Báo cáo thực hành sinh dược phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

BÁO CÁO THỰC HÀNH
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT SINH – DƯỢC PHẨM

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành:

CÔNG NGHỆ SINH – DƯỢC PHẨM

GVHD: T.S PHẠM MINH NHỰT
LỚP: 20DSHA1
NHÓM: 02
THÀNH VIÊN NHÓM: LÊ LÂM HỒNG ANH

2081000010 20DSHA1

TRẦN VÕ TƯ TỶ

2011100711 20DSHA1

NGƠ VĨNH KIÊN

2011100546 20DSHA1

TRẦN TẤN LỘC

2011100068 20DSHA1

PHAN TẤN MINH

2011100509 20DSHA1

TP. HỒ CHÍ MINH, Ngày 12 Tháng 06 Năm 2023


MỤC LỤC
BÀI 1: GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TRÀ XANH (Camellia sinensis) VÀ CATECHIN......1
I.

GIỚI THIỆU.............................................................................................................1
1. Giới thiệu về cây trà..............................................................................................1
2. Thành phần hóa học của trà......................................................................................1
3. Thuộc tính hóa học của Catechin.............................................................................2
4. Hoạt tính sinh học Catechin.....................................................................................3
5. Ứng dụng.................................................................................................................4

BÀI 2: TRÍCH LY CATECHIN TỪ LÁ TRÀ XANH.......................................................5
1. Nguyên Liệu..........................................................................................................5
2. Hòa Chất................................................................................................................ 6
3. Dụng Cụ................................................................................................................6
4. Các bước tiến hành................................................................................................6
5. Kết Quả Thu Được..............................................................................................10
BÀI 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CATECHIN … FOLIN-CLOCALTEU...................11
I.

LÝ THUYẾT..........................................................................................................11

II.

THỰC HÀNH.....................................................................................................11

1. Nguyên liệu.........................................................................................................11
2. Hóa Chất.............................................................................................................. 11
3. Dụng cụ...............................................................................................................12
4. Các bước thực hành.............................................................................................12
III.

KẾT QUẢ...........................................................................................................15

BÀI 4: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ... NĂNG LỰC KHỬ SẮT.........................................16
I.

LÝ THUYẾT..........................................................................................................16

II.

THỰC HÀNH.....................................................................................................16

1. Nguyên liệu.........................................................................................................16
2. Hóa chất..............................................................................................................16
3. Dụng cụ...............................................................................................................17
4. Các bước tiến hành..............................................................................................17
III.

KẾT QUẢ...........................................................................................................18

BÀI 5: ĐỊNH TÍNH CATECHIN … (TLC – THIN LAYER CHROMATOGRAPHY)..19
I.
II.

LÝ THUYẾT..........................................................................................................19
THỰC HÀNH.....................................................................................................19


1. Nguyên liệu.........................................................................................................19
2. Hóa chất..............................................................................................................19
3. Dụng cụ...............................................................................................................19
4. Các bước thực hiện..............................................................................................20
III.

KẾT QUẢ...............................................................................................................23


BÀI 1: GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TRÀ XANH (Camellia sinensis)
VÀ CATECHIN
I.

GIỚI THIỆU
1. Giới thiệu về cây trà

Giới
Hình 1.1: Thực
Lá trà vật
Ngành
Thực vật có hoa
Lớp

Hai lá mầm thực sự
Phân lớp
Asterids
Order
Ericales
Họ
Theaceae
Chi
Camellia
Lồi
C.sinensis
Trà là một những loại thức uống được tiêu thụ nhiều nhất trên thế giới. Trà
được chiết xuất từ lá cây trà Camellia sinensis, tùy thuộc vào phương pháp kỹ
thuật được áp dụng trong quá trình chế biến mà trà được phân ra làm 4 loại như
sau: trà trắng, trà xanh, trà ô long và trà đen.
2. Thành phần hóa học của trà
Thành phần hóa của trà biến đổi rất phức tạp, phụ thuộc vào vị trí địa lí, thổ
nhưỡng, chế độ dinh dưỡng, và giống trà tuy nhiên để tận dụng được nguồn chất
có lợi trong trà, đã có những nghiên cứu khá đầy đủ về thành phần, cấu trúc các
hoạt chất có trong trà.

