho em được học tập tại trường trong suốt thời gian học tập.
Em xin chân thành cảm ơn tập thể các anh chị, đặc biệt là ThS Khương Thị
Bích ở Bộ môn Kỹ thuật di truyền – Viện Di truyền Nơng Nghiệp đã tận tình giúp
đỡ và chỉ bảo để em hồn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè ln giúp đỡ và ủng
hộ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Hà Nội, ngày… tháng… năm 2023
Sinh Viên

Kiều Thị Hoa

ii


LỜI CAM ĐOAN
Em xin đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng em. Mọi số liệu và kết

quả trong khóa luận là trung thực và khơng trùng lặp hay sao chép từ một đề tài
nào khác.
Em xin cam đoan các thơng tin trong khóa luận được trích dẫn là có nguồn
gốc. Nếu sai, em hồn tồn chịu trách nhiệm.

iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................. ii
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... iii
MỤC LỤC ..................................................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................... vi
CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG KHỐ LUẬN ............................................. vii
TĨM TẮT........................................................................................................................1
PHẦN 1. MỞ ĐẦU .........................................................................................................2
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................2
1.2. Mục đích của đề tài...................................................................................................3
1.3. Yêu cầu của đề tài....................................................................................................3
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................4
2.1. Tổng quan về cây Nần nghệ .....................................................................................4
2.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái.............................................................................5
2.1.2. Đặc điểm sinh thái và phân bố ..............................................................................7
2.1.3. Thành phần hóa học...............................................................................................7
2.1.4. Tác dụng dược lý ...................................................................................................7
2.2. Tổng quan về nuôi cấy mô, tế bào thực vật..............................................................9
2.2.1. Định nghĩa .............................................................................................................9
2.2.2. Các ưu điểm và hạn chế của công nghệ vi nhân giống .......................................10
2.3. Lịch sử nghiên cứu về cây Nần nghệ (Dioscorea collettii) ....................................11

PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................14
3.1. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................................14
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..........................................................................14
3.3. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................................14
3.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................15
3.4.1. Tạo vật liệu khởi đầu ...........................................................................................15
3.4.2 Các giai đoạn nghiên cứu thí nghiệm cây Nần nghệ ............................................15
3.4.3. Điều kiện thí nghiệm ...........................................................................................18

iv


3.4.4. Xử lý số liệu ........................................................................................................19
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................20
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BAP đến khả năng tái sinh chồi .............20
4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BAP kết hợp NAA đến khả năng nhân
nhanh tạo cụm chồi ........................................................................................................22
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BAP kết hợp IBA đến khả năng nhân nhanh
tạo cụm chồi...................................................................................................................25
4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh
.......................................................................................................................................28
4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh
.......................................................................................................................................31
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................35
5.1. Kết luận...................................................................................................................35
5.2. Kiến nghị ................................................................................................................35
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................36

v

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi sau 4 tuần nuôi cấy .............20
Bảng 2: Ảnh hưởng BAP kết hợp NAA đến khả năng nhân nhanh sau 6 tuần nuôi cấy
.......................................................................................................................................23
Bảng 3: Ảnh hưởng BAP kết hợp IBA đến khả năng nhân nhanh sau 6 tuần nuôi cấy
.......................................................................................................................................26
Bảng 4: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh sau 6 tuần nuôi cấy
.......................................................................................................................................29
Bảng 5: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh sau 6 tuần ni cấy
.......................................................................................................................................32

DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Ảnh hưởng BAP đến khả năng tái sinh chồi ở CT4 sau 4 tuần........................22
Hình 2: Ảnh hưởng BAP kết hợp NAA đến khả năng nhân nhanh sau 6 tuần ti cấy
CT2 ................................................................................................................................25
Hình 3: Ảnh hưởng BAP kết hợp IBA đến khả nằn nhân nhanh sau 6 tuần ni cấy CT1
.......................................................................................................................................27
Hình 4: Ảnh hưởng NAA đến khả năng ra rễ sau 6 tuần ni cấy................................31
Hình 5: Ảnh hưởng IBA đến khả năng ra rễ sau 6 tuần nuôi cấy .................................33

