Phân lập và định danh vi khuẩn bacillus mycoides từ đất trồng cây lạc, đậu tương của một số tỉnh miền bắc

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
----------

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN BACILLUS
MYCOIDES TỪ ĐẤT TRỒNG CÂY LẠC, ĐẬU
TƯƠNG CỦA MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC

Hà Nội, 2023


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-------  -------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN BACILLUS
MYCOIDES TỪ ĐẤT TRỒNG CÂY LẠC, ĐẬU
TƯƠNG CỦA MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC

Sinh viên thực hiện

: Đào Văn Đỉnh

Lớp

: K63CNSHC

Mã sinh viên

: 637214

Ngành

: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn

: TS. Trần Thị Bình Nguyên

HÀ NỘI, 2023


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan,
Các số liệu mà tôi thu thập được trong quá trình thực tập là do tôi trực tiếp
nghiên cứu, theo dõi và ghi chép.
Các số liệu thu thập là trung thực, khách quan và chưa được cơng bố ở bất
kỳ báo cáo nào trước đó.
Các trích dẫn trong báo cáo là có nguồn gốc cụ thể rõ ràng, chính xác.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2023

Sinh viên

ĐÀO VĂN ĐỈNH

i


LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian làm đề tài tốt nghiệp tại Bộ môn Công nghệ sinh học động vật,
được sự giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các thầy cơ giáo, các cán bộ tại phịng thí
nghiệm của Bộ môn cùng với sự cố gắng và nỗ lực học tập của bản thân, tơi đã
hồn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Trước tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám đốc Học viện, Ban chủ nhiệm
khoa Công nghệ sinh học cùng tồn thể các thầy cơ giáo đã truyền đạt cho tôi
những kiến thức vô cùng bổ ích và quý báu trong suốt thời gian học tập, rèn luyện
và thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Tơi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Trần Thị Bình Ngun Giảng viên Bộ mơn Cơng nghệ sinh học Động vật, Khoa Công nghệ sinh học
là người đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và hướng dẫn tơi trong suốt q trình thực
hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp.
Tơi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các bạn sinh viên trong bộ môn
Công nghệ vi sinh, Công nghệ sinh học thực vật, bộ môn Sinh học và bộ môn
Sinh học phân tử đã giúp đỡ, cho tôi sử dụng nhờ máy móc, hố chất và dụng
cụ thí nghiệm cần thiết trong kì khố luận của tơi.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn các anh chị cán bộ tại phịng thí nghiệm Bộ mơn
cơng nghệ sinh học Động vật đã tận tình giúp đỡ để tơi có thể hồn thành khóa
luận tốt nghiệp này.
Một lần nữa xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất!
Hà Nội, ngày ….. tháng ……năm 2023
Sinh viên

Đào Văn Đỉnh

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................... ii
MỤC LỤC .................................................................................................... iii
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................... vi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................... vii
TÓM TẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ................................................... ix
PHẦN 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................... 1
1.2. Mục đích ............................................................................................. 1
1.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................... 1
PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 3
2.1. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus ......................................................... 3
2.1.1. Đặc điểm hình thái của Bacillus ................................................. 3
2.1.2. Vai trị của vi khuẩn Bacillus ...................................................... 4
2.2. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus mycoides.......................................... 7
2.2.1. Đặc điểm hình thái và phân loại ................................................. 7
2.2.2. Đặc điểm sinh học và điều kiện sinh trưởng của vi khuẩn mycoides. 8
2.2.3. Vai trò của chủng Bacillus mycoides ........................................ 11
2.3. Sử dụng 16S rRNA trong định danh vi khuẩn .................................. 15
PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 20
3.1. Vật liệu .............................................................................................. 20
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................... 20

3.1.2. Vật liệu nghiên cứu ................................................................... 20
3.1.3. Hóa chất và thiết bị ................................................................... 21
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................... 22
3.2.1. Địa điểm thực hiện .................................................................... 22

iii


3.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................. 23
3.3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn từ mẫu đất.............................. 23
3.3.2. Phương pháp làm thuần ............................................................ 23
3.3.3. Phương pháp xác định hình thái vi khuẩn................................. 24
3.3.4. Phương pháp nuôi giữ giống ..................................................... 24
3.3.5. Phương pháp nuôi lỏng ............................................................. 24
3.3.6. Phương pháp tách chiết DNA ................................................... 25
3.3.7. Phương pháp chạy điện di ......................................................... 26
3.3.8. Kĩ thuật PCR ............................................................................. 27
3.3.9. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR ..................................... 30
3.3.10. Phương pháp giải trình tự gen ................................................. 30
3.3.11. Phương pháp xử lí số liệu ....................................................... 30
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 31
4.1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn từ mẫu đất trồng cây họ đậu . 31
4.2. Kết quả làm thuần vi khuẩn .............................................................. 31
4.3. Kết quả định danh chủng vi khuẩn ................................................... 35
4.3.1. Kết quả tách chiết dna tổng số và đo quang phổ định lượng dna 36
4.3.2.Phản ứng pcr .............................................................................. 38
4.3.3. Kết quả giải trình tự gen vùng 16s ............................................ 38
4.3.4. Phân tích đa hình nucleotide vùng 16s của chủng Bacillus
mycoides (L3) với một số chủng Bacillus khác có mã số trên genbank ..... 41
4.3.5.Xây dựng và phân tích cây di truyền phả hệ của Bacillus mycoides

nghiên cứu cùng với các Bacillus khác có mã số trên genbank. ................. 44
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................... 45
5.1. Kết luận ............................................................................................. 45
5.2. Kiến nghị ........................................................................................... 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 46

