Phân lập và nghiên cứu một số đặc điểm chủng vi khuẩn bacillus coagulans từ men tiêu hóa yobitic sachet

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

S

Ọ

-------  -------

U

T T

ĐỀ TÀ :
Â

VÀ

Ê

ỨU MỘT S

ĐẶ Đ ỂM

CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS COAGULANS TỪ
ME T ÊU

“Y B T

à ội, 2023

S

ET”


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

S

Ọ

-------  -------

U

T T

ĐỀ TÀ :
Â

VÀ

Ê

ỨU MỘT S

ĐẶ Đ ỂM

CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS COAGULANS TỪ
ME T ÊU

“Y B T

S

ET”

Sinh viên thực hiện

: TRẦN THỊ QUỲNH NGA

Lớp

: K62 CNSHC

Mã sinh viên

: 620604

Khoa

:

SINH HỌC

iản viên hƣớn d n : ThS. NGUYỄN THANH HUYỀN

à ội, 2023


LỜ

MĐ

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học do tôi thực
hiện trong thời gian từ 08/2022 – 02/2023 dưới sự hướng dẫn của ThS.
Nguyễn Thanh Huyền – giảng viên Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công
nghệ sinh học – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam.
Tất cả số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực
và chưa được cơng bố ở bất kỳ cơng trình nghiên cứu nào ở trong và ngồi
nước. Các tài liệu đã trích dẫn được nêu ở mục tài liệu tham khảo.
Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!
Hà nội, ngày...tháng..năm...
Sinh viên thực hiện

Trần Thị Quỳnh Nga

i


LỜI CẢM Ơ
Trong thời gian 6 tháng làm khóa luận tốt nghiệp tại Khoa Công nghệ
Sinh học Vi sinh – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, được sự quan tâm và dìu
dắt tận tình của các Thầy Cơ giáo, các cán bộ, anh chị tại phịng thí nghiệm
của khoa cùng với sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã có cơ hội củng cố và
rèn luyện kiến thức cũng như kỹ năng học tập để có thể hồn thành tốt khóa
luận của mình.
Tơi xin bày tỏ sự kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS. Nguyễn Thanh
Huyền đã định hướng nghiên cứu, tận tình chỉ dạy, giúp đỡ, hỗ trợ tơi trong
suốt q trình thực hiện khóa luận.
Tôi xin cảm ơn đến thầy PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh, PGS.TS Nguyễn

Văn Giang, cô Th.S Trần Thị Đào, cô Th.S Trần Thị Hồng Hạnh, nghiên cứu
viên Dương Văn Hoàn, Nguyễn Thị Thu đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực
hiện khố luận.
Cuối cùng tơi muốn gửi lời cảm ơn đến Bố, Mẹ, gia đình và bạn bè
đang thực hiện khố luận tại bộ môn Công nghệ vi sinh đã khuyến khích,
động viên, hỗ trợ, tạo điều kiện tốt nhất để tơi có thể hồn thành tốt khố luận
tốt nghiệp.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng

năm 2023.

Sinh viên

Trần Thị Quỳnh Nga

ii


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC VIẾT TẮT ..................................................................................... vi
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................... vii
DANH MỤC ẢNH ............................................................................................ viii
TÓM TẮT ............................................................................................................ ix
PHẦN I: MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề....................................................................................................... 1

1.2. Mục tiêu và yêu cầu ....................................................................................... 2
1.2.1. Mục tiêu....................................................................................................... 2
1.2.2. Yêu cầu........................................................................................................ 2
PHẦN II: TỔ

QU

TÀ

U ................................................................. 3

2.1. Lịch sử phát hiện và nghiên cứu .................................................................... 3
2.2. Đặc điểm hình thái, hóa sinh của B.coagulans .............................................. 5
2.3. Ứng dụng của các chế phẩm sinh học của Bacillus coagulans ..................... 7
2.3.1. Trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản ............................................................. 7
2.3.2. Trong lĩnh vực chăn nuôi ............................................................................ 8
2.3.3. Trong lĩnh vực y học ................................................................................... 9
2.3.4. Trong lĩnh vực thực phẩm ......................................................................... 11
2.4. Giới thiệu một số chế phẩm sinh học chứa B. coagulans ............................ 12
PHẦN III. V T LI U VÀ

ƢƠ

Á

Ê

ỨU ..................... 14

3.1. Vật liệu ......................................................................................................... 14

3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu................................................................ 14
3.3. Đối tượng nghiên cứu................................................................................... 14
3.4 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ..................................................................... 14
iii


3.5. Mơi trường và hóa chất ................................................................................ 14
3.6. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................. 15
3.6.1. Phân lập vi khuẩn B.coagulans từ chế phẩm men tiêu hóa “ Yobitic
sachet” ................................................................................................................. 15
3.6.2. Phương pháp nhuộm Gram ....................................................................... 17
3.6.3. Đặc điểm sinh hóa ..................................................................................... 17
3.6.4. Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp xác định định
trình tự nucleotide 16S rRNA ............................................................................. 21
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ T ẢO LU N ....................................................... 23
4.1. Kết quả phân lập Bacillus coagulans từ chế phẩm “ Yobitic sachet” ......... 23
4.2. Xác định vi khuẩn B. coagulans phân lập dựa vào đặc điểm hình thái ....... 23
4.2.1. Hình thái tế bào ......................................................................................... 24
4.3. Xác định vi khuẩn B. coagulans phân lập dựa vào đặc điểm sinh hóa........ 25
4.3.1. Phản ứng MR (Methyl Red)...................................................................... 25
4.3.2.Phản ứng VP (Voges-Proskauer) ............................................................... 26
4.3.3. Phản ứng catalase ...................................................................................... 26
4.3.4.Thử khả năng di động ................................................................................ 27
4.3.5. Khả biến dưỡng citrate .............................................................................. 28
4.3.6.Khả năng khử nitrate .................................................................................. 29
4.3.7. Thử nghiệm lên men sucrose .................................................................... 30
4.3.8. Thử khả năng sinh gelatinase .................................................................... 31
4.3.9. Khả năng sản sinh lecithinase ................................................................... 31
4.3.10. Khảo sát khả năng chịu acid dạ dày ........................................................ 32
4.3.11. Khảo sát khả năng chịu muối mật (Gilliand và Walker, 1990) .............. 33