vi


CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG KHOÁ LUẬN
BAP

6- Benzyl Amino Purin

CT

Cơng thức

ĐC

Đối chứng

IBA

Indolyl Butyric Acid

KTST

Kích thích sinh trưởng

MS

Murashige – Skoog, 1962

NAA

Naphtyl Acetic Acid

TB

Trung bình

TS

Tiến sĩ

vii


TĨM TẮT
Nghiên cứu được tiến hành với mục đích xác định ảnh hưởng của nồng độ
các chất điều tiết sinh trưởng ảnh hưởng đến quá trình nhân nhanh In-vitro cây
Nần nghệ. Các nội dung nghiên cứu bao gồm nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BAP
đến khả năng tái sinh chồi. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BAP kết hợp với NAA
đến khả năng nhân nhanh tạo cụm chồi. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BAP kết
hợp vs IBA đến khả năng nhân nhanh tạo cụm chồi. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng
độ NAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ
IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh. Kết quả cho thấy nồng độ BAP lên
2,0 mg/l thì cho khả năng tái sinh chồi tốt nhất, tỉ lệ tạo chồi cao nhất đạt 93,33%;
đồng thời số chồi TB đạt cao nhất là 2,85 chồi/mẫu và chất lượng chồi khỏe. Nồng
độ BAP 2,0 mg/l và NAA 0,4 mg/l là nồng độ thích hợp nhất cho khả năng nhân
nhanh tạo cụm chồi cho hệ số nhân chồi 8,72; chiều cao 2,74 cm/chồi và cho hình
thái chồi khoẻ mạnh, nhiều cụm chồi, màu xanh đậm. Với môi trường MS cơ bản
bổ sung 2,0 mg/l BAP và 0,2 mg/l IBA là môi trường tối ưu cho khả năng nhân
nhanh tạo cụm chồi tốt nhất. Môi trường thích hợp nhất cho giai đoạn ra rễ cây
Nần nghệ là ½ MS + 25 g/l đường + 0,5 g/l than hoạt tính + 8 g/l agar + 1,0 mg/l
NAA. Nồng độ IBA lên 0,5 mg/l thì tỉ lệ tạo rễ tăng cao nhất, đạt 85,83%; số rễ
TB là 4,51 và chiều dài rễ TB là 2,73 cm, cho thấy chất lượng ra rễ đồng đều rễ
nhiều, mập, cây con khỏe mạnh. Đây là kết quả đầu tiên nghiên cứu ảnh hưởng
nồng độ các chất điều tiết sinh trưởng đến sự phát triển chồi và rễ giống cây Nần
nghệ. Kết quả của nghiên cứu này có thể sử dụng trong sản xuất nhân giống Invitro cây Nần nghệ giúp cung cấp đủ số lượng ra thị trường.

1

PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO) đánh giá, 80% dân số trên thế giới dựa
vào nền y học cổ truyền để đáp ứng cho nhu cầu chăm sóc sức khoẻ ban đầu, trong
đó chủ yếu là thuốc từ cây tự nhiên. Trong vài thập kỷ gần đây, với xu hướng “Trở
về với thiên nhiên”, nhiều nước trên thế giới đang đẩy mạnh việc nghiên cứu, bào
chế và sản xuất các chế phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên thay thế nguyên liệu
tổng hợp, dùng trong ngành công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm chức
năng để nâng cao chất lượng cuộc sống cho con người. Sự tín nhiệm của sản phẩm
từ thảo dược ngày càng được nâng cao. Do vậy mà về sau các nhà khoa học hướng
vào nghiên cứu các thuốc có nguồn gốc thảo mộc. Cây nần nghệ (cây nần vàng) là
loại thảo dược có tên khoa học là Dioscorea collettii, thuộc họ Củ nâu
(Dioscoreaceae). Cây có nguồn gốc từ Trung Quốc, Đài Loan. Ngồi ra, nó cịn
có mặt ở một số nước khác như Ấn Độ, Myanmar và vùng Tây Bắc Việt Nam.
Người Dao thường gọi loại thảo dược này với tên gọi khác là cây mài đắng. Sở dĩ
có tên gọi đó là vì củ nần nghệ có vị đắng chát, mùi hơi nồng. Cây nần vàng phát
triển ở độ cao trên 1500m so với mực nước biển, nhấp nhô như nương rẫy hoặc
các sườn đồi không màu mỡ. Đây là loại dây leo thân cuốn, sống lâu năm, chiều
dài có thể dài tới 5m.
Cuối những năm 70 thế kỷ trước, ở Liên xô cũ đã lưu thành các chế phẩm
Diosponin, Polysponin là thuốc giảm mỡ máu, cùng chi với cây Nần vàng.
Năm 1985 tại trường Đại học y số 1 Xêtrênốp – Matxcơva, luận án TS về
cây Nần vàng ở Việt Nam đã được bảo vệ thành công.
Sau khi được về nước, cùng với sự cộng tác của cố giáo sư Phạm Khuê
(viện lão khoa), GS.BS Nguyễn Trung Chính, các thầy thuốc ở bệnh viện Hữu
Nghị Việt Xơ, PGS.TS Hồng Kim Huyền cùng các đồng nghiệp tại trường ĐH
Dược Hà Nội. Kết quả là thuốc Diosgin đã ra đời vào năm 1995; từ quy mơ phịng
thí nghiệm đến nghiên cứu lâm sàng đánh giá trên người bệnh một cách cẩn trọng,

