Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn bacillus coagulans từ chế phẩm vi sinh tiêu hóa bac+

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

------- -------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS COAGULANS TỪ
CHẾ PHẨM “VI SINH TIÊU HÓA BAC+”

Hà Nội – 2023


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

------- -------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS COAGULANS TỪ
CHẾ PHẨM “VI SINH TIÊU HÓA BAC+”

Người thực hiện

: NGUYỄN THỊ MAI

Lớp

: K64CNSHB

Ngành

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn

: ThS. NGUYỄN THANH HUYỀN

Hà Nội – 2023


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học do tôi thực hiện
trong thời gian từ 07/2022 – 2/2023 dưới sự hướng dẫn của ThS. Nguyễn Thanh
Huyền – giảng viên Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học –
Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Tất cả số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực và
chưa được cơng bố ở bất kỳ cơng trình nghiên cứu nào ở trong và ngồi nước.
Các tài liệu đã trích dẫn được nêu ở mục tài liệu tham khảo.
Hà Nội, ngày tháng năm 2023
Sinh viên

Nguyễn Thị Mai

iii

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian làm khoá luận tốt nghiệp tại bộ môn Công nghệ vi sinh Khoa Công nghệ Sinh học – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, được sự quan
tâm giúp đỡ, hỗ trợ và dìu dắt tận tình của các Thầy Cơ giáo, anh chị tại phịng
thí nghiệm của khoa và nhóm sinh viên nghiên cứu cùng với sự cố gắng nỗ lực
của bản thân, tôi đã có cơ hội củng cố và rèn luyện kiến thức cũng như kỹ năng
học tập để có thể hồn thành tốt khố luận của mình.
Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới thầy, cô giáo ThS. Nguyễn Thanh
Huyền đã định hướng nghiên cứu, tận tình chỉ dạy, giúp đỡ, hỗ trợ tơi trong suốt
q trình thực hiện khóa luận bằng sự kiên nhẫn và kiến thức của mình.
Tơi xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh
học, đặc biệt là Bộ môn Công nghệ vi sinh. Thầy/cô đã cung cấp những kiến
thức khoa học cũng như kỹ thuật hữu ích cho tôi. Đây là một trong những điều
quan trọng nhất giúp tơi thực hiện thành cơng khóa luận của mình.
Tơi muốn cảm ơn những người bạn đồng hành trong phịng thí nghiệm
của tơi vì sự hỗ trợ đáng kể của mọi người.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới người thân trong gia đình và bạn bè
đã ln động viên, cổ vũ tinh thần và giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tơi trong
suốt q trình học tập và hồn thành khóa luận tốt nghiệp.
Hà Nội, ngày tháng năm 2023
Sinh viên thực hiện,

Nguyễn Thị Mai

iv


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... iv

MỤC LỤC ........................................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ viii
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................... ix
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .............................................................................. x
TÓM TẮT .......................................................................................................... xi
PHẦN I. MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề..................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu ..................................................................................... 2
1.2.1. Mục tiêu .................................................................................................... 2
1.2.2. Yêu cầu...................................................................................................... 2
1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ........................................ 3
1.3.1. Ý nghĩa khoa học ...................................................................................... 3
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ....................................................................................... 3
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 4
2.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus ......................................................... 4
2.2. Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus coagulans ................................................. 6
2.2.2. Đặc điểm hình thái .................................................................................... 7
2.2.3. Đặc điểm hóa sinh ..................................................................................... 9
2.2.4. Ứng dụng của Bacillus coagulans ........................................................... 9
PHẦN III. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 14
3.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu................................................................... 14
3.1.1. Thời gian, địa điểm nghiên cứu .............................................................. 14
3.1.2. Đối tượng nghiên cứu.............................................................................. 14
3.1.3. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ............................................................... 14
3.1.4. Mơi trường và hóa chất ........................................................................... 15
v


3.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 16
3.2.1. Phân lập Bacillus coagulans từ chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa BAC+”. .... 16

3.2.2. Phương pháp giữ giống ........................................................................... 16
3.2.3. Phương pháp nhuộm Gram ..................................................................... 17
3.2.4. Nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn B. coagulans .................... 17
3.2.5. Phương pháp xác định mật độ tế bào B. coagulans có trong chế phẩm . 22
3.2.6. Định danh chủng vi khuẩn ...................................................................... 23
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 25
4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus coagulans từ chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa
BAC+” ............................................................................................................... 25
4.2. Đặc điểm sinh học ...................................................................................... 26
4.2.1. Khả năng di động .................................................................................... 26
4.2.2. Phản ứng MR (Methyl Red) .................................................................... 26
4.2.3. Phản ứng VP (Voges-Proskauer) ............................................................ 27
4.2.4. Khả năng biến dưỡng citrate ................................................................... 27
4.2.5. Khả năng khử nitrate ............................................................................... 28
4.2.6. Khả năng lên men sucrose....................................................................... 29
4.2.7. Phản ứng catalase .................................................................................... 29
4.2.8. Khả năng chịu acid dạ dày ...................................................................... 30
4.2.9. Khả năng chịu muối mật ......................................................................... 31
4.2.10. Khả năng sản sinh lecithinase ............................................................... 31
4.2.11. Khả năng sinh gelatinase ....................................................................... 32
4.2.12. Khả năng bám dính ............................................................................... 33
4.3. Xác định mật độ vi khuẩn Bacillus coagulans có trong chế phẩm ............ 35
4.4. Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn....................................................... 35
4.4.1. Khuếch đại trình tự DNA bằng phản ứng PCR ...................................... 35