4.3.12. Khảo sát khả năng bám dính trên ruột ( Trần Quốc Việt & cs 2009) ..... 35
4.4. Phương pháp đếm khuẩn lạc và tính tốn kết quả mật độ tế bào B.
coagulans . ........................................................................................................... 36
4.5. Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn ........................................................ 39
4.5.1. Khuếch đại trình tự DNA bằng phản ứng PCR ........................................ 39
iv


PHẦN V: KẾT QUẢ VÀ

ẾN NGHỊ ........................................................... 43

5.1. Kết luận ........................................................................................................ 43
5.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 43
TÀ

U THAM KHẢO ................................................................................ 44

PHỤ LỤC ........................................................................................................... 47

v


DANH MỤC VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Giải n hĩa

µg

Microgam

µl

Microliter

ml

Milliter

nm

Nanometer

MR

Methyl red

VP

Voges proskauer

MRS

De Man, Rogosa and Sharpe

ĐC

Đối chứng

FAO

Food and Agricultrure Organization of
the United Nation

WHO

World Health Organization

Cs.

Cộng sự

PCR

Polymerase chain reaction

DNA

Deoxyribonucleic acid

RNA

Ribonucleic acid

SCFAs

Short-chan fatty acids

B. coagulans

Bacillus coagulans

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Kết quả đo OD620nm của vi khuẩn B. coagulans ở nồng độ muối
mật 0,3% ở các mốc thời gian khác nhau ......................................... 34
Bảng 2. Mật độ khuẩn lạc B. coagulans sau khi phân lập .............................. 37
Bảng 3. Kết quả thử nghiệm sinh hóa của chủng được phân lập.................... 40

vii


DANH MỤC ẢNH
Hình 1. Tế bào vi khuẩn B. coagulans dưới kinh hiển vi điện tử. .................... 6
Hình 2. Chế phẩm sinh học “ Yobitic sachet” ................................................ 14
Hình 3. Pha lỗng mẫu rắn .............................................................................. 16
Hình 4. Chủng Bc được phân lập .................................................................... 23
Hình 5. Kết quả nhuộm gram tế bào vi khuẩn quan sát dưới kính hiển vi
độ phóng đại 1000X .......................................................................... 24
Hình 6. Thử nghiệm phản ứng MR với chủng vi khuẩn ................................. 25
Hình 7. Thử nghiệm phản ứng MR với chủng vi khuẩn ................................. 26
Hình 8. Khả năng sinh catalase của vi khuẩn ................................................. 27
Hình 9. Khả năng di động của chủng vi khuẩn ............................................... 28
Hình 10. Khả năng biến dưỡng citrate của chủng........................................... 29
Hình 11. Khả năng khử nitrate ........................................................................ 30
Hình 12. Khả năng lên men đường sucrose .................................................... 31
Hình 13. Khả năng sinh gelatinase.................................................................. 31

Hình 14. Kết quả khả năng sinh lecithinase .................................................... 32
Hình 15. Khả năng chịu acid của chủng vi khuẩn Bc ..................................... 33
Hình 16. Kết quả trang pH ở các nồng độ....................................................... 33
Hình 17. Kết quả trang muối mật của vi khuẩn sau 4 giờ ni cấy ở các
nồng độ .............................................................................................. 35
Hình 18. Kết quả cấy trang dịch thu được sau khi rửa ruột gà ....................... 36
Hình 19. Đặc tính sinh hóa của chủng Bacillus coagulans trong bài báo
nghiên cứu. ........................................................................................ 41

viii


T M TẮT

Bacillus coagulans là vi khuẩn có lợi cho hệ tiêu hóa. Chúng khơng chỉ
có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch, ngăn ngừa sự phát triển của các vi
khuẩn có hại, sự lây lan của virus, phịng chống chứng rối loạn tiêu hóa, mà
cịn có khả năng tạo ra màng biofilm giúp ngăn ngừa và điều trị bệnh táo bón,
đặc biêt ở trẻ nhỏ. Ngồi ra, với khả năng tổng hợp các enzyme, B. coagulans
cịn góp phần làm tăng cường khả năng hấp thu được nhiều dưỡng chất hơn từ
thức ăn. “Yobitic sachet” là một trong số chế phẩm sinh học của Công ty cổ
phần dược phẩm Medzavy có chứa B. coagulans giúp bổ sung vi khuẩn có
ích, hỗ trợ duy trì hệ vi sinh đường ruột, giảm rối loạn tiêu hóa do loạn khuẩn
đường ruột, đồng thời kích thích tiêu hóa, giúp ăn ngon, tăng cường sức khỏe.
Chính vì vậy, đề tài này được thực hiện nhằm xác định được đặc
điểm hình thái, đặc điểm sinh hóa đặc trưng, xác định mật độ, của chủng B.
coagulans có trong chế phẩm sinh học từ đó có thể mang lại những thơng
tin hữu ích cho việc tiếp tục nghiên cứu sản xuât, đánh giá các chế phẩm
sinh học có chứa B. coagulans. Trong nghiên cứu này, vi khuẩn B.
Coagulans giả định có khuẩn lạc màu trắng sữa, hình trịn, bề mặt hơi lồi,

