Bước đầu xây dựng quy trình nhân giống loài củ dòm (stephania dielsiana y c wu) bằng kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng

LỜI CẢM ƠN
Trên thực tế khơng có sự thành cơng nào mà không gắn liền với những sự
hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của ngƣời khác. Trong
suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập ở giảng đƣờng đại học đến nay, em đã nhận
đƣợc rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của q thầy cơ, gia đình và bạn bè. Với
lịng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý thầy cô ở Viện Công nghệ sinh
học Lâm nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp với tri thức và tâm huyết của
mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian học tập tại
trƣờng. Và đặc biệt, trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, em đã tiến hành
thực hiện đề tài: Bước đầu xây dựng quy trình nhân giống lồi Củ dịm
(Stephania dielsiana Y.C.Wu) bằng kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng.
Em xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS. Nguyễn Văn Việt đã tận tâm
hƣớng dẫn em từng thực tập khóa luận. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn
thầy. Để hoàn thành tốt bài khóa luận này, em xin gửi lời cám ơn tới gia đình,
bạn bè và ngƣời thân đã ln khích lệ động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho
em học tập và nghiên cứu.
Bƣớc đầu đi vào thực tế, mặc dù đã có những cố gắng và đề tài đƣợc thực
hiện đúng hạn, thu đƣợc kết quả nhất định. Nhƣng khơng tránh khỏi những thiếu
sót, em rất mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp quý báu của quý thầy cơ và
các bạn để bài khóa luận của em đƣợc hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 14, tháng 5, năm 2018
Sinh viên
Nguyễn Thị Thùy Dƣơng

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i
MỤC LỤC ............................................................................................................. ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. v
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ............................................. 2
1.1. Tổng quan về cây Củ dòm ............................................................................. 2
1.1.1. Nguồn gốc và hệ thống phân loại ................................................................ 2
1.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố.................................................................... 3
1.2. Giá trị của cây Củ dòm................................................................................... 4
1.2.1. Giá trị kinh tế............................................................................................... 4
1.2.2. Giá trị dƣợc liệu .......................................................................................... 4
1.3. Tình hình nghiên cứu về cây Củ dịm trong nƣớc và trên thế giới ................ 5
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .............................................................. 5
1.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam............................................................. 6
1.4. Phƣơng pháp nhân giống Củ dòm .................................................................. 7
1.4.1. Nhân giống bằng phƣơng pháp vơ tính ....................................................... 8
1.4.2. Phƣơng pháp chế biến sử dụng ................................................................... 8
1.5. Kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào ................................................................. 8
1.5.1. Giới thiệu về kĩ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào .......................................... 8
1.5.2. Một số nghiên cứu ứng dụng phƣơng pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào .... 10
PHẦN II MỤC TIÊU – NỘI DUNG – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 13
2.1. Mục tiêu của đề tài ....................................................................................... 13
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 13
2.3. Đối tƣợng – phạm vi nghiên cứu ................................................................. 13
2.3.1. Đối tƣợng................................................................................................... 13
2.3.2. Địa điểm bố trí thí nghiệm ........................................................................ 13
ii


2.3.3. Hóa chất và các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ................................... 14

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 14
2.4.1. Phƣơng pháp luận ...................................................................................... 14
2.4.2. Phƣơng pháp thực nghiệm ........................................................................ 14
2.4.3. Phân tích và xử lý số liệu .......................................................................... 18
PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 20
3.1. Tạo mẫu sạch từ cành bánh tẻ của cây Củ dòm ........................................... 20
3.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp
từ lát mỏng........................................................................................................... 22
3.3. Khả năng tái sinh chồi từ các lát cắt có kích thƣớc khác nhau. ................... 25
3.4. Ảnh hƣởng của tổ hợp chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi............. 27
3.5. Ảnh hƣởng của ĐHST đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh .................... 29
PHẦN 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 32
4.1. Kết luận ........................................................................................................ 32
4.2. Tồn tại và kiến nghị...................................................................................... 33
4.2.1. Tồn tại........................................................................................................ 33
4.2.2. Kiến nghị ................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ BIỂU

