Phân lập và sàng lọc nấm sinh tổng hợp l axit lactic định hướng tạo nhựa sinh học chất lượng cao

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

-------oOo-------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:
PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC NẤM SINH TỔNG HỢP
L- AXIT LACTIC ĐỊNH HƯỚNG TẠO NHỰA
SINH HỌC CHẤT LƯỢNG CAO

HÀ NỘI – 2023


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

-------oOo-------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC NẤM SINH TỔNG HỢP
L- AXIT LACTIC ĐỊNH HƯỚNG TẠO NHỰA
SINH HỌC CHẤT LƯỢNG CAO

Người thực hiện

: NGUYỄN THỊ TRANG

Mã sinh viên

: 646428

Khóa

: 64

Ngành

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn

: TS. NGUYỄN THANH HẢO
TS. CHU NHẬT HUY

HÀ NỘI – 2023


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung
thực và chưa hề được sử dụng trong bất kì cơng bố nào.
Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận đã được cảm
ơn và các thơng tin trích dẫn đã được ghi rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày tháng năm 2023
Sinh viên

Nguyễn Thị Trang

i


LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian làm đề tài tốt nghiệp tại Viện công nghệ Sinh học – Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, được sự giúp đỡ và dìu dắt tận tình của
các thầy, các anh chị cán bộ tại phịng Cơng nghệ Sinh học Tái tạo Môi trường,
cùng sự cố gắng và nỗ lực học tập của bản thân, tơi đã hồn thành khóa luận tốt
nghiệp của mình.
Trước tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu nhà trường,
Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học, thầy TS. Nguyễn Thanh Hảo cùng tồn
thể các thầy cơ giáo đã truyền đạt cho tơi những kiến thức vơ cùng bổ ích và q
báu trong suốt thời gian học tập, rèn luyện tại trường.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy TS. Chu Nhật Huy – trưởng phịng
cơng nghệ Sinh học Tái tạo Môi trường và chị T.S Đào Thị Ngọc Ánh cùng các
anh chị trong phòng đã định hướng đề tài cũng như tận tình hướng dẫn, giúp đỡ
tơi trong suốt q trình làm khóa luận.
Cuối cùng tơi xin gửi lời cảm ơn tới bố, mẹ và tất cả người thân trong gia
đình đã ln đứng sau cổ vũ tinh thần ủng hộ mọi việc tôi đã làm và là chỗ dựa
vững chắc cho tơi để tơi có được ngày như hơm nay.
Hà Nội, ngày tháng năm 2023
Sinh viên

Nguyễn Thị Trang

ii


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................ vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.......................................................................... viii
TÓM TẮT ............................................................................................................ ix
MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3
Tổng quan về Axit lactic ................................................................................ 3
Giới thiệu Axit lactic ................................................................................... 3
Công thức cấu tạo Axit lactic ...................................................................... 3
Tính chất Axit lactic ................................................................................... 4
Ứng dụng và vai trò của axit lactic ............................................................. 5
Tổng quan về L- axit lactic ............................................................................ 7
Khái niệm L- axit lactic............................................................................... 7
Tính chất L- axit lactic ................................................................................ 7
Tổng hợp L- axit lactic từ vi sinh vật .......................................................... 8
Ứng dụng của L- axit lactic (LA)................................................................ 8
Tổng quan về nấm mốc sinh L- axit lactic ..................................................... 9
Nấm Rhizopus oryzae .................................................................................. 9
Vai trò và ứng dụng nấm mốc ................................................................... 10
Nhựa phân hủy sinh học polylactic acid (PLA) ........................................... 11
Tình hình nghiên cứu nấm mốc sinh tổng hợp L- axit lactic trong và
ngoài nước ........................................................................................................... 12

iii


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.................................................... 14

Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................ 14
Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 14
Đối tượng nghiên cứu................................................................................ 14
Hóa chất, dụng cụ và thiết bị..................................................................... 14
Mơi trường sử dụng trong nghiên cứu ...................................................... 14
Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 15
Thu thập mẫu nấm mốc từ các loại hoa .................................................... 15
Phân lập và tuyển chọn chủng nấm có khả năng sinh axit lactic .............. 15
Xác định khả năng sinh axit lactic của các chủng nấm đã chọn ............... 16
3.3.3.1. Lên men sinh axit lactic từ chủng nấm đã chọn..................................... 16
3.3.3.2. Xác định hàm lượng axit lactic bằng phương pháp đo quang phổ ........ 16
Xác định các đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của chủng nấm
đã chọn ................................................................................................................ 18
Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hàm lượng L- axit lactic sinh ra ........ 18
Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến hàm lượng L- axit lactic sinh ra ...... 19
Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng L- axit lactic sinh ra.......................... 19
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 20
Kết quả thu thập mẫu nấm mốc xung quanh Gia Lâm- Hà nội. .................. 20
Kết quả phân lập và tuyển chọn chủng có khả năng sinh L- Axit lactic. .... 21
Kết quả phân lập nấm mốc từ mẫu hoa quả .............................................. 21
Kết quả tuyển chọn chủng nấm sinh L- Axit lactic .................................. 21
Kết quả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của 7 chủng nấm mốc đã chọn ...... 23
Đặc điểm hình thái chủng TL.................................................................... 23
Đặc điểm hình thái chủng CR ................................................................... 25
Đặc điểm hình thái chủng HĐB. ............................................................... 26
Đặc điểm hình thái chủng HĐB1. ............................................................. 27
Đặc điểm hình thái chủng SS1. ................................................................. 28
iv

