Phân lập và nghiên cứu một số đặc điểm vi khuẩn azotobacter spp từ đất trồng lúa ở thái bình

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------ ------

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM
VI KHUẨN AZOTOBACTER SPP. TỪ ĐẤT TRỒNG
LÚA Ở THÁI BÌNH

HÀ NỘI – 2023


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------ ------

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM
VI KHUẨN AZOTOBACTER SPP. TỪ ĐẤT TRỒNG
LÚA Ở THÁI BÌNH

Sinh viên thực hiện

: TRẦN THỊ PHƯƠNG THÚY

Lớp

: K64CNSHA

Mã sinh viên

: 643012

Giảng viên hướng dẫn

: ThS. PHAN THỊ HIỀN
TS. PHẠM THỊ DUNG

Bộ môn

: SHPT & CNSH Ứng dụng

Khoa

: Công nghệ Sinh học

HÀ NỘI – 2023


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả được trình bày trong bản khố luận
này là hồn toàn trung thực. Kết quả được thu thập dựa vào q trình nghiên
cứu khoa học trực tiếp của tơi dưới sự hướng dẫn của ThS. Phan Thị Hiền và
TS. Phạm Thị Dung, giảng viên bộ môn SHPT& CNSH Ứng dụng, Khoa Công
nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Tôi xin cam đoan mọi thông tin được tham khảo trong bài khoá luận này
đã được ghi rõ nguồn gốc tại mục tài liệu tham khảo.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2023

Sinh viên

Trần Thị Phương Thúy

i


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng tới Ban Giám đốc Học viện,
thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Bộ môn SHPT & CNSH Ứng dụng và các
thầy, cơ trong tồn Học viện đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong suốt quá trình
học tập, rèn luyện, nghiên cứu tại Học viện Nơng nghiệp Việt Nam.
Em xin được bày tỏ lòng biết ơn tới ThS. Phan Thị Hiền và TS. Phạm Thị
Dung, giảng viên bộ môn SHPT& CNSH Ứng dụng, khoa Công nghệ Sinh học
đã tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện và hồn thành
khố luận.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, anh chị, bạn bè đã chỉ dạy,
góp ý, động viên trong suốt q trình thực tập khố luận.
Trong q trình thực tập khố luận, nhận thấy vốn hiểu biết và kinh
nghiệm cịn nhiều hạn chế nên bài nghiên cứu này chưa thể hoàn thiện một cách
tốt nhất. Em rất mong nhận được đóng góp ý kiến của thầy cơ để bài báo cáo
được hoàn thiện hơn.
Em xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2023

Sinh viên

Trần Thị Phương Thúy

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................vii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................. viii
TÓM TẮT .................................................................................................................. ix
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................... 3
3. Yêu cầu .................................................................................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 4
1. Tổng quan về vi sinh vật cố định Nitơ .................................................................... 4
1.1. Chu trình Nitơ trong tự nhiên ............................................................................... 4

1.1.1. Giai đoạn cố định Nitơ .................................................................. 6
1.1.2. Khống hóa ..................................................................................... 7

1.1.3. Giai đoạn Nitrat hóa ........................................................................ 8
1.1.4. Giai đoạn khử khống hóa .............................................................. 9
1.1.5. Giai đoạn phản nitrat hóa ................................................................ 9
1.2. Các vi sinh vật cố định Nitơ phân tử .................................................................... 9
1.3. Quá trình cố định Nitơ phân tử .......................................................................... 11

1.3.1. Con đường hóa học ....................................................................... 11
1.3.2. Con đường sinh học ...................................................................... 11
1.4. Vi khuẩn Azotobacter ......................................................................................... 12

1.4.1. Phân loại ........................................................................................ 12
1.4.2. Đặc điểm hình thái ........................................................................ 13

iii


1.4.3. Sự hình thành nang của vi khuẩn Azotobacter.............................. 15
1.4.4. Sự nảy mầm của nang ................................................................... 16
1.4.5. Đặc tính sinh lý ............................................................................. 17
1.4.6. Sự phân bố Azotobacter spp. trong tự nhiên ................................. 18
1.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về phân lập, tuyển chọn, nhân giống và nhân
sinh khối vi khuẩn Azotobacter ................................................................................. 19

1.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước.................................................. 19
1.5.2. Tình hình nghiên cứu ngồi nước ................................................. 20
1.6. Hiệu quả sử dụng chế phẩm phân bón chứa Azotobacter .................................. 21
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 23
2.1. Vật liệu, thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................ 23

2.1.1. Vật liệu .......................................................................................... 23

2.1.2. Môi trường nghiên cứu ................................................................. 24
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất thí nghiệm ...................................... 25
2.1.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu................................................. 26
2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 26
2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 26

