Hệ enzymes amylase ứng dụng trong sản xuất bia

1
Tinh bột, cùng với protein và chất béo là một thành phần quan trọng bậc nhất trong
chế độ dinh dưỡng của loài người cũng như nhiều loài động vật khác. Người La Mã gọi là
amilum, một từ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp (amilon). Trong quá trình tiêu hóa chúng bị
thủy phân thành đường glucose là chất tạo nên nguồn năng lượng chính trong thực phẩm.
Ngoài ra tinh bột còn giữ vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm do
những tính chất hóa lý của chúng. Tinh bột thường được dùng làm chất tạo độ nhớt sánh
cho các thực phẩm dạng lỏng, là tác nhân làm bền cho thực phẩm dạng keo, là các yếu tố
kết dính và làm đặc để tạo độ cứng, độ đàn hồi cho nhiều loại thực phẩm. Bên cạnh đó,
tinh bột còn được dùng trong các ngành công nghiệp khác như sản xuất giấy, rượu,
Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngô (sắn),
còn riêng ở nước ta thì sử dụng gạo và khoai mì là nguồn tinh bột chủ yếu. Trong chế biến
tinh bột và đường, công đoạn quan trọng nhất là thuỷ phân tinh bột về các đường đơn
giản. Sau đó, chủ yếu trên cơ sở đường đơn nhờ lên men, người ta sẽ nhận được rất nhiều
sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, các loại acid hữu cơ, amino acid,…
Trước đây người ta hay dùng acid hoặc H
2
SO
4
để thủy phân tinh bột. Nhưng kết quả cho
thấy, thuỷ phân bằng acid rất khó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong
muốn và không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm trong khi giá thành lại cao. Cho
nên hiện nay để thủy phân tinh bột người ta thường sử dụng enzyme amylase thu nhận từ
thực vật hoặc các loại vi sinh vật.
Ngoài ra, amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thuỷ phân tinh
bột như năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho
quá trình tinh sạch dịch đường. Nguồn amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch
(malt), hạt bắp nảy mầm, hay từ nấm mốc,… Trong đó Amylase được thu nhận từ malt
với số lượng nhiều nhất, chủ yếu dùng trong sản xuất bia. Nguyên liệu cho sản xuất
enzyme thường là gạo, bắp, khoai mì,… đây là những nguồn nguyên liệu rẻ tiền có thể
tìm thấy dễ dàng ở nước ta. Cho nên đây là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh có thể

làm cơ sở cho nhiều ngành khác phát triển.
2
3
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU VỀ ENZYME AMYLASE
1.1 Lịch sử nghiên cứu:
Vào đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được các chất gây ra quá trình
lên men. Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg đã phát hiện nước chiết của mấm
đại mạch có khả năng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ từ 400
0
C – 600
0
C. Năm
1833, hai nhà bác học người Pháp là Payen và Perso đã chứng minh chất có hoạt động
phân giải tinh bột thành đường có thể tách được ở dạng bột. Thí nghiệm này được tiến
hành bằng cách cho etanol vào dịch chiết của lúa đại mạch nẩy mầm thì thấy xuất hiện kết
tủa. Kết tủa được hình thành này có khả năng chuyển hóa tinh bột nếu đun kết tủa này sẽ
mất tác dụng chuyển hóa. Danh từ diastase là do Payen và Persor dùng để gọi enzyme lúc
bấy giờ (xuất phát từ tiếng Hy Lạp, diastatics, có nghĩa là phân giải, đó là amylase).
1.2 Enzyme Amylase là gì?
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này
thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm
polysaccharide với sự tham gia của nước.
RR’ + H-OH  RH + R’OH
Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và
dextrin hạn chế. Các enzyme amylase có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin), trong
dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và
vi khuẩn. Trong nước bọt của người có ptyalin nhưng ở một số loại động vật có vú thì
không có như ngựa, chó, mèo Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ miệng và quá trình
này hoàn tất ở ruột non nhờ Amylase của tuyến tụy (còn được gọi là amylopsin). Amylase
của malt thủy phân tinh bột lúa mạch thành disaccharide làm cơ chất cho quá trình lên

men bởi nấm men.
Amylase là một trong những loại enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong
công nghiệp, y tế, và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là trong ngành công nghiệp
thực phẩm.
4
CHƯƠNG II: TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE
2.1. Phân loại:
Hiện nay, có sáu loại enzyme amylase được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase
(enzyme nội bào) và Exoamylase (enzyme ngoại bào).
- Endoamylase: gồm có α-amylase (EC 3.2.1.) và nhóm enzyme khử nhánh.
Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase (hay
α-dextrin 6-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.41); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-
1,6-glucosidase) (EC 3.2.1.20) và amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10). Các enzyme này
thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide.
- Exoamylase: Đây là những enzyme thủy phân tinh bột tử đầu không khử của
chuỗi polysaccharide. Nhóm này gồm có:
+ β-amylase (EC 3.2.1.2).
+ Amyloglucosidase (glucoamylase hay γ-amylase) (EC 3.2.1.3).
Enzyme amylase được phân loại theo sơ đồ
sau:
Amylase
Exoamylase
β-Amylase
γ-Amylase
Endoamylase
Enzym khử nhánh
α-Amylase
Khử trực tiếp
α-dextrin 6-glucanohydrolase
(pullulanase)