Thành phần
Catechin
(-)-Epigallocatechin gallate
(-)-Epicatechin gallate
(-)-Epigallo catechin

% khối lượng khô
25-30
8-12

3-6
3-6
1


(-)-Epicatechin
(+)-Catechin
(+)-Gallocatechin
Flavonol và flavonol glucoside
Polyphenolic acid và depside
Leucoanthcyanin
Chlorophyll và các chất màu

1-3
1-2
3-4
3-4
3-4
2-3
0,5-0,6

khác
Khoáng
Caffeine
Theobromine
Theophylline
Amino acid

5-6
3-4

0,2
0,5
4-5

Acid hữu cơ
Monosaccharide
Polysaccharide
Cellulose và hemicellulose
Pectin
Lignin
Protein
Lipid
Các hợp chất dễ bay hơi
3. Thuộc tính hóa học của Catechin

0,5-0,6
4-5
14-22
4-7
5-6
5-6
14-17
3-5
0,01-0,02

2


Theo bảng 1.2, trong lá chè tươi, Catechin chiếm khiangr 25-35% tổng trọng
lượng khơ. Catechin thuộc nhóm flavan-3-ols với cấu trúc cơ bản 1 nhóm

Hình 1.2:Cấu trúc hóa học của flavonoid với khung sườn cơ bản C6-C3-C6
diphenylpropane với 2 vòng benzen (vòng A và B) được liên kết bởi 1 vịng
dihydropyan heterocylic (vịng C) hình thành từ 3 chuỗi carbon kín chứa oxygen.
Do đó, sườn cấu trúc của phân tử flavonoid là C6-C3-C6. Trong đó, vịng C có
thể chứa 1 nhóm hydroxyl tại phân tử carbon số 3.
Catechin gồm các hợp chất chính như (+)-catechin; (-)-epicatechin (EC);
(+)-gallocatechin (GC); (-)-epicatechin gallate (ECG); (-)-epigallocatechin

(EGC); và (-)-epigallocatechin gallate (EGCG), trong đó EGCG là đối tượng
được nghiên cứu nhiều nhất.
4. Hoạt tính sinh học Catechin
Các hoạt tính sinh học của catechin đã được đánh giá qua các thí nghiệm
invitro sử dụng tế bào ni cấy hoặc vi khuẩn. Các catechin trong trà như (+)catechin, (-)-epicatechin (EC), (-)-epigallocatechin (EGC), (-)-epicatechin gallate
(ECG), và (-)-epigallocatechin gallte (EGCG) có nhiều hoạt tính sinh học như
3
Hình 1.3: Các hoạt chất chính của Catechin


kháng viêm, kháng tế bào ung thư, có khả năng kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật
và hạ huyết áp.
5. Ứng dụng
Trong lĩnh vực thực phẩm
- Nhờ khả năng diệt cả 2 loại vi khuẩn Gram âm và dương nên có thể dùng
làm chất kháng khuẩn.
- Nhờ có khả năng kháng oxi hóa, Catechin có thể được dùng trong cơng
nghệ thực phẩm để thay thế các chất chống oxi hóa tổng hợp dễ gây tác dụng phụ
có hại.
Trong lĩnh vực y học
- Nhờ khả năng chỉ nhắm đích tiêu diệt tế bào ung thư mà không ảnh hưởng

đến tế bào thường, Catechin nên được dùng thay thế hoặc kết hơp cho các hóa
chấ đang được dùng trong hóa trị liệu hiện jay nhằm giảm tác dụng phụ chúng
đồng thời giúp bệnh nhân hồi phục nhanh hơn.
- Nhờ đặc tính tiêu diệt được cả những dòng tế bào kháng thuốc điều trị
(như kháng thuốc Imatinid trong bệnh bạch hầu cầu mạn dịng tủy (CML) và ung
thư mơ đệm đường tiêu hóa (GÍT)), Catechin có thể ứng dụng trong các trường
hợp này giúp tăng cường hi vọng cho các bệnh nhân mắc phải.

4


BÀI 2: TRÍCH LY CATECHIN TỪ LÁ TRÀ XANH

I.

LÝ THUYẾT
Nguyên tắc căn bản của sự chiết lỏng - lỏng là sự phân bố của một chất tan
vào hai pha lỏng và hai pha lỏng này khơng hịa tan vào nhau:
Cần nhớ:
-

Dung môi không phân cực (như eter dầu hỏa) sẽ hịa tan tốt các hợp chất
có tính khơng phân cực (như các alcol béo, ester béo…)

-

Dung môi phân cực trung bình (như diethy eter, cloroform…) hịa tan tốt
các hợp chất có tính phân cực trung bình (như các hợp chất có chứa
nhóm chức eter ₋O-, aldehyd ₋CH₌O, ceton ₋CO₋, ester ₋COO₋…)O-, aldehyd ₋O-, aldehyd ₋CH₌O, ceton ₋CO₋, ester ₋COO₋…)CH₌O, ceton ₋CO₋, ester ₋COO₋…)O, ceton ₋O-, aldehyd ₋CH₌O, ceton ₋CO₋, ester ₋COO₋…)CO₋O-, aldehyd ₋CH₌O, ceton ₋CO₋, ester ₋COO₋…), ester ₋O-, aldehyd ₋CH₌O, ceton ₋CO₋, ester ₋COO₋…)COO₋O-, aldehyd ₋CH₌O, ceton ₋CO₋, ester ₋COO₋…)…)