2.3.1. Phương pháp thu mẫu ................................................................... 26
2.3.2. Phân lập vi khuẩn Azotobacter spp. .............................................. 27
2.3.3. Phương pháp làm thuần khuẩn lạc ................................................ 27
2.3.4. Phương pháp nhuộm gram ............................................................ 28
2.3.5. Tách chiết DNA genome của vi khuẩn Azotobacter spp. ............. 29
2.3.6. Điện di DNA tổng số .................................................................... 30
2.3.7. Phương pháp PCR (Polymerasae Chain Reaction) ....................... 30
2.3.8. Xác định khả năng cố định đạm của Azotobacter spp. ................. 31
2.3.9. Xác định khả năng sinh IAA của Azotobacter spp. ...................... 32
2.3.10. Xác định ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng
của vi khuẩn ............................................................................................ 33
iv


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 34
3.1. Mẫu đất thu thập tại Thái Bình .......................................................................... 34
3.2. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn ................................................................ 35

3.2.1. Kết quả quan sát khuẩn lạc ........................................................... 35
3.2.2. Kết quả nhuộm gram và quan sát nang vi khuẩn .......................... 37
3.3. Ảnh hưởng của nguồn Carbon đến sinh trưởng của vi khuẩn ........................... 38
3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sinh trưởng của vi khuẩn ....................... 39
3.5. Xác định vi khuẩn Azotobacter spp. bằng chỉ thị phân tử ................................. 40

3.5.1. Kết quả điện di tổng số ................................................................. 40
3.5.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR ..................................................... 41
3.6. Kết quả định tính với thuốc thử Nessler ............................................................ 42
3.7. Kết quả định tính với thuốc thử Salkowski ........................................................ 43
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 47

v


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Nguồn gốc các mẫu đất .................................................................. 23
Bảng 2.2. Thành phần môi trường thạch Asbhy manitol ................................ 24
Bảng 2.3. Thành phần môi trường thạch Asbhy glucose ................................ 24
Bảng 2.4. Thành phần môi trường thạch Asbhy sucrose ................................ 24
Bảng 2.5. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ....................................................... 25
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR ............................................................. 31
Bảng 2.7. Thành phần thuốc thử Salkowkski ................................................. 32
Bảng 3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn Azotobacter spp. Sau 6 ngày nuôi cấy
trên môi trường Asbhy .................................................................................... 36
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sinh trưởng của vi khuẩn......... 39
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của vi khuẩn.................. 40
Bảng 3.4. Kết quả quan sát đặc điểm đặc trưng của các chủng vi khuẩn ....... 44

vi


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Vịng tuần hồn Nitơ cơ sở (.Nguyễn Lân Dũng et al., 2007) .......... 6
Hình 1.2. Sơ đồ biểu diễn chu trình Nitơ trong tự nhiên .................................. 7
Hình 2.1. Địa điểm lấy mẫu trên bản đồ vệ tinh tỉnh Thái Bình..................... 23
Hình 2.2. Các bước pha lỗng mẫu ................................................................. 27
Hình 3.1. Mẫu đất lấy từ đất trồng lúa Thái Bình ........................................... 34
Hình 3.2. Kết quả phân lập mẫu đất trên môi trường Asbhy, sau 7 ngày nuôi
cấy ................................................................................................................... 36
Hình 3.3. Kết quả nhuộm gram của lần lượt các chủng vi khuẩn OS01, OS02,
OS03 ................................................................................................................ 37
Hình 3.4. Vi khuẩn chủng OS02 hình thành nang sau 13 ngày ni cấy ....... 38
Hình 3.5. Vi khuẩn chủng OS02 hình thành nang sau 20 ngày ni cấy ....... 38
Hình 3.6. Kết quả điện di tổng số trên gel agarose 2%, ở 120 V trong 20 phút
......................................................................................................................... 41
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%, ở 120 V trong
30 phút ............................................................................................................. 42
Hình 3.8. Kết quả khả năng cố định đạm của từng mẫu sử dụng thuốc thử
Nessler ............................................................................................................. 43
Hình 3.9. Kết quả khả năng sinh IAA của từng mẫu sử dụng thuốc thử
Salkowski ........................................................................................................ 44

vii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

A. _ beijerinckii:

Azotobacter beijerinckii

CTAB:

Cetyl Trimetyl Amoni Bromua

DNA:

Axit Deoxyribonucleic

IAA:

3-Indole acetic acid

PCR:

Phản ứng chuỗi polymerase

SR:

Mẫu đất

TE:

Tris EDTA

TAE:

Tris Acetate EDTA

viii

TĨM TẮT
Trong nghiên cứu này, các dịng vi khuẩn được phân lập từ đất trồng lúa
tại một số địa điểm khác nhau trên địa bàn tỉnh Thái Bình. Các chủng này đã
được xác định và đặc trưng về mặt sinh hóa trên mơi trường chọn lọc Ashby,
khác biệt dựa trên các đặc tính hình thái và sinh lý. Để phân tích phân tử, gen
16S rDNA được khuếch đại bằng cách sử dụng cặp mồi (bao gồm mồi 27F và
1492R), sau đó sản phẩm PCR được điện di để phân tích kết quả. Xác định khả
năng cố định nitơ của các mẫu bằng phương pháp so màu với thuốc thử Nessler.
Xác định khả năng sinh IAA của chủng vi khuẩn bằng phương pháp so màu với
thuốc thử Salkowski. Kết quả thu được dựa vào hình thái và một số đặc điểm
đặc trưng cho thấy phân lập được 3 chủng vi khuẩn Azotobacter spp. phân bố
trong 5 mẫu đất trồng lúa ngoài tự nhiên, trên cơ sở đó đã tuyển chọn được 3
chủng Azotobacter, kí hiệu: OS01, OS02, OS03, vừa có khả năng cố định nitơ
phân tử trong khơng khí thành nitơ dạng ammonium (NH4+), vừa có khả năng
sinh Indole acetic acid (IAA). Ở mơi trường thạch Ashby có bổ sung 2%
mannitol thấy vi khuẩn sinh trưởng tốt nhất ở 28-300C. Qua khảo sát định tính
thấy chủng OS02 có khả năng cố định đạm và khả năng sinh IAA tốt nhất, tiếp
theo là chủng OS01 và OS03. Kết quả cho thấy mẫu OS02 phù hợp nhất với
đặc tính của Azotobacter beijerinckii.

ix


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cùng với sự phát triển không ngừng của các ngành cơng nghiệp thì nơng
nghiệp ở nước ta cũng đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể nhờ tiến bộ của
khoa học kĩ thuật, từ đó làm cho năng suất và chất lượng cây trồng tăng lên gấp
nhiều lần. Trong nông nghiệp, đạm được xem là nguồn dinh dưỡng rất quan
trọng đối với cây trồng. Việc cung cấp đạm cho cây trồng từ phân bón là vơ

cùng quan trọng nhằm đáp ứng nhu cầu sinh trưởng, phát triển trong các giai
đoạn của cây và phần nào bù đắp lại lượng đạm mà cây trồng đã lấy đi từ đất
qua các vụ mùa. Một thực trạng chúng ta đang thấy hiện nay là sự lạm dụng
phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật đã làm giảm khả năng chống chịu của
cây trồng dẫn đến bùng nổ dịch bệnh, ảnh hưởng không tốt đến chất lượng nông
sản và cũng là ngun nhân tất yếu dẫn đến thối hóa đất canh tác. Các sản
phẩm hóa học này đã để lại những tồn dư của chúng và đang được tích lũy trong
hệ sinh thái, trở thành mối hiểm họa nghiêm trọng đe dọa sức khỏe của con
người và môi trường sống. Sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh vật là giải pháp
mà các nhà khoa học trên thế giới cũng như ở Việt Nam đang hướng đến.
Khi bón phân đạm vào đất, cây trồng chỉ hấp thu khoảng 40 - 50% lượng
phân bón, lượng cịn lại bị nước mưa, nước tưới rửa trơi, hoặc bị chuyển hóa
và bốc hơi ở dạng NH3, NOx, N2. Bên cạnh đó, sự lạm dụng quá nhiều phân
bón hóa học để gia tăng năng suất đã làm cho đất đai ngày càng bạc màu, độ
phì nhiêu kém dần, tình trạng ơ nhiễm nguồn nước mặt gây nên hiện tượng
nước nở hoa, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và môi trường sống của con
người cũng như các sinh vật khác trong tự nhiên. Hơn nữa, giá phân đạm hóa
học ngày càng tăng. Do đó, cần tìm các nguồn nitơ thay thế để tránh những vấn
đề này. Cố định đạm sinh học có thể thay thế cho một số việc sử dụng phân
1


đạm hóa học trong canh tác lúa (Choudhury & Kennedy, 2004), do đó làm giảm
các vấn đề mơi trường nói trên ở một mức độ nào đó. Vi khuẩn cố định nitơ có
thể biến đổi nitơ trong khí quyển thành nitơ cố định, sẽ được thực vật sử dụng
tiếp.
Hiện nay, phân vi sinh có nhiều ưu điểm hơn hẳn so với phân hóa học
nhờ tác dụng nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng. Ngồi giảm chi phí
sản suất thì phân vi sinh cịn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường
và phát triển nông nghiệp bền vững. Tuy nhiên tình hình sản xuất phân vi sinh