Khử gián tiếp
5
oligo-1,6-glucosidase
(transglucosylase)
Và amylo 1,6-glucosidase
 Sự khác biệt giữa các loại enzyme Amylase:
- Các loại enzyme amylase không chỉ khác nhau ở đặc tính mà còn khác
nhau ở pH hoạt động và tính ổn định với nhiệt
- Tốc độ phản ứng của amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ polyme
hóa của cơ chất. Các enzyme amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có tính chất, cơ chế tác
dụng và sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác nhau.
- Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có thành phần, tính chất, nhiệt độ
hoạt động, pH tối ưu và các đặc điểm thủy phân khác nhau.
2.2. Hệ enzyme amylase:
2.2.1. Enzyme α-amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1):
a) Cấu tạo:
6
Enzyme α-amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng
50.000 đến 60.000 Dal. Có một số trường hợp đặc biệt như α-amylase từ loài vi khuẩn
Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal. Đến nay người ta đã biết rất rõ
các chuỗi acid amin của 18 loại α-amylase nhưng chỉ có 2 loại α-amylase là taka-amylase
từ Apergillus orysee và α-amylase của tụy lợn được nghiên cứu kỹ về hình thể không gian
cấu trúc bậc 3. Mới đây các nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗi mạch acid amin và về
vùng kị nước cho thấy các chuỗi mạch acid amin của tất cả các enzyme α-amylase đều có
cấu trúc bậc 3 tương tự nhau.
b) Cơ chế tác dụng của α-
Amylase:
α-amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-amylase có
khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glycoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh
bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-amylase không

chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất
chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn:
+ Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): Chỉ một số phân tử cơ chất bị
thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh
bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).
+ Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp tạo
thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất
7
Hình 1:
này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới
tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6 - 7
gốc glucose (vì vậy, người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn
6 - 7 gốc glucopiranose 1).
+ Sau đó, các poliglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch
polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và
maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13%
glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự
nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử
amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói
trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%.
Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành
maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-
amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với
Iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng
của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase
dịch hóa.
Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase:
+ Giai đoạn dextrin hóa:
Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp

+ Giai đoạn đường hóa:
Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide
Amylase oligosacharide poliglucose
Maltose maltotriose maltotetrose
c) Đặc tính α-amylase:
α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi
loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-amylase là một protein giàu
8
α-Amylase
tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm
khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme:
 α-amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine.
 Trọng lượng phân tử của α-amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da (Knir
1956; Fisher, Stein, 1960).
 Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng.
 Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline.
Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2 - 5,7 (Bernfeld P, 1951).
α-amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-30
nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 - 6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sự
hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme
(Modolova, 1965). Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động
bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử
α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. α-
amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm
lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg
2+
. Tất cả các amylase đều bị kiềm hãm bởi các
kim loại nặng như Cu
2+
, Ag

+
, Hg
2+
. Một số kim loại như : Li
+
, Na
+
, Cr
3+
, Mn
2+
, Zn
2+
, Co
2+
,
Sn
2+
, Cr
3+
, không có ảnh hưởng mấy đến α-amylase. Một đặc điểm cần lưu ý là hầu hết α-
amylase khá bền với tác động của protease như: pepsin, trypsin, papain
Thành phần amino acid của α-amylase ở nấm mốc Aspergillus như sau (g/100 g
protein): alamine = 6,8 ; glycine = 6,6 ; valine = 6,9 ; leucine = 8,3 ; Isoleucine = 5,2 ;
prolin = 4,2 ; phenylalanine = 4,2 ; tyrosine = 9,5 ; trytophan = 4,0; xetin = 6,5 ; trionin =
10,7 ; cystein + cystine = 1,6 ; glutamic acid = 6,9 ; amide = 1,5 (Akabori et amilose
1954). Không giống các α-amylase khác, amylase của Asp.orysee có chứa phần phi
protein là polysaccharide. Polyose này bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 mol
hexosemin trên 1 mol enzyme (Akabori et amilose, 1965). Vai trò của polyose này vẫn
chưa rõ, song đã biết được rằng nó không tham gia vào thành phần của trung tâm hoạt

