Phân lập và định danh vi khuẩn bacillus mycoides trong đất trồng bắp cải tại một số huyện trên địa bàn thành phố hà nội

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
-------***-------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN
BACILLUS MYCOIDES TRONG ĐẤT
TRỒNG BẮP CẢI TẠI MỘT SỐ HUYỆN
TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HÀ NỘI

HÀ NỘI - 2023


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
-------***-------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN
BACILLUS MYCOIDES TRONG ĐẤT
TRỒNG BẮP CẢI TẠI MỘT SỐ HUYỆN
TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HÀ NỘI
Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN ĐÌNH TỒN

Khóa

: 63

Ngành

: Cơng nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn

: TS. TRẦN THỊ BÌNH NGUYÊN

HÀ NỘI - 2023


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan,
Các số liệu mà tôi thu thập trong q trình thực tập là do tơi trực tiếp theo
dõi, ghi chép và thu thập.
Các số liệu thu thập là trung thực, khách quan và chưa được cơng bố ở bất
kỳ báo cáo nào trước đó.
Các trích dẫn trong báo cáo là có nguồn gốc cụ thể rõ ràng, chính xác.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2023

Sinh viên

NGUYỄN ĐÌNH TỒN

i


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc tới các thầy
cô và cán bộ làm việc tại Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật, nơi tôi trực tiếp
thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp. Tơi cũng xin chân thành cảm ơn Bộ môn
Công nghệ vi sinh, Công nghệ sinh học Thực vật, Sinh học phân tử & Công nghệ
sinh học ứng dụng đã nhiệt tính giúp đỡ, hỗ trợ về máy móc và trang thiết bị giúp
tơi hồn thành các thí nghiệm của đề tài.
T ơi xin chân thảnh cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ, cùng tồn thể ban
chủ nhiệm khoa trong Khoa Cơng nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tơi trong q trình học tập và thực hiện khố
luận tại khoa.
Đặc biệt, tơi xin chân thành cảm ơn TS. Trần Thị Bình Nguyên – Trưởng
bộ môn Công nghệ sinh học Động vật, Khoa Công nghệ sinh học là người đã tận
tình giúp đỡ, chỉ bảo và trực tiếp hướng dẫn tơi trong suốt q trình thực hiện đề
tài khóa luận tốt nghiệp.
Cối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân, bạn
bè đã giúp đỡ, động viên trong suốt quá trình thực tập khóa luận tốt nghiệp.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2023

Sinh viên

NGUYỄN ĐÌNH TỒN

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................. iii
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... iii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC HÌNH ẢNH .................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ vi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .............................................................................. vii
TÓM TẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ........................................................... ix
PHẦN I. MỞ ĐẦU................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề....................................................................................................... 1
1.2. Mục đích ......................................................................................................... 2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
2.1. Chi Bacillus .................................................................................................... 3
2.1.1. Hình thái của Bacillus ................................................................................. 3
2.1.2. Chức năng của Bacillus ............................................................................... 4
2.2. Vi khuẩn Bacillus mycoides ........................................................................... 5
2.2.1. Lịch sử và phân loại Bacillus mycoides ...................................................... 5
2.2.2. Phân bố của Bacillus mycoides ................................................................... 6
2.2.3. Hình thái học của Bacillus mycoides .......................................................... 7
2.2.4. Tác động có lợi của Bacillus mycoides với cây trồng............................... 10
2.3. Các phương pháp định danh vi khuẩn.......................................................... 11

2.3.1. Phương pháp truyền thống ........................................................................ 11
2.3.1.1. Sử dụng khóa phân loại .......................................................................... 12
2.3.1.2. Sử dụng phương pháp số học ................................................................. 12
2.3.2. Phương pháp hiện đại ................................................................................ 12
2.3.2.1. Sử dụng mẫu dò kết hợp với phương pháp in-situ phát huỳnh quang
(Flourescence in-siu Hybridazation – FISH) ...................................................... 13
2.3.2.2. Phương pháp lai nucleic acid ................................................................. 14
2.3.2.3. Định danh bằng phương pháp 16S rRNA .............................................. 15
2.4. Một số nghiên cứu về phân lập và định danh Bacillus mycoides ................ 19
PHẦN III. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..... 22
3.1. Vật liệu ......................................................................................................... 22
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................ 22
iii


3.1.2. Dụng cụ, thiết bị ........................................................................................ 22
3.1.3. Hóa chất..................................................................................................... 22
3.1.4. Môi trường nuôi cấy .................................................................................. 23
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................ 23
3.2.1. Địa điểm thực hiện .................................................................................... 23
3.2.2. Thời gian thực hiên ................................................................................... 23
3.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 23
3.3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn ................................................................ 23
3.3.2. Phương pháp làm thuần............................................................................. 24
3.3.3. Phương pháp nuôi lỏng ............................................................................. 24
3.3.4. Phương pháp giữ giống ............................................................................. 25
3.3.5. Phương pháp định danh vi khuẩn.............................................................. 25
3.3.5.1. Định danh bằng phương pháp truyền thống........................................... 25
3.3.5.2. Định danh bằng phương pháp 16S rRNA .............................................. 25
3.3.6. Phương pháp tách chiết DNA ................................................................... 26