2

đã được hội đồng nghiên cứu của trường Đại học Dược Hà Nội đánh giá xuất sắc;
cơng trình cũng được vinh dự đạt giải nhất hội nghị khoa học Y Dược trẻ toàn
quốc. Nần nghệ là dược liệu nằm trong top cây dược “ q hiếm “ vì nó chỉ mọc
ở độ cao trên 1500m so với mặt nước biển. Cây nần nghệ có tác dụng hạ
cholesterol rõ ràng, rối loạn lipid máu mà khơng có bất cứ tác dụng phụ nào. Kiểm
soát điều trị các bệnh về gan và đặc biệt là bệnh gan nhiễm mỡ. Thêm nữa, nần
nghệ lại có xu hướng tăng HDL (high density lipoprotein: lipoprotein tỷ trọng cao
, còn gọi là các “cholesterol tốt”, giúp chuyển cholesterol dư thừa từ thành mạch
máu về gan để chuyển hóa, giảm nguy cơ tai biến, nhồi máu cơ tim).Bên cạnh đó
Nần nghệ (Dioscorea collettii) là loại cây dược liệu quý nhưng lại mọc ở ở cao
khoảng 1500m tại những nơi có địa hình hiểm trở và phân bố tự nhiên chỉ ở một
số vùng nhất định. Hiện nay, nhu cầu sử dụng trong y học ngày càng cao dẫn đến
việc khai thác quá mức ngoài tự nhiên nên nguồn cây quý này đang dần bị khan
hiếm. Do vậy, công nghệ nuôi cấy mô đã phát triển và là một trong những phương
thức quan trọng để nhân nhanh giống, tiết kiệm không gian và thời gian. Đồng
thời cho ra hàng loạt cây giống có sự đồng nhất về tính trạng, kiểu gen và kiểu
hình, hệ số nhân giống cao nhằm cung cấp cây giống với số lượng lớn, đồng nhất
về chất lượng phục vụ cho sản xuất quy mô cơng nghiệp.
1.2. Mục đích của đề tài
Mục đích Nghiên cứu khả năng nhân giống nhanh cây nần nghệ (Dioscorea
collettii Hook.f. 1892) in vitro nhằm tạo nguồn giống cây ban đầu sạch bệnh có
tính đồng nhất về mặt di truyền đáp ứng yêu cầu cây giống phục vụ cho nhu cầu
sản xuất.
1.3. u cầu của đề tài
Xác định mơi trường thích hợp cho giai đoạn tái sinh chồi.
Xác định môi trường thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh chồi.
Xác định mơi trường thích hợp cho giai đoạn ra rễ tạo cây hoàn chỉnh.

3


PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về cây Nần nghệ
Đầu những năm 1970, trong lúc đi sưu tầm thảo dược quý, các chuyên gia
trường đại học Dược Hà Nội gặp gỡ một cụ già người Dao và được cụ chỉ cho
một dây leo cuốn, củ có màu vàng, rễ giống râu hùm, có vị đắng và chỉ mọc ở độ
cao trên 1500m so với mặt nước biển. Cụ nói “cây này q lắm đấy, nhưng chỉ
làm thuốc thơi khơng ăn được đâu, nó giúp một số cán bộ bụng to đã bé lại và
giúp hết đau nhức xương khớp rất hiệu nghiệm; dân ở đây gọi nó là củ Nần (Nần
theo tiếng dân tộc có nghĩa là râu hùm)”.
Thảo dược này sau đó đã được giám định tên khoa học là Dioscorea
collettii, chiết xuất saponin từ củ với hàm lượng khá cao (Những năm sau đó trong
các cơng trình khoa học đăng trên tạp chí Dược học trong nước và ở Liên Xô cũ,
cây được đặt tên là Nần nghệ). Hiện giờ cây Nần nghệ là cây thuốc quý hiếm có
tên trong Sách Đỏ của Việt Nam. Nần nghệ được sử dụng trong y học cổ truyền,
là thành phần chính để điều chế các loại thuốc đặc trị hạ mỡ dư thừa trong máu,
mỡ trong gan, mỡ nội tạng, giúp bình ổn huyết áp, điều hịa nhịp tim và chống
viêm khớp. Bộ phận sử dụng chính của cây là thân và rễ (tên trong Đông y là Tỳ
giải), được dùng trị đau khớp xương do phong thấp đau lưng gối, cảm nhiễm
đường tiết niệu, bạch đới, rắn độc cắn,…
Nần nghệ bán trên thị trường chủ yếu là nhập khẩu từ Trung Quốc, chất
lượng không ổn định và nguồn gốc khơng rõ ràng, phần cịn lại được khai thác
trong tự nhiên. Tuy nhiên, do diện tích rừng ngày càng thu hẹp, tình trạng khai
thác rừng bừa bãi lấy lâm sản phục vụ đời sống vẫn chưa được kiểm soát triệt để,
khiến cho mơi trường sống của những lồi dược liệu quý hiếm (trong đó có Nần
nghệ) ngày càng bị thu hẹp. Mặc khác,vì lợi ích kinh tế, một bộ phận người dân
còn đang khai thác dược liệu quý một cách triệt để, làm cạn kiệt nguồn dược liệu
quý hiếm trong tự nhiên. Trong khi đó, nguồn giống cây dược liệu Nần nghệ được