động và nằm ở phía trong phân tử enzyme.
α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tổn.
Sản phẩm cuối cùng của thủy phân amylase là glucose và maltose. Đối với nấm sợi tỉ lệ là
1:3,79 (Hanrahan, Caldwell, 1953). Fenikxova và Eromsina (1991) cho biết rằng các
maltopentose và maltohexose bị thủy phân theo sơ đồ sau:
G5 G4 + G1; G6  G2 + G4 hay 2G3 (chính) hoặc G5 + G1 (ít)
9
α-amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-1,6-glycoside của
amylopectin, nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh. Đây là
một cấu trúc phân tử tinh bột do enzyme α-amylase phân cắt tạo thành dextrin tới hạn
phân nhánh.
Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của amylase nấm sợi
chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose. Nồng độ α-amylase của VSV tương đối lớn có
thể chuyển hóa 70 - 85% tinh bột thành đường lên men. Còn các α-amylase của nấm mốc
thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84 - 87%.
Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không
giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,0 - 4,8 (có thể hoạt
động tốt trong vùng pH từ 4,5 - 5,8). Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động
dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ Asp.orysee trong vùng 5,6 - 6,2. Còn
theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0 - 7,0.
Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau. α-amylase của
Asp.orysee bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis.
Ở pH= 3,6 và 0
o
C, α-amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 - 30 phút; α-amylase
vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-amylase của nấm sợi hình như
không giảm bao nhiêu (Fenilxova, Rmoshinoi 1989). Trong dung dịch α-amylase nấm sợi
bảo quản tốt ở pH= 5,0 - 5,5; α-amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH
từ 2,5-2,8. Ở 0
o

C và pH= 2,5, nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau
cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt. Nhiệt
độ tối thích của nó là 50
0
C và bị vô hoạt ở 70
0
C (Kozmina, 1991).
Trong dung dịch đệm pH = 4,7, α-amylase của Asp.orysee rất nhạy với tác động
của nhiệt độ cao, thậm chí ở 40
0
C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22 -
29%, hoạt lực đường hóa còn 27 - 85%. Ở 50
0
C trong 2 giờ, α-amylase của nấm sợi này
bị vô hoạt hoàn toàn (Miller và cộng sự).
Bảng 1: Một số tính chất của α-Amylase từ vi sinh vật
Tên vi sinh vật pH
opt
T
opt
Phân tử lượng
(kD)
Bacillus acidocaldarius 3,5 75 68
Bacillus
stearothermophilus
4,5 – 6,5 65 – 73 48
10
Bacillus subtilis 5,3 – 6,4 50 47
Acinetobacter sp.I 7,0 50 – 55 55

Acinetobacter sp.II 7,0 50 – 55 65
Bacteroides amylophilus 6,3 43 92
Micrococcus halobius 6,0 – 7,0 50 – 55 89
Streptomyces
hygroscopicus
5,0 – 6,0 50 – 55 48
Streptomyces aureofaciens 4,6 – 5,3 40 40
Thermonospora curvata 5,5 – 6,0 65 62
Aspergillus prysee 5,5 – 5,9 40 52
Mucor pusillus 3,5 – 4,0 65 – 70 48
Lipomyces kononenkaae 5,5 40 38
Schwaniomyces castellii 6,0 60 40
(nguồn: http//www.luanvan.co)
2.2.2. Enzyme β-amylase (β-1,4-glucan-maltohydrolase) (EC 3.2.1.2):
a) Cấu tạo:
β-amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm. Ở trong các
hạt ngũ cốc nảy mầm, β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết 1,4- α-glucan trong
tinh bột, glycogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của
mạch. Maltose được tạo thành do sự xúc tác của β-amylase có cấu hình β.
Ở ngũ cốc, β-amylase tham gia vào sự phân giải của tinh bột trong quá trình
nảy mầm của hạt. Ở lúa, β-amylase được tổng hợp trong suốt quá trình của hạt và hầu như
không được tổng hợp ở hạt khô. Ở lúa mạch, enzyme có mặt ở trong hạt khô, nó được tích
lũy trong suốt quá trình phát triển của hạt, khi ở dạng liên kết, enzyme này là một phân tử
có trọng lượng phân tử là 64.000 Da và khi bị phân cắt bởi một protease sẽ được phóng
thích dưới dạng tự do và có khối lượng phân tử là 59.000 Da.
11
Hình 2:
b) Cơ chế tác dụng của β-amylase:
β-amylase là một enzyme ngoại bào (exoenzyme). Tiến trình phân giải bắt đầu
từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất. β-amylase phân cắt các liên kết α-