3.3.7. Phương pháp PCR ..................................................................................... 27
3.3.8. Phương pháp điện di.................................................................................. 28
3.3.9. Giải trình tự ............................................................................................... 29
3.3.10. Phương pháp xử lý số liệu....................................................................... 29
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 30
4.1. Phân lập vi khuẩn từ đất trồng cây nông nghiệp .......................................... 30
4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn ......................................................................... 30
4.1.2. Tạo dòng thuần .......................................................................................... 31
4.2. Kết quả định danh vi khuẩn Bacillus mycoides bằng 16S rRNA ................ 32
4.2.1. Thu dịch nuôi khuẩn lạc ............................................................................ 32
4.2.2. Kết quả chạy điện di của phản ứng PCR .................................................. 33
4.2.3. Kết quả giải trình tự và xử lý số liệu ......................................................... 34
4.2.4. Kết quả phân tích cây phả hệ .................................................................... 40
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 42
5.1. Kết luận ........................................................................................................ 42
5.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 43

iv


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1. Hình thái Bacillus dưới kính hiển vi ..................................................... 3
Hình 2.2. Khuẩn lạc của B. mycoides DX và SIN ................................................ 7
Hình 2.3. Khuẩn lạc B. mycoides SINett............................................................... 8
Hình 2.4. Bacillus mycoides phát triển trên mơi trưởng lỏng ............................... 8
Hình 2.5. Vi khuẩn Bacillus mycoides dưới kính hiển vi điện tử ......................... 9
Hình 2.6. Cấu trúc thứ cấp của 16S rRNA .......................................................... 16
Hình 2.7. Cấu trúc thứ cấp của 16S rRNA .......................................................... 16

Hình 2.8. Tốn tử rRNA...................................................................................... 17
Hình 4.1. Đĩa thạch chứa khuẩn lạc Bacillus mycoides ...................................... 30
Hình 4.2. Đĩa thạch khơng chứa khuẩn lạc Bacillus mycoides ........................... 30
Hình 4.3. Hình dạng của khuẩn lạc Bacillus mycoides phân lập từ đất trồng bắp
cải trên môi trường LB-agar................................................................................ 31
Hình 4.4. Các chủng Bacillus mycoides trên mơi trường LB – lỏng .................. 32
Hình 4.5. Điện di DNA tổng số........................................................................... 33
Hình 4.6. Sản phẩm điện di phản ứng PCR gen 16S rRNA ............................... 34
Hình 4.7. Kết quả giải trình tự gen...................................................................... 36
Hình 4.8. So sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotidecủa Mau 1 với các chủng
tương đồng trên Genbank .................................................................................... 37
Hình 4.9 Xử lý trình tự gen 16S rRNA của Mau 1 với các trình tự 16s rRNA thuộc
nhóm Bacillus cereus .......................................................................................... 40
Hình 4.10. Cây di truyền phả hệ thể hiện vị trí phân loại của chủng Bacillus
mycoides BC 01 ................................................................................................... 41

v


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu ............................................ 2323
Bảng 3.2. Số lượng và nguồn gốc mẫu ............................................................... 24
Bảng 3.3. Mồi đặc hiệu loài được sử dụng trong nghiên cứu ............................. 27
Bảng 3.4. Chu kì nhiệt của phản ứng PCR ......................................................... 27
Bảng 4.1. Kết quả đo quang phổ DNA tổng số................................................... 33

vi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Nghĩa của từ

A

Adenine Nucleotide

APX

Ascorbate peroxidase

B. mycoides

Bacillus mycoides

BC

Bắp cải

bp

Base pair - Cặp bazơ

C

Cytosine Nucleotide

CDS

Trình tự mã hóa giả định

cs

Cộng sự

DNA

Deoxyribonucleic acid

ELISA

Xét nghiệm chất hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym

Fol

Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici

F

Forward primer – Môi xuôi

FISH

Flourescence in-siu Hybridazation - in-situ phát huỳnh
quang

G

Guanine Nucleotide

GPX

Guaiacol peroxidase

LB

Luria Bertani

MALDI-TOF MS Matrix assisted laser desorption ionization - time of flight
MLEE

Điện di enzyme đa điểm

NAAT

Kỹ thuật khuếch đại axit nucleic

OD

Optical density – Mật độ quang

PCR

Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi polymerase

PAL

Phenylalanine amoniac-lyase

sp

species - loài
vii


spp

species pluriel - nhiều loài

T

Thymine Nucleotide

TP

Thành phố

TAE

Tris-acetate-EDTA

Ta

Annealing temperature - Nhiệt độ gắn mồi

R

Reverse primer – Mồi ngược

RFLP

Restristion Fragment Length Polymorphisms - Đa hình
chiều dài đoạn phân cắt giới hạn

rRNA

Ribosomal ribonucleic acid

UV

Ultraviolet - Tia tử ngoại

16s rRNA

16S ribosomal RNA

viii


TĨM TẮT KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên khố luận: Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus mycoides trong đất
trồng bắp cải tại một số huyện trên địa bàn thành phố Hà Nội.
Giảng viên hướng dẫn: TS. Trần Thị Bình Nguyên
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Đình Tồn
Khoa: Cơng nghệ Sinh học
Lớp: CNSHB