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Số lượng và nguồn gốc mẫu..........................................................................20
Bảng 3.2. Các thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ............................................................... 21
Bảng 3.3. Các hóa chất pha mơi trường LB ..................................................................21
Bảng 3.4. Hóa chất dùng để tách chiết DNA ................................................................ 22
Bảng 3.5. Hóa chất sử dụng để chạy điện di DNA trên gel Agarose ............................ 22
Bảng 4.1. Kết quả đo quang phổ DNA tổng số ............................................................. 37

v


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1. Bacillus dưới kính hiển vi quang học (x100) ..................................................4
Hình 2.2. Sự phát triển của B. mycoides trong (A) môi trường lỏng LB & (B) đĩa thạch
LB; hình thái tế bào được quan sát bằng kính hiển vi tương phản pha (C) .....8
Hình 2.3. Phân tích phát sinh lồi dựa trên tồn bộ trình tự bộ gen của 7 chủng B.
mycoides phân lập và các đại diện khác của nhóm B. cereus: B. cereus, B.
anthracis và B. thuringensis ...........................................................................10
Hình 2.4. Cấu trúc thứ cấp của 16S rRNA ....................................................................16
Hình 2.5. Cây phát sinh được xây dựng dựa trên so sánh trình tự 16S ......................... 18
Hình 3.1. Chu trình phản ứng PCR ...............................................................................29

Hình 4.1. Hình ảnh đại diện khuẩn lạc sau khi nuôi cấy từ đất trồng cây lạc, đậu tương
10-5(A), 10-6(B)............................................................................................... 31
Hình 4.2. Vi khuẩn có hình dạng đặc trưng của Bacillus mycoides sau khi nuôi cấy .......32
Hình 4.3. mycoides trên mơi trường thạch LB trong 20 giờ .........................................32
Hình 4.4. Bacillus mycoides trên mơi trường thạch LB trong 16 giờ ........................... 33
Hình 4.5. Bacillus mycoides trên mơi trường thạch LB trong 18 giờ ........................... 33
Hình 4.6. Bacillus mycoides trên môi trường thạch LB trong 20h (A) và 22h (B) ......34
Hình 4.7. Bacillus mycoides trên mơi trường thạch LB trong 24 giờ ........................... 34
Hình 4.8. Chủng vi khuẩn (mẫu L3) được ni lỏng sau 24 giờ...................................35
Hình 4.9. Dịch vi khuẩn (L3) sau khi nuôi cấy trên môi trường thạch LB (100µl dịch ở
độ pha lỗng 10-6 trong 16 giờ) ......................................................................36
Hình 4.10. Kết quả điện di DNA tổng số và đo OD từ dịch (L3) .................................37
Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi 27F/1492R............................. 38
Hình 4. 12. Kết quả giải trình tự gen .............................................................................40
Hình 4. 13. So sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotite của chủng (L3) với các chủng
tương đồng trên Genbank ...............................................................................40
Hình 4.14. Kết quả đánh giá sự tương đồng giữa chủng Bacillus mycoides (L3) với một
số chủng Bacillus khác có mã số trên Genbank .............................................43
Hình 4.15. Cây phả hệ di truyền của chủng vi khuẩn mycoides L3 và một số vi khuẩn
cùng chi Bacillus ............................................................................................ 44

vi


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Nghĩa của từ

A

Adenine Nucleotide

APX

Ascorbate peroxidase

B. mycoides

Bacillus mycoides

bp

Base pair - Cặp bazơ

C

Cytosine Nucleotide

CDS

Trình tự mã hóa giả định

cs

Cộng sự

DNA

Deoxyribonucleic acid

ELISA

Xét nghiệm chất hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym

B. cereus

Bacillus cereus

F

Forward primer – Môi xuôi

B. subtilis

Bacillus subtilis

G

Guanine Nucleotide

GPX

Guaiacol peroxidase

LB

Luria Broth

B.licheniformis

Bacillus licheniformis

MLEE

Điện di enzyme đa điểm

NAAT

Kỹ thuật khuếch đại axit nucleic

OD

Optical density – Mật độ quang

PCR

Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi polymerase

BBG

Vác xin phòng bệnh lao

sp

species - loài

spp

species pluriel - nhiều loài

vii


EDTA

axit aminopolycarboxylic

CTAB

Hexadecyltrimethylammonium bromide

TAE

Tris-acetate-EDTA

Ta

Annealing temperature - Nhiệt độ gắn mồi

R

Reverse primer – Mồi ngược

RFLP

Restristion Fragment Length Polymorphisms hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn

rRNA

Ribosomal ribonucleic acid

UV

Ultraviolet - Tia tử ngoại

16s rRNA

16S ribosomal RNA

L3

Đa

Chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng lạc (Đình Bảng- Từ
Sơn- Bắc Ninh)

viii


TÓM TẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài: Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus mycoides từ đất trồng
cây lạc, đậu tương của một số tỉnh miền Bắc
Giảng viên hướng dẫn: TS. Trần Thị Bình Nguyên
Sinh viên thực hiện: Đào Văn Đỉnh
Lớp: K63CNSHC
Mã SV: 637214
Khóa: 63
Tóm tắt:

Bacillus mycoides là vi khuẩn Gram dương, hình que, khơng có khả năng
di động, thuộc nhóm Bacillus cereus. Bacillus mycoides có thể được tìm thấy
ở nhiều mơi trường khác nhau. Khi phát triển trong đất vi khuẩn Bacillus
mycoides có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật và tăng năng suất nông
nghiệp. Mục tiêu hướng đến của nghiên cứu này là phân lập vi khuẩn Bacillus
mycoides từ đất trồng cây lạc, đậu tương ở một số tỉnh miền bắc và định danh
được chủng Bacillus mycoides bằng phương 16S rRNA. Các phương pháp được
sử dụng trong nghiên cứu gồm có: phân lập vi khuẩn, làm thuần khuẩn lạc Bacillus
mycoides, nuôi lỏng, giữ giống, định danh bằng phương pháp truyền thống và
phương pháp 16S rRNA, tách chiết DNA, PCR, điện di, giải trình tự gen, thu thập
và xử lý số liệu bằng phần mền BioEdit, MegaX. Nghiên cứu đã phân lập và định
danh bằng hình thái vi khuẩn Bacillus mycoides từ đất trồng cây lạc tại Đình Bảng,
Tiêu Sơn (Từ Sơn- Bắc Ninh) và xóm 9 xã An Châu (Đơng Hưng- Thái Bình),
đất trồng cây đậu tương tại Viện sinh học (HVNN Việt Nam) và thơn Hậu, Tiền
xã Mê Linh (Đơng Hưng- Thái Bình). Các mẫu đất trồng cây lạc tại Đồng Nguyên
(Từ Sơn- Bắc Ninh), An Lạc (Trâu Quỳ- Gia Lâm- Hà Nội) và xóm 8, xóm 9 (An
Châu- Đơng Hưng- Thái Bình) khơng xuất hiện khuẩn lạc đặc trưng cho Bacillus
mycoides; Định danh được chủng Bacillus mycoides phân lập từ đất trồng cây lạc
tại Đình Bảng (Từ Sơn- Bắc Ninh) (L3) bằng 16S rRNA; Kết quả giải trình tự và

ix


so sánh mức độ tương đồng của L3 cho thấy chủng này có độ tương đồng
nucleotide đạt 99,81% với trình tự nucleotide 16S rRNA của một số chủng
Bacillus mycoides; Phân tích cây di truyền phả hệ cho thấy chủng Bacillus
mycoides trong nghiên cứu nằm cùng nhánh vơi các chủng Bacillus mycoides khác
trên Genbank.

x

PHẦN 1 MỞ ĐẦU
1.2. Mục đích
- Phân lập được vi khuẩn Bacillus mycoides từ đất trồng cây lạc, đậu tương
ở 1 số tỉnh miền bắc.
- Định danh được các chủng Bacillus mycoides.
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay giá trị của các vi sinh vật đã được con người sử dụng vào trong các
lĩnh vực sản xuất khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, y học... để phục vụ
cho đời sống. Biết rằng trong quá trình sống của thế giới sinh vật ln xảy ra các
phản ứng hóa sinh để chuyển hóa vật chất. Các phản ứng này đem lại hiệu suất
xúc tác lớn hơn so với các chất vô cơ, chất hữu cơ khác và có tính đặc hiệu cao.
Do đó các chế phẩm vi sinh thường được sử dụng rộng rãi trong y học, trong công
nghiệp, sản xuất thực phẩm và trong chăn ni... Trong đó khơng thể khơng nhắc
tới vai trị to lớn của chi Bacillus. Đã có nhiều nghiên cứu về các vi khuẩn thuộc
chi Bacillus nhưng vi khuẩn Bacillus mycoides vẫn chưa được biết đến nhiều và
vẫn chưa nhận được nhiều sự quan tâm và nghiên cứu.
Bacillus mycoides là vi khuẩn Gram dương, khơng có khả năng di động,
thuộc nhóm Bacillus cereus. B. mycoides được tìm thấy ở nhiều môi trường khác
nhau như trong đất, nước, không khí, cơ thể động vật, và ở một số lồi thực vật.
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy Bacillus mycoides khi phát triển trong đất chúng có
vai trị rất lớn đối với thực vật với khả năng thúc đẩy sự phát triển của cây trồng
và tăng năng suất thu hoạch đối với nền nơng nghiệp... Mặc dù Bacillus mycoides
có nhiều giá trị đối với con người và cây trồng nhưng đến nay chúng vẫn ít được
quan tâm đến.
Xuất phát từ những thực tế đó tơi bước đầu đã tiến hành nghiên cứu đề tài
“Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus mycoides từ đất trồng cây lạc, đậu
tương của một số tỉnh miền bắc” nhằm mục đích tìm hiểu được thêm sự phát

1


triển và sự đa dạng của chủng vi khuẩn mycoides để sau này tuyển chọn tạo ra các
chế phẩm vi sinh về Bacillus mycoides đem lại vai trò cần thiết cho con người và
cho động, thực vật.
1.3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus mycoides từ các mẫu đất trồng cây lạc,
đậu tương thu thập được ở các địa phương.
- Định danh chủng vi khuẩn Bacillus mycoides bằng các phương pháp truyền
thống, phương pháp phân tử.