1,4-glycoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4-glycoside đứng kế cận liên kết α-1,6-
glycoside thì nó sẽ ngừng tác dụng. Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có
chứa rất nhiều liên kết α-1,6- glycoside và được gọi là β-dextrin.
Cơ chế tác dụng của β-amylase lên tinh bột:
Tinh bột maltose (54-58%)+ β-dextrin(42-46%)
(glycogen)
Tinh bột bị thuỷ phân đồng thời bởi cả α và β-amylase thì lượng tinh bột thủy
phân tới 95%.
c) Đặc tính của β-amylase:
β-amylase là một albumin, tâm xúc tác có chứa nhóm –SH, nhóm X-COOH và
vòng imidazol của các gốc histidine và là enzyme ngoại bào (exoenzyme).
β-amylase không bền khi có Ca
2+
, β-amylase bị kìm hãm bởi Cu
2+
, Hg
2+
, urea,
iodineoacetamide, iodine, ozon…
β-amylase chịu nhiệt kém hơn α-amylase nhưng bền hơn với acid. β-amylase bị
bất hoạt ở nhiệt độ 70
0
C. Nhiệt độ tối thích của β-amylase là 55
0
C, pH 5,1 – 5,5.
12
- amylase
β
→
Tham gia vào cơ chế tác dụng của β-amylase thường có một nhóm caboxyl thể

hiện tính chất ái nhân và một nhóm imidazol thể hiện tính chất ái electron. Sự nghịch đảo
hình thể của cacbon anome (C1) được thực hiện nhờ việc tạo thành hợp chất đồng hoá trị
trung gian kiểu este axetal giữa cacbon anome và nhóm cacboxyl của tâm hoạt động. Sau
đó ester này bị phân hủy bởi tác động của 1 phân tử nước lên nhóm cacboxyl để giải
phóng ra α-maltose và hoàn nguyên nhóm cacbxyl của enzyme.
Bảng 2: Một số tính chất của β-amylase
Nguồn gốc enzyme pH
opt
T
opt
Phân tử lượng
(kD)
Đại mạch 5,2 - 56
Lúa mì 5,2 – 5,6 55 64,2
Đỗ tương 5,4 55 57
Khoai lang 5,0 – 6,0 50 – 55 50
B.cerus 7,0 40 58
B.polymyxa 7,5 40 42
B.megaterium 6,5 40 - 65 58
(nguồn: http/www.luanvan.co)
2.2.3. Enzyme γ-amylase (glucoamylase) (EC 3.2.1.3):
a) Cấu tạo:
γ-amylase (glucoamylase hay α-1,4-glucan-glucohydrolase) là những enzyme
có thể thủy phân được cả hai kiểu liên kết của các mạch α-glucan để giải phóng ra ở dạng
β. Glucoamylase hay γ-amylase chủ yếu được tạo ra bởi các vi sinh vật. Đặc biệt là kiểu
nấm mốc aspergillus, penicillium và Rhizopus.
Amyloglucosidase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng dao
động rất lớn từ 27.000 đến 112.000 Dal tuỳ thuộc vào nguồn gốc của enzyme.
Nói chung thì các amyloglucosidase đều chứa các gốc methioni, tritophan, và
một nửa gốc cystein. Tuy nhiên mối quan hệ giữa chuỗi acid amin, cấu trúc bậc 3 và hoạt

động của enzyme vẫn chưa được làm sáng tỏ tất cả các amyloglucosidase từ nấm mốc đều
13
là glucoprotein chứa từ 5 - 20% gluxit trong đó chủ yếu là các monosaccharide, glucose,
mannose, galactose và glucosamin.
Các amyloglucosidase chủ yếu được tạo nên từ hai isoenzyme I và II khác nhau ở
khả năng thủy phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi độ bền của chúng. Amyloglucosidase I
tự hấp thụ và thủy phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lại amyloglucosidase II không có
cả hai tính chất này.
Hình 3:
b) Cơ chế tác dụng:
Amyloglucosidase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thủy phân lặp
lại nhiều lần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử, chúng cũng thủy
phân được các liên kết α-1,6 và α-1,3 nhưng rất chậm (10 - 30 lần). Tốc độ thủy phân
cũng phụ thuộc vào bản chất của các liên kết kề cận với các liên kết glycoside được thủy
phân, cũng như kích thước và cấu trúc của cơ chất bị thủy phân. Nhất là với các α-glucan
mạch dài (amylose và amylopectin) thì bị thủy phân nhanh hơn là với các maltodextrin và
các oligosaccharide.
c) Tính chất:
Glucoamylase có khả năng thủy phân các liên kết α-1,4 lẫn α-1,6-glycoside.
Khi thủy phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần
lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose. Enzyme này
có nhiều tên gọi khác nhau: α-1,4; α-1,6-glucan-4; 6-glucohydrolase; glucoamylase;
amyloglucosidase, taka-amylase B; γ-amylase… Là enzyme ngoại bào.
Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6-glycoside, glucoamylase còn có khả năng
thủy phân các liên kết α-1,2 và α-1,3-glycoside .
14
Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen,
amylopectin, dextrin, panose, iso maltose và maltose thành glucose, mà không cần có sự
tham gia của các loại enzyme khác. Glucoamylase thủy giải các polysaccharide có phân
tử lớn nhanh hơn so với các chất có phân tử nhỏ. Các polysaccharide có nhánh như