iii


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

STT

Từ viết tắt

Viết đầy đủ

1

BAP

Benzylamino purine-6

2

IBA

Indole-3-butyric acid

3

Kinetin

Furfuryamino purine

4

NAA

Naphthylacetic acid

5

ĐHST

Điều hịa sinh trƣởng

6

MS

Murashige&Skoog, 1962

7

WPM

Woody plant Medium

8

CTTN

Cơng thức nghiên cứu

9

CTNC

Cơng thức nghiên cứu

10

TB

Trung bình

11

NN

Nhân nhanh

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến kết quả tạo
mẫu sạch .............................................................................................................. 15
Bảng 2.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả năng tái sinh chồi từ
lát mỏng ............................................................................................................... 16
Bảng 2.3. Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ các lát cắt có kích thƣớc khác
nhau. .................................................................................................................... 17
Bảng 2.4. Ảnh hƣởng của tổ hợp chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi ... 17
Bảng 2.5. Ảnh hƣởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ in vitro ..................... 18
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% ...................... 20
đến kết quả tạo mẫu sạch..................................................................................... 20
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả năng tái sinh chồi từ
lát mỏng ............................................................................................................... 23
Bảng 3.3. Khả năng tái sinh chồi từ các lát cắt có kích thƣớc khác nhau.......... 25
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của tổ hợp chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi ... 27
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh .. 29

v


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Củ dịm (Stephania dielsiana Y.C.Wu) (Đỗ Tất Lợi, 2009) ................. 2
Hình 3.2. Chồi tái sinh ở các cơng thức mơi trƣờng ........................................... 24
Hình 3.3. Chồi tái sinh ở các cơng thức thí nghiệm............................................ 26
Hình 3.4. Chồi nhân Củ dịm trong các cơng thức thí nghiệm ........................... 28
Hình 3.5. Cây ra rễ ở các cơng thức thí nghiệm ................................................. 31

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Nguồn dƣợc liệu con ngƣời đang sử dụng có thể đƣợc tổng hợp bằng
nhiều con đƣờng khác nhau nhƣ tổng hợp hóa học, tổng hợp từ vi sinh vật, song
dƣợc liệu quý từ thực vật đã đƣợc con ngƣời sử dụng từ lâu đời và nhu cầu ngày
càng lớn. Theo thống kê của Viện Dƣợc liệu, hiện nay nhu cầu sử dụng dƣợc
liệu trong nƣớc ta khoảng gần 60 – 80000 tấn/năm. Tuy nhiên, các loài cây này
trong tự nhiên đang bị giảm về số lƣợng và chất lƣợng bởi sự khai thác quá mức
cùng với điều kiện bất lợi của môi trƣờng dẫn đến nhiều cây quý bị tuyệt chủng,
ảnh hƣởng đến nguồn cung cấp dƣợc liệu bền vững cho con ngƣời trong đó có
lồi Củ dịm.
Cây Củ dòm (Stephania dielsiana Y.C. Wu) là một vị thuốc nam mang
nguồn gen quý mới đƣợc phát hiện ở Việt Nam đƣợc ghi trong Sách đỏ Việt
Nam (1996), thuộc họ Tiết dê – Menispermaceae là một lồi thực vật có hoa
trong họ Biển bức cát, chứa nhiều hoạt chất dƣợc liệu quý. Nhiều nghiên cứu đã
chỉ ra rằng trong Củ dịm có chứa alkaloid bao gồm: L-tetrahydropalmatin
(rotundian), stephrin, roemerin, cuycleanin có tác dụng giảm đau, an thần hiệu
quả, gây tê niêm mạc, giãn mạch, hạ huyết áp, điều hịa hơ hấp và tim mạch.
Cepharanthin đƣợc tìm thấy trong Củ dịm có tác dụng kích thích miễn dịch và
làm giảm nhẹ một cách hữu hiệu những tác dụng phụ của thuốc chống ung
thƣ.[3]. Bên cạnh đó, Bun Sok – Siya và cộng sự (2009) đã phát hiện
cepharanthin có tác dụng ức chế 2 dòng tế bào ung thƣ đại trực tràng và ung thƣ

gan. Mặt khác, còn ức chế sự phát triển của trực khuẩn lao. Ngoài ý nghĩa về
mặt y học, cây Củ dịm cịn làm vật trang trí, làm cảnh đƣợc nhiều ngƣời ƣa
chuộng. Thế nhƣng Củ dòm đang nằm trong nguy cơ cạn kiệt cảnh báo tuyệt
chủng ở cấp VU trong sách đỏ Việt Nam (2007) nên cần đƣợc nhân giống mở
rộng và duy trì nguồn gen quý hiếm này. Vì vậy, mà việc bảo tồn giống cây Củ
dịm là rất cấp thiết và có ý nghĩa quan trọng.
Nhận thức đƣợc việc bảo tồn và phát triển loài cây thuốc quý tiền năng
chúng tôi đã tiến hành thực hiện nghiên cứu đề tài: Bước đầu xây dựng quy
trình nhân giống lồi Củ dịm (Stephania dielsiana Y.C.Wu) bằng kỹ thuật
nuôi cấy lát mỏng.
1