vi


PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 38
5.1. Kết luận ...................................................................................................... 38

5.2. Kiến nghị .................................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 39
PHỤ LỤC ......................................................................................................... 43

vii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Thành phần khuếch đại DNA ................................................................. 24
Bảng 3.2. Chu kì nhiệt thực hiện phản ứng PCR .................................................... 24
Bảng 4.1. Đặc điểm hóa sinh của các chủng vi khuẩn tuyển chọn ......................... 34
Bảng 4.2. Mật độ khuẩn lạc B. coagulans sau khi phân lập ................................... 35

viii


DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Bacillus coagulans chủng 36D1. .............................................................. 8
Hình 3.1. Chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa BAC+” ....................................................... 14
Hình 4.1. Hình ảnh khuẩn lạc của chủng vi khuẩn được phân lập ......................... 25
Hình 4.2. Hình thái tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi ........................................... 25
Hình 4.3. Khả năng di động của B1 ........................................................................ 26
Hình 4.4. Phản ứng MR .......................................................................................... 26
Hình 4.5. Phản ứng VP............................................................................................ 27
Hình 4.6. Khả năng thử citrate ................................................................................ 28
Hình 4.7. Khả năng khử nitrate ............................................................................... 28
Hình 4.8. Khả năng lên men sucrose....................................................................... 29
Hình 4.9. Khả năng sinh catalase ............................................................................ 29
Hình 4.10. Khả năng chịu acid của chủng vi khuẩn B1 .......................................... 30

Hình 4.11. Kết quả phân lập khả năng chịu muối mật ............................................ 31
Hình 4.12. Kết quả phản ứng lecithinase ................................................................ 32
Hình 4.13. Khả năng sinh gelatinse của chủng B1 ................................................. 32
Hình 4.14. Kết quả phân lập khả năng bám dính của B1 ở nồng độ 10-4 ............... 33
Hình 4.15. Hình ảnh phân lập vi khuẩn B. coagulans từ chế phẩm “Vi sinh
tiêu hóa BAC+”..................................................................................... 35
Hình 4.16. Sản phẩm PCR đoạn gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn .................... 36
Hình 4.17. Kết quả search Blast trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn
B1 trên GenBank................................................................................... 36

ix


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Giải nghĩa

µg

Microgram

µl

Microliter

ml

Milliter

nm

Nanometer

MR

Methyl Red

VP

Voges proskauer

MRS

De Man, Rogosa and Sharpe

ĐC

Đối chứng

FAO

Food and Agricultrure Organization of the United Nation

WHO

World Health Organization

Cs.

Cộng sự

PCR

Polymerase chain reaction

DNA

Deoxyribonucleic acid

RNA

Ribonucleic acid

SCFAs

Short-chan fatty acids

x


TÓM TẮT
Hiện nay, Bacillus coagulans là một trong những lợi khuẩn được sử dụng
để sản xuất các sản phẩm probiotics. Các sản phẩm chứa B. coagulans được ghi
nhận có khả năng ngăn ngừa các vấn đề tiêu hóa như táo bón, tiêu chảy, giảm
nhiễm trùng đường tiêu hóa và tăng cường hệ thống miễn dịch cho người và động
vật “Vi sinh tiêu hóa BAC+” là một trong những chế phẩm sinh học có chứa B.
coagulans nhằm giúp cá, tơm và tép phòng ngừa các bệnh về đường ruột hay ức
chế nấm, kí sinh trùng cho cá cảnh.Các sản phẩm này đặc biệt chúng an toàn đối

với con người và động vật, khơng những thế cịn rất thân thiện với mơi trường.
Trong đề tài này, tôi đã tiến hành phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn B.
coagulans và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh hóa và phân tử
để xác định và định lượng B. coagulans trong chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa
BAC+”. Kết quả nghiên cứu cho thấy, chủng vi khuẩn B1 được phân lập từ mẫu
chế phẩm đều thể hiện đặc điểm sinh học giống chủng vi khuẩn B. coagulans
(trực khuẩn gram dương, có khả năng phân giải CaCO3, khả năng di động,
catalase dương tính và khơng có khả năng khử nitrate, khử citrate, phản ứng âm
tính với lecithinase…). Và chủng vi khuẩn B1 được phân lập từ chế phẩm có
định lượng 1,6x108 Cfu/ml giống với kết quả của nhà sản xuất ghi trên bao bì
của “Vi sinh tiêu hóa BAC+” . Hơn thế nữa, chủng B. coagulans cịn có khả
năng chịu muối mật tốt nhất ở nồng độ 0.3% và có khả năng chịu acid dạ dày từ
pH2 – pH5.
Từ các kết quả đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân tử của chủng vi
khuẩn B1 có thể khẳng định rằng B1 là vi khuẩn Bacillus coagulan.