4


trồng chủ yếu là từ giâm hom và nhân giống bằng củ có hệ số nhân thấp, khơng
cung cấp đủ nguồn cây giống cho các vùng trồng cây dược liệu.
Vì vậy, việc áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân
giống Nần nghệ, phát triển những vùng trồng chuyên canh cây dược liệu này sẽ
cho phép sản xuất được lượng cây giống lớn trong thời gian ngắn, chất lượng cây
giống đồng đều, có thể nhân giống ở quy mô công nghiệp, chủ động sản xuất để
cung cấp nguồn nguyên liệu cho ngành dược.
2.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái
* Phân loại
Tên khoa học: Dioscorea collettii Hook.f. 1892.
Tên đồng nghĩa: Dioscorea oenea Prain & Burk. 1914.
Tên khác

: Từ collett.

Giới

: Plantae

Ngành

: Angiospermae

Lớp

: Monocots

Bộ

: Dioscoreales

Họ

: Củ nâu (Dioscoreaceae)

Chi

: Dioscorea

Loài

: D. collettii

5


* Đặc điểm hình thái
• Dây leo quấn, sống nhiều năm, dài 5-10 m.
• Lá đơn, mọc cách; phiến lá hình tim, cỡ 6-10 × 5-9 cm; có 7 gân, trong đó
3 gân gốc vươn tới chóp lá; ở gốc cuống lá có 2 gai nhỏ cong (lá kèm biến dạng).
• Cụm hoa đực là những xim dài 10-30 cm, mỗi xim có 3-4 hoa. Hoa đực
khơng cuống, bao hoa gồm 6 mảnh dính nhau ở gốc, với 6 thùy hình tam giác ở
đỉnh. Nhị hữu thụ 3 có chỉ nhị chia đơi thành hình nạng và mỗi nhánh mang 1 bao
phấn; nhị lép 3, hình dùi.
• Cụm hoa cái hình chùm, dài 15-30 cm. Hoa cái có 2 lá bắc, bao hoa 6 thùy,
khơng có nhị lép; nùm nhụy 3 thùy.

• Quả nang quặt lại, có 3 cánh, 3 ơ, mỗi ơ chứa 2 hạt. Hạt có cánh trịn.
• Thân rễ màu vàng, phân nhiều nhánh ngắn tạo thành một khối có đường
kính đạt tới 20 cm. Vỏ ngồi có màu nâu vàng hoặc xám, xù xì, lồi lõm, mang rất
nhiều rễ con nhỏ.

6


• Thân rễ nằm dưới đất, đến tháng 2-3 mới mọc thân khi sinh, tháng 5-6 ra
hoa và kết quả, cây tàn lụi vào tháng 11-12.
2.1.2. Đặc điểm sinh thái và phân bố
* Đặc điểm sinh thái
Nần nghệ thường sống ở vùng đồi núi nhấp nhô như nương rẫy hoặc các
sườn đồi kém màu mỡ, thường có ở những vùng có độ cao khoảng 1.500m so với
mặt nước biển.
* Phân bố
– Trong nước: Cây phân bố ở Sơn La (Mộc Châu).
– Thế giới: Cây có ở Ấn Độ, Trung Quốc, Myanmar.
Cây mọc rải rác ven rừng, trong rừng tre nứa, cây bụi, ven suối, sườn núi.
Phân bố rất hẹp, mọc rất rải rác, nơi sống đang bị xâm hại do tàn phá rừng.
Vì vậy, hiện nay Nần nghệ đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam (1996) với
cấp đánh giá “hiếm”.
2.1.3. Thành phần hóa học
Thành phần quan trọng nhất là Diosgenin. Theo Dược điển Việt Nam V,
dược liệu phải chứa khơng được ít hơn 2,5 % diosgenin (C27H42O3) tính theo dược
liệu khô kiệt. Trong thời kỳ hoa nở, hàm lượng diosgenin lên cao nhất (4,4%).
Các nhà khoa học đã chiết được diosgenin tinh khiết từ Nần nghệ với hiệu suất
chiết là 2%.
2.1.4. Tác dụng dược lý
* Theo y học cổ truyền :