Khố: 63

Tóm tắt: Bacillus mycoides (B. mycoides) là vi khuẩn Gram dương, khơng có
khả năng di động, thuộc nhóm Bacillus cereus. B. mycoides có thể được tìm
thấy ở nhiều mơi trường khác nhau. Khi phát triển trong đất vi khuẩn Bacillus
mycoides có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật và tăng năng suất nông nghiệp.
Mục tiêu hướng đến của nghiên cứu này là phân lập vi khuẩn Bacillus mycoides
từ đất trồng cây bắp cải tại một số huyện trên địa bàn thành phố Hà Nội và định
danh được chủng Bacillus mycoides bằng phương 16S rRNA. Các phương pháp
được sử dụng trong nghiên cứu gồm có: phân lập vi khuẩn, làm thuần khuẩn lạc
Bacillus mycoides, nuôi lỏng, giữ giống, định danh bằng phương pháp truyền
thống và phương pháp 16S rRNA, tách chiết DNA, PCR, điện di, giải trình tự gen,
thu thập và xử lý số liệu bằng phần mền BioEdit, MegaX. Nghiên cứu đã phân
lập và định danh bằng hình thái vi khuẩn Bacillus mycoides từ đất trồng cây bắp
cải tại huyện Mê Linh, Đông Anh, Gia Lâm và Ứng Hịa, đất thu tại huyện Sóc
Sơn và Ba Vi khơng xuất hiện khuẩn lạc đặc trưng cho Bacillus mycoides; Định
danh được chủng Bacillus mycoides phân lập từ đất trồng bắp cải tại huyện Mê
Linh (Mau 1) bằng 16S rRNA; Kết quả giải trình tự và so sánh mức độ tương
đồng của Mau 1 cho thấy chủng này có độ tương đồng nucleotide đạt 99,32% với
trình tự nucleotide 16S rRNA của một số chủng Bacillus mycoides; Phân tích cây
di truyền phả hệ cho thấy chủng Bacillus mycoides trong nghiên cứu nằm cùng
nhánh vơi các chủng Bacillus mycoides khác trên Genbank.

ix


PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Vấn đề sử dụng thái quá phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật ở
Việt Nam đang rất được quan tâm, theo thống kê của Cục Bảo vệ thực vật (Bộ
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) mỗi năm nước ta tiêu thụ đến 10 triệu

tấn phân bón các loại. Điều này ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường và con
người. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các biện pháp và xu hướng
trồng trọt mới đã ra đời với mục tiêu xây dựng một nền nông nghiệp thân thiện,
bền vững mà vẫn đạt năng xuất cao. Đến nay, đã có rất nhiều nghiên cứu khoa
học chứng minh tiềm năng của việc sử dụng vi sinh vật để kích thích sinh
trưởng thực vật.
Bacillus mycoides (B. mycoides) là vi khuẩn Gram dương, khơng có khả
năng di động, thuộc nhóm Bacillus cereus. B. mycoides có thể được tìm thấy ở
nhiều mơi trường khác nhau như trong môi trường đất, môi trường nước, khơng
khí, cơ thể động vật, mơ thực vật.
Khi phát triển ở mơi trường đất, vi khuẩn Bacillus mycoides có khả năng
thúc đẩy tăng trưởng thực vật và tăng năng suất nông nghiệp như ở cây bắp cải
(Yi & cs., 2018), ngô (Ali & cs., 2022), Arabidopsis thaliana (Kurniawan, A.,
& Chuang, H. W.,2022), hoa hướng dương (Ambrosini & cs., 2015), củ cải
đường (Fravel DR & cs., 1977), bầu bí (Bargabus R & cs., 2002), thuốc lá (Neher
OT & cs., 2009),… Bacillus mycoides trong đất trồng bắp cải có thể tăng cường
sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp, bao gồm các hợp chất phenolic, flavonoid,
glucosinolate, axit indole axetic, siderophore, ACC deaminase và exopolysacarit
từ đó làm tăng chiều dài, số lượng của chồi và rễ cây đồng thời Bacillus mycoides
giúp tăng kích thước và trọng lượng tươi của cây. Bacillus mycoides có thể được
ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ cho nông nghiệp trồng trọt, tăng
năng suất, chất lượng cây trồng từ đó làm giảm lượng phân thải hóa hoặc và thuốc
bảo vệ thực vật.
1


Dù Bacillus mycoides là vi khuẩn có lợi với cây trồng và có thể phát triển
ở đa dạng các loại mơi trường, nhưng đến nay chúng vẫn ít được quan tâm ở Việt
Nam. Xuất phát từ những cơ sở kể trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập
và định danh vi khuẩn Bacillus mycoides trong đất trồng bắp cải tại một số

huyện trên địa bàn thành phố Hà Nội”.
1.2. Mục đích
- Phân lập được vi khuẩn Bacillus mycoides từ đất trồng cây bắp cải tại một
số huyện trên địa bàn thành phố Hà Nội.
- Định danh được chủng Bacillus mycoides đã phân lập.