Đặc điểm hình thái chủng SS2. ................................................................. 30
Đặc điểm hình thái chủng SS3. ................................................................. 31
Khả năng sinh axit lactic của 7 chủng nấm mốc đã tuyển chọn .................. 32
Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hàm lượng L- axit lactic sinh ra ........... 34
Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến hàm lượng L- axit lactic sinh ra ......... 35
Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng L- axit lactic sinh ra............................. 36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................... 38
Kết luận ........................................................................................................ 38
Kiến nghị ...................................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 39
PHỤ LỤC ........................................................................................................... 44

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Tính chất nhiệt động học của axit lactic ............................................... 5
Bảng 4.1. Kết quả các chủng nấm mốc phân lập ................................................ 21
Bảng 4.2. Kết quả tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng hịa tan CaCO3 và đổi
màu môi trường ................................................................................................... 22

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc khơng gian 2 dạng đồng phân axit lactic (Anh, 2018) ........... 4
Hình 2.2 Cơng thức cấu tạo của PLA ................................................................. 11
Hình 3.1. Xây dựng đường chuẩn ....................................................................... 17
Hình 4.1. Một số mẫu nấm mốc thu thập được ................................................... 20
Hình 4.2. Hình thái chủng nấm TL ..................................................................... 24

Hình 4.3. Hình thái chủng nấm CR ..................................................................... 25
Hình 4.4. Hình thái chủng nấm HĐB .................................................................. 27
Hình 4.5. Hình thái chủng nấm HĐB1................................................................ 28
Hình 4.6. Hình thái chủng nấm SS1.................................................................... 29
Hình 4.7. Hình thái chủng nấm SS2.................................................................... 30
Hình 4.8. Hình thái chủng nấm SS3.................................................................... 31
Hình 4.9.Khả năng sinh tổng hợp L- axit lactic bởi các chủng nấm tuyển chọn...... 33
Hình 4.10. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh L- axit lactic ....... 34
Hình 4.11. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh L- axit lactic ........... 35
Hình 4.12. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh L- axit lactic ........................ 36

vii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Tên đầy đủ

HCN

Axit hydrocyanic

LA

L- axit lactic

LAB

vi khuẩn lactic

PCL

polycaprolactone

PLA

Poly lactid acid

R. oryzae

Rhizopus oryzae

viii


TĨM TẮT
Với mục đích phân lập và sàng lọc nấm sinh tổng hợp L- axit lactic (LA)
định hướng tạo nhựa sinh học chất lượng cao, chúng tôi đã tiến hành phân lập và
tuyển chọn các mẫu nấm mốc thu thập được từ hoa quả hỏng. Kết quả tuyển chọn
được 7 chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp LA là SS1; SS2; SS3; TL; CR;
HĐB và HĐB1. Qua thí nghiệm khảo sát nồng độ LA sỉnh ra bởi 7 chủng nấm
được chọn, chủng SS2 và SS3 có khả năng sinh tổng hợp LA cao nhất với nồng
độ LA tương ứng là 15mg/l và 42mg/l. Từ đó, tiến hành các thí nghiệm đánh giá
ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy như nguồn cacbon, nguồn nitrogen, điều
kiện pH đến khả năng sinh tổng hợp LA của 2 chủng SS2 và SS3. Trong số nguồn
cacbon thử nghiệm, saccharose là nguồn cacbon thích hợp nhất để 2 chủng SS2
và SS3 sinh tổng hợp LA. Trong môi trường nuôi cấy chứa yeast extract, lượng
LA sinh ra là cao nhất với nồng độ là 26,59 mg/l và 14,05 mg/l tương ứng với 2

chủng SS2 và SS3. Vào ngày nuôi cấy thứ 5, ở giá trị pH=3, chủng SS2 có khả
năng sinh tổng hợp LA cao nhất, tuy nhiên đối với chủng SS3, pH=5 là điều kiện
thích hợp nhất để lượng LA sinh ra đạt cực đại.

ix


MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, lượng rác thải nhựa đang dần
gia tăng ở mức báo động. Lượng rác thải nhựa dùng một lần chưa qua xử lý,
chuyển hóa có ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng cuộc sống, sức khỏe con người
và các loài sinh vật khác. Điều nguy hiểm nhất của rác thải nhựa là tính chất khó
phân hủy, tồn tại lâu dài trong môi trường đất. Ngay cả khi bị chôn vùi trong bùn,
đất chúng vẫn tồn tại hàng trăm nghìn năm, làm thay đổi tính chất vật lý của đất,
gây xói mịn đất, làm cho đất khơng giữ được nước và chất dinh dưỡng, ngăn cản
oxy đi qua đất, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây trồng, cản trở sự sinh trưởng
và phát triển của vật nuôi và cây trồng,...
Các sản phẩm từ nhựa khó biến mất hồn toàn trong đời sống bởi những
tác dụng tiện lợi của chúng nên việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu thân thiện với
môi trường, các sản phẩm tự phân hủy đang là vấn đề được quan tâm nhiều bởi
các nhà nghiên cứu hàng đầu hiện nay. L- axit lactic (LA) là một ngun liệu thơ
quan trọng để sản xuất các polyme có khả năng phân hủy sinh học và tương thích
sinh học, chẳng hạn như axit poly-lactic. LA là một axit hữu cơ phổ biến được sử
dụng rộng rãi trong các ngành liên quan đến thực phẩm và có tiềm năng sản xuất
các polyme polylactate có thể phân hủy sinh học. LA được sản xuất bởi các vi
khuẩn lactic và nấm. Loài nấm Rhizopus tạo ra LA dưới dạng đồng phân duy nhất
của axit lactic và đã được cơng nhận là lồi duy nhất có khả năng tạo ra đồng phân
LA (Wu & cs., 2011b; 2022).
Hiện nay, LA được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu như dầu mỏ, khí tự