5


-

Dung mơi phân cực mạnh (như methanol…) hịa tan tốt các hợp chất có
tính phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức ₋O-, aldehyd ₋CH₌O, ceton ₋CO₋, ester ₋COO₋…)OH, ₋O-, aldehyd ₋CH₌O, ceton ₋CO₋, ester ₋COO₋…)COOH…)
Lá trà xanh chứa hàm lượng lớn catechin, sẽ được thu nhận bằng cách xử
lý lá trà xanh với nước và dung môi hữu cơ, như hình 1.1 và hình 1.2

Hình 1.1: Sơ đồ sơ chế lá trà tưới thành bột trà

II.

THỰC HÀNH
1. Nguyên Liệu
Sử dụng nguyên liệu là lá trà xanh Camellia sinensis.
2. Hòa Chất
- Chloroform
- Ethyl acetate
- FeCl3
3. Dụng Cụ
- Máy ly tâm
- Giấy lọc
- Máy cô quay
- Phễu chiết quả lê
6


- Bình hứng

- Cân phân tích
- Tủ sấy
4. Các bước tiến hành
Giai đoạn 1: Sơ chế nguyên liệu lá trà xanh
Lá trà thu hái là các lá trà ở vị trí tơm lá 1, lá 2 và lá 3. Lá trà được tiến
hành sấy ở nhiệt độ 95-105oC trong thời gian 30-40 phút để giảm hàm lượng
nước xuống còn 4-5%. Tiếp theo nghiền trà xnah thành bột nhỏ tạo thành bột
trà.

7


Hình 2.4 : Lá Trà đem sấy Hình 2.5: Bột Trà

Hình 2.3 : Lá Trà

Giai đoạn 2: Quy
trình tách chiết Catechin
Bước 1: Hịa 10g bột trà với 100ml nước.

Hình 2.6: Nước Trà
Bước 2: Ủ ở 80oC trong 1,5 giờ

8


Bước 3: Lọc

Hình 2.7: Ủ 80oC

Hình 2.8: Lọc

Hình 2.9: Tách lớp Chloroform với nước
Bước 4: Lấy 50ml + 50ml chloroform
Bước 5: Thu lớp nước
Bước 6: Lớp nước vừa thu được + 50ml ethyl acetate

Hình 2.10: Tách lớp nước với ethyl acetate

9


Bước 7: Thu lớp nước

Hình 2.11: Thu dịch
Hình 2.12: Cơ quay thu cắn
Hình 2.13: Cắn

Bước 9: Cắn + 2ml Dimethyl sufoxide
Hình 2.14: Dịch Catechin

10


5. Kết Quả Thu Được
Độ ẩm

Hình 2.15: Độ ẩm sau sấy
Khối lượng catechin thu được 0.34g

11


BÀI 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CATECHIN THÔNG QUA HÀM
LƯỢNG

POLYMEPHENOL

BẰNG

PHƯƠNG

PHÁP

FOLIN-CLOCALTEU
I.

LÝ THUYẾT
Phương pháp Folin-cincalteu là một trong những phương pháp sử dụng
để xác định hàm lượng polyphenol tồn phần.
Catechin có bản chất là các Flavonol, thuộc nhóm polyphenol, khi cho
các chất polyphenol oxy hóa với thuốc thử Folin-ciocalteu tạo ra sản phẩm
màu xanh lam. Giá trị OD màu của hỗn hợp tỷ lệ thuận với hàm lượng
polyphenol trong dung dịch. Căn cứ vào cường độ màu đo được trên máy so
màu ở bước sóng 765nm và đồ thị đường chuẩn của acid gallic với thuốc
thử Folin-ciocalteu sẽ xác định được hàm lượng polyphenol trong mẫu khảo
sát.

II.

THỰC HÀNH
1. Nguyên liệu
Nguyên liệu được sử dụng để tiến hành làm chế phẩm catechin thu được
ở bài trước.
2. Hóa Chất
- Cồn 96o
- Acid gallic
- Cồn tuyệt đối
12


- Thuốc thử Folin-ciocalteu dung dịch Na2CO3 bão hòa: hòa tan NaHCO3
trong 800ml nước cất và mang đi đun sôi. Sau đó làm lạnh, cho thêm vài
tinh thể Na2CO3 và để ở nhiệt độ phịng tỏng 24h. Sau đó lọc thêm nước cất
cho đến 1000ml. Bảo quản ở nhiệt độ phịng.