mép trơn , tế bào hình que, bào tử có dạng hình oval, elip, hình cầu, hình
bầu dục. Hơn nữa, chủng vi khuẩn B. coagulans giả định được đánh giá các
phản ứng hóa sinh và cho thấy chúng thể hiện khả năng di động, bám dính,
chịu muối mật, tồn tại được trong mơi trường có pH từ 2,5 đến 5,5, đồng
thời chúng cũng có thể sinh catalase, nhưng lại âm tính khi thử phản ứng
sinh lecithinase, citrate, nitrate. Như vậy, dựa vào các đặc tính sinh hóa
cùng với kết quả giải trình tự gen rRNA, chủng vi khuẩn B. coagulans giả
định có thể được khẳng dịnh là chủng Bacillus coagulans và chủng này duy
trì mật độ 1x 109trong chế phẩm “ Yobitic sachet”.

ix


PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trên thị trường hiện nay có rất nhiều các chủng vi sinh được sử dụng
trong các chế phẩm sinh học, trong số đó phải kể đến các chủng Bacillus sp.
có rất nhiều đặc điểm đang được các nhà khoa học nghiên cứu. Vi khuẩn
Bacillus là một trong những lợi khuẩn có khả năng tổng hợp nhiều loại enzym
tiêu hóa, hỗ trợ hiệu quả trong việc hấp thu thức ăn ở người và động vật, đào
thải các chất cặn bã ra ngoài cơ thể, từ đó giúp cho hệ tiêu hóa hoạt động khỏe
mạnh hơn. Ngồi ra, nhiều loại vi khuẩn Bacillus sp. cịn có khả năng tiết ra
các chất kháng khuẩn, các kháng sinh tự nhiên để tiêu diệt những vi khuẩn
gây hại, loại trừ mầm bệnh, chống tiêu chảy, ngăn ngừa viêm ruột, kích thích
miễn dịch và làm cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột.
Hiện nay có hơn 40 lồi Bacillus đã được xác định. Trong đó một số
lồi đã được thương mại hóa như: B. cereus, B. clausii, B. coagulans, B.
licheniformis, B. polyfermenticus, B. pumilus và B. subtilis. Hiện nay B.
coagulans đang là một loại lợi khuẩn được quan trọng được quan tâm nghiên
cứu và sản xuất các loại men vi sinh nhờ khả năng tạo ra coagulins có tác

dụng tạo pH cho đường ruột và ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn có hại,
từ đó chúng được ứng dụng trong q trình sản xuất men vi sinh. Ngồi ra, B.
coagulans cịn sản sinh các enzyme ngoại bào góp phần làm tăng cường khả
năng hấp thu được nhiều dưỡng chất hơn từ thức ăn. Vì vậy men vi sinh có
chứa B. coagulans có thể được dùng làm thực phẩm chức năng giúp tăng
cường miễn dịch, bổ sung hệ vi khuẩn có lợi cho đường ruột. B. coagulans
sinh bào tử và bào tử của chúng có thể tồn tại bền vững trong acid của dịch vị
dạ dày nên nó có thể đi qua dạ dày một cách an toàn, khi tới ruột sẽ trở thành
vi khuẩn có lợi cho hệ tiêu hóa.
Men vi sinh B. coagulans đã được Cục Quản lý An toàn Thực phẩm và
thuốc của Mỹ FDA phê duyệt và được xác định là đủ điều kiện sử dụng cho
các mục đích y dược. Ngồi ra chúng được dùng để bổ sung vào thực phẩm
1


nấu chín, thức ăn trực tiếp trong sản xuất chăn nuôi như ở lợn, gia súc, gia
cầm và tôm, cá.
Như vậy, với những đặc tính nổi trội của B. coagulans có được thì việc
nghiên cứu phát triển các chế phẩm sinh học có chứa B. coagulans trong các
chế phẩm probiotic là một khâu vô cùng quan trọng và cần thiết. Xuất phát từ
những lý do đó, đề tài “Phân lập và nghiên cứu một số đặc điểm chủng vi
khuẩn Bacillus couagulans từ men tiêu hóa “Yobitic sachet” được thực hiện.
1.2.Mục tiêu và yêu cầu
1.2.1. Mục tiêu
• Tuyển chọn được chủng vi khuẩn B. coagulans từ các chế phẩm sinh
học như: men tiêu hóa “Yobitic sachet”.
• Đánh giá một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
1.2.2. Yêu cầu
- Phân lập được được chủng vi khuẩn B. coagulans từ chế phẩm và định
danh các chủng B.coagulans bằng phương pháp giải trình tự gen.

- Xác định được một số đặc tính sinh học, mật độ của vi khuẩn B.
coagulans có trong chế phẩm bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc trên
đĩa thạch.