2


PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus
2.1.1. Đặc điểm hình thái của Bacillus
Bacillus là một chi vi khuẩn gram dương, hình que, có kích thước lớn khác
nhau (0,5-2,5)x(1,2-10)m, chúng sống hiếu khí hay hiếu khí tuỳ tiện và thường
được tìm thấy rộng rãi trong đất, nước và khơng khí. Chúng là catalase dương
tính, nhiều loại có khả năng lên men và hầu hết đều có tính di động nhờ có chùm
tiêm mao, là vi khuẩn dị dưỡng hóa năng, hoại sinh thu năng lượng nhờ oxi hóa
các hợp chất hữu cơ. Chi này bao gồm nhiều lồi, một số có lợi cho hệ sinh thái
trên cạn và dưới nước, trong khi những lồi khác có hại đối với các sinh vật khác.
Các thành viên của chi Bacillus có khả năng thích nghi cao, nhờ khả năng hình
thành nội bào tử - cấu trúc bảo vệ chúng khỏi một loạt các môi trường bất lợi bao
gồm nhiệt độ rất cao cho tới nhiệt độ rất thấp, cực khơ, bức xạ và hóa chất độc
hại, bào tử của vi khuẩn khơng phải là một hình thức sinh sản mà chúng chỉ là
một hình thức thích nghi để giúp vi khuẩn vượt qua những điều kiện sống bất lợi.

Bacillus có thể ngưng hoạt động trong nhiều năm nhờ vào khả năng tạo ra bào tử
gần như hình cầu để tồn tại trong trạng thái “ngủ đơng” và kích hoạt trở lại khi
gặp được điều kiện thuận lợi. Ngoài nội bào tử, những vi khuẩn này cịn có hàng
loạt các khả năng sinh lý giúp chúng thích nghi với các môi trường khác nhau và
chịu đựng nhiều điều kiện mà nhiều loại sinh vật khác không thể tồn tại được.
Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 - 10 như
Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 - 6 như Bacillus
acidocaldrius.
Về nhiệt độ có nhiều chủng ưa lạnh (5oC - 25oC), hay chịu ở nhiệt độ cao
(45oC - 75oC), nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ 34oC - 37oC (Nguyễn
Thị Trần Thuỵ, 2009).

3


Hình 2.1. Bacillus dưới kính hiển vi quang học (x100)
(Biền Văn Minh- Trường ĐHSP- Đại học Huế)
2.1.2. Vai trò của vi khuẩn Bacillus
Vi khuẩn Bacillus được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, phục vụ
cho nhu cầu của con người như nông - lâm - ngư nghiệp, công nghiệp sản xuất chế biến thực phẩm, y tế - sức khỏe người và động vật, … và giá trị của chúng
cũng đang được loài người dần dần khai thác và ứng dụng, dưới đây là 1 số ví dụ
về vai trò của chủng Bacillus:
Bacillus rất đa dạng về khả năng hóa sinh, được đặc trưng bởi khả năng
kháng khuẩn và khả năng chịu nhiệt. Nghiên cứu của Baruzzi & cs. (2011) đã cho
thấy khả năng sản xuất nội bào tử cho phép các vi khuẩn Bacillus chịu được các
điều kiện môi trường khắc nghiệt như những điều kiện xảy ra trong quá trình chế
biến thực phẩm. Bacillus spp., đặc biệt là B. subtilis, thường được tìm thấy trong
các loại thực phẩm như xúc xích khơ, pho mát, sữa lên men truyền thống, bột
chua... trong đó chúng hợp tác với các vi sinh vật khác trong q trình lên men,
giải phóng amylase, lipase và protease. Một trong những đặc điểm chính được tìm

thấy giữa các chủng Bacillus là khả năng tạo ra một loạt các hợp chất kháng khuẩn
hoạt động chống lại vi khuẩn và nấm. Mặc dù khả năng kiểm sốt vi sinh vật do
các chất chuyển hóa này gây ra đã được chứng minh trong môi trường thực vật
nhưng nghiên cứu cũng cho thấy các hợp chất này có thể tương tác với hệ vi sinh
vật thực phẩm.