3. Dụng cụ
- Cốc thủy tinh
- Bình định mức
- Đũa thủy tinh
- Các loại pipet
4. Các bước thực hành
Bước 1: Chuẩn bị các dung dịch sau
-

Na2CO3 7,5%

-

Methanol 40%

-

Acid gallic

-

Folin-Ciocalteu 100% (F-C)

Bước 2: Chuẩn bị các dung dịch Acid Gallic có dãy nồng độ như sau:
Nồng độ

DD

Cách pha loãng nồng độ

1

Hút 100µl GA Stock + 900µl nước cất

400

2

500µl dung dịch có nồng độ 0.4µg/µl + 500µl nước cất

200

3

500µl dung dịch có nồng độ 0.2µg/µl + 500µl nước cất

100

4

500µl dung dịch có nồng độ 0.1µg/µl + 500µl nước cất

50

(µg/ml)

13


5

500µl dung dịch có nồng độ 0.05µg/µl + 500µl nước cất

25

6

500µl dung dịch có nồng độ 0.025µg/µl + 500µl nước cất

12.5

7

500µl dung dịch có nồng độ 0.0125µg/µl + 500µl nước cất

6.25

Hình 3.1: Hút Gallic Acid
Bước 3: Tiến hành đặt phản ứng như sau:
-

Hút 200µl acid gallic (Methanol 40% đối với mẫu blank)

-

Thêm 200µl F-C, vortex, đợi 5 phút

-

Thêm 1600µl Na2CO3 5%, ủ tối 40oC trong 20 phút

14


-

Tiến hành đo OD ở bước sóng 765nm trên máy quang phổ kế

Hình 3.2: mẫu chuẩn bị đo OD
Bước 4: Thu nhận kết quả và dựng đường chuẩn Gallic acid sao cho hệ số
R2>0.95
Bước 5: Tiến hành tương tự bước 2-3 mẫu Catechin với nồng độ tương ứng
0.1mg/ml pha loãng bậc 2 xuống 0.00625 mg/ml

Nồng độ

DD

Cách pha lỗng nồng độ

1

441µl dung dịch có nồng độ 0.1133µg/µl + 559µl nước cất

50

2

500µl dung dịch có nồng độ 0.05µg/µl + 500µl nước cất

25

3

500µl dung dịch có nồng độ 0.025µg/µl + 500µl nước cất

12.5

4

500µl dung dịch có nồng độ 0.0125µg/µl + 500µl nước cất

6.25

5

500µl dung dịch có nồng độ 0.00625µg/µl + 500µl nước cất

3.125

(µg/ml)

15


6

500µl dung dịch có nồng độ 0.003125µg/µl + 500µl nước cất

1.5625

Bước 6: Tiến hành đặt phản ứng như sau:
-

Hút 200µl Catechin (Methanol 40% đối với mẫu blank)

-

Thêm 200µl F-C, vortex, đợi 5 phút

-

Thêm 1600µl Na2CO3 5%, ủ tối 40oC trong 20 phút

-

Tiến hành đo OD ở bước sóng 765nm trên máy quang phổ kế

Hình 3.3: mẫu Catechin chuẩn bị đo OD
Bước 9: Lựa chọn 1 nồng độ catechin cho kết quả OD nằm trong giới hạn
đường chuẩn Gallic acid đã dựng ở bước 4. Căn cứ vào đường chuẩn này và
tính tốn hàm lượng polyphenol tổng số theo cơng thức:

polyphenol tổng=

X∗V ∗hệ số phalỗng
m

Trong đó:
X: nồng độ polyphenol trong mẫu đo
V: thể tích Catechin ban đầu (ml)
m: Khối lượng catechin pha dung dịch stock (g)
Hàm lượng polyphenol tổng(mg/g) GAE

III.

KẾT QUẢ
Đường chuẩn Gallic acid

16


Y = 0.0012x + 0.01312
R2 = 0.6843

Kết quả đo OD của mẫu Catechin

BÀI

4:

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG

KHÁNG OXI HÓA CỦA CATECHIN THÔNG QUA NĂNG
LỰC KHỬ SẮT
I.

LÝ THUYẾT
Khả năng khử của catechin được đánh gia bằng khả năng khử potassium
ferricyanide (K3[Fe(CN)6]) thành dạng potassium ferrocyanide (K4[Fe(CN)6])
Phản ứng của Fe3+ trong FeCl3 với potassium ferroanide tạo thành phức sắt
(K3[Fe(CN)6]3) màu xanh dương. Độ tăng cường độ màu xanh tỉ lệ với hàm
lượng chất chống oxy hóa có trong mẫu. Đo độ tăng cường độ màu này ở bước
17