PHẦN I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1.Tổng quan về cây Củ dòm
1.1.1. Nguồn gốc và hệ thống phân loại
Củ dòm (Stephania dielsiana Y.C.Wu) thuộc họ Menispermaceae (Tiết
Dê), tên khác là củ Gà ấp (củ mọc lộ khỏi mặt đất giống con gà đang ấp trứng).
Có nguồn gốc ở Biển Đơng, Nam Châu Á, Trung Quốc. Ở Việt Nam, Củ dịm
có thể sống cả ở vùng núi đá lẫn rừng núi đất, cả ở nơi có nhiều đá lộ đầu, thuộc
các tỷnh Lào Cai, Yên Bái, Hà Tây, Hà Bắc, Quảng Ninh [1,3].
Hệ thống phân loại:
Giới:

Plantase

Ngành:

Magloliophyta

Phân lớp: Magloliosida
Bộ:

Ranunculales

Họ:

Menispermaceae

Chi:

Stephania

Lồi:

Stephania dielsiana Y.C.Wu

Hình 1.1. Củ dòm (Stephania dielsiana Y.C.Wu)
(Đỗ Tất Lợi, 2009)

2


1.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố
Cây Củ dịm là cây mọc hoang dại ở các vùng núi đá, núi đất có nhiều đá
lộ đầu, độ cao 300 – 500m. Thích hợp ở nhiệt độ trung bình năm 21 – 230C,
lƣợng mƣa 2000 – 2500mm, độ pH = 6,5 – 7 [3].
Cây Củ dòm là một dây leo nhỏ, sống nhiều năm, rễ củ to, thân leo cuốn,
dài khoảng 3m, thân non hồng tím nhạt, tồn cây khơng lơng. Lá đơn nguyên,

mọc so le, có cuống dài 4,5 – 8,5cm. Phiến lá hình tam giác trịn, 9 – 13 x 8 –
13,5cm, mép lá hơi lƣợn sóng, hoặc có răng tù rất thƣa ở phía ngọn, chóp lá
nhọn, gốc bằng hoặc hơi lõm, gân chính xếp dạng chân vịt, xuất phát từ chỗ
đính của cuống lá. Ngọn no, cuống là và cuống cụm hoa có dịch màu tím hồng
[1,3].
Hoa đơn tính khác gốc, hoa đực tụ họp thành tán giả, hoa cái thành dạng
đầu. Hoa nhỏ, có cuống ngắn, 6 lá dài màu tím xếp 2 vịng, 3 vịng cánh hoa
hình quạt trịn, hoa có màu vàng cam, cột nhị ngắn. Cụm hoa cái gồm 7 - 8 đầu
nhỏ, cuống rất ngắn, xếp thành dạng đầu. Hoa nhỏ, 1 lá dài màu tím hồng, 2
cánh hoa hình quạt trịn vàng cam có vân tím. Bầu hình trứng, đầu nhụy có 4 – 5
thùy dạng dài. Quả hình trứng đảo, hơi dẹt. Hạt hình trứng ngƣợc cụt đầu, có lỗ
thủng ở giữa, trên lƣng hạt có 4 hàng gai nhọn, cong [1].
Mùa hoa tháng 4 - 5, quả tháng 6 – 7, mọc chồi thân hoặc từ cổ rễ vào
đầu mùa xuân. Sau khi bị chặt phá, phần còn lại vẫn có khả năng tái sinh. Cây
ƣa ẩm, ƣa sáng và có thể chịu bóng. Thƣờng mọc ở rừng kín thƣờng xanh ẩm đã
trở nên thứ sinh, đôi khi cũng gặp ở rừng núi đá vôi (Tuyên Quang), ở độ cao
300 - 600m [1].
Củ dịm ở nƣớc ta có phân bố rộng rãi đặc biệt ở miền Bắc, tập trung ở
vùng núi đá vôi thuộc tỷnh Lào Cai, Yên Bái, Tuyên Quang (Na Hang, Chiêm
Hóa), Bắc Kạn, Thái Nguyên, Bắc Giang, Quảng Ninh, Hà Giang, Hà Tây,
Quảng Nam. Sự phân bố khác nhau tùy theo đặc tính sinh học. Trên thế giới
thƣờng có ở: Trung Quốc, Nam Châu Á và vùng Biển Đông [1,3].