2


PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Chi Bacillus
2.1.1. Hình thái của Bacillus
Bacillus là vi khuẩn gram dương có kích thước lớn (chiều rộng 0,7 - 0.8
µm, chiều dài 2,0 - 3,0 µm), hiếu khí, hình que, khơng kết thành chuỗi, khơng tạo
bao nang, bắt phẩm nhuộm khơmg đồng đều.

Hình 2.1. Hình thái Bacillus dưới kính hiển vi
(Wang & cs., 2020)
Bacillus được tìm thấy ở hầu hết các mơi trường: đất, nước, khơng khí,
trong cơ thể động vật, thực vật (Nicholson, 2002). Hầu hết các lồi thuộc chi
Bacillus đều có khả năng di động, khả năng hình thành nội bào tử - cấu trúc
bảo vệ chúng khỏi một loạt các môi trường tiêu cực như môi trường nhiệt độ
cao, nhiệt độ thấp thấp, môi trường khô, môi trường bức xạ và hóa chất độc hại.
Bacillus có thể ngưng hoạt động trong nhiều năm và kích hoạt trở lại khi gặp
trúng điều kiện thuận lợi.
Bacillus phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên khi mơi trường
thiếu oxy chúng vẫn có thể tồn tại và phát triển. Bacillus phát triển tốt trong môi
trường cung cấp đủ nguồn carbon (như glucose) và nito (như peptone). Nhiệt độ
tối ưu để nuôi cấy Bacillus là 37°C và pH thích hợp khoảng 7,0 – 7,4.
3

2.1.2. Chức năng của Bacillus
Bacillus được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, phục vụ cho nhu
cầu của con người như nông – lâm – ngư nghiệp, công nghiệp sản xuất – chế biến
thực phẩm, y tế – sức khỏe người và động vật, …
Bacillus đa dạng về khả năng hóa sinh thái, được đặc trưng bởi khả năng
kháng thuốc và khả năng ngủ đông, bào tử Bacillus spp. không bị ảnh hưởng
bởi nhiệt, sấy khô, chất khử trùng. Do vậy, chúng rất quan trọng trong ngành
chế biến thực phẩm, Bacillus spp. cung cấp nhiều ứng dụng tiềm (Abriouel &
cs., 2011). Việc sử dụng Bacillus bacteriocins trong bảo quản thực phẩm là
một lĩnh vực nghiên cứu đầy hứa hẹn, vì nhiều lồi vi khuẩn thuộc chi Bacillus
có thể giải quyết các hạn chế của vi khuẩn acid lactic. Các loài Bacillus như
Bacillus subtilis và Bacillus amyloliquefaciens được sử dụng rộng rãi để sản
xuất thực phẩm lên men từ đậu nành và hạt châu chấu ở các nước châu Á và
Tây Phi (Kimura & Yokoyama, 2019).
Nhiều chi Bacillus tồn tại tự nhiên trong đất đã tạo ra các mối quan hệ
thúc đẩy tăng trưởng chặt chẽ với thực vật, thuốc bảo vệ thực vật từ các chủng
Bacillus có thể được áp dụng để tăng năng xuất cây trồng và cũng để tránh sự
thối rữa của trái cây và rau quả sau thu hoạch. Bacillus velezensis có thể được
áp dụng như một tác nhân kiểm soát sinh học chống lại bệnh thối sen gây ra
bởi nấm Fusarium oxysporum gây – một loài nấm tồn tại trong đất gây thối sen
và giảm năng suất nghiêm trọng. Các phương pháp kiểm soát bệnh này hiện
nay còn rất hạn chế, việc xác định được một tác nhân kiểm soát sinh học mới
đầy hứa hẹn chống lại bệnh thối sen do Fusarium oxysporum gây ra (Wang &
cs., 2020). Bacillus thuringiensis là tác nhân diệt côn trùng vi sinh vật thành
công nhất và các protein của nó đã được nghiên cứu trong nhiều năm do độc
tính của nó đối với cơn trùng thuộc bộ Coleoptera (Domínguez-Arrizabalaga
& cs., 2020), sâu keo (Zhang & cs., 2020, Hou & cs., 2020), bướm đêm (Pinos
& cs., 2020, Wang & cs., 2020), muỗi vằn (Valtierra-de-Luis & cs., 2020) là