ở nước ta vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp,
do quy mô sản xuất nhỏ. chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn định. Do
đó, nghiên cứu để hồn thiện và nâng cao chất lượng phân vi sinh là việc làm
hết sức cần thiết. Trong đó, việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật
là khâu đầu tiên và quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm (.Nguyễn Lân
Dũng et al., 2007).
Thời gian gần đây việc nghiên cứu và sử dụng phân sinh học có nguồn
gốc từ vi sinh vật ngày càng được nhiều nước trên thế giới quan tâm nhằm tạo
ra một sản phẩm sạch, giảm bớt chi phí đầu tư sản xuất trong nơng nghiệp và
bảo vệ mơi trường.
Phân vi sinh vật đặc biệt có ý nghĩa sử dụng nếu các vi sinh vật sử dụng
có nhiều hoạt tính sinh học. Đặc biệt Azotobacter spp. là nhóm có phổ phân bố
khá rộng. Các nghiên cứu trước đây đã phát hiện ra nhiều đặc tính quý của
Azotobacter spp. như khả năng cố định nitơ tự do, kích thích sinh trưởng, đối
kháng, sinh polyshacarit.
Việc tuyển chọn, đánh giá hoạt tính của các chủng vi sinh vật là khâu đầu
tiên và quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm. Azotobacter spp. là loại vi
khuẩn hiếu khí, sống tự do trong đất, chúng có khả năng cố định đạm cao và
khơng phụ thuộc vào cây chủ. Ngồi việc cố định nitơ, Azotobacter có thể cải
2


thiện sự phát triển của thực vật thông qua việc tăng khả năng tận dụng của các
chất dinh dưỡng, chẳng hạn như phốt pho và sản xuất các hormone tăng trưởng
như axit indole acetic (IAA), gibberlins và cytokinin, tế bào phụ và các hợp
chất kháng nấm (Chen et al., 2018). Azotobacter spp. tạo ra các chất thúc đẩy
tăng trưởng thực vật, tăng cường sự hấp thu dinh dưỡng của cây trồng và hỗ trợ
hạt nảy mầm, hình thành chồi và hệ thống kéo dài rễ. Chúng cũng làm tăng tích
lũy chất khô bằng cách tăng chiều dài chồi và rễ trong quá trình sinh trưởng.
Sự hiện diện và hiệu quả của Azotobacter spp. trong đất bị ảnh hưởng bởi các

môi trường sinh học và phi sinh học khác nhau. Từ những thực tế trên chúng
tôi thực hiện đề tài “ Phân lập và nghiên cứu một số đặc điểm của vi khuẩn
Azotobacter spp. từ đất trồng lúa ở Thái Bình” nhằm tuyển chọn được chủng
vi khuẩn có khả năng cố định đạm và sinh IAA, đồng thời khảo sát một số ảnh
hưởng của môi trường tới sinh trưởng của các chủng, tạo tiền đề phục vụ cho
các nghiên cứu sau này.
2. Mục đích nghiên cứu

Phân lập và nghiên cứu một số đặc điểm vi khuẩn Azotobacter spp. Từ
đất trồng lúa ở Thái Bình.
3. Yêu cầu

- Phân lập được các chủng vi khuẩn Azotobacter spp., nghiên cứu đặc
điểm hình thái của vi khuẩn Azotobacter spp.
- Xác định khả năng cố định N2.
- Xác định khả năng sinh tổng hợp IAA.
- Khảo sát ảnh hưởng của môi trường, nhiệt độ, pH đến khả năng sinh
trưởng của các chủng Azotobacter spp.

3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Tổng quan về vi sinh vật cố định Nitơ
1.1. Chu trình Nitơ trong tự nhiên

Chu trình nitơ là một q trình mà theo đó nitơ bị biến đổi qua lại giữa
các dạng hợp chất hóa học của nó. Việc biến đổi này có thể được tiến hành bởi
cả hai quá trình sinh học và phi sinh học. Quá trình quan trọng trong chu trình
nitơ bao gồm sự cố định nitơ, khống hóa, nitrat hóa, và khử nitrat. Thành phần

chính của khí quyển (khoảng 78,1%) là nitơ, bởi vậy có thể xem đó là một bể
chứa nitơ lớn nhất. Tuy nhiên, nitơ trong khí quyển có những giá trị sử dụng
hạn chế đối với sinh vật, dẫn đến việc khan hiếm lượng nitơ có thể sử dụng
được đối với một số kiểu hệ sinh thái. Chu trình nitơ là một nhân tố đáng chú
ý của các nhà sinh thái học do chúng có thể ảnh hưởng đến tốc độ phát triển
của các quá trình sinh thái chính, như sản lượng thứ cấp và phân hủy. Các hoạt
động của con người như đốt nhiên liệu hóa học, sử dụng các loại phân bón nitơ
nhân tạo và thải nitơ trong nước thải làm biến đổi đáng kể đến chu trình nitơ
trên Trái Đất.
Nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu đối với động vật,
thực vật và ngay cả đối với các loài vi sinh vật. Nitơ là một chất cần thiết cho
nhiều quá trình và là chất chủ yếu của bất kỳ dạng sống nào trên Trái Đất. Nó
là thành phần chính trong tất cả amino acid, cũng như liên kết với protein, và
có mặt trong các chất cơ bản cấu thành nên các acid nucleic, như DNA và RNA.
Trong thực vật, hầu hết nitơ được dùng trong các phân tử chlorophyll, là chất
cần thiết cho quá trình quang hợp và sự phát triển về sau của chúng (Jewell,
1998). Mặc dù nitơ trong khí quyển Trái Đất là một nguồn phong phú, tuy nhiên
hầu hết chúng không thể được sử dụng trực tiếp bởi các lồi thực vật
(Trautmann & Porter, 1989). Q trình hóa học, hoặc quá trình cố định nitơ tự
4