4


Nghiên cứu của Pinchuk & cs. (2002) cho thấy quá trình sản xuất
isocoumarin- hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng và sự đa dạng di truyền
của 51 chủng Bacillus được phân lập từ các vùng sinh thái và địa lý khác nhau
bằng cách Sử dụng các kỹ thuật nhận dạng phân tử. Ở đây 47 chủng được xác
định là B. subtilis , ba chủng là Bacillus licheniformis và một là Bacillus
pumilus. Khi các chủng này được sàng lọc để sản xuất isocumarin, 11 chủng thuộc
loài B. Subtilis sản xuất amicoumacin, kháng sinh của nhóm isocoumarin.
Các chế phẩm vi sinh bao gồm: BaDS1A1, BaD-S1F3, BaD-S13E2, BaDS13E3, BaD- S18F11, BaD- S20D12 được sản xuất từ các chủng vi khuẩn Bacillus
phân lập từ rễ lạc ở miền Trung Việt Nam đều có tác dụng hạn chế các bệnh hại gỉ
sắt và đốm lá, đồng thời các chế phẩm này cũng cho thấy khả năng kích thích sinh
trưởng tốt đối với cây lạc, cụ thể là tăng tỷ lệ mọc, số cành và tăng số lượng nốt sần
so với đối chứng góp phần tăng năng suất và khả năng cải tạo đất của cây lạc, được
chứng minh bằng thí nghiệm trộn các chế phẩm vi sinh trên với đất trên đồng ruộng
và bón vào đất theo hàng trước khi gieo giống lạc (L23) với liều lượng 1 gam chế
phẩm/1m2 đất (10kg/ha). Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ, 3
lần nhắc lại trên đất thịt pha cát. Diện tích mỗi ơ thí nghiệm là 15m2 (3m x 5m).
Kết quả cho thấy tỉ lệ bệnh gỉ sắt giảm xuống dao động từ 62,67% đến 89,33%,
bệnh đốm lá cũng giảm xuống đáng kể, tỉ lệ bệnh dao động từ 58,67% đến 89,33%.
Đồng thời, các chế phẩm này cũng có khả năng làm tăng năng suất giống lạc L23
từ 2,48% – 21,13% (Nguyễn Xuân Vũ & cs., 2021).
Các bào tử B.subtilis được sử dụng để điều trị vi khuẩn đường miệng và vi

khuẩn dự phịng rối loạn tiêu hóa ở cả người và động vật. (Ngơ Thị Hồ & cs.,
2000) đã làm thí nghiệm thiết lập danh tính của vi khuẩn Bacillus có sẵn trong
men vi sinh thương mại được sử dụng cho con người. Ở đây họ đã tiến hành phục
hồi chủng Bacillus từ các chế phẩm thương mại và nhà sản xuất sau:
Lactipan plus (Istituto Biochimico Italiano SpA, Milan, Italy), Domuvar
(Consorzio Farmaceutico e Biotecnologico Bioprogress ari, Anagni-FR, Italy),

5


Bactisubtil Marion Merrell SA, (Bourgoin-Jallieu, France), Biosubtyl , (Viện
Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế, Đà Lạt, Việt Nam), và Subtyl
(Nhà máy Dược phẩm 24, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam) bằng cách trộn
các chế phẩm men vi sinh khơ trong nước cất, sau đó pha loãng và cấy nối tiếp
trên thạch bào tử Difco. Kết quả đã được kiểm chứng với sự phát triển mạnh của
chủng Bacillus subtilis trên môi trường thạch.
Các chủng Bacillus còn được biết đến với khả năng sản xuất và bài tiết
protein cao. Ngồi ra, các lồi khác nhau có hiệu suất tăng trưởng cao nhờ nguồn
carbon chi phí thấp, thao tác di truyền được thiết lập và hỗ trợ q trình lên men
quy mơ lớn, khiến chúng trở nên tuyệt vời cho ứng dụng công nghiệp (Yang Gu
& cs., 2018, Van Der Maarel & cs., 2002, Ramesh & cs., 2020, Samanta & cs.,
2020).
Một số loài Bacillus chẳng hạn như B. subtilis, B. amyloliquefaciens , B.
licheniformis và GeoBacillus stearothermophilus đã được báo cáo về khả năng
sản xuất amylase bằng cách lên men chìm ở quy mơ cơng nghiệp (Bhattacharjee
& cs., 2012, Ramesh & cs., 2020). Hơn nữa, B. licheniformis và B. subtilis được
quan tâm đặc biệt đối với ngành công nghiệp thực phẩm, có trạng thái "thường
được cơng nhận là an toàn” (Yang Gu & cs., 2018).
Vào thời điểm thế giới đang phải lãnh chịu đại dịch do vi-rút corona gây ra
mà chưa có được vắc xin hiệu quả thì cũng đã có những tranh luận về nghiên cứu

việc tiêm vắc xin trực khuẩn Calmette-Guérin (BCG) vì trong lịch sử BCG- một
dòng mycobacterium bovis đã được làm yếu đi, đã được sử dụng làm vắc xin
phòng bệnh lao. Việc chủng ngừa được thực hiện cho trẻ em trong năm đầu đời ở
hầu hết các quốc gia trên thế giới và BCG đã đóng góp được giá trị lớn vào thời
điểm đó (Hegarty & cs., 2020). Hơn nữa BCG cịn có vai trị cực kì quan trọng
trong việc điều trị ung thư bàng quang (Gontero & cs., 2010).