những loài gây hại trong trồng trọt và chăn nuôi.
4


Nhiều báo cáo trong các lĩnh vực sức khỏe đã nói về lợi ích của Bacillus
như kiểm sốt các vi khuẩn gây bệnh (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
– nhiễm tụ cầu khuẩn, Gardnerella vaginalis – vi khuẩn gây viêm âm đạo,..) hoặc
ức chế C. difficile đường ruột,... (Abriouel & cs., 2011). Bacillus cũng có thể
được áp dụng để kiểm sốt bệnh các bệnh ở động vật như bệnh viêm vú, ức chế
các mầm bệnh đường ruột ở gia cầm, cải thiện quá trình lên men ở dạ cỏ của bị
(Abriouel & cs., 2011). Bacillus được sử dụng rộng rãi nhất làm probiotic bao
gồm B. subtilis, B. clausii, B. cereus, B. coagulans và B. licheniformis. Các bào
tử ổn định nhiệt của Bacillus có nhiều ưu điểm hơn so với những lồi khơng sinh
bào tử khác như Lactobacillus spp. Các chế phẩm sinh học chứa bào tử đang được
sử dụng rộng rãi ở người như là chất bổ sung dinh dưỡng, ở động vật như chất
kích thích tăng trưởng và các chất cạnh tranh chống vi sinh vật gây bệnh, trong
nuôi trồng thuỷ sản để tăng cường sự phát triển và chống chịu bệnh tật của tôm
nuôi (Cutting, 2011).
2.2. Vi khuẩn Bacillus mycoides
2.2.1. Lịch sử và phân loại Bacillus mycoides
B. mycoides được mô tả lần đầu tiên vào năm 1886 bởi Flugge. Trong
thời điểm đó, B. mycoides là một trong số rất ít vi khuẩn khơng gây bệnh được
quan tâm. Đặc điểm hình thái và sinh thái của B. mycoides được các nhà khoa
học mô tả từ những năm đầu của thế kỉ XX (Gottheil, 1901; Holzmüller, 1909;
Pringsheim, 1924; Nyberg, 1927). Năm 1930, Oesterle và Stahl đã nghiên cứu
ba chủng điển hình chịu các điều kiện thí nghiệm khác nhau, bao gồm ni cấy
trong môi trường chất lỏng không thuận lợi và tiếp xúc với ánh sáng hoặc tia
cực tím. Họ đã thu được rất nhiều dạng mới của B. mycoides không giống với
dạng ban đầu. Một số trong số này được phân lập bằng phương pháp mạ trực
tiếp, từ các môi trường nuôi cấy đã được ủ trong thời gian dài, trong khi một

số khác được lấy từ dịch lọc của các môi trường ni cấy đó. Danh sách này
bao gồm cầu khuẩn sinh màu đỏ và vàng, trực khuẩn Gram âm nhỏ và trực
khuẩn Gram dương lớn. Một số biến thể khác với dạng đồng loại ở tính di động,
5


khơng có bào tử và khơng thể hóa lỏng gelatin. Trong một số trường hợp, các
biến thể tỏ ra ổn định nhưng nói chung, chúng trở lại trạng thái ban đầu khi
nuôi cấy trên môi trường thạch. Sự đảo ngược chỉ xảy ra từ một số đoạn nhất
định của các khuẩn lạc thạch.
Bacillus mycoides Flugge (1886) hay Bacillus cereus var. mycoides Smith,
Gordon & Clark (1946) được phân loại như sau:
Giới (Kingdom): Bacteria
Ngành (Division): Firmicutes
Lớp (Class): Bacilli
Bộ (Order): Bacillales
Họ (Family): Bacillaceae
Chi (Genus): Bacillus
Lồi (Species): Bacillus mycoides
Bacillus mycoides thuộc nhóm Bacillus cereus. Các vi khuẩn cùng nhóm
có kiểu hình rất gần Bacillus mycoides gồm: Bacillus anthracis, Bacillus cereus,
Bacillus weihenstephanenis, Bacillus pseudomycoides và Bacillus thuringiensis.
Trên thực tế, dựa vào đặc tính động lực học của các vi khuẩn này vẫn có ý kiến
khơng ủng hộ việc cơng nhận các thành viên của nhóm Bacillus cereus là các
loài riêng biệt. Nhưng dựa vào bằng chứng di truyền thì các vi khuẩn này đã
được cơng nhận. Bacillus mycoides được phân biệt bởi các khuẩn lạc hình thoi
đặc trưng, khơng có khả năng di chuyển, Bacillus pseudomycoides chỉ có thể
được phân biệt với Bacillus mycoides bởi sự liên quan đến DNA và một số khác
biệt trong thành phần acid béo.
2.2.2. Phân bố của Bacillus mycoides

B. mycoides có thể phát triển trong nhiều loại mơi trường như đất, nước, cơ
thể động vật, thực vật,… Ở động vật, Bacillus mycoides được cho là tác nhân gây
ra bệnh nhiễm trùng máu ở người (Heidt & cs., 2019) và bệnh hoại tử ở cá da trơn
6