amylopectin, glycogen, β-dextrin bị glucoamylase thủy phân khá nhanh.
Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng có pH 3,5 – 5,5 và nhiệt độ
50
0
C. Nó bền với acid hơn α-amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và không
được bảo vệ bởi Ca
2+
.
2.2.4. Oligo 1,6-glucosidase (dextrinase tới hạn) (EC 3.2.1.10):
Enzyme này có thể thủy phân liên kết α-1,6-glycoside trong isomaltose, panose
và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được. Enzyme này có ở VSV nhưng
đồng thời cũng có trong các hạt nảy mầm (đại mạch, thóc nảy mầm). Ngoài oligo–1,6–
glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc, hạt nảy mầm còn có amylopectin–1,6–
glucosidase hay R–Enzyme và dextrin–1,6–glycoside hay amylo–1,6–gluyoside hay
dextrin-6-glucocanhydrolase. Hai loại enzyme này đều thủy phân dextrin triệt để hơn α-
amylase và β-amylase do đó trong dung dịch thủy phân có nhiều maltose hơn.
Nhiệt độ tối thích cho các hoạt động của các dextrinase là 40
0
C và pH tối thích là 5,1.
2.2.5. Enzyme pullulanase (α-dextrin 6-glucosidase) (EC 3.2.1.41):
Enzyme này có thể thủy phân các liên kết α-1,6 của tinh bột, glycogen, pululan
và các dextrin tới hạn. Điều đáng chú ý là sự định vị của các liên kết α-1,6 có ảnh hưởng
lớn đến tác động của enzyme. Đặc biệt là sự có mặt của hai liên kết α-1,4 nằm liền kề bên
liên kết α-1,6 là điều kiện cần thiết cho enzyme phân cắt liên kết này.
Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6-glycoside bị bao quanh tứ phía bởi các liên
kết α-1,4. Nó còn có khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp chỉ gồm có hai
gốc maltose nối nhau bằng liên kết α-1,6-glycoside. Tác dụng hiệp đồng của α-amylase và
pullulanase làm nó bị thủy phân hoàn toàn.
15
Hình 4:

2.2.6. α-glucosidase hay maltase (α-D,glucoside-glucohydrolase) (EC 3.2.1.20):
Nhiều loại nấm sợi sản sinh enzyme này. Giống như glucomylase, nó thủy phân
maltose thành glucose nhưng không thủy phân tinh bột. Maltase và glucozyltranferase là
là một enzyme đồng vừa có khả năng thủy phân liên kết α-1,4, trong các glucopyranoside
vừa có khả năng chuyển các gốc glycoside sang đường và rượu.
2.3. Cơ chất:
Cơ chất tác dụng của enzyme amylase là tinh bột và glucose.
2.3.1. Tinh bột:
Là polysaccharide thực vật chủ yếu có trong các loại củ như khoai lang, khoai
tây, khoai mì…, trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt hòa thảo. Hạt tinh bột có hình dáng rất
khác nhau với kích thước từ 0,02 đến 0,12mm.
Tinh bột là chất keo háo nước điển hình cấu tạo từ amylose và amylopectin. Tỷ
số amylose và amylopectin trong tinh bột thường vào khoảng 1 : 4. Cả hai đều tạo những
gốc α-D-glucose. Ngoài amylose và amylopectin trong tinh bột còn có chứa một lượng
nhỏ các chất khác như muối khoáng, chất béo, protide… Hàm lượng chung của chúng
khoảng 0,2 – 0,7%.
16
Tinh bột không hòa tan trong nước lạnh, trong rượu và ete. Amylose dễ tan
trong nước nóng và tạo nên độ nhớt của dung dịch. Amylopectin khi hòa tan trong nước
nóng tạo dung dịch rất nhớt.
Trong nước nóng tinh bột sẽ hút nước trương nở và tạo dạng gel. Mức độ
trương của tinh bột phụ thuộc nhiệt độ. Khi tăng dần nhiệt độ, dịch tinh bột sẽ biến thành
dạng keo và gọi là hồ tinh bột. Nhiệt độ làm cho hồ tinh bột có độ nhớt cực đại gọi là
nhiệt độ hồ hóa của tinh bột. Trong thực tế luôn luôn tồn tại một giới hạn nhiệt độ hồ hóa,
vì tinh bột của nguyên liệu bất kì đều gồm nhiều hạt có kích thước khác nhau.
+ Amylose: Có cấu tạo chuỗi không phân nhánh, mạch thẳng cấu tạo từ các
gốc α–D-glucopyranose, liên kết với nhau bởi gốc α-1,4-glycoside, dài khoảng 300 –
1000 gốc glucose, xoắn theo chiều lò xo mỗi xoắn có 6 gốc glucose tạo thành hình lục
giác. Cấu trúc xoắn được giữ vững nhờ các liên kết hydro được tạo thành giữa các nhóm
OH tự do. Bên trong xoắn có thể kết hợp với các nguyên tử khác. Cùng với amylopectin,