2


PHẦN II: TỔNG QUAN TÀ

U

2.1. Lịch sử phát hiện và n hiên cứu
B. coagulans là vi khuẩn gram dương, hô hấp tùy tiện, chúng có khả
năng sinh bào tử, sinh acid lactic và khơng gây bệnh (Aşan Ưzüsağlam & cs,
2010). B. coagulans có khả năng chịu nhiệt, chúng sinh trưởng tốt nhất ở
nhiệt độ từ 35 đến 50 °C và độ pH tăng trưởng tối ưu là 5,5 đến 6,5. Nhiều
nghiên cứu cho thấy, B. coagulans còn mang các đặc điểm đặc trưng của các
vi sinh vật thường được sử dụng để sản xuất men vi sinh (Karri & cs, 2016).
Một số báo cáo khẳng định rằng, việc sử dụng B. coagulans thường
xuyên làm tăng cường sự hoạt động của các tế bào niêm mạc ruột, từ đó làm
giảm viêm, cải thiện sự hấp thụ chất dinh dưỡng thông qua sự phát triển tối
ưu của khu vực hấp thụ của nhung mao (Kimmel & cs, 2010). Ngồi ra, B.
coagulans cịn có thể sản xuất các chất chuyển hóa như diacetyl, axit béo
chuỗi ngắn (SCFAs) và vitamin. Đồng thời B.coagulans cũng có thể ức chế
sự phát triển của các vi sinh vật có hại và cải thiện mơi trường trao đổi chất
trong ruột. Chính điều này thúc đẩy nhu động ruột khỏe mạnh và tránh tích tụ
độc tố trong cơ thể (Nyangale, Farmer, Keller, Chernoff & Gibson, 2014).
B.coagulans đã được (FDA) (Cục quản lí thực phẩm và Dược phẩm Hoa
Kỳ) cấp trạng thái Được Cơng nhận Chung là An tồn (GRAS. Ngồi ra, phân
tích bộ gen của B.coagulans cho thấy rằng các gen liên quan đến kháng thuốc

kháng sinh ở loài này không dễ dàng chuyển sang vi khuẩn khác và khơng có
gen nào khác có rủi ro an tồn tiềm ẩn được phát hiện (Salvetti & cs, 2016).
Hiện nay, B. coagulans được dùng làm chế phẩm sinh học trong nuôi
trồng thủy sản, sản xuất men vi sinh cho người và động vật, trong xử lí nước
thải… Vi khuẩn B. coagulans trong q trình sinh trưởng có khả năng sinh ra
acid lacitic. Điều này giúp tạo môi trường pH thấp trong đường ruột và dạ dày
giúp cạnh tranh cũng như ngăn ngừa sự phát triển của các loài vi khuẩn khác
3


đặc biệt là nhóm vi khuẩn gây bệnh. Ngồi sản xuất axit lactic thì chúng cịn
khả năng sản xuất các enzyme ngoại bào như amylase, protease, lipase,
celluase, trong đó có amylase, protease được sản sinh cao nhất. Những
enzyme này rất cần thiết cho q trình tiêu hóa thức ăn và có khả năng phát
triển trong chất nhầy ở dạ dày và ruột cá tơm. Amylase ở dạng α-amylase có
khả năng chịu nhiệt, vì lí do này mà việc bổ sung vi khuẩn B. coagulans rất
thuận lợi trong quá trình sản xuất và giúp tối ưu hóa q trình tiêu hóa và hấp
thụ thức ăn cho động vật và thủy sản.
Năm 1915, B. coagulans được phân lập lần đầu tiên từ sữa đóng hộp hư
bởi Hammer (Weerkamp, 1991). Năm 1935, B. coagulan được phân lập và
mô tả trong ấn bản thứ năm của Bergey's Manual of Systematic Bacteriology
với tên gọi Lactobacillus sporogenes. B. coagulans mang những đặc điểm
điển hình cả cả hai chi vi khuẩn chi Lactobacillus và Bacillus.
Nghiên cứu phân loại sau đó đã chứng minh rằng lồi này nên được
phân loại trong chi Bacillus (Drago & Vecchi, 2009).
Theo hệ thống phân loại trong (Bergey’s Manual of Systematic
Bacteriology, tái bản lần 2, 2001), vi khuẩn Bacillus coagulans thuộc:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli

Bộ: Bacillales
Họ: Bacillacaeae
Chi: Bacillus
Loài: Bacillus coagulans
Muhammed Majeed và cs của mình năm 2019 đã thực hiện nghiên cứu:
“Đánh giá khả năng tồn tại của men vi sinh Bacillus coagulans MTCC 5856
sau khi pha trà, cà phê và sự phát triển của nó trong mơi trường khơng thuận
lợi của đường tiêu hóa”. Từ đó đưa ra kết luận rằng: các bào tử của B.

4


coagulans có thể tồn tại ở nhiệt độ cao được sử dụng để bổ sung vào trà hoặc
cà phề mà k ảnh hưởng đến tính cảm quan của sản phẩm.
Năm 2019 Nasim Adibpour và cs đã thực hiện nghiên cứu và khẳng
định rằng các bào tử Bacillus được bổ sung vào thực phẩm
Jiang Cao và cs của mình năm 2020 đã tiến hành nghiên cứu: “ Đánh
giá đặc tính lợi khuẩn của Bacillus coagulans và những tác động liên quan
đến sức khỏe và bệnh tật của con người”. Từ đó đưa ra kết luận rằng: tác dụng
của lợi khuẩn, B. coagulans đã cho thấy tiềm năng to lớn trong việc điều trị
các bệnh khác nhau ở người.
Nghiên cứu mới nhất về B. cogulans năm 2022 do tác giả Tiehu Sun và
các cs của mình đã tiến hành: “ Nghiên cứu ảnh hưởng của Bacillus
coagulans trong khẩu phần ăn đến năng suất và hệ vi sinh vật đường ruột của
heo con cai sữa”. Từ đó cho ra kết luận rằng: việc bổ sung lượng Bacillus
coagulans khác nhau vào chế độ ăn cơ bản của heo con cai sữa giúp cải thiện
năng suất tăng trưởng ở heo con ( Jurenka, 2012 ). Ngồi ra cũng có nghiên
cứu khác cho rằng Bacillus coagulans có thể được sử dụng kết hợp với men
thủy phân, axit benzoic và dầu oregano để cải thiện đáng kể năng suất tăng
trưởng ở cả heo con cai sữa (Wu & cs, 2018 ) và lợn vỗ béo đang phát triển (