xi


PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Trong bộ quy tắc được xây dựng bởi tổ chức Nông Lương Liên hợp quốc

(Food and Agricultrure Organization of the United Nation (FAO)) và tổ chức Y
tế Thế giới (World Health Organization (WHO)) năm 2002 về đánh giá
probiotics trong thực phẩm, probiotics được định nghĩa là “các sinh vật sống
được đưa vào cơ thể với một lượng đủ sẽ mang lại lợi ích về sức khỏe cho vật
chủ” (Araya & cs., 2002). Các vi khuẩn probiotic giúp người và một số lồi

động vật có thể ngăn ngừa các bệnh đường ruột, chống nhiễm trùng đường tiết
liệu và sinh dục (Hilton & cs., 1992; Vanderhoof & cs., 1999; Allen & cs.,
2010), giảm nhiễm trùng đường hô hấp và dị ứng (Bengmark, 2000; Hatakka &
cs., 2001), tăng cường khả năng đề kháng với bệnh nhiễm trùng (Perdigon & cs.,
1995; Arunachalam and Chandra, 2000) và giúp ngăn chặn việc sinh trưởng của
hệ vi sinh vật khơng có lợi hay điều chỉnh trạng thái miễn dịch ở mô niêm mạc
khoang miệng (Meurman, 2005).Các vi khuẩn lactic như Lactobacillus,
Bifidobacterium,… là những vi sinh vật được dùng phổ biến trong sản xuất
probiotics. Tuy nhiên, những vi sinh vật này rất nhạy cảm với nhiệt độ và gần
như khơng thể sống sót trong quá trình xử lý nhiệt ở ngưỡng 75°C. Để khắc
phục được những hạn chế này, các nhà nghiên cứu sử dụng các vi sinh vật có lợi
có khả năng tạo bào tử nhờ khả năng hình thành bào tử, các vi
khuẩn Bacillus sống sót và ổn định trong các điều kiện khắc nghiệt cũng như
nhiệt độ cao. Một số lồi Bacillus khơng gây bệnh là lựa chọn lý tưởng để sản
xuất các sản phẩm probiotics.
B. coagulans là một trong những vi khuẩn thuộc chi Bacillus được sử
dụng để sản xuất các sản phẩm probiotics (Hong & cs., 2005). Cũng giống như
một số vi khuẩn Bacillus sp. khác, B. coagulans cũng là lồi vi khuẩn có khả
năng làm tăng cường sức đề kháng và bảo vệ cơ thể khỏi các hiện tượng nhiễm

1


trùng, cũng như điều trị tiêu chảy và có thể ngăn chặn một số mầm bệnh trong
ni trồng thủy sản.
Vì vậy, hiện nay việc sử dụng các sản phẩm probiotics cho người hay cho
động vật có chứa B. cogulans bắt đầu được quan tâm, khá phổ biến tại Việt
Nam. Nhiều nhà sản xuất đang sản xuất ra các sản phẩm có thành phần B.
coagulans dưới các dạng khác nhau, gồm dạng viên, dạng lỏng hay dạng bột;
nhưng phương pháp phát hiện và định lượng vi khuẩn B. coagulans có trong các

sản phẩm này hiện nay vẫn chưa được công bố rộng rãi. Vì vậy, việc nghiên cứu
thiết lập phương pháp phát hiện và định lượng vi khuẩn B. coagulans trong mẫu
chế phẩm vi sinh ở điều kiện Việt Nam là cần thiết, có ý nghĩa khoa học và ứng
dụng. Xuất phát từ lý do đó, tơi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập và nghiên
cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus coagulans từ chế phẩm “Vi
sinh tiêu hóa BAC+””.
1.2.

Mục tiêu và yêu cầu

1.2.1. Mục tiêu
- Tuyển chọn chủng và nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn
Bacillus coagulans phân lập từ chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa BAC+”.
- Xác định mức độ duy trì mật độ vi khuẩn B. coagulans trong chế phẩm.
1.2.2. Yêu cầu
- Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus coagulans từ chế phẩm “Vi sinh
tiêu hóa BAC+”.
- Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, đặc điểm hóa sinh của chủng vi
khuẩn được tuyển chọn.
- Định danh vi khuẩn B. coagulans được tuyển chọn chọn bằng kỹ thuật
phân tử.