nhiên, than đá nhưng các nguồn nguyên liệu này đang dần cạn kiệt. Việc khai thác
quá mức các nguồn khoáng sản thiên nhiên ảnh hưởng đến nguồn tài nguyên, dẫn
đến các vấn đề ô nhiễm gây hại cho sức khỏe con người và các quần thể sinh vật
trên cạn và dưới nước. Vì vậy, việc tìm ra nguồn nguyên liệu sản xuất LA thân
thiện với môi trường từ vi sinh vật là điều cần thiết. Do đó, tơi đã tiến hành nghiên
1


cứu đề tài “ Phân lập và sàng lọc nấm sinh tổng hợp L- axit lactic định hướng
tạo nhựa sinh học chất lượng cao.”
 Mục đích nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp L- axit
lactic.
 Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và tuyển chọn nấm thu thập từ thanh long, cà rốt, su su,...
- Sàng lọc nấm có khả năng sinh lactic cao trong môi trường lên men tăng sinh
khối của các chủng nấm đã tuyển chọn.
- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp L- axit
lactic của các chủng nấm được tuyển chọn.
- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp L- axit
lactic của các chủng nấm được tuyển chọn.
- Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp L- axit lactic của các
chủng nấm được tuyển chọn.

2


TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Tổng quan về Axit lactic
Giới thiệu Axit lactic

Axit lactic (2-hydroxypropionic, CH3CHOHCOOH) là một axit hữu cơ có
giá trị vì nó được ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm và các sản phẩm liên quan
đến thực phẩm, được sử dụng như chất bảo quản, chất oxy hóa và hương liệu. Các
nghiên cứu về axit lactic ngày nay trở nên phổ biến với chiến dịch xanh, khả năng
tạo ra axit polylactic (PLA) có thể được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất
polyme phân hủy sinh học, bao gồm nhựa phân hủy sinh học để giải quyết một
trong những ngun nhân nóng lên tồn cầu (Wu & cs., 2011a). Axit hữu cơ được
sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và hóa chất.
Việc sản xuất axit lactic hiện đang thu hút rất nhiều sự quan tâm của các nhà
nghiên cứu hiện nay. Một nghiên cứu được thành lập vào năm 1995 cho biết 85%
axit lactic được sản xuất tại Hoa Kỳ được sử dụng trong thực phẩm và các ứng
dụng liên quan đến thực phẩm. Một trong những ứng dụng mới nổi nhất của axit
lactic ngày nay là sử dụng nó để sản xuất polyme polylactate có thể phân hủy sinh
học, cung cấp một giải pháp thay thế thân thiện với môi trường cho nhựa phân
hủy sinh học có nguồn gốc từ nguyên liệu hóa dầu. Với sự phát triển và thương
mại hóa các chất ngoại sinh này, việc sử dụng axit lactic đã tăng lên đáng kể để
trở thành trọng điểm hàng đầu của ngành công nghiệp quốc gia (Anh, 2018).
Công thức cấu tạo Axit lactic
Axit lactic còn được gọi là axit cacboxylic 1- hydroxyethanol hoặc axit 2hydroxypropanoic. Với công thức phân tử C3H6O3, công thức chung là CH3CHOH-COOH.
Cấu tạo phân tử của các axit lactic có cacbon bất đối xứng nên chúng có 2
đồng phân quang học là D - axit lactic và L - axit lactic. Hai đồng phân quang học
này có các tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau về khả năng quay mặt phẳng
phân cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái. Do đó, hai đồng phân quang
học này có tính chất sinh học khác nhau hoàn toàn (Anh, 2018).
3