(Logan, N.A. & Vos, P.D., 2015). Nhưng với thực vật chúng là vi khuẩn có lợi,
giúp tăng năng suất và khả năng chống chịu của hoa hướng dương (Ambrosini &
cs., 2015), bơ (Guerrero-Barajas & cs., 2015), củ cải đường (Fravel DR & cs.,
1977), bầu bí (Bargabus R & cs., 2002), thuốc lá (Neher OT & cs., 2009),…
2.2.3. Hình thái học của Bacillus mycoides
Bacillus mycoides là vi khuẩn Gram dương, không di động. Chúng có
thể phát triển dưới dạng tế bào đơn lẻ hoặc liên kết với nhau tạo thành các chuỗi
tế bào. Tế bào của chúng có hình que dài 3-5μm, rộng khoảng 1μm. Các tế bào
phát triển trên thạch glucose tạo ra một lượng lớn khuẩn lạc, tạo ra hình dạng
khơng bào hoặc bọt. Bào tử của chúng có hình elip, phát triển từ trung tâm, các
cạnh tỏa ra từ trung tâm hoặc dưới đầu, khơng làm phình túi bào tử, viên nang
khơng có mặt. Khuẩn lạc có máu trắng đến trắng đục (màu kem), mờ đục và có
hình thoi đặc trưng.

Hình 2.2. Khuẩn lạc của B. mycoides DX và SIN
(Di Franco & cs., 2002)
Ảnh chụp các khuẩn lạc được hình thành bởi các tế bào trực khuẩn liên kết
từ đầu đến cuối thành các sợi chạy thành bó với hướng cong được xác định về mặt
di truyền (hình 2.2). DX, với các hình chiếu cong theo chiều kim đồng hồ (hình
2.2 – DX). SIN, với độ cong ngược lại. Các khuẩn lạc được đặt tên khi chúng
được nhìn từ dưới cùng của đĩa (hình 2.2 – SIN). Các chủng được phát triển ở
7

nhiệt độ phòng trong 30 giờ trên đĩa thạch TS 1,5%. Thanh tỷ lệ = 1 cm (Di Franco
& cs., 2002).

Hình 2.3. Khuẩn lạc B. mycoides SINett
(Turchi & cs., 2012)
SINett, một đột biến kiểu hình có nguồn gốc từ SIN mà đột biến chưa được
xác định (Hình 2.3). Ảnh chụp khuẩn lạc B. mycoides SINett được phát triển trên
thạch TS 1,5% trong 72 giờ ở 30°C. Thanh tỷ lệ = 1 cm (Turchi & cs., 2012).

Hình 2.4. Bacillus mycoides phát triển trên môi trưởng lỏng
(Di Franco & cs., 2002)
8


Khi phát triển trên mơi trường lỏng Bacillus mycoides có dạng huyền phù,
lơ lửng trong môi trường nuôi cấy. Sau khi li tâm, các tế bào vi khuẩn sẽ lắng
xuống (hình 2.4).

Hình 2.5. Vi khuẩn Bacillus mycoides dưới kính hiển vi điện tử
(Di Franco & cs., 2002)
(a) Bacillus mycoides hình thành các sợi mở rộng trên thạch.
(b) Các sợi mở rộng theo các hướng khác nhau.
(c) Các sợi mở rộng theo cùng 1 hướng.
(d) Các sợi mở rộng theo các hướng khác nhau và theo cùng 1 hướng xếp
chồng lên nhau.
9


(e) (f) Ở độ phóng đại cao (25–30.000 X) cho thấy cấu trúc của thành tế
bào bên ngồi khơng bị xoắn.

2.2.4. Tác động có lợi của Bacillus mycoides với cây trồng
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn Bacillus mycoides có khả
năng thúc đẩy tăng trưởng ở cây ngơ (Ali & cs., 2022), Arabidopsis thaliana
(Kurniawan, A., & Chuang, H. W.,2022), hoa hướng dương (Ambrosini & cs.,
2015), bơ (Guerrero-Barajas & cs., 2015), củ cải đường (Fravel DR & cs.,
1977), bầu bí (Bargabus R & cs., 2002), thuốc lá (Neher OT & cs., 2009),…
Bacillus mycoides được bổ sung vào cây trồng có thể tăng cường sản xuất các
chất chuyển hóa thứ cấp, bao gồm các hợp chất phenolic, flavonoid,
glucosinolate, axit indole axetic, siderophore, ACC deaminase và
exopolysacarit từ đó làm tăng chiều dài, số lượng của chồi và rễ cây đồng thời
Bacillus mycoides giúp tăng kích thước và trọng lượng tươi của cây (Ali &
cs., 2022, Kurniawan, A., & Chuang, H. W.,2022, Guerrero-Barajas & cs.,
2020). Cây trồng được xử lý bằng Bacillus mycoides có hiệu quả quang hợp
nâng cao thơng qua tích lũy hàm lượng diệp lục và tinh bột cao hơn
(Kurniawan, A., & Chuang, H. W.,2022). Bacillus mycoides B38V là một loại
vi khuẩn được phân lập từ rễ hoa hướng dương có khả năng thúc đẩy sự phát
triển và hấp thu nito của cây trồng. Bộ gen của chủng phân lập có khoảng
5,80Mb và trình bày các bộ mã hóa trình tự cho các đặc tính thúc đẩy tăng
trưởng của thực vật, chẳng hạn như khử nitrat và amon hóa và hấp thu sắtsiderophore (Ambrosini & cs., 2015). Các vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus
cereus giúp thúc đẩy nảy mầm đồng thời tăng hàm lượng K, NO 3-N, P ở cây
lúa (Hassan & cs., 2018)
Một số chủng của B. mycoides được báo cáo là giúp thực vật chống chịu
tốt hơn khi bị nhiễm mặn, stress và chống oxy hóa. Theo nghiên cứu của Ali
& cs. (2022) về vi khuẩn Bacillus mycoides PM35 trong đất trồng cây ngơ cho
thấy Bacillus mycoides PM35 có khả năng chống lại áp lực lên đến 3M NaCl,
B. mycoides PM35 làm giảm căng thẳng do mặn bằng cách tăng cường các
10