nhiên là cần thiết để chuyển đổi khí nitơ thành các dạng mà sinh vật có thể sử
dụng được, quá trình này làm cho nitơ trở thành một thành phần quan trọng
trong q trình sản xuất ra phân bón vi sinh. Sự phong phú hay khan hiếm lượng
nitơ ở dạng đã được cố định này ám chỉ lượng nhiều hay ít phân bón vi sinh để
hỗ trợ cho sự phát triển của một mảnh đất.
Cơ bản của vịng tuần hồn nitơ là q trình Nitrat hóa (Nitrification),
Phản nitrat hóa (Denitrification) và cố đinh nitơ (Nitơ fixation). Nitơ chủ yếu
tồn tại ở khí quyển, chiếm tới 78% trong khí quyển, trong sinh quyển chỉ chiếm

0,3% tổng khối lượng sinh vật. Muối vơ cơ của nitơ (muốỉ amon, nitrat, nitrit)
có độ hịa tan trong nước cao, dễ tham gia vào vòng tuần hồn. Khí nitơ là khí
trơ, muốn mở nối liên kết 3 cần dùng nhiều năng lượng, chỉ có một số ít sinh
vật cố định được Nitơ hoặc thông qua tia chớp phóng điện hay phun trào của
núi lửa có thể cố định được một lượng ít nitơ. Ngồi ra cố định nitơ tại các nhà
máy phân đạm hóa học cũng có thể biến N2 thành muối amon hoặc nitrat cung
cấp cho cây trồng, tuy nhiên việc sản xuất tốn rất nhiều năng lượng.
Khoảng 85% tác dụng cố định nitơ trên Trái đất là do vi sinh vật cố định
nitơ thực hiện, trong đó 60% xảy ra trên đất liền và 40% xảy ra ở đại dương.
Thực vật hấp thụ nitơ vô cơ trong đất, chủ yếu là nitrat để tổng hợp ra protein
thực vật. Động vật hấp thu protein thực vật để tổng hợp thành protein động vật.
Xác động thực vật và chất bài tiết chứa nitơ được vi sinh vật phân hủy trở lại
thành nitơ vô cơ, một phần được thực vật hấp thu, phần còn lại qua tác dụng
cùa vi khuẩn phản nitrat hóa biến thành khí nitơ trở về khí quyển (.Nguyễn Lân
Dũng et al., 2007).

5


Hình 1.1. Vịng tuần hồn Nitơ cơ sở (.Nguyễn Lân Dũng et al., 2007)
1.1.1. Giai đoạn cố định Nitơ
Trong giai đoạn này, nitơ di chuyển từ khí quyển vào đất. Bầu khí quyển
của Trái đất chứa một lượng lớn khí nitơ (N2). Nhưng nitơ ở dạng khí (N2) thực
vật khơng thể sử dụng trực tiếp được mà phải qua quá trình biến đổi. Để thực
vật sử dụng được, N2 phải được chuyển hóa thơng qua một q trình được gọi
là quá trình cố định nitơ. Quá trình này chuyển đổi nitơ trong khí quyển (N2)
thành các dạng mà thực vật có thể hấp thụ qua bộ rễ.
Một lượng nhỏ nitơ được cố định khi trời có sét. Sét cung cấp năng lượng
để N2 phản ứng với oxy, tạo ra NO và NO2. Các dạng nitơ này sau đó đi vào
đất thông qua nước mưa. Ngày nay Nitơ cũng được tạo ra từ ngành cơng nghiệp

sản xuất phân bón. Dạng cố định này xảy ra dưới nhiệt độ và áp suất cao. Trong
đó nitơ trong khí quyển và hydro được kết hợp để tạo thành amoniac (NH3).
Sau đó có thể được xử lý thêm, để tạo ra muối amoni nitrat (NH4NO3). Một
dạng nitơ có thể được sử dụng bởi thực vật.
6


Nitơ cố định sau đó được mang đến các bộ phận khác của cây và được
sử dụng để tạo thành các mô cây. Các vi khuẩn khác sống tự do trong đất hoặc
nước và có thể cố định nitơ mà không cần mối quan hệ cộng sinh với thực vật.
Những vi khuẩn này cũng có thể tạo ra các dạng nitơ có thể được sử dụng bởi
các sinh vật.