Hình 2.1. Cấu trúc không gian 2 dạng đồng phân axit lactic (Anh, 2018)
Tính chất Axit lactic
Axit lactic là chất lỏng màu vàng đến không màu (ở 15°C và 1 atm) và khơng

mùi. Do đặc tính hút ẩm cao của axit lactic, nó thường được sử dụng dưới dạng
dung dịch đậm đặc tới 90% trọng lượng, hầu như không mùi và chứa một lượng
đáng kể axit lactoyllactic và các đồng phân axit lactic khác. Axit lactic hịa tan
hồn tồn trong nước, ethanol, dietyl ete và các dung môi hữu cơ khác. Nó gần
như khơng hịa tan trong benzen và chloroform. Các tính chất nhiệt động của axit
lactic được trình bày cụ thể trong bảng 1.1.
D- axit lactic và L- axit lactic là chất lỏng có nhiệt độ nóng chảy 16,8oC, độ
sơi 122oC, là chất kết tinh có thể hịa tan hịa tan hồn tồn trong H2O, rượu, tuy
nhiên khơng tan trong CHCl3. Axit lactic có khối lượng phân tử 98,08 và là một
chất hữu cơ khơng màu, có mùi nhẹ, một chất lỏng nhớt, hút ẩm cao, có sẵn trên
thị trường với các chất lượng khác nhau và tùy theo độ tinh khiết mà có các chỉ
tiêu khác nhau: axit lactic kỹ thuật, axit lactic thực phẩm, dược phẩm và nhựa. Ở
dạng đồng phân axit D- axit lactic hoặc L- axit lactic có nhiệt độ nóng chảy tương
ứng là 28oC và 103oC. Một tiêu chuẩn chất lượng quan trọng của acid lactic tinh
sạch cao là sự bền nhiệt, ví dụ: khơng màu tạo thành khi làm nóng dung dịch 80%
acid lactic đến 180 oC.
4


Bảng 2.1. Tính chất nhiệt động học của axit lactic
Tính chất

Giá trị

Mật độ ở 20o C (g/l)

1.249

Điểm nóng chảy oC

52,8 (Đ); 53,0 (L); 16,8 (DL)

Điểm sôi (° C)

82,0 (ĐL) a 0,5 mmHg; 122,0 (DL)
ở 15 mmHg; 103 (D) ở 15 mmHg

Hằng số phân ly (pKa) ở 25 ° C

3,83 (Đ); 3,79 (L)

Nhiệt dung (J / mol ∙ ° C) ở 20 ° C

3,83 (Đ); 3,79 (L)

Nhiệt dung dịch (kJ / mol) ở 25 ° C

7,79 (L)

Nhiệt của phản ứng tổng hợp (kJ/mol)

16,86 (L); 11,33 (ĐL)
(Andrea Komesu & cs., 2017)

Tùy thuộc vào bản chất của vi sinh vật mà các đồng phân được tạo ra là khác
nhau. Nhờ quá trình lên men cùng với hoạt động của vi sinh vật đã tạo ra axit
lactic. Tỷ trọng, độ nhớt, chiết suất và độ dẫn điện của dung dịch axit lactic trong
nước ở các nồng độ khác nhau (Chahal & Starr, 2000).
Ứng dụng và vai trò của axit lactic
Axit lactic cung cấp các thành phần tự nhiên cho các ứng dụng mỹ phẩm.

Chúng có nhiều đặc tính khác nhau như hoạt động kháng khuẩn, làm sáng và chăm
sóc da, nhưng chủ yếu được sử dụng làm chất dưỡng ẩm và điều chỉnh độ pH. Tác
dụng dưỡng ẩm liên quan trực tiếp đến khả năng giữ nước của lactate và tác dụng
làm sáng da của axit lactic được tạo ra bằng cách ức chế sự hình thành tyrosinase.
Vì chúng là một thành phần tự nhiên của cơ thể con người, axit lactic hoàn toàn
phù hợp với xu hướng hiện đại hướng tới các công thức tự nhiên và an toàn hơn,
đồng thời chúng tạo ra các tác dụng như làm sáng và trẻ hóa da. Đó là thành phần
hoạt chất rất hữu ích trong mỹ phẩm (Wee & cs., 2006).
Việc sử dụng axit lactic đang phát triển nhanh nhất là việc sử dụng nó làm
monomer để sản xuất axit polylactic hoặc polylactide (PLA). Nature Works LLC
sản xuất PLA thơng qua q trình trùng hợp lactide mở vòng (Henton & cs., 2005).
5


Lactide được tạo ra bằng cách ngưng tụ hai thực thể axit lactic. Axit lactic gần
đây đã nhận được rất nhiều sự chú ý như một monome nguyên liệu để sản xuất
PLA, được sử dụng làm nhựa hàng hóa có thể phân hủy sinh học. Axit lactic tinh
khiết về mặt quang học có thể được polyme hóa thành PLA có trọng lượng phân
tử cao thông qua các phản ứng nối tiếp polycondensation, depolyme hóa và trùng
hợp mở vịng. Polyme thu được có nhiều cơng dụng trong nhiều ứng dụng khác
nhau, chẳng hạn như quần áo bảo hộ, bao bì thực phẩm, chất phủ, túi đựng rác,
thùng chứa cứng, màng co và khay có thời hạn sử dụng ngắn. Với sự tăng trưởng
mạnh mẽ của thị trường PLA sẽ kích thích đáng kể nhu cầu sử dụng axit lactic
trong tương lai sắp tới (Wee & cs., 2006).
a) Trong thực phẩm
Ngành công nghiệp thực phẩm ăn được là ngành tiêu thụ lớn axit lactic và
lactate. Nó chủ yếu được sử dụng như một chất axit hóa và chất bảo quản. Axit
lactic có vị chua nhẹ và không lấn át mùi thơm yếu hơn, nó xuất hiện tự nhiên nên
nó khơng đưa các nguyên tố lạ vào thực phẩm và muối của nó rất dễ hịa tan, do
đó có thể thay thế một phần axit trong hệ thống đệm. Axit lactic và muối của nó