2


1.3.

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

1.3.1. Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần cung cấp nguồn thơng tin quan
trọng về vi khuẩn B. coagulans.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đề tài được thực hiện sẽ góp phần bổ sung thơng tin về chủng vi khuẩn B.
coagulans. Đồng thời các kết quả nghiên cứu cũng có thể phục vụ cho mục đích
nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm sinh học có hiệu quả hơn trong tương lai.
Từ đó góp phần nâng cao năng suất sản xuất, nâng cao sức khỏe cho người và
động vật, bảo vệ môi trường.

3


PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus
Vi khuẩn Bacillus thuộc họ Bacillaceae, bộ Bacillales, lớp Bacilli, ngành
Firmicutes. Vi khuẩn Bacillus bao gồm các loài trực khuẩn, gram dương có tế
bào hình que với kích thước 0.5 x 1,2 - 10µm. Các tế bào thường xếp thành
chuỗi hoặc các cặp, đầu hơi vng hoặc trịn, di động nhờ tiêm mao. Tế bào của
các loài riêng lẻ thường có kích thước khá nhỏ. Ví dụ, tế bào của Bacillus
pumilus thường có kích thước 0,6 - 0,7 x 2,0 - 3,0 µm, trong khi tế bào của
Bacillus megaterium thường là 1,2 - 1,5 x 2,0 - 5,0 µm (Aldridge & cs., 1977).
Mỗi bào vi khuẩn Bacillus chỉ có một nội bào tử và nội bào tử có hình trụ
hoặc hình oval, tồn tại được trong các điều kiện bất lợi. Các bào tử của chúng có khả
năng tồn tại ở điều kiện khắc nghiệt (như chịu lạnh, chịu nhiệt và khử trùng). Vi
khuẩn dinh dưỡng theo kiểu hóa dưỡng hữu cơ, hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện nhưng
trong điều kiện hiếu khí hoạt động mạnh hơn. Các tế bào thường có hoạt tính
catalase dương tính. Nhiều lồi Bacillus có khả năng kháng nhiệt, các pH cực trị,
điều kiện khơ hạn, tính mặn, chất khử và các chất có hại khác (Logan & Vos, 2015).
Vi khuẩn Bacillus đều là lồi ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 - 45⁰C,
nhưng cũng có nhiều lồi ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65⁰C. Đa số Bacillus sinh

trưởng ở pH7, một số lại phát triển tốt trong môi trường pH 9 - 10 như Bacillus
alcalophillus, hay có lồi phù hợp với pH 2 - 6 như Bacillus acidocaldrius.
Các lồi thuộc chi Bacillus đều có các hình thái khác nhau và điều kiện
ni cấy, cũng như thành phần mơi trường khác nhau có ảnh hưởng đến đặc
điểm hình thành khuẩn lạc các vi khuẩn này. Tuy nhiên, mặc dù có sự đa dạng
như vậy, các khuẩn lạc Bacillus trên các mơi trường khác nhau thường khơng
khó nhận ra. Bề mặt khuẩn lạc trơn hoặc khô hoặc cũng có thể là nhầy hoặc kết
dính. Đường kính khuẩn lạc từ 2 – 7 mm; hình dạng khác nhau từ trịn đến
khơng đều với các mép ngun đến khơng gợn sóng, gấp khúc hoặc hình sợi;
chúng có kết cấu dạng hạt hoặc mờ, màu sắc thường là màu xám, trắng kem,
trắng đục (Logan & Vos, 2015).
4


Vi khuẩn Bacillus phân bố rộng rãi ở trong không khí, nước, đất do có
khả năng hình thành nội bào tử và sống hiếu khí, một số lồi cịn thấy trong
khoang miệng, trong đường ruột của người và động vật (Lương Đức Phẩm,
1998). Các lồi Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ chứa nitơ
như protein nhờ sinh ra protease ngoại bào. Ngồi ra, chúng cịn có khả năng
sinh ra amylase có thể phân giải tinh bột thành các dextrin và hỗn hợp các loại
đường khác nhau. Một số chủng thuộc lồi Bacillus subtilis, Bacillus
mesentericus… có thể có khả năng sinh ra enzym xenlulase và hemixenlulase có
thể phân hủy hay sinh bacteriocin (Lương Đức Phẩm, 1998).
 Vai trị của vi khuẩn Bacillus
Bacillus có khả năng phân giải phosphate khó tan, sinh tổng hợp các chất
kích thích sinh trưởng thực vật (như sinh IAA), đồng thời các chủng vi khuẩn
này có khả năng sinh ra enzyme ngoại bào (amylase, protase, cellulase,
chitinase) và các hợp chất đối kháng với tác nhân gây bệnh. Như vậy, có thể
thấy rằng, nhiều chủng vi khuẩn Bacillus sp. có tiềm năng trong việc sản xuất
các sản phẩm thương mại sử dụng trong việc kích thích sinh trưởng thực vật,