Fu & cs, 2019 )
2.2. Đặc điểm hình thái , hóa sinh của B.coagulans
B.coagulans là vi khuẩn gram dương, kỵ khí, có khả năng di động, có tế
bào hình que, kích thước khoảng 0,9 x 3,0 đến 5,0 µm, các tế bào thường xuất
hiện đơn lẻ, hiếm khi tạo thành chuỗi ngắn và có khả năng hình thành nội bào
tử. Nội bào từ hình bầu dục và được hình thành sau khi khuẩn lạc được nuôi
cấy ở 37oC trong 48 giờ. Khuẩn lạc của B. coagulans có hình hình tròn hoặc
dẹt , bề mặt khuẩn lạc lồi, mép trơn, khuẩn lạc có đường kính 1-7 mm, màu
trắng sữa, sau đó chuyển thành màu kem theo thời gian, bề mặt khuẩn lạc lồi.
Với khả năng hình thành bào tử, Bacillus có thể tồn tại được trong các mơi
trường khắc nghiệt có nhiệt độ cao cũng như nồng độ acid cao trong dạ dày.
5


B

A

C
Chú thích:
A: tế bào sinh dưỡng.
B: tế bào bào tử.
C: bào tử trưởng thành.
ình 1. Tế bào vi khuẩn B. coagulans dƣới kinh hiển vi điện tử.
Trong quá trình tăng trưởng, B.coagulans có thể sử dụng các nguồn
cacbon như: glucose, sucrose, maltose và mannitol để tạo ra axit L-lactic.
Biotin và thiamine là những yếu tố tăng trưởng chính thúc đẩy sự phát triển
của B. coagulans ( Sneath & cs, 1986) , (Weerkamp, 1991 ) . B. coagulans có
khả năng bám dính và khả năng kháng khuẩn ( Drago & Vecchi, 2009 ).
Các nghiên cứu cho thấy chủng B. coagulans có những đặc điểm sinh

lý, hóa sinh đặc trưng như thủy phân tinh bột, thủy phân gelatine, không sử
dụng citrate, không khử nitrate thành nitrite, dương tình với catalase và dương
tính với MR-VP. Có khả nặng chịu muối mật và acid cao trong dạ dày. Ngoài
ra B. coagulans được xác định có tồn tại và phát triển trên lớp chất nhầy trong
ruột của tơm cá. Điều này góp phần vào duy trì mật số vi khuẩn B. coagulans
trong đường ruột để đạt hiệu quả tiêu hóa thức ăn cao nhất, cũng như khả
năng tăng cường miễn dịch.

6


2.3. Ứng dụng của các chế phẩm sinh học của Bacillus coagulans
2.3.1. Trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản
Hiện nay B.coagulans được dùng làm chế phẩm sinh học sử dụng trong
nuôi trồng thủy sản, chủ yếu là bổ sung vào thức ăn, tuy nhiên chúng cũng
được dùng trong xử lý nước thải.
B. coagulans có khả năng chống chịu lại sự bất lợi của yếu tố mơi
trường do chúng có khả năng sinh bào tử. Ví dụ như điều kiện nhiệt độ cao
trong quá trình sản xuất, thời gian và điều kiện lưu trữ, đặc biệt chúng cịn có
thể tồn tại và sinh trưởng tốt trong hệ tiêu hóa của động vật thủy sản. B.
coagulans trong q trình sinh trưởng có khả năng sinh ra axit lactic, đặc
điểm này hiếm gặp ở Bacillus. Điều này tạo môi trường pH thấp trong đường
ruột và dạ dày giúp cạnh tranh cũng như ngăn ngừa sự phát triển của các loài
vi khuẩn khác đặc biệt là nhóm vi khuẩn gây bệnh. Với những vai trị trên nên
B. coagulans có thể được sử dụng để làm chế phẩm sinh học sử dụng trong
thủy sản và xử lý tnước thải
Khi các loại thủy sản được bổ sung các chế phẩm này thì cho thấy sự
gia tăng nhung mao trong đường ruột động vật thủy sản, giúp làm tăng diện
tích tiếp xúc của chất dinh dưỡng, đồng thời các tế bào biểu mô liên kết chặt
chẽ giúp cho hệ đường ruột của động vật thủy sản khỏe mạnh hơn, giúp hạn

chế ảnh hưởng của nhóm vi khuẩn khơng có lợi trong đường ruột. Bên cạnh
đó, B. coagulans còn sản xuất ra các enzyme cần thiết giúp cho các loại thủy
sản dễ dàng tiêu hóa thức ăn. Bên cạnh đó, chủng vi khuẩn này cịn giúp tăng
cường hệ miễn dịch đường ruột. Nhiều báo cáo đã cho thấy rằng, việc sử dụng
B. coagulans là an tồn, khơng có bất kỳ ảnh hưởng nào đến thủy sản.
Hơn nữa, chế phẩm sinh học còn được sử dụng rộng rãi trong ni
trồng thủy sản. Ví dụ, B. coagulans có thể cải thiện đáng kể trọng lượng cuối
cùng, tăng trọng hàng ngày và tăng trọng tương đối của tơm. Ngồi ra, chế độ
ăn có bổ sung B.coagulans có tác dụng tương tự đối với cá trắm cỏ.