Hình 1.2. Sơ đồ biểu diễn chu trình Nitơ trong tự nhiên
Nguồn

truy

cập:

/>
trong/danh-gia-vai-tro-cua-azotobacter-trong-do-phi-nhieu-va-tinh-ben-vungcua-dat-104.html
1.1.2. Khống hóa
Giai đoạn này diễn ra trong đất. Nitơ chuyển từ chất hữu cơ, chẳng hạn
như phân hoặc xác thực vật sang dạng nitơ vơ cơ mà thực vật có thể sử dụng.
Cuối cùng, chất dinh dưỡng được cây sử dụng hết và cây chết và phân hủy.
Điều này trở nên quan trọng trong giai đoạn thứ hai của chu trình nitơ.
Q trình khống hóa xảy ra khi vi sinh vật hoạt động phân hủy chất hữu
cơ (phân hoặc xác thực vật…). Sau đó chuyển nó thành dạng nitơ mà cây trồng
7

hấp thụ được. Tất cả các loại cây đang trồng trọt, ngoại trừ cây họ đậu đều nhận
được nitơ qua đất. Các loại đậu nhận nitơ nhờ quá trình cố định ở trong các nốt
sần ở rễ của chúng.
Quá trình amon hóa
Dạng nitơ đầu tiên được tạo ra từ quá trình khống hóa là amoniac, NH3.
Sau đó NH3 trong đất phản ứng với nước tạo thành amon, NH4. Amon này được
giữ trong đất và có sẵn để sử dụng cho các lồi thực vật khơng lấy nitơ thơng
qua mối quan hệ cố định nitơ cộng sinh được mô tả ở trên.
1.1.3. Giai đoạn Nitrat hóa
Giai đoạn thứ ba, q trình nitrat hóa, cũng xảy ra trong đất và trong nước
(nước thải, nước ao ni tơm, ao hồ…) Trong q trình nitrat hóa, amoniac
trong đất, được tạo ra trong q trình khống hóa, được chuyển đổi thành các
hợp chất gọi là nitrit, NO2− và nitrat, NO3−. Nitrat có thể được sử dụng bởi
thực vật và động vật tiêu thụ thực vật.
Một số vi khuẩn trong đất có thể biến NH3 thành NO2. Mặc dù thực vật và động
vật không thể sử dụng trực tiếp NO2. Nhưng các vi khuẩn khác có thể biến đổi
NO2 thành NO3 một dạng mà thực vật và động vật có thể sử dụng được. Phản
ứng này cung cấp năng lượng cho vi khuẩn tham gia vào q trình này.
Vi khuẩn mà chúng ta đang nói đến được chia làm hai loại: vi khuẩn tự
dưỡng (Nitrosomonas và Nitrobacter) và vi khuẩn dị dưỡng (Pseudomonas và
Bacillus) Cả hai loại vi khuẩn chỉ có thể hoạt động khi có oxy. Q trình nitrat
hóa rất quan trọng đối với thực vật, vì nó tạo ra một lượng nitơ bổ sung có thể
được cây trồng hấp thụ qua hệ thống rễ của chúng. Đối với nước thải và nước
ao, quá trình nitrat hóa làm giảm lượng ơ nhiễm amon và nitơ.

8

1.1.4. Giai đoạn khử khống hóa
Giai đoạn thứ tư của chu trình nitơ là sự đảo ngược của quá trình khống
hóa. Hai q trình này cùng nhau kiểm sốt lượng nitơ trong đất. Cũng giống
như thực vật, vi sinh vật sống trong đất cần nitơ như một nguồn năng lượng.
Các vi sinh vật này hấp thụ nitơ từ đất khi thực vật phân hủy không chứa đủ
nitơ.
1.1.5. Giai đoạn phản nitrat hóa
Trong giai đoạn thứ năm của chu trình nitơ, nitơ được trả lại trong khơng
khí khi nitrat được vi khuẩn chuyển thành khí nitơ bay vào khí quyển (N2). Quá
trình này gọi là quá trình khử nitrat. Khử nitrat là bước tiếp theo của chu trình
nitơ, sau khi quá trình nitrat hóa đã chuyển đổi amoni thành nitrit và nitrat. Quá
trình khử nitrat là quá trình chuyển đổi Nitrat (NO3) thành khí nitơ (N2) nhờ vi
khuẩn khử Nitrat trong mơi trường thiếu khí. Khử nitrat xảy ra khi lượng oxy
bị cạn kiệt. Lúc này nitrat (NO3) trở thành nguồn oxy chính cho vi sinh vật sử
dụng. Q trình được thực hiện trong điều kiện thiếu khí. Nghĩa là nồng độ oxy
hòa tan nhỏ hơn 0,5 mg/L, lý tưởng là nhỏ hơn 0,2. Khi vi khuẩn phân tách
nitrat (NO3) để lấy oxy (O2), nitrat (NO3) bị khử thành khí nitơ (N2).
1.2. Các vi sinh vật cố định Nitơ phân tử