• Củ nần nghệ có vị đắng, tính bình, quy vào các kinh can, thận.
• Nó được dùng để giải độc, tiêu thũng, chỉ thống, tán ứ, khu phong, trừ thấp,
dùng trong các bệnh đau nhức xương khớp do phong thấp, lưng gối mỏi đau, viêm
đường tiết niệu, rắn cắn, cao huyết áp.
• Ngồi ra, nó cịn giúp hạ cholesterol máu đáng kể.

7


*Theo y học hiện đại:
Nhờ thành phần diosgenin- một dạng saponin steroid, nần vàng có tác dụng
trong điều trị nhiều bệnh như tăng cholesterol máu, rối loạn lipid máu, các loại
viêm, ung thư và tiểu đường mà khơng có bất cứ tác dụng phụ nào.
• Theo nghiên cứu, diosgenin có thể làm giảm lượng triglycerid huyết tương
và gan, thúc đẩy sự biệt hóa tế bào mỡ và ức chế viêm ở các mơ mỡ.
• Bên cạnh đó, hoạt chất này cịn ảnh hưởng đến một số bệnh chuyển hóa do
có ảnh hưởng trực tiếp đến một số phân tử tham gia vào q trình chuyển hóa
enzyme cũng như q trình truyền tín hiệu ở gan. Nhờ đó, nó có tác dụng điều
hòa chức năng gan và hỗ trợ trong việc kiểm sốt các bệnh về gan, đặc biệt gan
nhiễm mỡ.
• Hơn thế, nần nghệ cịn có xu hướng làm tăng HDL (high density lipoprotein
- lipoprotein có tỷ trọng cao). Đây là những cholesterol tốt, giúp chuyển
cholesterol dư thừa từ thành mạch máu về gan để chuyển hóa, giảm nguy cơ xuất
hiện các biến chứng do xơ vữa động mạch như nhồi máu cơ tim, tai biến mạch
máu,...
• Một số nghiên cứu tiền lâm sàng khác cũng thấy chiết xuất diosgenin từ củ
nần nghệ có hiệu quả trong hóa trị liệu điều trị ung thư ở một số cơ quan nội tạng.

8

Cây nần vàng giúp giảm chỉ số cholesterol máu ở người bệnh
2.2. Tổng quan về nuôi cấy mô, tế bào thực vật
2.2.1. Định nghĩa
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù chung cho tất cả các loại nuôi cấy,
nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng
nhân tạo, trong điều kiện vơ trùng.
Ni cấy mơ tế bào thực vật cịn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro (trong ống
nghiệm) để phân biệt với các q trình ni cấy trong điều kiện tự nhiên, ngồi
ống nghiệm gọi là ni cấy invitro.
• Hormone ni cấy mơ thực vật chi làm 3 nhóm chính
Nhóm hormone Auxin
Nguồn gốc auxin là chúng sinh ra từ đỉnh thân và cành sau đó auxin sẽ di
chuyển và tích lũy ở rễ. Auxin có tác dụng tăng cường sự phát triển của rễ. Khi tế
bào được cung cấp auxin, auxin sẽ hoạt hóa bơm ion H+ trên màng sinh chất. Ion
H+ được vận chuyển tích cực từ tế bào chất vào trong vách. Sự gia tăng đó làm
hoạt hóa enzim giúp bẻ gảy một số liên kết chéo giữa các đường đa cấu tạo vách

9


và vách trở nên mềm dẻo hơn. Vì vậy, nước vào tế bào và không bào càng lúc
càng nhiều vách sẽ bị căng ra.
Có nhiều loại auxin khác nhau với cấu trúc hoá học khác nhau. Loại auxin
quan trọng nhất là β-indol-acetic acid (IAA), ngoài ra một số auxin khác cũng khá
phổ biến là napthalen-acetic acid (NAA), phenyl-acetic acid (PAA), Indole-3acetic acid (IBA), 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4D)
Nhóm hormone Cytokinin
Hormone cytokinin(xitokinin) là những chất giúp tăng cường quá trình phát
triển chồi trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cytokinin được sinh ra
từ rễ và hạt đang phát triển sau đó được chuyển hóa lên thân. Các loại cytokinin