được sử dụng trong nhiều loại đồ uống, bánh kẹo, thịt và nước sốt. Canxi lactate
có thể được sử dụng trong nhiều loại thực phẩm để tạo ra sản phẩm tăng cường
canxi. Steroyl lactate và muối natri và canxi của nó được sử dụng trong bánh mì.
b) Trong cơng nghiệp
Có nhiều ứng dụng cơng nghiệp cho axit lactic và các dẫn xuất của nó, được
sử dụng trong các ngành công nghiệp mạ kim loại, mỹ phẩm, dệt may và da. Este
lactate được sử dụng trong sản xuất sơn và mực in, đồ điện tử và làm sạch kim
loại. Sản xuất axit lactic quy mơ cơng nghiệp địi hỏi một số lượng lớn vi khuẩn
được nuôi cấy trong môi trường thích hợp. Để thu được sản lượng cao và độ tinh
khiết, cần hạn chế nghiêm ngặt các chất gây ô nhiễm vi sinh vật trong trại giống
và trong sản xuất. Sản lượng axit lactic là từ 85 đến 95% dựa trên đường có thể
lên men. Các sản phẩm phụ lên men điển hình, chẳng hạn như axit formic và axit
axetic, được tìm thấy ở nồng độ dưới 0,5% tính theo trọng lượng. Trong quá trình
lên men để hạn chế tối đa các sản phẩm phụ nên chọn loại vi khuẩn đồng tính.
6


Tổng quan về L- axit lactic
Khái niệm L- axit lactic
Theo danh pháp IUPAC hoạt chất LA có tên hóa học là 2- Hydroxypropanoic.
Hoạt chất LA (C3H6O3) là một axit cacboxylic cùng với D- axit lactic là hai đồng
phân quang học của chất đối kháng axit lactic. Độ tinh khiết tối thiểu của hoạt
chất tạo ra là ≥ 95,5%w/w.
Theo Andrea Komesu & cs., 2017, với nhiệt độ 53,0°C được coi là nhiệt độ
nóng chảy của axit lactic tinh khiết, điểm sơi của axit lactic tinh khiết không xác
định được, nhưng được tính tốn là 204,2°C. Mật độ tương đối của LA là 1,213 ở
20°C. Áp suất hơi tính tốn cho LA tinh khiết là 0,4 Pa ở 20°C. LA tinh khiết có
thể trộn hồn tồn với nước và hịa tan cao trong metanol (78,6% w/w ở 20°C).
Tính chất L- axit lactic
Để sản xuất ra các polyme có khả năng phân hủy sinh học như poly- L- lactic

thì LA là một thành phần chính khơng thể thiếu. Axit lactic tổng hợp được tạo ra
từ các nguyên liệu hóa dầu là một hỗn hợp raxemia, không hoạt động về mặt
quang học. Sản xuất axit lactic tinh khiết trong công nghiệp chủ yếu dựa vào khả
năng lên men sinh tổng hợp LA từ các chủng vi khuẩn axit lactic và các chủng
nấm mốc như loài Rhizopus. Mặc dù Lactobacillus debruckii và các loại vi khuẩn
và nấm men biến đổi khác có thể tạo ra LA nhưng khi vi lọc hoặc ly tâm để làm
rõ dịch cấy rất tốn kém. Ngược lại, muối amoniac rẻ tiền có thể đóng vai trị là
nguồn nitơ cho R. oryzae và các tế bào dạng sợi có thể dễ dàng loại bỏ khỏi môi
trường nuôi cấy bằng cách lọc thô. Theo truyền thống, khi lên men glucose, tinh
bột với Rhizopus sp sẽ thu được lượng LA nhất định (Wee & cs., 2006).
Như vậy, khoảng 70% LA sản xuất đã được sử dụng trong ngành công nghiệp
thực phẩm. Hơn nữa, LA là ngun liệu thơ hữu ích để tổng hợp polylactide có
thể phân hủy sinh học (PLA), có một số ứng dụng bao gồm chỉ khâu phẫu thuật,
cấy ghép chỉnh hình, hệ thống và sản phẩm tiêu dùng dùng một lần. Do ứng dụng
rộng rãi và phổ biến của LA dẫn tới sự gia tăng về nhu cầu sử dụng LA, ước tính
7


với tốc độ tăng trưởng hằng năm 16,2% tương đương với mức độ tiêu thụ tồn
cầu ước tính khoảng 300 000– 400 000 tấn mỗi năm. Trong khi nhu cầu ước tính
vào năm 2013 là 714,2 kt và dự kiến sẽ đạt 1960,1 kt vào năm 2020, vì nó được
sử dụng để sản xuất axit polylactic và ethyl lactate. Chính vì vậy, với nhu cầu sử
dụng LA ngày càng gia tăng địi hỏi phải tìm kiếm một lộ trình sản xuất tốt hơn
với chi phí thấp và năng suất cải thiện (Ajala et al. , 2021).
Tổng hợp L- axit lactic từ vi sinh vật
LA được sản xuất thương mại trong quá trình lên men tinh bột hoặc glucose
với các vi khuẩn hoặc vi nấm trong sản xuất axit lactic như Rhizopus oryzae trong
mơi trường ni cấy chìm. Rhizopus sp. có thể tạo LA từ tinh bột nhưng hiệu suất
rất kém so với vi khuẩn lactic, tuy nhiên nhược điểm của Rhizopus oryzae là tạo
ra LA đồng phân duy nhất. Có thể tạo ra LA với hiệu suất 85% bằng việc sử dụng