7


B. coagulans giúp tăng cường hệ miễn dịch nhưng tăng cường hoạt tính
lysozyme, hoạt tính chống oxy hóa, enzyme catalase hay tăng cường biểu
hiện gen miễn dịch như nhóm gen biểu hiện về yếu tố điều tiết phản ứng
chống stress oxy hóa và giải độc cơ thể, các cytokine sinh ra bởi các đại thực
bào, các yếu tố này đóng một vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch của
cá, tơm. Ngồi ra, vi khuẩn cịn giúp các loại thủy sản chống lại tác nhân gây
bệnh với tỉ lệ bảo vệ hơn 50%.
Trong một số báo cáo về sử dụng B. coagulans thì nhóm nghiên cứu đã
đánh giá và có kết luận rằng chúng an tồn, khơng có bất kỳ dấu hiệu ảnh
hưởng đến sức khỏe cá. cũng như khơng có các triệu chứng bệnh lý hay gây
chết nào. Kết quả tương tự cũng được báo cáo ở một số nghiên cứu trên nuôi
tôm nuôi thương thẩm và tôm ở giai đoạn giống.
2.3.2. Trong lĩnh vực chăn nuôi
Theo nghiên cứu của tác giả Jane Byrne nghiên cứu cho thấy việc ứng
dụng B. coagulans trong chăn nuôi đã cho kết quả tốt. Ví dụ, B.coagulans có
thể làm giảm tỷ lệ tiêu chảy và cải thiện năng suất tăng trưởng của heo con.
Điều đáng nói là B.coagulans có tác dụng kích thích tăng trưởng đối với gà,

có thể thơng qua việc cải thiện sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột để
cải thiện tỷ lệ chuyển đổi thức ăn. Hơn nữa, B.coagulans không chỉ thể hiện
tác dụng thúc đẩy tăng trưởng ở gà thịt mà còn làm tăng hoạt động của
protease và amylase . Chúng ta biết rằng protease và amylase đóng một vai
trị quan trọng trong q trình lên men của các chất dinh dưỡng tương đối.
Đối với gà địa phương, chẳng hạn như gà vàng Quảng Tây, việc bổ sung B.
coagulans có thể cải thiện hiệu suất tăng trưởng của chúng và cho thấy tác
động tích cực đến chất lượng thịt.
Việc bổ sung vi khuẩn B.coagulans trong thức ăn chăn ni có tác động
tích cực đến hiệu suất tăng trưởng và vi khuẩn đường ruột của lợn con cai sữa
là những phát hiện mới được nghiên cứu.

8


Một nghiên cứu của Trung Quốc với sự tham gia của các nhà nghiên
cứu từ COFCO Feed Co Ltd. và tập đồn New Hope Liuhe đã đánh giá tính
khả thi của vi khuẩn B. coagulans như một giải pháp thay thế cho kháng sinh.
Kết quả cho thấy rằng việc bổ sung lợi khuẩn đó vào chế độ ăn uống
góp đã phần cải thiện hiệu suất tăng trưởng và chỉ số tiêu chảy ở lợn con cai
sữa. Đồng thời các tác giả đã báo cáo sự đa dạng của vi sinh vật có lợi để bảo
vệ sức khỏe và có thể cải thiện đường ruột của lợn con.
Chỉ số tiêu chảy thường được sử dụng để đánh giá chuyển đổi thức ăn
và tình trạng sức khỏe đường ruột của lợn. Tiêu chảy ở lợn con cai sữa và sự
tổn thương chức năng của nó đối với đường tiêu hóa là các vấn đề cần giải
quyết trong chăn nuôi lợn con. Hội chứng căng thẳng ở lợn con cai sữa là một
mối quan tâm chính trong quản lý chế độ ăn và cũng đã trở thành một vẫn đề
cốt lõi trong dinh dưỡng lợn. Điều này dẫn đến giảm lượng thức ăn ăn vào,
tăng trưởng chậm và thậm chí tạo ra những con lợn còi cọc (Moser & cs,
2017). Các chất phụ gia với chức năng chống tiêu chảy, những chất duy trì

khả năng miễn dịch đường ruột và cân bằng vi khuẩn ở lợn con là cần thiết để
đảm bảo sự phát triển bền vững của chăn nuôi, sự phát triển khỏe mạnh của
lợn con cai sữa, bảo vệ môi trường và an toàn thực phẩm.
2.3.3. Trong lĩnh vực y học
B.coagulans là thành phần trong các sản phẩm men tiêu hóa và thực
phẩm bảo vệ sức khỏe giúp điều chỉnh quá trình tiêu hóa cũng như tăng cường
sức đề kháng cho cơ thể. Men vi sinh là chế phẩm chứa các vi sinh vật có lợi
hay cịn gọi là lợi khuẩn, được chỉ định dùng khi bị loạn khuẩn, rối loạn tiêu
hóa, thiếu hụt lợi khuẩn, trẻ dùng kháng sinh kéo dài… Các lợi khuẩn trong
men vi sinh khi vào đường ruột giúp cân bằng hệ vi sinh đường ruột, ổn định
các vấn đề tiêu hóa. Có nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng B.coagulans có
thể tăng cường đáng kể sức khỏe của các tế bào niêm mạc ruột bằng cách giảm
viêm, do đó cải thiện sự hấp thụ chất dinh dưỡng thông qua sự phát triển tối ưu
của khu vực hấp thụ của nhung mao ( Kimmel & cs, 2010 ).
9


Ngồi việc sản xuất các enzym tiêu hóa, B.coagulans có thể sản xuất
các chất chuyển hóa như diacetyl, axit béo chuỗi ngắn (SCFAs) và vitamin.
B.coagulans cũng có thể kích thích nhu động ruột, giảm sản xuất các chất
có hại và cải thiện mơi trường trao đổi chất trong ruột. Chính điều này
thúc đẩy nhu động ruột khỏe mạnh và tránh tích tụ độc tố trong cơ thể
( Nyangale & cs, 2014 ).
Một nghiên cứu về ảnh hưởng của B.coagulans đối với nhu động ruột ở
người bệnh cho thấy việc sử dụng B.coagulans có thể giảm táo bón hiệu quả,
cải thiện cảm giác giữ phân và cải thiện môi trường ruột so với nhóm đối
chứng (Kimiko & cs, 2015 ). B.coagulans cũng đã được chứng minh là cải
thiện tần suất đi tiêu, cải thiện hình dạng và màu sắc của phân và cải thiện
mùi phân ( Ara & cs, 2002 ). Do đó, việc sử dụng các sản phẩm men vi sinh
có chứa bào tử lợi khuẩn B.coagulans sẽ rất hiệu quả với những người mắc