phổ biến trong ni cấy mơ thực vật: Kinetin,Benzyl-amino-purine (BAP),
Thidiazuron (TDZ), zeatin
Nhóm hormone Gibberellins
Gibberellin hay Gibêrelin là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật có tác
dụng điều chỉnh sự phát triển ở thực vật và có ảnh hưởng tới một loạt các quá
trình phát triển như làm cho thân dài ra, nảy mầm,ngủ, ra hoa, biểu hiện gen, kích
thích enzym và tình trạng già yếu của lá cũng như quả.
2.2.2. Các ưu điểm và hạn chế của công nghệ vi nhân giống
2.2.2.1. Ưu điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật:
• Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công
nghệ nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây sau khi được ni cấy
từ 1 đến 2 năm có thể tạo ra hàng triệu cây.
• Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vì nó tạo ra quần thể có độ đều cao đủ xuất
phát từ cây mẹ có kiểu gen đi hợp hay đồng hợp.
•

Tiết kiệm khơng gian: Vì hệ thống sản xuất hồn tồn trong phịng thí

nghiệm, khơng phụ thuộc vào thời tiết bên ngoài và các vật liệu khởi đầu có kích
thước nhỏ. Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với
sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kinh theo phương pháp truyền thống.

10


• Nâng cao chất lượng cây giống: cây được nuôi cấy đã được loại trừ các
mầm bệnh như virus, nấm, vi khuẩn... nên cấy giống tạo ra hoàn toàn sạch bệnh.
Vì vậy, cây giống tạo ra có sức sinh trưởng và phát triển tốt, năng suất cây trồng
tăng 15-30% so với phương pháp truyền thống.
• Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác

nhau có thể tạo ra từ phương pháp ni cấy môTBTV như cây con in vitro (trong
ống nghiệm) hoặc trong bầu đất.
• Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi
xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được
xác nhận là sạch bệnh. Do vậy, bảo đảm an toàn đáp ứng các qui định về vệ sinh
thực vật.
• Sản xuất quanh năm: Q trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ thời
gian nào, không phụ thuộc mùa vụ.
2.2.2.2. Nhược điểm nuôi cấy mơ tế bào thực vật:
 Tốn kém kinh phí, cơng sức.
 Địi hỏi trình độ kĩ thuật cao.
2.3. Lịch sử nghiên cứu về cây Nần nghệ (Dioscorea collettii)
Đầu những năm 70 thế kỷ trước, trong lúc đi sưu tầm cây thuốc ở vùng Tây
Bắc, Ts. Lương y, Nguyễn Hoàng đang tìm cây Bổ béo, thì gặp một số người Dao
đang làm nương. Thấy trong tay tiến sĩ có mẫu dược liệu, một cụ già hỏi thuốc
này chữa bệnh gì? Ts. nói dùng làm thuốc ăn ngủ được, béo khỏe ra nên gọi là củ
bổ béo. Chuyện trò một lúc, cụ già nói dân mình ở đây lại có thuốc cho bớt béo đi
cơ. Ts. bảo cụ đùa đấy chứ đồng bào ở đây tồn người gầy thì dùng thuốc bớt béo
làm gì. Thỉnh thoảng cũng có cán bộ béo nặng nề q đấy, cụ già nói, mình đã
mách cho những cán bộ đó dùng, bụng bớt to đi, cịn đồng bào mình thì bụng
khơng to nhưng tay chân sưng to, dùng cũng đỡ đi đấy. Cụ già chỉ cho Ts. một
dây leo cuốn, thân cây sắn, bới nhẹ lớp đất lên đã thấy có củ màu vàng, nhấm có
vị đắng. Cụ bảo nó đấy, dễ sống lắm, lúc quốc đất làm nương vơ nó cùng với cỏ

11


dại vứt lên bờ, nó lại mọc, sót một mẩu củ nào trong nương nó cũng mọc, leo lên
cây sắn, chỉ làm thuốc thơi khơng ăn được đâu. Mình gọi nó là “bớt béo”, đùa vậy
thơi, vì cán bộ đang đi tìm cây bổ béo mà, dân ở đây có người gọi nó nó là nâu