lò phản ứng sinh học airlift trong điều kiện tối ưu. Hình thái sợi nấm khơng có lợi
cho q trình lên men vì chúng làm tăng độ nhớt của mơi trường và gây tắc nghẽn
trong q trình lấy mẫu. Việc điều chỉnh nồng độ bào tử được cấy trong môi trường
tiền nuôi cấy sẽ tạo ra các sợi nấm nhỏ của R. Oryzae (Narayanan & cs., 2004).
Trọng lượng phân tử trung bình nằm trong khoảng từ 2x 104 đến 6,8x 105
khi trùng hợp mở vòng của lactic. Nhưng khi tổng hợp PLA thông qua trùng hợp
monome axit lactic lại cho trong lượng phân tử trung bình thấp hơn là 1,6x 104
(Hyon & cs., 1997). Độ chuyển hóa monome và khối lượng phân tử trung bình
đạt cực đại ở nồng độ xúc tác là 0,05%. Nó tăng tuyến tính với thời gian trùng
hợp lên đến mức chuyển đổi monome tối đa là 80% nhưng sự giảm nhiệt của
polylactide tạo thành được quan sát thấy với độ giãn dài ở nhiệt độ trùng hợp cao
hơn (Narayanan & cs., 2004).
Ứng dụng của L- axit lactic (LA)
LA là đồng phân quang học của axit lactic nên có hoạt tính tương tự như axit
lactic. Có bốn ứng dụng hiện tại của LA: ứng dụng thực phẩm, mỹ phẩm, dược
phẩm và hóa chất (Chholten, 1971). Theo Wee & cs., 2006 axit lactic được sử
8


dụng thương mại trong ngành công nghiệp thịt và gia cầm, giúp sản phẩm có thời
hạn sử dụng lâu hơn, tăng hương vị và kiểm soát tốt hơn mầm bệnh từ thực phẩm.
Các polyme gốc axit LA có thể tạo ra các homopolyme mạch thẳng với kích
thước phân tử >70 kDa. Các lĩnh vực ứng dụng chính của PLA là các ứng dụng y
tế, và một số công ty đã cố gắng sản xuất polyme dựa trên axit lactic và các sản
phẩm của họ. Các ứng dụng y tế này bao gồm việc sử dụng PLA nếu nó có các
đặc tính khác nhau về độ bền kéo, độ nhớt, độ tinh khiết, v.v. (Zhang & cs., 2007).
Các ứng dụng của PLA ở dạng rắn được sử dụng để lấp đầy các khoảng trống
trong xương, ở dạng rắn để sản xuất chỉ khâu y tế và cuối cùng ở dạng keo để cấy
ghép màng hoặc ghép da mỏng ở người (Shikinami & cs., 2002).
Việc sử dụng axit lactic phát triển nhanh nhất là sử dụng nó như một chất đồng

phân để sản xuất axit polylactic (PLA). NatureWorks LLC sản xuất PLA thơng
qua trùng hợp lactide mở vịng. Đồng phân LA là thành phần chính của PLA. Các
ứng dụng của PLA bao gồm hộp đựng cho ngành công nghiệp thực phẩm và đồ
uống, màng và hộp đựng cứng để đóng gói và đồ dùng phục vụ (cốc, đĩa, đồ dùng).
Polyme PLA cũng có thể được kéo thành sợi và sử dụng trong quần áo, hàng dệt
(gối), thảm và các ứng dụng không dệt như khăn lau (Chahal & Starr., 2000).
Tổng quan về nấm mốc sinh L- axit lactic
Nấm là vi sinh vật chính để sản xuất axit hữu cơ trong cơng nghiệp, chúng
thực hiện quá trình trao đổi chất theo cách chuyển hóa glucose để tạo ra axit hữu
cơ (Nguyễn Quốc Việt & cs., 2015). Trong công nghiệp, các vi khuẩn axit lactic
và một số nấm sợi thuộc chi Rhizopus đặc biệt là Rhizopus oryzae là một trong
những thành phần tạo ra axit lactic. Thơng thường, khả năng lên men và tích lũy
axit lactic của R. oryzae thấp hơn so với vi khuẩn axit lactic, nhưng R. Oryzae lại
có lợi thế trong quá trình lên men là tạo ra đồng phân duy nhất là LA từ các nguyên
liệu tái tạo như đường glucose, tinh bột...
Nấm Rhizopus oryzae
Rhizopus oryzae là vi sinh vật quan trọng trong q trình lên men cơng
nghiệp, được sử dụng rộng rãi để sản xuất LA và các axit hữu cơ khác. Bởi vì nó
chỉ có thể tạo ra một sản phẩm (LA) và không phải là hỗn hợp raxemia, nó vừa là
9