chứng táo bón, rối loạn tiêu hóa, trong đó có trẻ nhỏ.
Đặc biệt, B.coagulans là vi khuẩn Bacillus duy nhất vừa có khả năng
hình thành bào tử vừa có khả năng sản sinh acid lactic có tác dụng làm giảm
độ pH, đưa môi trường về trạng thái acid nhẹ. Đây là điều kiện môi trường rất
tốt cho lợi khuẩn đường ruột phát triển và ngăn ngừa sự phát triển của các vi
khuẩn có hại; đồng thời tăng cường khả năng hấp thu, cải thiện tình trạng
biếng ăn ở trẻ.
Ngoài ra B.coagulans được biết đến là một loại vi khuẩn được dùng
tương tự như Lactobacillus và probiotic khác như vi khuẩn có ích. Bên cạnh
đó, người ta cịn dùng B. Coagulans nhằm để điều trị những tình trạng bệnh lý
như: những vấn đề về đường tiêu hóa, tiêu chảy trong đó bao gồm tiêu chảy
do virus ở trẻ em, tiêu chảy do kháng sinh gây ra, tiêu chảy ở người đi du lịch
đến nơi khác , bệnh viêm đại tràng Clostridium difficile và một số hội chứng
và bệnh lý về đường ruột khác.

10


2.3.4. Tron lĩnh vực thực phẩm
Trong những năm gần đây, sản xuất sinh học nhiều chất chuyển hóa
(như etanol, axit lactic, axit fumaric, axit xylonix và các sản phẩm quan trọng
khác) đã thu hút được sự chú ý nhiều hơn so với sản xuất hóa học bằng
nguyên liệu dầu mỏ .
Trong số các chất chuyển hóa này, acid lactic là một sản phẩm quan
trọng dựa trên năng suất cao của nó. Do nhu cầu về vật liệu phân hủy sinh học
và tương thích sinh học, sự quan tâm đến axit lactic ngày càng tăng.
B.coagulans là vi sinh vật lý tưởng trong sản xuất axit lactic công nghiệp do
khả năng lên men glucose và xylose thành axit lactic trong điều kiện yếm khí
ở nhiệt độ dưới 50°C . Trong nhiều nghiên cứu, việc sản xuất acid lactic từ B.
coagulans được thực hiện bằng bã mía , nước lúa miến , chiết xuất cà phê ,

rơm lúa mì , lõi ngơ , chất thủy phân lignocellulose và bột ngô làm chất nền.
β-galactosidase được sử dụng để thủy phân đường sữa trong công
nghiệp thực phẩm. Nó được tìm thấy phổ biến trong tự nhiên và được phân
lập từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Nó là một loại enzyme được sử dụng
rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Sản xuất enzyme
này từ vi sinh vật cho phép năng suất cao hơn và lợi thế công nghệ lớn hơn so
với các nguồn khác. β-galactosidase cũng có thể được sản xuất bởi một số loại
men (Kluyveromyces lactis và Kluyveromyces marxianus), nấm mốc
(Aspergillus niger và Aspergillus oryzae) và vi khuẩn (B. circulans , E. coli ,
Lactobacillus

bulgaricus

,

Lactobacillus

ưa

nhiệt

,Geobacillus

stearothermophilus), bên cạnh đó α-galactosidase là enzym quan trọng trong
công nghiệp thực phẩm, được sử dụng nhiều ứng dụng, đặc biệt trong sản
xuất đường, công nghệ sinh học và y học. Việc sử dụng quan trọng nhất trong
ngành công nghiệp thực phẩm là sản xuất đường. α-galactosidase cũng có thể
tạo điều kiện thuận lợi cho q trình tiêu hóa các loại đậu, chẳng hạn như đậu
tương, thông qua việc loại bỏ các galactoside như raffinose và stachyose khỏi
cấu trúc của chúng và tăng cường khả năng tạo gel của galactomannans. Một

số nghiên cứu đã báo cáo về α-galactosidase được sản xuất bởi B. coagulans.
11


Đã có báo cáo rằng B.coagulans có hoạt tính phân giải protein. Trong
nhiều nghiên cứu, việc sản xuất α-amylase được thực hiện bằng cách sử dụng
B. coagulans. Có một mối quan tâm lớn trong việc sản xuất lipase từ vi sinh
vật, mặc dù sự hiện diện của lipase trong nhiều lồi động vật, thực vật và vi
sinh vật. Nó được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm cũng
như trong ngành dược phẩm, dệt may và mỹ phẩm .
Xylanase được sử dụng rộng rãi trong quá trình làm trong của nước ép
trái cây và rượu vang. Một số nghiên cứu đã được thực hiện để sản xuất
xylanase bởi B. coagulans .
2.4. Giới thiệu một số chế phẩm sinh học chứa B. coagulans
Hiện tại, việc sử dụng các sản phẩm probiotic đang rất phổ biến tại Việt
Nam. Nhiều nhà sản xuất đang chạy đua sản xuất ra các sản phẩm probiotic
dưới các dạng khác nhau, gồm dạng viên, dạng lỏng hay dạng bột bởi các
probiotics dễ sản xuất và không phải tuân theo các quy chuẩn chất lượng
nghiêm ngặt. Các sản phẩm này được cấp phép bởi Bộ Y tế như các sản phẩm
hỗ trợ điều trị với công dụng công bố từ việc ngăn ngừa tiêu chảy, ngộ độc
thực phẩm cho tới kích thích hệ miễn dịch.
Một số thông tin về sản phẩm probiotic bắt buộc phải công bố trên
nhãn chỉ bao gồm tên loài của chủng probiotics và số lượng tế bào sống (cfu)
trong một gram chế phẩm mà khơng hề cần tên chủng chính xác cũng như các
đặc tính probiotic. Trong thực tế, có bằng chứng khoa học cho thấy rằng các
thuộc tính probiotic là đặc hữu của mỗi chủng chứ không là đặc điểm chung
của một loài vi sinh vật (Arayaet & cs, 2002).
Hơn nữa, trong năm 2011, trên các phương tiện thông tin đại chúng đã
thông báo khoảng 50% sản phẩm probiotic trên thị trường Việt Nam không đủ
về số lượng vi sinh vật cịn sống, thậm chí khơng có vi sinh vật sống. Trước