3


1.2.Giá trị của cây Củ dòm
1.2.1. Giá trị kinh tế
Cây Củ dòm là một loại cây thuốc nam mọc tự nhiên ở một số vùng của
nƣớc ta, cây dạng thân leo dễ trồng, phù hợp với điều kiện tự nhiên của Việt

Nam. Cây có thể phát triển tốt ở điều kiện khô cằn, vùng đất đá mà không cần
tốn công chăm sóc hay kỹ thuật canh tác cao nhƣng mang lại giá trị kinh tế cao
cho ngƣời trồng. Hiện nay, giá của 1kg Củ dòm tƣơi là 120000 – 150000VND.
Cây Củ dịm đƣợc coi là cây trồng “Xóa đói giảm nghèo” của ngƣời dân
tộc vùng cao. Bên cạnh đó, cây có tiềm năng lớn trong y học, là nguồn nguyên
liệu cho ngành dƣợc học.
Tuy nhiên, trƣớc việc khai thác ồ ạt của ngƣời dân thì loại cây quý này
đang dần cạn kiệt và có nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên.
1.2.2. Giá trị dược liệu
Cây Củ dòm thuộc họ Menispermaceae cây chứa nhiều chất có giá trị về
dƣợc liệu có tác dụng thanh nhiệt, giải độc. Hoạt chất trong cây chứa alkaloid
bao gồm L-tetrahydropalmatin (rotundian), stephrin, roemerin, cycleanin. Ngồi
ra cịn có tinh bột đƣờng khử oxygen, acid malic, men oxidase. Trong đó quan
trọng nhất là L-tetrahydropalmatin (rotundian) và roemerin và cepharanthin.
Rotundin có tác dụng giảm đau, an thần rất hiệu quả, điều hịa hơ hấp và tim
mạch. Hàm lƣợng chất này có trong Củ dịm tƣơi khoảng 0,12 – 0,3% [6,7].
Theo kinh nghiệm y học cổ truyền, Củ dòm đƣợc dùng dƣới dạng thuốc
sắc hay ngâm rƣợu để chữa bệnh mất ngủ, sốt, đau đầu, sốt rét, phù thũng, đau
lƣng, chân tay nhức mỏi, đau bụng, đau dạ dày, kiết lỵ, đại tiện ra máu. Cách
chế biến và sử dụng cây Củ dòm: đào củ về đem rửa sạch, thái lát mỏng, phơi
khơ. Dƣợc liệu có màu nâu, vị chát, đắng và tê, tính ấm, khơng độc. Liều dùng
hằng ngày: 4 – 8g sắc với 200ml nƣớc còn 50ml, uống làm một lần trong ngày,
có thể ngâm rƣợu uống với tỷ lệ 1/10 [14].
Trong y học hiện đại, hoạt chất L-tetrahydropalmatin (hyndarin, gindarin)
chiết từ củ cây Củ dịm có tác dụng đặc hiệu đối với một số trƣờng hợp loạn tâm
4


thần, trạng thái căng thẳng tinh thần, suy nhƣợc thần kinh, mất ngủ dai dẳng
nguyên nhân do bệnh tâm thần [2]. Liều dùng: 0,05 – 0,1g dƣới dạng viên đơn