chất axit hóa vừa là chất bảo quản. Việc sử dụng nhựa phân hủy sinh học PLA
thúc đẩy hơn nữa việc ứng dụng LA (Wang et al., 2005). Phân loại khoa học được
thống nhất nhất cho rằng loài Rhizopus oryzae nằm trong số các sinh vật nhân
chuẩn trong cây phát sinh loài phổ quát và được phân loại theo chi Rhizopus, họ
Mucoraceae theo thứ tự Mucorales của ngành Zygomycota (Wu & cs., 2011b)
Chi Rhizopus thuộc bộ Mucorales trong Zygomycetes. Chi được đặc trưng
bởi sự hình thành của một thân rễ. Một số phân lập của R. oryzae ký sinh trên thực
vật hoặc con người, nhưng R. oryzae bao gồm các lồi có khả năng sản xuất axit hữu

cơ một cách hiệu quả. Một ví dụ đáng chú ý về việc sử dụng nó như một nhà sản
xuất axit hữu cơ là sản xuất đồ uống có cồn. Trong số các axit hữu cơ đó, axit lactic
được coi là cơ chất quan trọng để sản xuất nhựa phân hủy sinh học và chất bảo quản
thực phẩm (Abe et al., 2003). Tuy nhiên, Das et al., 2014 cho thấy không phải tất cả
các lồi thuộc chủng R. Oryzae đều có khả năng lên men sinh tổng hợp LA.
Vai trò và ứng dụng nấm mốc
Các quy trình chế biến thực phẩm liên quan đến q trình lên men đều cần
có sự hiện diện của vi sinh vật, bao gồm cả nấm mốc. Nấm mốc giúp tổng hợp
các chất kháng sinh (penicillin, griseofulvin), axit hữu cơ (axit oxalic, citric,
gluconic...), vitamin (nhóm B, riboflavin), hormone (gibberellin, auxin,
cytokinin), một số enzym và các hoạt chất khác dùng trong công nghiệp thực
phẩm và y, dược... đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Ngoài ra, nấm cịn có
vai trị quan trọng trong việc phân giải chất hữu cơ trả lại độ phì nhiêu cho đất.
Một số loài gây hại cho động vật và thực vật như: Rhizopus, Mucor, Candida
gây bệnh cho người, Microsporum gây bệnh cho chó, Aspergillus fumigatus gây
bệnh cho chim, Phytophthora, Fusarium, Cercospora gây bệnh trên cây trồng....
Đặc biệt là các loại nấm Aspergilus flavus và Aspergillus fumigatus phát triển trên
ngũ cốc trong điều kiện thuận lợi sẽ sinh ra độc tố aflatoxin.
Bên cạnh tác hại, một số lồi nấm mốc cịn rất có ích trong sản xuất và đời
sống như nấm ăn, nấm dược liệu (nấm linh chi, Penicillium notatum tổng hợp
penicillin, Penicillium griseofulvum tổng hợp griseofulvin...) Nấm Aspergillus
10


niger tổng hợp các axit hữu cơ như axit xitric, axit gluconic, một số lồi nấm thuộc
nhóm Phycomycetina hoặc Deuteromycetina có thể ký sinh trên cơn trùng gây
hại, qua đó có thể sử dụng làm thiên địch để diệt cơn trùng. Một số giống Rhizopus
tham gia vào quá trình lên men để tạo ra nhựa phân hủy sinh học (PLA). Ngoài
ra, các loại nấm sống cộng sinh với cây trồng như Mycorrhizae giúp rễ cây hấp
thụ nhiều phân vô cơ khó tan hơn và cung cấp cho nhu cầu sinh trưởng của cây.

Nhựa phân hủy sinh học polylactic acid (PLA)
Axit poly lactid (PLA) có cơng thức hóa học (C3H4O2)n. PLA thuộc nhóm
poly (α-hydroxy ester), được điều chế từ nguồn tinh bột tự nhiên là glucose (chủ
yếu từ tinh bột ngô).
Axit polylactic (PLA) là một polyester aliphatic thủy phân. Tốc độ thủy phân
polyme tăng theo thời gian, và điều này là do khả năng phản ứng cao của este cuối
cùng và động học của quá trình tự xúc tác. Kết quả thủy phân dung dịch được
kiểm tra và thấy phù hợp với phương trình dẫn xuất. Quá trình thủy phân cũng
được thực hiện với polycaprolactone (PCL) trong acetonitril, trong đó động học
phản ứng được phát hiện là khác với PLA (Siparsky et al., 1998).
Axit polylactic (PLA) là một polyme phân hủy sinh học với các tính chất đặc
biệt đã được nghiên cứu rộng rãi trong 25 năm qua. Axit polylactic là một trong
những tác nhân tạo màng sinh học hứa hẹn nhất được sử dụng trên thế giới hiện
nay. Do nguồn gốc hữu cơ của nó, nó đã thu hút nhiều sự chú ý của các nhà nghiên
cứu trong những năm gần đây (Davachi & cs., 2015)