Vi sinh vật cố định nitơ là các nhóm vi sinh vật có khả năng chuyển hóa
khí N2 dồi dào trong khơng khí (78%) thành nitơ dạng ammonium (NH4+) cung
cấp cho thực vật. Trong tự nhiên, vi sinh vật cố định nitơ có một vai trị quan
trọng trong chu trình tuần hoàn N2 và cung cấp một lượng N đáng kể cho cây
trồng. Theo tính tốn của các nhà khoa học, các nhóm vi sinh vật cố định nitơ
có thể cung cấp cho hành tinh tới 240 x 106 tấn N/năm (gấp 6 lần lượng nitơ cả
thế giới sản xuất bằng con đường hóa học) (Khan & Rahman, 2008). Trong số
các vi sinh vật có khả năng cố định nitơ theo kiểu không cộng sinh, vi khuẩn
9

Azotobacter được quan tâm và ứng dụng nhiều nhất trong sản xuất phân bón
sinh học cố định nitơ. Ngồi khả năng cố định nitơ, Azotobacter cịn có nhiều
đặc tính hữu ích khác như: Sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật, tăng cường
sự hấp thu lân và các hợp chất hữu cơ từ đất của thực vật bởi chúng có thể sinh
enzyme phosphatase, cellulase (Kizilkaya, 2009).
Vi sinh vật cố định Nitơ là các nhóm vi sinh vật có khả năng chuyển hóa
khí Nito trong khi quyền Nitơ dễ hấp thụ cung cấp cho cây. Có 2 nhóm vi sinh
vật cố định nitơ: Nhóm vi sinh vật sống tự do và hội sinh; nhóm vi sinh sống
cộng sinh
Nhóm vi sinh vật sống tự do và hội sinh có một số lồi điển hình sau:
Vi khuẩn Azotobacter
Vi khuẩn Beijerinckia
Vi khuẩn Clostridium
Nhóm vi sinh vật sống cộng sinh có một số loại điển hình sau:
Rhizobium
Azospirillum
Một số vi sinh vật cố định Nitơ khác
Ngồi những giống vi sinh vật cố định nitơ phân tử nói trên, cịn vơ số những
giống khác đều có khả năng cố định nitơ phân tử, chúng có nhiều ý nghĩa trong
sản xuất nông lâm, ngư nghiệp.
- Vi

khuẩn:

Azotomonas

insolita,

Azotomonas

fluorescens,

Pseudomonas azotogenis, Klebsiella pneumonia, Aerobacter
aerogene, Rhodospirillum rubrum, Chromatium sp., Chlorobium

10


sp.

Rhodomicribium

spp.,

Desulfovibrio

desulfuricans;

Methanobacterium spp., ...
- Xạ khuẩn: Một số loài thuộc giống: Actinomyces, Frankia, Nocardia,
Actinopolyspora. ...
- Tảo -Vi khuẩn lam: Plectonema, Anabaena azolla, …
1.3. Quá trình cố định Nitơ phân tử

Quá trình liên kết N2 với H2 để hình thành nên NH3 gọi là q trình cố
định nitơ. Trong tự nhiên có hai con đường cố định nitơ phân tử thành dạng
nitơ mà cây hấp thụ được là: Con đường hóa học và con đường sinh học
1.3.1. Con đường hóa học
Đây là liên kết giữa N2 với H2 diễn ra theo phương thức hóa học (phản
ứng hóa học) trong điều kiện nhiệt độ và áp suất cao (tia chớp sấm sét). Lượng

NH3 được tạo ra trong sấm sét (tia lửa điện) theo nước mưa rơi xuống và thâm
nhập vào đất để cung cấp cho cây. Tuy nhiên lượng ion khoáng nitơ được hình
thành theo phương thức này khơng nhiều.
1.3.2. Con đường sinh học
Trong tự nhiên thì lượng nitơ cung cấp cho đất từ N2 thông qua con đường
cố định nitơ theo phương thức sinh học lớn gấp nhiều lần so với con đường hóa
học ở trên. Con đường này diễn ra ngay trong điều kiện nhiệt độ và áp suất bình
thường nhờ vi sinh vật cố định đạm (cố định nitơ). Vi sinh vật cố định nitơ có
2 nhóm là: vi sinh vật cố định nitơ sống tự do trong đất như vi khuẩn lam
(Cyanobacteria), Azotobacter spp. và vi sinh vật cố định nitơ sống cộng sinh
với thực vật (như cộng sinh với các loài cây họ đậu, bèo hoa dâu, ...). Những
nghiên cứu trong những năm gần đây đã cho thấy rõ được một phần cơ chế của
quả trình cố định nitơ của vi sinh vật là nhờ enzyme.
11