kiểm sốt sinh học và việc sử dụng chúng trong nông nghiệp đã được báo cáo
gần đây (Lacey & cs., 2001).
Đóng góp nguồn dinh dưỡng và enzym tiêu hóa: Bacillus sp. cịn cung
cấp nguồn dinh dưỡng trực tiếp cho vật nuôi đặc biệt như là acid béo và vitamin.
Đồng thời khi bổ sung Bacillus vào thức ăn sẽ hỗ trợ tiêu hóa do sản sinh ra các
enzym như: proteases, lipases, giúp cho quá trình tiêu hóa của vật chủ tốt hơn.
Ngồi ra, cịn có các vi khuẩn có thể sin acid như B. coagulans làm giảm pH
trong đường ruột, ức chế sự phát triển của các khuẩn có hại.
Tăng cường các phản ứng miễn dịch: cụ thể là khi phát hiện khi phát hiện
các vi khuẩn gây bệnh, vi khuẩn Bacillus sẽ phá vỡ cơ chế truyền tín hiệu của
chúng và ngăn chặn những tác động do virus gây hại nào cho vật chủ. Cơ chế
này giúp vi khuẩn Bacillus kháng lại vi khuẩn có hại và mang lại sự cân bằng
cho hệ vi sinh đường ruột của tôm cá.
5


Giúp cải thiện môi trường: Bacillus tiết ra enzyme phân hủy các chất như
carbonhydrate, chất béo và chất đạm thành những đơn vị nhỏ hơn. Chúng có khả
năng phân hủy các chất hữu cơ tích lũy trong nền đáy ao ni tơm cá. Ngồi ra,
Bacillus có tác dụng làm giảm hydro sulfua… trong ao tôm làm tăng năng suất
nuôi. Trong điều kiện kỵ khí, các acid amin khơng được vơ cơ hóa hồn tồn,
bởi bên cạnh amoniac và carbon dioxide cịn tích lũy nhiều loại hợp chất hữu cơ
khác như: acid hữu cơ, rượu, hydro sunfua và những dẫn suất của nó như
mecaptan, các chất độc như diamin và tomain, indon và scaton. Đây là lý do
ln phải duy trì hàm lượng oxy hòa tan cao, nhất là oxy ở đáy ao ln cao để
đảm bảo q trình phân hủy hữu cơ xảy ra hồn tồn. Ứng dụng Bacillus trong
ni trồng thủy sản làm tăng quá trình phân hủy hữu cơ, giảm các chất dư thừa
tích tụ đáy ao, giảm phát sinh khí độc và mùi hơi đáy ao.
Phần lớn các lồi Bacillus hầu như khơng hoặc có ít khả năng gây bệnh và
hiếm khi liên quan đến bệnh ở người hoặc động vật khác. Các trường hợp ngoại

lệ chính là Bacillus anthracis (bệnh than), Bacillus cereus (ngộ độc thực phẩm
và nhiễm trùng cơ hội), và Bacillus thuringiensis (gây bệnh cho động vật khơng
xương sống), nhưng một số lồi khác, đặc biệt là Bacillus licheniformis, có liên
quan đến ngộ độc thực phẩm và các nhiễm trùng người và động vật. Sự kháng
lại của các bào tử với nhiệt, bức xạ, chất khử trùng và hút ẩm cũng tạo ra
Bacillus các lồi là chất gây ơ nhiễm khó chịu trong phịng phẫu thuật, trên băng
vết thương, trong dược phẩm và thực phẩm (Alibek, 1999).
2.2. Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus coagulans
2.2.1. Giới thiệu chung
* B.coagulans là vi khuẩn Gram dương, có khả năng sinh tổng hợp acid
lactic. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng B. coagulans có thể tăng
cường khả năng hoạt động của các tế bào niêm mạc ruột, do đó cải thiện sự hấp
thụ chất dinh dưỡng thông qua sự phát triển tối ưu của khu vực hấp thụ của
nhung mao của con người và động vật (Kimmel & cs., 2010). Hiện nay, B.
6


coagulans được dùng làm chế phẩm sinh học sử dụng trong nuôi trồng thủy sản,
sản xuất men vi sinh, trong xử lí nước thải B. coagulans trong q trình sinh
trưởng có khả năng sinh ra acid lacitic nên tạo mơi trường pH thấp trong đường
ruột và dạ dày giúp cạnh tranh cũng như ngăn ngừa sự phát triển của các lồi vi
khuẩn khác đặc biệt là nhóm vi khuẩn gây bệnh.
* Lịch sử phát hiện
B. coagulans được phân lập từ sữa hỏng và mô tả đầu tiên vào năm 1915
bởi B. W. Hammer tại Trung tâm thí nghiệm nơng nghiệp lowa (Sarles &
Hammer, 1932). B. coagulans được biết đến như một loài vi khuẩn ưa acid và
chịu nhiệt trong quá trình trao đổi chất hiếu khí. Vào năm 1935, vi khuẩn B.
coagulans được phân lập và được mơ tả có đặc điểm điển hình của hai chi
Lactobacillus và Bacillus và được mô tả là Lactobacillus sporogenes trong ấn
phẩm lần thứ năm của Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Tuy nhiên