Hình 2.2 Công thức cấu tạo của PLA
11


Nhựa phân hủy sinh học PLA là một loại nhựa sinh học nhiệt dẻo có nguồn
gốc từ thực vật như bột bắp, bột sắn, mía, tinh bột khoai tây… Do đó, chúng có
khả năng tự phân hủy mà khơng cần đến bất kỳ tác động nào khác từ con người
và được dùng để sản xuất các vật dụng hàng ngày như bao bì thực phẩm, khay,
ly, cốc, màng bọc thực phẩm, màng bọc thực vật, dụng cụ y tế,… Đây là nguồn
nguyên liệu tái tạo, sau khi sử dụng, chúng được phân hủy bởi vi sinh vật và được
sử dụng để bón cho cây trồng như phân vi sinh. Bề mặt nhựa PLA có khả năng
thẩm thấu tốt giúp sinh vật dễ dàng xâm nhập thúc đẩy quá trình phân hủy tự
nhiên. Dưới tác động của các vi sinh vật trong mơi trường tự nhiên, nhựa PLA có
thể phân hủy thành carbon dioxide, nước và mùn sinh học, tốt cho cây trồng và

khơng gây ơ nhiễm mơi trường.
Tình hình nghiên cứu nấm mốc sinh tổng hợp L- axit lactic trong và
ngoài nước
Khả năng sinh acid lactic từ nấm sợi Rhizopus oryzae đã được nghiên cứu ở
một số quốc gia trên thế giới. Ở Indonesia, những nghiên cứu này vẫn còn hạn chế.
Năm 2014, Kurniawati và cộng sự đã phân lập được 4 chủng từ quả bơ và ổi thối có
khả năng sinh axit lactic (AT1, JT1, AT2 và AT3) (Kurniawati & cs., 2014).
Rhizopus oryzae ATCC 52311 được sử dụng để chuyển đổi glucose thành
axit L-lactic tinh khiết về mặt quang học, điều thú vị nhất đồng phân cho ngành
công nghiệp thực phẩm vì cơ thể con người chỉ thích nghi để đồng hóa chất này.
Ảnh hưởng của sục khí, nồng độ chất cấy, pH và bổ sung canxi cacbonat được
phân tích bằng cách sử dụng bình lắc để thu được kích thước đồng nhất của các
viên sợi nấm (đường kính từ 1 đến 2 mm) từ Rhizopus oryzae và tối ưu hóa nồng
độ L- axit lactic và năng suất thể tích. Năng suất thể tích cao nhất (1,13 g lít axit
L-lactic-1h-1) đạt được trong điều kiện sục khí thấp, nồng độ bào tử cao và nồng
độ canxi cacbonat cao nhất. Kích thước đồng nhất của các viên sợi nấm cũng thu
được trong các điều kiện này(Domínguez & Vázquez, 1999).

12


Hiện nay, tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã sử dụng
Gen Lactate Dehydrogenease (LDH) làm chỉ thị phân tử cho sàng lọc các chủng
Rhizopus Oryzae sinh Lactic acid cao. Trong nghiên cứu này, từ 23 chủng
Rhizopus được phân lập định hướng từ các mẫu đất, hoa quả và bánh men rượu.
Chọn ra được 4 chủng kí hiệu là CN01, DL11, VLSH-LA01 và Rh. Các chủng
này được xác định là thuộc vào loài R. Oryzae và được đặt tên là R. Oryzae CN01,
R. Oryzae DL11, R. Oryzae VLSH-LA01, R. Oryzae Rh. Trong đó, ba chủng R.
Oryzae CN01, R. Oryzae DL11, R. Oryzae Rh khi lên men có thể tạo nên 60g/l
lactic axit từ 120g/l glucose. Chủng R. Oryzae VLSH-LA01 sau khi lên men 90h

có thể tích lũy trên 62g/l lactic axit (Nguyễn Quốc Việt & cs. 2015).

13


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Phịng Cơng nghệ sinh học Tái tạo Môi trường – Viện
Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Thời gian nghiên cứu: Từ 08/2022 đến 2/2023.
Vật liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
Các chủng nấm mốc được phân lập từ hoa quả thối, hỏng thu nhận quanh
khu vực Gia Lâm- Hà nội.
Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
Hóa chất:
Các hóa chất dùng trong nghiên cứu vi sinh vật và một số hóa chất khác như:
Tinh bột tan, glucose, fructose, saccharose, cao nấm men, maltose, cao thịt,
K2HPO4, KH2PO4 , MgSO4,...
Các nguồn Nitrogen: NH4Cl, NH4NO3, yeast extract, (NH4)2SO4.
Các nguồn cacbon: glucose, maltose, tinh bột, xylose, lactose.
Dụng cụ và thiết bị:
Các dụng cụ và thiết bị sử dụng thuộc phịng thí nghiệm Công nghệ Sinh học
Tái tạo Môi trường - Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng
nghệ Việt Nam: Cân kỹ thuật, cân phân tích, kính hiển vi quang học, máy lắc, tủ
ấm, Pipet man các loại, tủ lạnh, lị vi sóng,...
Mơi trường sử dụng trong nghiên cứu
Môi trường PDA (g/l) : khoai tây: 200; glucose: 20; agar: 16; guaiacol:
0.01%; kháng sinh 1%; CaCO3: 0.3%
Môi trường sinh tổng hợp L- axit lactic (g/l): Saccharose: 60; (NH4)2SO4:

1,35; MgSO4.7H2O: 0,25; ZnSO4.7H2O: 0,04; KH2PO4: 0,3

14