sắc tố quang hợp, caroten, khả năng nhặt gốc tự do, đường hịa tan và hàm

lượng protein trong cây ngơ được cấy so với cây không được cấy. Các gen
quy định khả năng chống chịu stress phi sinh học ( gen CzcD, sfp và srfAA)
được khuếch đại trong B. mycoides PM35. Các gen liên quan đến stress ở thực
vật là APX và SOD bị suy giảm, còn DREB2A và HsFA2 có chức năng điều
hịa stress phi sinh học tăng cao ở cây Arabidopsis thaliana (một loại cây có
hoa nhỏ thuộc Họ Cải, thường dùng trong nghiên cứu sinh lý học thực vật)
sau khi được xử lý bằng Bacillus mycoides A3 (Kurniawan, A., & Chuang, H.
W.,2022). Việc cấy B. mycoides A3, B. mycoides PM35 đã kích thích hệ thống
phịng thủ chống oxy hóa, giảm rị rỉ chất điện giải, H2O2 và MDA bằng cách
tăng hoạt động của catalase (CAT), guaiacol peroxidase (GPX), ascorbate
peroxidase (APX) và phenylalanine amoniac-lyase (PAL).
Ngoài ra, protein liên quan đến sinh bệnh học (PR-1 và PR-2), gen đánh
dấu khả năng kháng bệnh được tăng cao khi so sánh cây trồng được bổ sung
và không bổ sung vi khuẩn B. mycoides (Kurniawan, A., & Chuang, H.
W.,2022, Guerrero-Barajas & cs., 2020). Bacillus mycoides A1 làm giảm 75%
sự phát triển của sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư
được phân lập từ quả bơ. Dịch nổi B. mycoides A1 trong quá trình ni cấy
làm giảm 41,9 % mức độ nghiêm trọng của bệnh thán thư trên quả bơ.
(Guerrero-Barajas & cs., 2020). B. mycoides BM02 được phân lập từ vùng rễ
cây cà chua đã tạo ra một loạt các hợp chất có hoạt tính sinh học bao gồm
PAA và MPA để ngăn chặn các bệnh thực vật do Fusarium oxysporum f. sp.
lycopersici (Fol) và các vi sinh vật gây bệnh khác gây ra (Wu & cs., 2020).
2.3. Các phương pháp định danh vi khuẩn
2.3.1. Phương pháp truyền thống
Việc phân loại vi khuẩn được thực hiện lần đầu vào năm 1987, khi
Ferdinad Cohn phân nhóm vi khuẩn dựa vào hình dạng tế bào. Mặc dù phương
pháp phân loại dựa vào hình thái sớm cho thấy khơng có hiệu quả trong phân
11

loại, nhưng hình thái và đặc điểm cấu trúc hiển vi vẫn có vai trị quan trọng
trong định danh vi sinh vật, đặc biệt là trong định danh các chủng mới (Kiều
Phương Nam, 2005).
Phương pháp truyền thống để định danh vi sinh vật thường dựa vào các
chỉ tiêu phân loại như: đặc điểm hình thái, sinh lý, đặc điểm biến dưỡng năng
lượng. Trong đó các thử nghiệm để xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa là
các chỉ tiêu quan trọng nhất.
2.3.1.1. Sử dụng khóa phân loại
Thơng thường để định danh các loài vi khuẩn mục tiêu theo phương
pháp truyền thống, người ta thhường dựa vào các khóa phân loại, trong đó
khóa phân loại Prokaryote là đầy đủ nhất, được sử dụng rộng rãi là khóa phân
loại Bergey (Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology) (Trần Linh Thước,
2022).
2.3.1.2. Sử dụng phương pháp số học
Dựa vào những thông tin về đặc điểm của vi sinh vật, người ta cịn có
thể tính hệ số tương đồng để đánh giá mức độ tương đồng giữa các chủng vi
sinh vật. Trong đó hệ số laccard được sử dụng để so sánh mức độ tương đồng
giữa hai chủng khi muốn bỏ qua các đặc điểm mà cả hai chủng đều thiếu (Kiều
Phương Nam, 2005).
2.3.2. Phương pháp hiện đại
Ngày nay, sự phát triển của các kỹ thuật sinh học hiện đại đã đưa việc
phân loại, định danh vi sinh vật lên một bước phát triển mới. Phương pháp
hiện đại trong định danh vi sinh vật dựa trên vật liệu di truyền có thể cho kết
quả chính xác trong một thời gian ngắn. Tuy nhiên, phương pháp phân loại
hiện đại này địi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại và hóa chất đắt tiền (Trần