vàng, vì nó hơi giống củ nâu nhưng có mầu vàng.
Đầu những năm 70 của thế kỷ trước, Ts. chưa nghĩ đến tác dụng “bớt béo”
của cây thuốc mấy, vì thời đó tuyệt đại đa số dân ta gầy. Nhưng tác dụng chống
sưng đau (có thể là viêm khớp) như cụ già nói thì cũng là thuốc mà Ts. đang đi
tìm. Cây “nâu vàng” mà cụ già đang nói Ts. dễ dàng nhận ra ngay, về mặt thực
vật học, nó thuộc họ củ nâu, thuộc chi Dioscorea mà Ts. đã lưu ý sưu tầm qua các
vùng rừng núi nước ta từ vài năm trước. Vậy là Ts. sưu tầm, nghiên cứu những
cây thuốc họ củ nâu đến giờ đã tròn 40 năm.
Từ củ nâu vàng ,những năm sau đó trong các cơng trình khoa học đăng
trên tạp chí Dược học trong nước và ở Liên xơ cũ Ts. cịn gọi là Nần nghệ, Nần
Vàng, nhóm nghiên cứu đã chiết xuất saponin steroid với hàm lượng khá cao.
Những năm đầu nhóm nghiên cứu chú ý nghiên cứu saponin của Nần vàng chủ
yếu theo hai hướng:
- Một là chiết xuất saponin toàn phần làm thuốc chống viêm khớp.
- Hai là tách Diosgenin làm nguyên liệu bán tổng hợp các thuốc steroid
(các nhóm này trong 4-5 thập kỷ hiện tại có tầm quan trọng ngang thuốc kháng
sinh).
Khoảng 2-3 thập kỷ nay, trong nước ta cũng như trên thế giới quan tâm
nhiều đến thuốc giảm mỡ máu (do rối loạn chuyển hóa lipid), vì hàm lượng mỡ
trong máu cao là nguyên nhân chính dẫn đến xơ vữa động mạch, tăng huyết áp,
nghẽn mạch… gây tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim… Những loại thuốc
này lúc đầu được tổng hợp từ hóa chất, về sau các nhà khoa học hướng vào nghiên
cứu các thuốc có nguồn gốc thảo mộc. Cuối những năm 70 thế kỷ trước ở Liên xô
cũ đã lưu hành các chế phẩm Diosponin, Polisponin làm thuốc giảm mỡ máu.
Hoạt chất của các thuốc này là saponin tan trong nước chiết xuất từ Dioscorea

12


caucasica. Đó là một loại thực vật rất gần gũi (cùng chi Dioscorea) với cây Nần

vàng-Nần nghệ hay cây Bớt béo mà đồng bào Dao gọi đùa từ năm nào. Vậy là
trong hành trình nghiên cứu sử dụng saponin của nâu vàng theo 2 hướng đã nói ở
trên đã được bổ sung một mục tiêu nữa – nghiên cứu làm thuốc giảm mỡ máu.
Năm 1985 tại trường Đại học y số 1 Xêtrênốp Matxcơva Ts. đã bảo vệ luận
án PTS trên cơ sở những nghiên cứu bước đầu cây Nần vàng (Nần nghệ) cùng 5
cây thuốc khác đều thuộc chi Dioscorea ở Việt Nam.
Từ năm 1986 Ts. đã tập trung vào hướng nghiên cứu chính là thuốc giảm
mỡ máu từ cây Nần nghệ, cùng với sự cộng tác của cố giáo sư Phạm Khuê (viện
lão khoa), các thầy thuốc ở bệnh viện Việt xơ, GS. Hồng Kim Huyền, cùng nhiều
sinh viên và nghiên cứu sinh. Kết quả là thuốc Diosgin đã ra đời, được hội đồng
nghiên cứu của trường Đại học Dược Hà Nội, ngày 30/12/1995 đánh giá xuất sắc.
Sau khi sử dụng cho gần 500 người có rối loạn chuyển hóa lipid, kết quả xét
nghiệm sinh hóa trên 5 chỉ tiêu về lipoprotein tromg máu cho thấy tất cả các chỉ
số lipid máu đều trở lại bình thường, đặc biệt hạ rất mạnh lipoprotein tỷ trọng thấp
(LDL) và có xu hướng tăng lipoprotein tỷ trọng cao (HDL), do đó hạ được tỷ số
CT/HDL (CT-cholesterol toàn phần) Đặc biệt cholesterol tồn phần trong máu
của 100% người bệnh đều giảm.
Thuốc cịn có tác dụng hạ huyết áp trên hầu hết các bệnh nhân có huyết áp
cao. Trong điều trị khơng thấy có tai biến và tác dụng xấu nào đáng kể.
Kết quả nghiên cứu dược lý cho thấy thuốc có tác dụng chống viêm mạnh
(tương đương prednisolon), gần đây một số bệnh nhân bị sưng khớp sau khi
dùng thuốc đã khỏi. Nghiên cứu dược lý cũng cho thấy thuốc có tác dụng điều
hịa nhịp tim và có độ độc rất thấp.
Vậy là sau 40 năm nghiên cứu nhóm nghiên cứu thấy cây Nần vàng (Nần
nghệ) có 3 tác dụng chữa bệnh khá rõ:
- Một là chống viêm khớp
- Hai là hạ cholesterol dư thừa trong máu
- Ba là hạ huyết áp cho những bệnh nhân huyết áp cao.