trong ấn phẩm lần thứ bảy của Bergey’s, cuối cùng B. coagulans đã được xác
định là thuộc chi Bacillus sp.
* Theo hệ thống phân loại trong “Bergey’s Manual of Systematic
Bacteriology”, tái bản lần thứ 2, năm 2001, vi khuẩn Bacillus coagulans được
phân loại như sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillacaeae
Chi: Bacillus
Loài: Bacillus coagulans
2.2.2. Đặc điểm hình thái
Khuẩn lạc của B.coagulans thường nhỏ, lồi, trịn, mép trơn, mờ, có đường
kính 2-5 mm, màu trắng, bề mặt trơn hoặc nhẵn.
7


B.coagulans là vi khuẩn Gram dương, các tế bào có dạng hình que với hai
đầu trịn. Vi khuẩn B. coagulans có khả năng sinh bào tử. Bào tử của B.coagulans
hình oval, elip, hình cầu, hình bầu dục, dài khoảng 0.9- 1.5 µm. Các tế bào vi
khuẩn B. coagulans có thể tồn tại đơn lẻ, theo cặp hoặc chuỗi. Trong môi trường
chứa hàm lượng đường tinh chế cao, vi khuẩn B. coagulans hiếm tạo bào tử. Nội
bào tử của vi khuẩn B. coagulans hình bầu dục nằm ở cực vi khuẩn và có khả năng
chịu nhiệt và điều kiện mơi trường có hại khác. Nội bào tử của B. coagulans có thể
sống trong dung dịch acid clohydric loãng hoặc natri hydroxit (Konuray &
Erginkaya, 2018). Do đó, các bào tử của B. coagulans có thể phát triển trong mơi
trường acid dạ dày với pH thấp để đến ruột non, nơi chúng có thể sinh trưởng.
Khoảng 85% bào tử đến được ruột. Tuy nhiên, B. coagulans khơng có khả năng tồn
tại lâu trong ruột mà chỉ có thể cư trú tạm thời trong ruột.

Vi khuẩn B. coagulans có thể di động và phát triển được trong điều kiện hiếu
khí, kị khí và có khả năng di động. Nhiệt độ thích hợp cho B. coagulans có thể sinh
trưởng và phát triển trong điều kiện nhiệt độ 33°C đến 45°C và pH 5,5 – 6,5.

(Nguồn: Mun & cs., 2011)
Hình 2.1. Bacillus coagulans chủng 36D1.
A.

Tế bào sinh dưỡng

B. Bào tử

C. Bào tử trưởng thành

8


2.2.3. Đặc điểm hóa sinh
B. coagulans có khả năng lên men sinh acid trong môi trường chứa
glycerol, mannitol, saccharose, glucose nhưng khơng sinh khí. Vi khuẩn B.
coagulans khơng tồn tại được trong môi trường NaCl. Vi khuẩn B. coagulans
phản ứng âm tính với lecithinase, gelatinase, catalase.
Chủng vi khuẩn B. coagulans có khả năng bám dính (Drago & Vecchi,
2009), khả năng chịu acid dạ dày, khả năng chịu muối mật (Hilton & cs., 1992).
Và chủng phản ứng dương tính với phản ứng VP, phản ứng MR nhưng khơng có
khả năng khử nitrate thành nitrit và không sử dụng nguồn biến dưỡng citrate.
2.2.4. Ứng dụng của Bacillus coagulans
 Ứng dụng Bacillus coagulans trong y học
Bacillus coagulans là một trong một số loài có khả năng hình thành nội
bào tử vậy nên nó có khả năng thích ứng trong điều kiện mơi trường khắc nghiệt

(Jurenka, 2012). Vì vậy, B.coagulans có tính ổn định cao trong sản xuất, bảo
quản, vận chuyển và quản lý, giúp chúng trở thành ứng cử viên phù hợp hơn cho
các công thức dược phẩm và thực phẩm (Elshaghabee & cs., 2017). B.
coagulans được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (GRAS) cơng
nhận là an tồn trong thực phẩm. B. coagulans cũng đã được Ủy ban Kế hoạch
hóa Gia đình và Sức khỏe Quốc gia của Trung Quốc phê duyệt dùng làm thức ăn
cho người. Hiện nay, B. coagulans đã thu hút nhiều sự chú ý cho các ứng dụng
trong y học. Một số chủng B.coagulans đã được chứng minh là mang lại nhiều
tác dụng có lợi như trong việc hệ vi sinh đường ruột và tiết ra chất kháng khuẩn
như acid lactic,… để ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh (Liu & cs.,
2022).
Vi khuẩn B. coagulans là vi khuẩn có khả năng tạo ra biofilm, một hợp
chất được xem như là chất xơ sinh học đóng vai trị quan trọng trong việc hỗ trợ
xử lý và phịng ngừa bệnh táo bón ở trẻ nhỏ. Mà trong cơ thể, việc bổ sung chất
xơ tự nhiên sẽ giúp đẩy lùi bệnh táo bón. Chất xơ sinh học được tạo ra từ B.
9