các phân tử amylose tham gia tạo nên cấu hình hạt tinh bột ở thực vật. Ví dụ Amylose tạo
thành màu xanh khi tác dụng với Iod, nếu đun nóng liên kết hydro bị cắt đứt, chuỗi
amylose bị duỗi thẳng do bị tách ra khỏi amylose dung dịch mất màu xanh.
Amylose thường được phân bố ở phần bên trong của hạt tinh bột.
Dung dịch amylose có độ nhớt thấp hơn dung dịch amilopectin. Amylose bị kết tủa bởi
ancol butylic.
17
+ Amylopectin: Là một polyme mạch nhánh, được cấu tạo từ các gốc α-D-
glucopyranose liên kết với nhau bởi α-1,4 và α-1,6-glycoside. Mức độ polyme hóa tử
amylopectin có thể lên đến giá trị hàng triệu. Cấu trúc phân mạch của nó bao gồm 1
nhánh trung tâm (chứa liên kết 1-4) từ nhánh này phát ra các nhánh phụ có chiều dài
khoảng vài chục gốc glucose. Khối lượng phân tử của amylopectin khoảng 2000000 -
1000000. Amylopectin được phân bố mặt ngoài hạt tinh bột. Dung dịch amylopectin có
độ nhớt cao, khi đun nóng làm thay đổi sâu sắc và không thuận nghịch cấu trúc phân tử
amylopectin gây ra trạng thái hồ hoá tinh bột. Tinh bột có thể bị thủy phân dưới tác dụng
của enzyme amylase hoặc acid tạo thành các sản phẩm có khối lượng phân tử thấp hơn
gọi là dextrin. Các dextrin này có thể bị thủy phân hoàn toàn tạo thành các gốc glucose.
Như vậy sản phẩm thủy phân hoàn toàn tinh bột là glucose, tuy nhiên ở những điều kiện
xác định, dưới tác dụng của enzyme disaccharide mantose lại là sản phẩm chủ yếu trong
sản phẩm thuỷ phân tinh bột.
Hình 5: Cấu trúc của Amylose và Amylopectin
2.3.2. Glycogen :
Glycogen cũng thuộc glucan, là polysaccharide dự trữ ở người và động vật.
Phân tử glycogen có công thức chung là (C
6
H
10
O
5
)n cũng phân nhánh giống như phân tử

amylopectin nhưng mức độ phân nhánh nhiều hơn. Phần lớn các gốc glucose trong phân
tử kết hợp với nhau qua liên kết α -1,4-glycoside, liên kết α-1,6-glycosize ở chỗ phân
nhánh của phân tử. Glycogen bị thủy phân dưới tác dụng của enzyme amylase hoặc acid.
Khi thủy phân hoàn toàn glycogen nhận được α-D-glucose. Glycogen hòa tan trong nước
nóng, cho màu đỏ tím hoặc đỏ nâu với iod.
Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột. Phân tử lượng ở trong khoảng 2 – 3
triệu Da. Glycogen dễ tan trong nước, nếu như chúng ta ăn quá nhiều carbohydrate thì cơ
18
thể chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ. Ở động vật và người glycogen
chủ yếu tập trung ở gan.
Hình 6: Quá trình thủy phân tinh bột của các enzyme amylase
2.4. Nguồn thu nhận enzyme amylase:
Enzyme amylase có trong các tế bào sinh vật, động thực vật, các loại nấm mốc.
Muốn thu nhận enzyme cần chiết rút ra khỏi tế bào.
Trong cơ thể sinh vật, enzyme ở trong tế bào chất và các cấu tử tạo nên tế bào
như nhân microsom … Enzyme không có khả năng đi qua màng tế bào, để đi vào dung
dịch chiết. Vì vậy việc đầu tiên là cần phải phá vỡ màng tế bào. Việc phá vỡ cấu trúc tế
bào có thể sử dụng một số cách sau :
+ Biện pháp cơ học như nghiền xay với bột thủy tinh, cát thạch anh hoặc
máy xay đồng hoá…
+ Bằng dung môi hữu cơ như butanol, axeton, glycerin, etyl axetat …
+ Bằng sóng siêu âm, tia X, tia UV…
Sau khi nghiền nhỏ enzyme được chiết rút bằng nuớc hay dung dịch đệm thích
hợp, hoặc dung dịch muối trung tính …
Dung dịch thu được sau khi chiết ngoài enzyme còn có các tạp chất khác như
protein phi enzyme, muối, glucide …
19
Chúng ta cần loại bỏ để thu nhận enzyme có độ tinh khiết cao. Có rất nhiều
phương pháp tinh sạch enzyme sau đây là một số phương pháp cơ bản được sử dụng rộng
rãi và có hiệu quả :