độc 0,05g L-tetrahydropalmatin hydroclorid hoặc viên phối hợp gồm Ltetrahydropalmatin 0,03g, cao khô lá vông 0,06g, cao khô lá sen 0,05g, tá dƣợc
vừa đủ cho 1 viên.[1,2]. Dạng viên phối hợp này đƣợc ứng dụng cho 100 bệnh
nhân ở khoa thần kinh – Bệnh viện Hữu Nghị, thấy tác dụng an thần, gây ngủ
nhanh hơn, giấc ngủ kéo dài em dịu, khơng mệt mỏi nhƣ dùng thuốc
meprobamat. Dùng ngồi, Củ dịm để tƣơi, giã với muối và gừng, đắp có tác
dụng tiêu viêm, chữa nhọt độc, bắp chuối, áp - xe do tiêm. Nơng dân ở địa
phƣơng cịn cho trâu bị uống nƣớc sắc củ cây Củ dòm mỗi khi chúng chán ăn,
chê cỏ [2,9].
Rễ Củ dịm có chứa nhiều alkaloid nhƣ L- tetrahydropalmatin, cyclanolin,
maganiflorin… Những hợp chất đƣợc sử dụng nhiều để điều chế thuốc, đặc biệt
là thuốc an thần [5,6,7].
1.3.Tình hình nghiên cứu về cây Củ dịm trong nƣớc và trên thế giới
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nhu cầu sử dụng thuốc cho điều trị trên thế giới ngày càng tăng.Theo
thống kê của tổ chức Y tế thế giới (WHO) đáng giá cho đến nay 80% dân số thế
giới dựa vào nền y học cổ truyền để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban
đầu, trong đó chủ yếu là thuốc từ cây cỏ. Trên thế giới hiện nay có hơn 35.000
lồi thực vật dùng làm thuốc, trong đó có khoảng 2500 cây thuốc đƣợc bn
bán trên thế giới. Ở châu Âu, có ít nhất 2.000 cây thuốc đƣợc sử dụng. Ở Châu
Á có khoảng 5.000 loài ở Trung Quốc 1.700 Loài ở Ấn Độ, trong đó có đến
90% thảo dƣợc thu hái hoang dại [3].
Năm 1950 và 1952 Qiaudry G.R và Siddiqui (Ấn Độ) đã nghiên cứu và
chiết từ củ cây Stephania Glabra (Roxb). Nhiều alkaloit và đặt tên là hyndarin
C23H25O4N, Stefarin C18H9O3N và cyckanin C35H42O6N trong đó hydrain chiếm
thành phần chủ yếu (khoảng 30% hyndarin, 15-18% stefarin và rất ít cyckanin).

5


Nghiên cứu cấu tạo hydarin ngƣời ta thấy rằng hydarin thực ra cũng chỉ là một

alkaloid đã biết có tên là tetrahydropanmain [14].
Trƣớc năm 1965, ngƣời ta vẫn cho rằng hyndarin và rotundin là hai alkaloid
khác nhau vì chiết từ hai cây khác nhau, mọc tại hai nƣớc khác nhau. Nhƣng
đến năm 1965, Viện nghiên cứu cây thuốc và cây cỏ tinh dầu tồn liên bang Xơ
viết cũng có dịp so sánh hai cây, một cây từ Ấn Độ, một cây từ Việt Nam đánh,
thấy rằng hai cây thuốc chi Stephania là một lồi nên đã kiểm tra lại tính chất
của rotundin và đã xác định rotundin và hyndarin chỉ là một chất có cấu tạo của
tetrakydropanmatin [14].
Zhang Yi (2009) và cs đã phân lập và nhận đƣợc 12 alkaloid từ loài
Stephania dielsiana là sinocutin, stephania, ayuthianin, dehydrostephanin,
cephamorphinanin, aknandinin, liriodenin, sinomenin, l-tetrahydropalmatin, ()cordalmin, oxocrebanin, nor-canelillin [34].
Yecherg deng (2010) và cs đã phân lập đƣợc hai alkaloid từ các loài
Stephania dielana là stephanin và crebanin, rebanin [33].
1.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Phạm Thị Duyên (2004) đã nghiên cứu định lƣợng L-tetrahydrolmatin
bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết quả định lƣợng cho
thấy hàm lƣợng L-tetrahydrolmatin trong Củ dịm (S.dielsiana) thu hái ở Ba Vì
– Hà Tây là 0,4% [2].
Nguyễn Quốc Huy (2009) đã phân lập và nhận dạng 3 alcaloid từ loại Củ
dịm0(Stephaniaodielsiana)olàoL-tetrahydrolmatin,ooxostepphanin,
dehydrocrebanin. Có tác dụng gây độc cho 3 dòng tế bào ung thƣ gan (Hep-2),
ung thƣ cơ vân (RD) và ung thƣ phổi (LU) với IC50 lần lƣợt là 0,566; 0,755 và
1,4046 [9].
Nguyễn Kim Liễn (2011). Nghiên cứu đặc điểm phân bố và thử nghiệm
nhân giống lồi Củ dịm (Stephania dielsiana Y.C.Wu) tại vƣờn quốc gia Ba vì,
Hà Nội [15].