Cố định đạm sinh học do Beijerinck phát hiện năm 1901 (Beijerinck 1901)
được thực hiện bởi một nhóm chuyên biệt của sinh vật nhân sơ. Những sinh vật
này sử dụng enzyme nitrogenase để xúc tác quá trình chuyển đổi nitơ trong khí
quyển (N2) thành amoniac (NH3). Các vi sinh vật cố định Nitơ cần 16 mol
adenosine triphosphate (ATP) để khử mỗi mol nitơ (Hubbell & Kidder, 2009).
Những sinh vật này có được năng lượng này bằng cách oxy hóa các phân tử
hữu cơ. Các vi sinh vật sống tự do không quang hợp phải lấy các phân tử này
từ các sinh vật khác, trong khi các vi sinh vật quang hợp, chẳng hạn như vi
khuẩn lam, sử dụng đường được tạo ra bởi quá trình quang hợp. Các vi sinh vật
cố định đạm liên kết và cộng sinh thu được các hợp chất này từ rễ cây chủ của
chúng (Hubbell & Kidder 2009).
Tất cả các phản ứng sinh học liên quan đến quá trình cố định đạm đều
được xúc tác bởi các enzym có tên là nitrogenaza. Các enzym này có chứa sắt,
thường có kim loại thứ hai, thường là molypden nhưng đơi khi là vanadi.

Q trình cố định đạm sinh học xảy ra khi nitơ trong khí quyển được
chuyển đổi thành amoniac nhờ enzyme nitrogenase. Phản ứng chung cho qua
trình cố định đạm sinh học là:
N 2 + 16ATP + 16H 2 O + 8e - + 8H + →2NH 3 + H 2 + 16ADP + 16P i
1.4. Vi khuẩn Azotobacter
1.4.1. Phân loại
Theo Fribram (1938) phân loại khoa học của Azotobacter được ghi nhận như
sau:
Giới: Vi khuẩn
Ngành: Proteobacteria

12


Lớp: Gammaproteobacteria
Bộ: Pseudomonadales
Họ: Azotobacteraceae
Chi: Azotobacter
Azotobacter là vi khuẩn cố định nitơ sống tự do trong đất được nhà vi sinh vật
Hà Lan Beijerinck phân lập và nuôi cấy thuần khiết năm 1901.
The Becking (1974), Azotobacter spp. có 4 lồi đặc trưng sau
• A.chroococcum
• A.vinelandii
• A.agilis
• Beijerinckii
Theo FAO (1982) Azotobacter spp. có các lồi phổ biến sau :
• A.chroococcum
• A.beijerinckii
• A.vinellandii
• A.insignis

• Acagilis
• A.macrocytogenes
• A.paspali
1.4.2. Đặc điểm hình thái
Azotobacter spp là vi khuẩn hiếu khí nhưng có thể phát triển trong điều kiện vi
hiếu khí, Gram âm khơng sinh bào tử.

13


Vi khuẩn Azotobacter khi nuôi cấy trong các môi trường nhân tạo thường biểu
hiện đặc tính đa hình. Hình dạng tế bào và chu kì biến đổi của chúng phụ thuộc
vào tuổi của ống giống và điều kiện phát triển.
Khi cịn non tế bào có dạng que đầu trịn đứng riêng lẻ hay xếp thành từng đôi
chồng chất, chất tế bào nhuộm màu đồng đều, sinh sản bằng cách phân cắt có
khả năng di động nhờ tiên mao. Kích thước: 2,0-7,0 ì 1.0-2.5 àm. Khi gi t
bo Azotobacter mt kh năng di động, kích thước thu nhỏ lại biến thành dạng
hình cầu. Vỏ nhầy của vi khuẩn Azotobacter chứa khoảng 75 % là chất hiđrit
của axit uronic và chứa khoảng 0,023 % nitơ. Lượng ADN trong tế bào
Azotobacter thường thấp hơn so với nhiều loại vi khuẩn khác (0,70- 0,81%)
(.Lương Đức Phẩm, 1998). Khi già, tế bào thường được bao bọc lớp vỏ dày và
tạo thành nang xác. Khi môi trường sống không thuận lợi như thay đổi nồng độ
các chất định dưỡng hoặc bổ sung một số chất hữu cơ như ethanol, butanol-n
hoặc β-hydroxybutyrate tế bào cũng có thể hình thành nang. Khi gặp điều kiện
thuận lợi, nang xác sẽ nứt ra và tạo thành các tế bào mới. Azotobacter spp. ít
hình thành nang trong mơi trường lỏng.
Trên mơi trường đặc, khuẩn lạc của Azotobacter có dạng nhày, đàn hồi, lồi, có
khi ở dạng nhăn nheo. Khi già, khuẩn lạc có màu vàng lục, màu hồng hoặc màu
nâu đen. Màu sắc khuẩn lạc là một trong những tiêu chuẩn để phân loại các loài
Azotobacter (.Trần Thị Linh, 2012).

Trong đất, Azotobacter spp. thường phổ biến các loài sau:
- Azotobacter chrococcum: Kích thước tế bào 2,0 x 3,1 µm, có khả
năng tạo nang, có khả năng di động. Khuẩn lạc khi già có màu nâu
sẫm, sắc tố khơng khuếch tán vào mơi trường, có khả năng đồng
hóa mannitol, ramnose và tinh bt.
- Azotobacter beijerinckii: Kớch thc t bo 2,4 ì 5,0àm, có khả
năng tạo nang xác, khơng có tiêm mao, khơng di động được. Khi
14