13

PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu nghiên cứu
Đối tượng: Cây Nần nghệ (Dioscorea collettii), đoạn thân sạch bệnh, sinh
trưởng tốt chứa chồi đỉnh và các mắt ngủ.
• Hóa chất
Các thí nghiệm ni cấy mô tế bào được tiến hành trên nền môi trường cơ
bản MS (Murashige & Skoog, 1962).
Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết và thông dụng như: nước dừa, đường,
agar, ethanol, NaOH… và các chất sinh trưởng nhóm auxin và cytokinin như:
NAA; BAP; IAA; IBA; kinetin...
• Thiết bị và dụng cụ
• Phịng ni cấy
• Tủ cấy vơ trùng (Biological Safety Cabinets) của hãng Nuarie (Mĩ)
• Nồi hấp tự động (Auto Clave), tủ sấy, bếp điện
• Máy đo pH, cân phân tích, pipet
• Bình tam giác thủy tinh, bình trụ, ống đong, ca đựng môi trường, cốc
thủy tinh định mức.
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• Địa điểm: Phịng ni cấy mô, bộ môn Kĩ thuật di truyền, Viện Di
truyền Nơng nghiệp.
• Thời gian nghiên cứu: 7/2022 – 12/2022
3.3. Nội dung nghiên cứu
• Nội dung 1: Tạo vật liệu khởi đầu
• Nội dung 2: Tái sinh chồi
• Nội dung 3: Nhân nhanh
• Nội dung 4: Ra rễ tạo cây hồn chỉnh

14

3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Tạo vật liệu khởi đầu
Từ đoạn thân Nần nghệ tiến hành cắt thành các đoạn nhỏ khoảng 4 cm chứa
đỉnh sinh trưởng và mắt ngủ đem rửa với xà phòng và rửa sạch lại dưới vịi nước
chảy. Sau đó, dùng cồn 70 độ khử trùng trong 1 phút.
Mẫu sau đó được đưa vào khử trùng bằng NaClO 20% và H2O2 10% với
các ngưỡng thời gian khác nhau.

CT
1
2

Chất khử trùng
NaClO (A)

3
4

7

(phút)
25
30
15

H2O2 (B)

5

6

Thời gian khử trùng

20
15 (A) + 10 (B) + 5 (B)

NaClO + H2O2

8

20 (A) + 10 (B) + 5(B)
25 (A) + 10 (B) + 5 (B)
30 (A) + 10 (B) + 5 (B)

3.4.2 Các giai đoạn nghiên cứu thí nghiệm cây Nần nghệ
3.4.2.1. Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi
cây Nần nghệ.
Môi trường nền: MS + 30 g/l đường sucrose + 8 g/l agar
Mơi trường thí nghiệm đối chứng (ĐC): MS + 30 g/l đường sucrose + 8 g/l
agar

15


CT mơi trường

Nồng độ BAP (mg/l)

ĐC

0

1

0,3

2

0,5

3

1,0

4

2,0

5

3,0

3.4.2.2. Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp NAA đến khả năng
nhân nhanh tạo cụm chồi.
Môi trường nền: MS + 30 g/l đường sucrose + 8 g/l agar
Mơi trường thí nghiệm đối chứng (ĐC): MS + 30 g/l đường sucrose + 8 g/l
agar
CT

Chất KTST
BAP (mg/l)

NAA (mg/l)

ĐC

2

0

1

2

0,2

2

2

0,4

3

2

0,6

4

2

0,8

5

2

1,0

3.4.2.3. Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp IBA đến khả năng
nhân nhanh tạo cụm chồi
Môi trường nền: MS + 30 g/l đường sucrose + 8 g/l agar
Mơi trường thí nghiệm đối chứng (ĐC): MS + 30 g/l đường sucrose + 8 g/l
agar

16


CT

Chất KTST
BAP (mg/l)

IBA (mg/l)

ĐC

2

0

1

2

0,2

2

2

0,4

3

2

0,6

4

2

0,8

5

2

1,0

3.4.2.4. Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ tạo cây
con hoàn chỉnh
Mơi trường nền: ½ MS + 25 g/l đường sucrose + 0,5 g/l than hoạt tính + 8
g/l agar
Mơi trường thí nghiệm đối chứng (ĐC): ½ MS +25 g/l đường sucrose + 0,5
g/l than hoạt tính + 8 g/l agar
CT

NAA (mg/l)

ĐC

0

1

0,2

2

0,5

3

1,0

4

1,5

5

2,0

3.4.2.5. Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây
hồn chỉnh
Mơi trường nền: ½ MS + 25 g/l đường sucrose + 0,5 g/l than hoạt tính + 8
g/l agar

17