12


Linh Thước, 2022). Năm 1967, Zucker Kank và Pauling đã cho rằng các phân

tử sinh học có thể là “tài liệu của lịch sử tiến hóa”, là “thước đo tiến hóa”.
2.3.2.1. Sử dụng mẫu dị kết hợp với phương pháp in-situ phát huỳnh quang
(Flourescence in-siu Hybridazation – FISH)
Mẫu dò là một trình tự acid nucleic, thường là một đoạn mạch đơn của
acid nucleic (DNA) được gắn với một nhận tố nhận biết là phóng xạ hay chất
phát huỳnh quang, dùng để nhận biết trình tự nucleotide đặc trưng (trình tự
nhận diện) của một chủng vi sinh vật đã biết trước.
Phân tích dữ liệu trình tự sau rRNA (Small Subunit rRNA) đã biết sẽ
cho phép xác định các trình tự nhận diện chuyên biệt cho từng giới. Một số
trình tự nhận diện cho một nhóm chuyên biệt trong giới , thậm trí một giống,
một lồi cũng đã được xác định. Trong tương lai, nhiều trình tự được xác định
và sẽ rất hữu dụng trong việc nhận diện, định danh một vi sinh vật mới.
Các trình tự nhận diện chuyên biệt cho vi khuẩn có thể tổng hợp, đánh
dấu bằng chất phát huỳnh quang và dùng để phát hiện chuyên biệt của giới
này. Các mẫu dò này được gọi là “mẫu dò phát sinh chủng loại” (phylogenic
prode).
Bằng việc xử lý mẫu chứa vi sinh vật bằng một tác nhân thích hợp làm
tăng tính thấm của màng, cho phép mẫu dị vào bên trong tế bào, thực hiện
phương pháp lai phân tử (lai in-situ, tức là lai trực tiếp trên tế bào mẫu), và
quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, người ta có thể xác định trực tiếp
chủng thuần thuộc giới nào hay quần xã vi sinh vật hiện diện trong một mẫu
tự nhiên gồm những giới nào. Kỹ thuật lai và phát hiện này được gọi là phương
pháp lai in-situ huỳnh quang (FISH). Phương pháp này được sử dụng rộng rãi
trong nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật.

13


2.3.2.2. Phương pháp lai nucleic acid
Thành phần base của DNA chỉ có tác đụng chứng minh các vi khuẩn

là khơng có liên hệ với nhau. Tỷ lệ các base trong DNA có thể thay đổi trong
phạm vi rất rộng. nếu hai vi sinh vật có thành phần base khác nhau thì chúng
khơng có liên hệ với nhau. Tuy nhiên, hai vi khuẩn có cùng thành phần base
chưa hẳn là có quan hệ với nhau do trình tự base có thể khác nhau. Việc lai
giữa các DNA của hai vi khuẩn cho phép định danh một số loài mới hoặc
xác định mối qua hệ đến mức giống và loài giữa hai vi khuẩn (Trần Linh
Thước, 2002).
Để xác định mối quan hệ giữa các chủng, thông thường người ta so
sánh phần trăm lai (DNA-DNA) giữa chủng cần khảo sát với một chủng đã
biết (chủng chuẩn). DNA từ chủng chuẩn được người ta tách triết, tinh tế,
đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ, phân đoạn thành những đoạn ngắn có chiều
dài ngẫu nhiên, đun nóng để tách mạch. DNA từ các chủng được khảo sát
cũng được chuẩn bị tương tự nhưng không được đánh dấu. tiến hành lai mẫu
DNA chủng thuần với nhau (đối chứng). Sau đó tuận tự lai DNA chủng thuần
với DNA chủng cần khảo sát. Thu lấy DNA mạch kép (có lai), loại bỏ DNA
mạch đơn. Đo năng lượng phóng xạ của trường hợp đối chứng, lượng này
được xem là tương đồng 100% lai. Tương tự tính năng lượng phóng xạ thu
được từ các trường hợp lai giữa chủng thuần với chủng được khảo sát, tính
phần trăm lai.
Từ số liệu về mức độ lai có thể xác định mối tương quan giữa các
chủng như sau:
Trên 70% lai: 2 chủng cùng loài (khác chủng)
Trên 20% lai: 2 chủng cùng giống (khác loài)
Dưới 10% lai: 2 chủng khác giống

14