6


2.2. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus mycoides
2.2.1. Đặc điểm hình thái và phân loại
Bacillus mycoides được mơ tả lần đầu tiên vào năm 1886 bởi Flugge và các
đặc điểm hình thái của vi khuẩn này được mơ tả đầy đủ bởi các nha khoa học vào
những năm đầu thế kỉ XX (Gottheil, 1901; Holzmüller, 1909; Pringsheim, 1924;
Nyberg, 1927). Bacillus mycoides theo (Flugge, 1886) được phân loại theo như sau:
Giới (Kingdom): Bacteria
Ngành (Division): Firmicutes
Lớp (Class): Bacilli
Bộ (Order): Bacillales
Họ (Family): Bacillaceae
Chi (Genus): Bacillus
Loài (Species): Bacillus mycoides
Bacillus mycoides là một loại vi khuẩn Gram dương có màu trắng đến kem,
có bề ngồi giống lơng và các sợi này phát triển theo hình xoắn ốc có thể cùng
chiều hoặc ngược chiều kim đồng hồ tùy chủng, tế bào hình que và sinh bào tử,
khơng di động, kích thước khoảng 1,0-1,2x 3,0-5,0 μm. Các tế bào phát triển trên
thạch glucose tạo ra một lượng lớn vật liệu lưu trữ, tạo ra hình dạng khơng bào
hoặc bọt. Bào tử có hình elip, trung tâm, cạnh trung tâm hoặc dưới đầu, khơng
làm phình túi bào tử, viên nang khơng có mặt.

Sự phát triển của B. mycoides trên đĩa thạch có một hình dạng đặc biệt, kết
quả từ các tế bào được liên kết chặt chẽ từ đầu đến cuối và được nhóm lại thành
sợi bó.

7


Hình 2.2. Sự phát triển của B. mycoides trong (A) mơi trường lỏng LB & (B) đĩa
thạch LB; hình thái tế bào được quan sát bằng kính hiển vi tương phản pha (C)
Bacillus mycoides thuộc nhóm Bacillus cereus. Các vi khuẩn cùng nhóm có
kiểu hình rất gần Bacillus mycoides gồm: Bacillus anthracis, Bacillus cereus,
Bacillus weihenstephanenis, Bacillus pseudomycoides và Bacillus thuringiensis
và một số loài được xác định gần đây (Fiedoruk & cs., 2017). Tuy nhiên, B.
mycoides ít được chú ý hơn so với các thành viên khác, vì nó là khơng gây bệnh
như B. cereus và Bacillus anthracis, cũng khơng có khả năng trừ sâu như B.
thuringiensis. Cho đến nay, có hơn 20 chủng B. mycoides đã được giải trình tự
tồn bộ gen, với kích thước bộ gen dao động từ 5,17 đến 6,55 megabase (mb). Tất
cả các chủng được giải trình tự đều chứa một số plasmid thuộc nhiều loại khác
nhau kích cỡ. Chủng loại ATCC6462 có một nhiễm sắc thể 5,25mb, một lớn
plasmid, pBMX_1, 360 kilobase (kb) và hai plasmid khác có kích thước khoảng
10kb. Nó chịu được nhiệt độ khắc nghiệt, tuy nhiên điều kiện để vi khuẩn phát
triển tối ưu trong khoảng từ 25°C đến 30°C (Fiedoruk & cs., 2017).
2.2.2. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn mycoides
Khuẩn lạc màu trắng đến kem, mờ đục và có hình thoi đặc trưng, khả năng
hình thành các khuẩn lạc này có thể bị mất kỵ khí tùy tiện. Nhiệt độ tối đa từ 35oC40oC, nhiệt độ tối thiểu từ 10oC-15oC. Phát triển trong thạch kỵ khí và trong mơi
trường dinh dưỡng tăng trưởng trong 7% NaCl là thay đổi. Phát triển ở pH 5,7
(cũng ở pH 6 và 7).

8

Bacillus mycoides là một loại vi khuẩn Gram dương hình que và hình thành
bào tử có liên quan đến nhóm Bacillus cereus. Trên đĩa thạch, nó tạo thành các
khuẩn lạc hình thoi độc đáo từ các tế bào được liên kết từ đầu đến cuối. Các kết
nối nội bào mạnh mang lại một mạng lưới ổn định trong sự tương tác với các đối
tượng khác, chẳng hạn như vi khuẩn và rễ cây (Turchi & cs., 2012).
Do các đặc tính sinh lý và trình tự bazơ rất giống nhau của các rRNA 16S
của Bacillus cereus, Bacillus mycoides và Bacillus thuringiensis, một số nhà phân
loại đặt câu hỏi về tính hợp lệ của việc tách các sinh vật này thành các loài riêng
biệt. Các nghiên cứu về mối liên quan đến DNA dựa trên tốc độ phục hồi được đo
bằng phép đo quang phổ đã được thực hiện để xác định mối quan hệ phân loại của
ba loài. Một nghiên cứu về 58 chủng tiết lộ rằng mức độ liên quan giữa B. cereus
và B. mycoides và giữa B. cereus và B. thuringiensis dao động lần lượt từ 22%
đến 44% và từ 59% đến 69%. Trên cơ sở mức độ liên quan đến DNA vừa phải
mà nghiên cứu đã xác định được B. cereus và B. thuringiensis dường như là các
thực thể có liên quan về mặt di truyền nhưng khác biệt về mặt phân loại. B.
mycoides có liên quan di truyền xa với B. cereus và đại diện cho một đơn vị phân
loại riêng biệt. Ngồi hình thái có dạng hình thoi và khơng có khả năng di động,
nhóm B. mycoides có thể được phân biệt với B. cereus bởi sự khác biệt về thành
phần axit béo và các hoạt động sản xuất acetanilide.