những thực tế kể trên, nghiên cứu này được tiến hành nhằm kiểm tra nhanh
một cách có hệ thống thành phần chủng Bc và một số đặc điểm của chủng có
trong men tiêu hóa “ Yobitic sachet ”.

12


Men vi sinh BIOnAQUA-MV do công ty Mai Việt sản xuất . Thành
phần: Gồm các chủng vinh sinh: Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus
atrophaeus,

Bacillus

coagulans,

Bacillus

licheniformis,

Bacillus

polyfermenticus, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Nitrosomonas sp,
Nitrobacter sp. Chế phẩm xử lý nước dùng được cho cá nước ngọt, cá cảnh
nước mặn, nước lợ và bể thủy sinh. Phân hủy chất thải và thức ăn thừa của cá
trong hồ. Khử mùi tanh hôi của nước hồ, ao cá nuôi, làm sạch và giúp nước
trong. Ức chế các mầm bệnh, giúp cá phát triển. Tạo chất kháng nấm, cá
không bị nấm. Không cần phải thay nước hồ cá, ao cá trong nhiều tháng.
Hồn tồn vơ hại với cá, cả kể cá ăn phải.
Thực phẩm bảo vệ sức khỏe LiveSpo Preg-Mom do Công ty Cổ phần
Ana Bio Research & Development sản xuất tại Việt Nam là một dòng men vi

sinh dạng nước, có thành phần trên 3 tỷ bào tử lợi khuẩn Bacillus.
B.coagulans trong men vi sinh LiveSpo Preg-Mom là vi khuẩn Bacillus vừa
có khả năng hình thành bào tử vừa có khả năng sản sinh acid lactic có tác
dụng làm giảm độ pH, đưa môi trường về trạng thái acid nhẹ. Đây là điều kiện
môi trường tốt cho lợi khuẩn đường ruột phát triển và bổ sung bào tử lợi
khuẩn hỗ trợ giúp hệ vi sinh đường ruột khỏe mạnh.
Men tiêu hóa cho cá KOIKA BAC+ do Cơng ty TNHH Khoa học Công
nghệ Liên Hiệp Phát sản xuất: Thành phần chứa B.coagulans giúp cá và tép
cảnh mau lớn, phòng các bệnh đường ruột, nấm, ký sinh trùng. Giúp cá lên
màu đẹp.
Men Sống Bạch Mai Plus do Công ty Cổ phần dược phẩm Ecolife Việt
Nam sản xuất, có thành phần gồm 3 chủng vi khuẩn: Bacillus clausii, Bacillus
subtilis, Bacillus coagulans. Men sống Bạch Mai plus giúp bổ sung vi khuẩn có
lợi. Giúp cân bằng hệ vi sinh đường ruột và nâng cao khả năng miễn dịch cơ thể.
Sản phẩm giảm thiểu tối đa tác dụng phụ khi trẻ phải sử dụng kháng sinh. Giúp
giảm các triệu chứng như: đầy bụng, khó tiêu, phân sống hay táo bón, tiểu chảy
ở trẻ em và người lớn (đặc biệt là phụ nữ có thai và cho con bú).

13


PHẦN III. V T LI U VÀ

ƢƠ

Á

Ê

ỨU

3.1. Vật liệu
Chế phẩm men tiêu hóa “ Yobitic sachet” được mua tại hiệu thuốc.

ình 2. Chế phẩm sinh học “ Yobitic sachet”
3.2. Thời ian và địa điểm n hiên cứu
- Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại phịng thì nghiệm thuộc Bộ môn Công
nghệ vi sinh - Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Thời gian: 07/2022- 02/2023.
3.3. Đối tƣợn n hiên cứu
- Vi khuẩn B. coagulans được phân lập từ men tiêu hóa “ Yobitic sachet ”
3.4 Dụng cụ và thiết bị n hiên cứu
- Thiết bị: Kính hiển vi quang học; box cấy; cân phân tích, cân kỹ thuật; máy
đo pH; máy khuấy từ; lị vi sóng; máy lắc ni cấy; máy li tâm lạnh; tủ nuôi
vi sinh; nồi hấp khử trùng; tủ lạnh; máy đo mật độ quang.
- Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, micropipette (10µl, 20µl, 100µl, 1000µl),
eppendorf (1,5ml; 2ml), bình định mức, ống đong, que cấy, đèn cồn.
3.5. Mơi trƣờn và hóa chất
- Mơi trƣờn MRS có chứa agar (g/l): 20g Glucose, 10g Meat extract , 10g
Pepton, 5g Yeast extract , 1ml Tween 80, 2g K2HPO4, 5g CH3COONa, 2g
Triammonium citrate, 0,58g MgSO4.7H2O, 0,28g MnSO4.4H2O, 5g CaCO3,
15g agar, pH = 6,5 ± 0,2.
-

ác hóa chất nhuộm gram: Tím gentian, lugol, fucshin.
14