+ Để loại muối và tạp chất có trọng lượng phân tử nhỏ ta dùng phương pháp
thẩm tích qua màng bán thấm. Tinh chất của màng này sẽ cho chất có trọng lượng phân
tử nhỏ đi qua. Các chất có trọng lượng phân tử lớn bị giữ lại (enzyme , protein ).
+ Để loại protein lạ và tạp chất có trọng lượng phân tử cao ta dùng phối hợp
nhiều phương pháp khác nhau như sắc kí hấp phụ, sắc kí trao đổi ion, điện di lọc gel…
2.4.1. Động vật:
Enzyme amylase có trong tụy tạng của động vật. Tụy tạng là ống dạng chùm,
dài, lớn, nằm ngang phía sau dạ dày, giữa lá lách và tá tràng. Chiều dài của tụy tạng
khoảng 30-35cm, và nặng khoảng 80-150g. Bên trong có những vách ngăn nhỏ chia tụy
tạng thành nhiều thùy nhỏ. Tụy tạng vừa có chức năng nội tiết vừa có chức năng ngoại
tiết.
Thu nhận amylase từ động vật phần lớn là từ dịch tụy tạng. 98% tụy tạng được
cấu tạo từ các tế bào ngoại tiết hoặc là tế bào tuyến. Các tế bào này tiết enzyme tiêu hoá
vào trong tá tràng.
2.4.2. Thực vật:
Được lấy từ nhiều nguồn như:
- Đại mạch (Hordeum sativum): có giống hai hàng và giống nhiều hàng (4,
6 hàng), trong đó người ta sử dụng loại hai hàng để sản xuất malt làm bia, những loại còn
lại để làm thức ăn cho gia súc.
- Lúa (Oryse sativa L): Chủ yếu ở vùng Đông Nam Á
- Ngô (Zea mays): có nhiều loại ngô: ngô đá, ngô bột, ngô răng ngựa. Hạt
ngô có màu trắng, màu vàng hay màu hồng. Ngô màu vàng do có sự hiện diện của
carotenoid và zeaxanthine ở trong nội nhũ, ngô màu hồng là do trong nội nhũ của ngô có
anthocyanin.
2.4.3. Vi sinh vật:
Ngày nay do ưu thế về nhiều mặt, VSV trở thành nguồn thu enzyme amylase
chủ đạo. Những chủng VSV tạo nhiều amylase thường được phân lập từ các nguồn tự
20
nhiên. VSV tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, giả nấm men và vi khuẩn,
còn xạ khuẩn thì ít hơn.

- Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus, Rhizopus
- Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces.
Endomycopsy, Endomyces cũng tạo amylase.
- Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn Amylase như: Bac. Polymyxa,
Phytomonas destructans, Bact. cassavanum, Clostridium acetobutylium, Pseudomonas
saccharophila… Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh và phát triển tốt ở
nhiệt độ cao nên khi nuôi chúng ít bị nhiễm VSV khác. Đáng chú ý là Bac. diastaticus,
Bac. stearothermophilus, Bac. coagulans, Bac. circulans
- Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo amylase mạnh mẽ, tuy nhiên
cũng có một số chẳng hạn như xạ khuẩn ưa nhiệt. Micromonospora vulgaris 42 có khả
năng tạo một lượng nhỏ α-amylase hoạt động ở 65
0
C cùng với proteinase và các enzyme
khác.
21
CHƯƠNG III: ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE TRONG SẢN
XUẤT BIA
Malt
Nghiền
bã
Phụ gia
Nước
CO
2
tinh khiết
Nấm men
O
2
tinh khiết
Nước nóng