9


Hình 2.3. Phân tích phát sinh lồi dựa trên tồn bộ trình tự bộ gen của 7 chủng
B. mycoides phân lập và các đại diện khác của nhóm B. cereus: B. cereus, B.
anthracis và B. thuringensis
Các loài Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus mycoides, và Bacillus
thuringiensis được đưa vào danh sách tên vi khuẩn được phê duyệt năm 1980
(Skerman & cs., 1980). Các đặc điểm được sử dụng để phân biệt các đơn vị phân

loại này là khả năng gây bệnh và đặc điểm hình thái tổng thể; B. anthracis và B.
thuringiensis lần lượt là tác nhân gây bệnh cho động vật có vú và cơn trùng, trong
khi sinh vật hoại sinh B. mycoides trái ngược với B. cereus tạo ra các khuẩn lạc
hình thoi. Bởi vì bốn lồi này có chung nhiều đặc điểm kiểu hình nên một số nhà
phân loại học đã đặt câu hỏi về tình trạng của chúng với tư cách là loài riêng biệt
(Gordon & cs., 1973, Smith & cs., 1952). Kết quả của các nghiên cứu về mối liên
hệ với DNA dường như xác nhận mối quan hệ phân loại chặt chẽ của B. anthracis ,
B. cereus và B. Thuringiensis (SEKI & cs., 1978). Dữ liệu hạn chế đã gợi ý rằng

10


B. mycoides cũng có thể liên quan chặt chẽ về mặt di truyền với B. cereus
(Somerville & Jones, 1972).
2.2.3. Vai trị của chủng Bacillus mycoides
Bacillus mycoides là nhóm vi khuẩn đã được nghiên cứu và ứng dụng trong
một số lĩnh vực khác nhau. Trong lĩnh vực nông nghiệp, vi khuẩn này được biết
đến có tác dụng thúc đẩy tăng trưởng thực vật và hoạt động kiểm soát ở các loại
cây trồng khác nhau. Bên cạnh đó, lồi vi khuẩn này có khả năng kiểm sốt sinh
học cho các lồi thực vật. Một số ví dụ cụ thể như:
B. mycoides TKU038 được phân lập từ đất có thể để tạo ra một chitosanase
mới chuyển đổi chitinous thành chito-oligomers với khả năng chống oxy hóa và
chống viêm (Liang & cs., 2016). B. mycoides phân lập từ mỏ dầu tạo ra chất hoạt
động bề mặt sinh học ở mức độ cao (Najafi & cs., 2010). Hầu hết các nghiên cứu
về B. mycoides đều tập trung về hoạt động kiểm soát sinh học và PGPR của nó.
B. mycoides Bac J (BmJ) được phân lập từ lá củ cải đường làm giảm bệnh đốm lá
Cercospora của củ cải đường lên đến 91% (Bargabus & cs., 2002). Sức đề kháng
mắc phải tồn thân gây ra thơng qua việc tạo ra các protein liên quan đến sinh
bệnh học và bùng nổ oxy hóa là cơ chế chính (Bargabus & cs., 2003). Chủng này
trì hỗn sự khởi đầu của bệnh thán thư và làm giảm tổng số và sản xuất bào tử

sống của mầm bệnh gây bệnh Glomerella cingulata var. orbiculare, khi được sử
dụng để gây ra SAR trong dưa chuột (Neher & cs., 2009). Bacillus mycoides SU23 có thể ngăn chặn hồn tồn các triệu chứng suy giảm do Pythium gây ra
mamillatum trên dưa chuột và có hoạt tính kích thích sinh trưởng trên cây con
(Paul & cs., 1995). Ứng dụng nuôi cấy B. mycoides sản xuất surfactin ngăn chặn
hồn tồn sự hình thành các tổn thương do ngâm nước trên lá dưa chuột và giảm
35% khả năng khử Pythium trong nhà kính (Peng & cs., 2003). Hoạt động cố định
đạm của B. mycoides đã được kiểm chứng (Ambrosini & cs., 2016), làm cho
chủng này có tiềm năng phân bón sinh học.