6

Nguyễn Vũ Minh (2014) và cs đã phân lập đƣợc 2 alcaloid là palmatin,
corydin. Đây là lần đầu tiên hai alkaloid này đƣợc phân lập từ loài (Stephania
Dielsiana) thu hái Phong Nha (Quảng Ninh) ở Việt Nam [17].
Nguyễn Vũ Minh (2014) và cs đã phân lập đƣợc một alcaloid là
thailandin, oxostephanin từ lồi Stephania dielsiana Y.C.Wu có tác dụng ức chế
sự tăng trƣởng của các tế bào ung thƣ gan, ung thƣ phổi , ung thƣ màng tim, tế
bào ung thƣ buồng trứng , tế bào ung thƣ dạ dày [18].
Nguyễn Quốc Huy (2015) và cs thử hoạt tính in vitro của phân đoạn SM2
chiết từ loài (Stephania dielsiana) trên chuột nhắt chủng Swiss mang khối u
Sarcom 180 cho kết quả tỷ lệ thoát lui khối u là 35,7% [8].
1.4. Phƣơng pháp nhân giống Củ dòm
Theo Trung tâm Tài Nguyên và Môi trƣờng - Đại học Quốc gia Hà Nội
(2000) đã thống kê nƣớc ta có 3.800 lồi vật có giá trị dƣợc liệu. Việc sử dụng
thảo dƣợc chữa bệnh đã có từ xa xƣa song chủ yếu dựa theo kinh nghiệm dân
gian. Trong những năm gần đây, nhu cầu nguyên liệu cho sản xuất dƣợc phẩm
tăng mạnh, việc khai thác nguồn tài nguyên cây thuốc một cách bừa bãi làm
cho các cây lồi cây có giá trị dƣợc liệu bị suy giảm nghiêm trọng, một số loài
đứng trƣớc nguy cơ bị tuyệt chủng, phải đƣa vào danh sách mục thực vật rừng
nguy cấp, quý hiếm, nghiêm cấm khai thác sử dụng vì mục đích thƣơng mại
(Nghị định số 32/2006/NĐ-CP ngày 30 tháng 3 năm 2006 của Chính Phủ ).
Trƣớc thực trạng đó, ƣu tiên đầu tƣ sản xuất nguyên liệu hóa dƣợc để phục vụ
sản xuất thuốc nhập khẩu. Ƣu tiên việc tạo dựng nguồn nguyên liệu ổn định về
số lƣợng và chất lƣợng để cung cấp cho các nhà máy chiết xuất. Chi Stephania
gồm nhiều loại cây thuốc có tác dụng an thần, chữa ho, sốt, chữa mất ngủ,
chúng còn đƣợc sử dụng để chữa bệnh ung thƣ một trong những căn bệnh của
thế kỷ. Hiện nay, các tài liệu mô tả về đặc điểm sinh vật học, hình thái học của
các lồi Củ dịm rất hạn chế. Trong đó lồi Củ dịm (Stephania dielsiana) đang
bị suy giảm nghiêm trọng trong tự nhiên. Do vậy việc tìm kiếm phƣơng pháp