Houblon
Caramel
Phụ gia
Cân
Houblon hóa
Đường hóa
Lọc, rửa tách bã
Lắng cặn
Làm lạnh
Lên men chính
Lên men phụ
Bão hòa CO
2
Thu hồi CO
2
22
Xử lý CO
2
Thu hồi nấm men
Xử lý nấm men
Tái sử dụng nấm men
Chiết lon
Dán nhãn
Lọc bia
Cặn
Bã men
Thanh trùng
Chiết chai
Thanh trùng
Bột lọc

Bã
Sản phẩm
Sản phẩm
3.1. Sơ đồ quy trình công nghệ:
23
3.2. Thuyết minh quy trình công nghệ:
3.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu:
Malt là nguyên liệu chính cung cấp tinh bột và amylase cho quá trình đường
hóa. Cơ sở khoa học của việc sử dụng amylase của malt ở chỗ, khi đại mạch chuyển từ
trạng thái hạt
sang
trạng thái nảy mầm (malt), enzyme amylase sẽ được tổng hợp và
khi
đó
enzyme này sẽ thủy phân tinh bột có trong hạt tạo ra năng lượng và vật
chất
cho sự tạo thành mầm. Như vậy việc đường hóa tinh bột trong hạt nhờ
enzyme
của
chính nó. Khi đó hạt chỉ tổng hợp ra lượng enzyme amylase vừa đủ
để
phân hủy
lượng tinh bột có trong hạt. Như thế cần rất nhiều mầm đại mạch
để
sản xuất bia ở qui
mô lớn, dẫn đến chi phí cao cho sản xuất và sản phẩm.
Để
khắc phục điều này thì nhà sản xuất không
sử
dụng hoàn toàn 100%

nguyên liệu là malt đại mạch mà có sự pha trộn theo
một
công thức nào đó để thay thế
24
malt và còn bổ sung nguồn tinh bột cho quá
trình
lên men. Tỷ lệ phối trộn này phụ
thuộc vào phương thức sử dụng nguyên liệu có sẵn trong mỗi nước, tính kinh tế,
yêu cầu về chất lượng của bia thành phẩm. Lượng nguyên liệu thay thế thay đổi
từ 20 – 30% ở châu Âu và lên tới 50 – 70% hoặc hơn nữa ở một số nước châu
Phi, châu Mỹ và châu Á.
Lý do là một phần để tạo hương vị cho bia, màu sắc, độ cồn phù
hợp
cho
người tiêu dùng và một phần là làm giảm giá thành cho sản phẩm
bia
nhưng vẫn
giữ được đặc trưng cho bia. Chính vì điều này, các nhà sản xuất
bia
quan tâm đến việc
sử dụng chế phẩm enzyme amylase cung cấp cho quá
trình
thủy phân tinh bột. Enzyme
này có ý nghĩa rất lớn trong việc làm bia, giúp
sản
xuất bia ở qui mô công
nghiệp.
Ngoài ra, trong sản xuất bia, người ta còn sử dụng chế phẩm
enzyme
cellulose có tác dụng phá vỡ thành tế bào, tạo điều kiện để các thành phần

có
trong tế
bào hạt thoát ra phía ngoài nhờ đó chất lượng bia được nâng cao
hơn.
Một loại enzyme
khác cũng được sử dụng khá rộng rãi đó là glucose
amylase,
enzyme này được sử
dụng để loại trừ O
2
có trong bia, giúp quá trình bảo
quản
bia kéo dài hơn rất
nhiều.
Các loại nguyên liệu thay thế có thể được chia làm hai nhóm:
+ Nhóm nguyên liệu thay thế dạng hạt: tiểu mạch, gạo, thóc tẻ, ngô, lúa mì
+ Nhóm nguyên liệu thay thế dạng đường: đường mía, đường củ cải, đường
thủy phân (thu nhận bằng cách thủy phân tinh bột khoai tây hoặc tinh bột ngô bằng
acid), đường invertase, siro tinh bột.
3.2.2
Quá trình đường hóa:
• Mục đích:
Đây là quá trình quan trọng nhất trong quá trình sản xuất dịch lên men.
Hầu hết các hợp chất của bột malt không tan trong nước. Chỉ có những chất
hòa tan mới tham gia vào thành phần bia. Do vậy quá trình đường hóa thực hiện việc
chuyển các chất không tan của bột nghiền sang dạng hòa tan. Các hợp chất cao phân tử
của cơ chất như tinh bột, protein, các hợp chất chứa phosphor, sẽ bị tác động bởi các
nhóm enzyme tương ứng là amylase, protease, phosphatase,…khi nhiệt độ của khối dịch
được nâng lên đến các điểm thích hợp cho các enzyme này hoạt động. Dưới sự xúc tác
của hệ enzyme thủy phân, các hợp chất cao phân tử bị phân cắt thành sản phẩm thấp phân

tử và hòa tan vào nước để trở thành chất chiết của dịch đường.
25