coagulans trong ruột sẽ có độ nhớt, làm tăng thể tích phân và kích thích nhu
động ruột để đẩy phân ra ngồi, làm chậm lại q trình tiêu hóa và do đó q
trình hấp thụ thức ăn được thực hiện triệt để hơn.
Ngồi ra, B. coagulans có thể sản xuất các chất chuyển hóa các chất khác
như diacetyl, axit béo chuỗi ngắn (Short-chan fatty acids (SCFAs) và nhiều loại
vitamin. B. coagulans cũng có thể kích thích nhu động ruột, hạn chế sản xuất
các chất có hại và cải thiện mơi trường trao đổi chất trong ruột. Chính điều này
đã thúc đẩy nhu động ruột khỏe mạnh và tránh tích tụ độc tố trong cơ thể
(Nyangale & cs., 2014).
Cho đến nay, hiệu quả của B. coagulans trong điều trị các bệnh đường
ruột ở người đã được chứng minh trong một số lượng lớn các thử nghiệm lâm
sàng. Các thí nghiệm độc tính và dữ liệu lịch sử về việc sử dụng lâu dài B.

coagulans cũng đã chứng minh sự an toàn tuyệt vời của nó. Xem xét tính ổn
định cao của B. coagulans trong sản xuất, lưu trữ, vận chuyển và quản lý do khả
năng hình thành bào tử của nó, B. coagulans chắc chắn sẽ đóng một vai trị quan
trọng hơn trong việc điều trị các bệnh đường ruột ở người bằng men vi sinh
trong tương lai.
 Ứng dụng B. coagulans trong nuôi trồng thủy sản
Hiện nay B. coagulans được dùng làm chế phẩm sinh học sử dụng trong
nuôi trồng thủy sản, chủ yếu là bổ sung vào thức ăn, tuy nhiên chúng cũng được
dùng trong xử lý nước.
B. coagulans có khả năng chống chịu lại sự bất lợi của yếu tố mơi trường
do chúng có khả năng sinh bào tử. Ví dụ như điều kiện nhiệt độ cao trong quá
trình sản xuất, thời gian và điều kiện lưu trữ, đặc biệt chúng cịn có thể tồn tại và
sinh trưởng tốt trong hệ tiêu hóa của động vật thủy sản . B. coagulans trong q
trình sinh trưởng có khả năng sinh ra acid lactic, đặc điểm này hiếm gặp
ở Bacillus. Điều này tạo môi trường pH thấp trong đường ruột và dạ dày giúp

10


cạnh tranh cũng như ngăn ngừa sự phát triển của các lồi vi khuẩn khác đặc biệt
là nhóm vi khuẩn gây bệnh.
Ngồi sản xuất axit lactic thì chúng cịn có khả năng sản xuất các enzym
ngoại bào như amylase, protease, lipase, cellulase, trong đó amylase, protease
cần thiết cho q trình tiêu hóa nguyên liệu thức ăn và có khả năng phát triển
trong chất nhầy ở dạ dày và ruột cá tơm vì lý do này mà B. coagulans rất thuận
lợi trong q trình sản xuất, giúp tối ưu hóa q trình tiêu hóa và hấp thu thức ăn
cho động vật thủy sản. Hơn nữa, chế phẩm sinh học còn được sử dụng rộng rãi
trong ni trồng thủy sản. Ví dụ, B. coagulans có thể cải thiện đáng kể trọng
lượng cuối cùng, tăng trọng hàng ngày và tăng trọng tương đối của tơm. Ngồi
ra, chế độ ăn có bổ sung B.coagulans có tác dụng tương tự đối với cá trắm cỏ.