11


Các tác nhân sinh học hoặc sinh hóa kiểm sốt bệnh cây trồng bằng cách tạo
ra sức đề kháng toàn thân đối với sự lây nhiễm mầm bệnh có thể đóng một vai trị
quan trọng trong việc quản lý bệnh cây trồng. Bacillus mycoides, phân lập J, BmJ,
đại diện cho tác nhân đầu tiên tác động bằng cách phun lên lá (chứ không phải
gốc) và không gây tổn thương mô lá ở bất kỳ loại cây nào.
B. mycoides phân lập, BmJ, đã được sử dụng trong chế phẩm phun qua lá
như một loại thuốc diệt nấm để phòng bệnh cho cây trồng. BmJ đã chứng minh
khả năng kiểm soát dịch bệnh khi áp dụng cho củ cải đường, khoai tây, cà chua,
ớt và hồ đào, đồng thời có thể kiểm soát sự phát triển của nấm gây bệnh, Phythium
ở cây cảnh và nấm mốc xám Botrytis ở cà chua.
Kiểm soát dịch bệnh với chủng này trước đây đã được chứng minh ở củ cải
đường. Nghiên cứu trong dự án SBIR giai đoạn I cho thấy khả năng kiểm soát
nhiều loại bệnh trên dưa chuột, mở rộng đáng kể tiềm năng thương mại. Trong dự
án SBIR giai đoạn II, MMP sẽ thúc đẩy thương mại hóa BmJ bằng cách chứng
minh khả năng kiểm soát dịch bệnh hiệu quả trên cây dưa chuột và dưa lưới, phát
triển các công thức thương mại, mở rộng thị trường tiềm năng bằng các thử
nghiệm trên cây trồng bổ sung, hệ thống dịch bệnh và tiến hành nghiên cứu sâu
hơn về cơ chế gây bệnh của BmJ sức đề kháng ở thực vật.

Bacillus mycoides phân lập Bac J, một loại vi khuẩn không gây bệnh, sống
trong thực vật, làm giảm bệnh đốm lá Cercospora (Cercospora beticola Sacc.) của
củ cải đường từ 38%–91% trong cả thí nghiệm trong nhà kính và ngồi đồng.
Kiểm sốt dịch bệnh là do khả năng của vi khuẩn gây ra sức đề kháng tồn thân,
điều này đã được chứng minh thơng qua các thí nghiệm thách thức sức đề kháng
do cảm ứng cổ điển, phân tích phương Tây và xét nghiệm hoạt động của enzyme.
Các xét nghiệm enzyme sau khi điều trị bằng B. mycoides và acibenzolar- S methyl đã chứng minh hoạt động gia tăng của chitinase, β-1,3-glucanase và
peroxidase, tất cả các protein liên quan đến sinh bệnh học và các chỉ số được chấp
nhận về tính kháng tồn thân. Phân tích của phương Tây đã phát hiện nhiều dạng

12


đồng phân chitinase trong B. mycoides và các cây được xử lý bằng acibenzolar- S
-methyl không được phát hiện trong các biện pháp kiểm soát nước. Các dạng đồng
phân chitinase hoạt động được xác định bằng cách sử dụng các thử nghiệm hoạt
động trong gel. Thử nghiệm hoạt tính β-1,3-glucanase sau khi điện di trên gel
polyacrylamide tự nhiên cho thấy hai dạng đồng phân duy nhất được tạo ra sau
khi xử lý B. mycoides, một trong số đó cũng được tìm thấy khi xử lý bằng
acibenzolar- S -methyl. Sự gia tăng hoạt tính cụ thể của peroxidase sau khi xử lý
bằng acibenzolar- S -methyl và B. mycoides là do sản xuất hai dạng đồng phân
độc nhất khơng tìm thấy trong thực vật được xử lý nước như thể hiện qua các xét
nghiệm hoạt tính sau điện di trên gel polyacrylamide tự nhiên.
Nghiên cứu của Beryl & cs. (2021) cho thấy rằng Bacillus mycoides (G2)
sửa dụng để giúp tăng khả năng phân hủy của một số loại lông vũ. Nghiên cứu
cho thấy sự phân hủy bằng phương pháp thông thường của lông chim cút (QF1)
(62%), tiếp theo là lông gà (CF1) (58%), lông gà Guinea (QF2) (51%) và lông
chim bồ câu (CF2) (43%). Phương pháp bổ sung Bacillus mycoides (G2) cho kết
quả khả năng phân huỷ cao hơn phương pháp xử lý QF 1 (5%), phương pháp xử
lý CF 1 (5%), phương pháp xử lý QF 2 (10%), phương pháp xử lý CF 2 (10%).

Vi khuẩn Bacillus mycoides có khả năng làm giảm thiểu bệnh đốm lá do nấm
Alternaria. Chủng vi khuẩn Bacillus mycoides được phân lập chủ yếu thu được từ
nước rửa lá cây thuốc lá trồng trong nhà kính và trên đồng ruộng đã được dùng để
thử nghiệm chống lại ba dòng nấm Alternaria bằng cách khảo sát khả năng đối
kháng của chủng vi khuẩn này với bào tử nấm Alternaria trên môi trường thạch
dinh dưỡng. Kết quả cho khả năng sự ức chế của chủng vi khuẩn tới sự nảy mầm
của chủng nấm Alternaria (Fravel & cs., 1977).
B. mycoides có khả năng giúp cây trồng chịu được độ mặn của đất hơn bằng
cách tạo ra proline và enzyme chống oxy hóa. Bằng thí nghiệm ngâm hạt giống
ngơ (SG-2002) được thu thập từ Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc gia
(NARC), Pakistan, đã được khử trùng vào dung dịch chủng vi khuẩn B.

13