B. coagulans giúp tăng cường hệ miễn dịch như tăng cường hoạt tính
lysozyme, hoạt tính chống oxy hóa, enzyme catalase hay tăng cường biểu hiện
gen miễn dịch như nhóm gen biểu hiện về yếu tố điều tiết phản ứng chống stress
oxy hóa và giải độc cơ thể, các cytokine sinh ra bởi các đại thực bào, các yếu tố
này đóng một vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch của cá, tơm. Ngồi ra,
vi khuẩn cịn giúp động vật thủy sản chống lại tác nhân gây bệnh với tỉ lệ bảo hộ
hơn 50%.
 Ứng dụng B. coagulans trong lĩnh vực chăn nuôi
Theo Jane Byrne nghiên cứu cho thấy việc ứng dụng B. coagulans trong
chăn nuôi đã cho kết quả tốt. Điển hình như B.coagulans có thể làm giảm tỷ lệ
tiêu chảy và cải thiện năng suất tăng trưởng của heo con. Điều đáng nói là
B.coagulans có tác dụng kích thích tăng trưởng đối với gà, có thể thơng qua việc
cải thiện sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột để cải thiện tỷ lệ chuyển đổi
thức ăn. Hơn nữa, B.coagulans không chỉ thể hiện tác dụng thúc đẩy tăng trưởng
ở gà thịt mà còn làm tăng hoạt động của protease và amylase. Chúng ta biết rằng
protease và amylase đóng một vai trị quan trọng trong q trình lên men của các
chất dinh dưỡng tương đối.
11


Việc bổ sung vi khuẩn B.coagulans trong thức ăn chăn ni có tác động
tích cực đến hiệu suất tăng trưởng và vi khuẩn đường ruột của lợn con cai sữa là
những phát hiện mới được nghiên cứu.
Vào năm 2022, Tiehu Sun và các cộng sự của mình đã thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu ảnh hưởng của Bacillus coagulans trong khẩu phần ăn đến năng
suất và hệ vi sinh vật đường ruột của heo con cai sữa”. Từ đó cho ra kết luận
rằng: việc bổ sung lượng Bacillus coagulans khác nhau vào chế độ ăn cơ bản
của heo con cai sữa giúp cải thiện năng suất tăng trưởng ở heo con (Jurenka,
2012). Ngồi ra cũng có nghiên cứu khác cho rằng B. coagulans có thể được sử
dụng kết hợp với men thủy phân, acid benzoic và dầu oregano để cải thiện đáng

kể năng suất tăng trưởng ở cả heo con cai sữa (Wu & cs., 2018) và lợn vỗ béo
đang phát triển (Fu & cs., 2019)
Nghiên cứu từ COFCO Feed Co Ltd. và New Hope Liuhe đã đánh giá
tính khả thi của vi khuẩn B. coagulans như một giải pháp thay thế cho kháng
sinh. Kết quả cho thấy rằng việc bổ sung lợi khuẩn đó vào chế độ ăn uống góp
đã phần cải thiện hiệu suất tăng trưởng và chỉ số tiêu chảy ở lợn con cai sữa.
Đồng thời các tác giả đã báo cáo sự đa dạng của vi sinh vật có lợi để bảo vệ sức
khỏe và có thể cải thiện đường ruột của lợn con.
Chỉ số tiêu chảy thường được sử dụng để đánh giá chuyển đổi thức ăn và
tình trạng sức khỏe đường ruột của lợn. Tiêu chảy ở lợn con cai sữa và sự tổn
thương chức năng của nó đối với đường tiêu hóa là các vấn đề cần giải quyết
trong chăn nuôi lợn con. Và hội chứng căng thẳng ở lợn con cai sữa là một trong
những số mối quan tâm chính trong quản lý chế độ ăn và cũng đã trở thành một
vấn đề quan trọng trong nguồn dinh dưỡng cung cấp cho lợn. Điều này dẫn đến
giảm lượng thức ăn ăn vào, tăng trưởng chậm và thậm chí tạo ra những con lợn
cịi cọc (Moser & cs., 2017). Các chất phụ gia với chức năng chống tiêu chảy,
những chất duy trì khả năng miễn dịch đường ruột và cân bằng vi khuẩn ở lợn

12


con là cần thiết để đảm bảo sự phát triển bền vững của chăn nuôi, sự phát triển
khỏe mạnh của lợn con cai sữa, bảo vệ môi trường và an tồn thực phẩm.
Tóm lại, những ưu điểm trên cho thấy B. coagulans là một lợi khuẩn khá
đặc biệt vì có cả các đặc điểm của Bacillus và Lactobacillus. Việc sử dụng B.
coagulans như một chế phẩm sinh học (probiotics) trong sản xuất men tiêu hóa
hay chế phẩm trong chăn ni, nuôi trồng thủy sản là một lợi thế hơn so với các
chủng vi khuẩn khác.

13

PHẦN III. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: Từ tháng 7/2022 đến tháng 2/2023.
- Địa điểm: Đề tài được thực hiện tiến hành tại phịng thí nghiệm thuộc
Bộ mơn Cơng nghệ vi sinh – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp
Việt Nam.
3.1.2. Đối tượng nghiên cứu
- Chủng vi khuẩn B. coagulans có trong chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa
BAC+”.

Hình 3.1. Chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa BAC+”
3.1.3. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
 Thiết bị:
-Kính hiển vi quang học, cân phân tích, cân kĩ thuật, box cấy, máy đo pH,
máy khuấy từ, máy li tâm lạnh, tủ nuôi vi sinh, lị vi sóng, tủ lạnh, máy lắc,…

14