7

nhân giống lồi cây này có ý nghĩa lớn nhằm góp phần bảo tồn nguồn gen và
phát triển cây thuốc q hiếm [3].
1.4.1. Nhân giống bằng phương pháp vơ tính
Trong phƣơng pháp này phần đầu của Củ dòm đƣợc cắt để làm giống.
Mỗi đầu có thể xẻ làm bốn mảnh. Thời vụ trồng bằng phƣơng pháp vơ tính vào
tháng 2-3, đất trồng cao thống nƣớc. Ngồi ra, có thể nhân giống bằng hom
thân. Cây Củ dòm trồng ở Việt Nam có hiện tƣợng sâu xanh hại lại lá từ tháng 4
- 10 và thối củ do bị úng nƣớc. Thu hoạch cây trồng sau 2-3 năm, thời gian càng
lâu năng suất càng cao. Trồng bằng hạt có năng suất cao hơn trồng từ mầm củ
thu hoạch vào mùa đông tháng 11-12 khi cây tàn lụi. Khi đào tránh làm xây sát
củ. Năng suất trung bình 1 tấn củ khơ/ha [1].
1.4.2. Phương pháp chế biến sử dụng
Hiện nay nƣớc ta thu hái cây Củ dòm chủ yếu từ nguồn hoang dại. Khi
thu hoạch về cạo sạch vỏ nâu đen, thái lát mỏng đem phơi hoặc sấy khô đƣợc sử
dụng hoặc đem chiết lấy hoạt chất sinh học. Từ Củ dịm có thể chế biến đƣợc rất
nhiều hoạt chất sinh học khô hay tinh khiết nhƣ sau: Thái hay xát Củ dòm, ép
lấy nƣớc cho tới hết đắng nƣớc ép để lắng (alkaloid ra hết). Nƣớc ép để lắng,
thêm nƣớc vôi trong hoặc trong dung dịch cacbonat kiềm sẽ cho tủa rotudin thô.
Lọc hay gạn lấy phơi sấy khô. Nhƣ vậy ta sẽ thu đƣợc rotudin thô, dễ bảo quản
và dễ vận chuyển. Từ rotudin thơ ta có thể chiết rotudin tinh khiết bằng cách
dùng cồn hay dung dịch axit sunfuric nóng 5 – 10% lọc rồi kết tinh, làm đi làm
lại nhiều lần , theo nguyên tắc chung kết tủa alkaloid , ta sẽ thu đƣợc rotudin
tinh khiết [1].
1.5. Kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào
1.5.1. Giới thiệu về kĩ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào
Công nghệ nuôi cấy lát mỏng tế bào – Thin Cell Layer (TCL) đã tăng cƣờng
tầm quan trọng của phôi soma trong nhân giống, bảo quản và các biến đổi di
truyền. Công nghệ nuôi cấy TCL cũng cung cấp một cơ sở thử nghiệm lý tƣởng để

8


điều tra và hiểu các cơ chế của tính tồn năng và sự khác biệt trong tế bào thực vật,
mô và cơ quan.
Hệ thống lát mỏng tế bào -TCL bao gồm các mẫu cấy có kích thƣớc nhỏ
đƣợc cắt ra từ các cơ quan thực vật khác nhau (thân, lá, rễ, hoa,…). Chúng đƣợc
cắt hoặc theo chiều dọc (lTCL) hoặc theo chiều ngang (tTCL) có chứa số lƣợng
tế bào nhỏ nhất có thể. Các lTCL (1 mm x 0,5 hay 10 mm) chỉ chứa một loại mô
nhƣ lớp đơn của tế bào biểu bì hoặc một vài lớp (3- 6 lớp) của tế bào vỏ. Các
tTCL dày khoảng 0,2 đến vài mm bao gồm một số tế bào thuộc các mơ khác
nhau. Cả lTCL và tTCL đều có điểm chung là mỏng [29].
Các tính chất mong muốn có đƣợc trong phƣơng pháp nuôi cấy lát mỏng
tế bào là sự đồng nhất về sinh lý, di truyền và có thể ứng dụng phƣơng pháp này
cho mọi thực vật. Tuy nhiên, điều kiện môi trƣờng lý tƣởng phù hợp cho sự tồn
tại của mẫu TCL cịn phụ thuộc vào lồi và phải thử nghiệm lại tất cả các điều
kiện nuôi cấy in vitro.
Lát mỏng có ƣu điểm là đồng nhất nên dễ phản ứng một cách đồng nhất
với môi trƣờng. Việc giảm số lƣợng tế bào trong lát mỏng tế bào có ý nghĩa
quan trọng vì ảnh hƣởng đến quá trình phát triển hoặc các chƣơng trình biệt hóa
mơ, cơ quan.
Khi cắt mẫu, mô thực vật bị tổn thƣơng, nhiều enzyme hoặc các
polysaccharide sinh ra rất cần cho quá trình cảm ứng sự sinh trƣởng và phát
triển của thực vật. Việc ứng dụng một vài tế bào trong hệ thống TCL vì chúng
có mối quan hệ mật thiết với các tế bào bị tổn thƣơng và chất dinh dƣỡng cùng
các yếu tố khác bên trong mơi trƣờng để kiểm sốt sự phát sinh hình thái. Khác
với khi sử dụng một tế bào tách ra hay tế bào trần, sau khi tách chúng tạo nên
vách tế bào và hình thành nên cụm tế bào mới với tổ chức không gian và thời
gian khác biệt với sự tổ chức trƣớc khi tiến hành quá trình tách ra từ mơ hay cơ

quan cho. Hầu hết các trƣờng hợp trong quá trình phát triển của tế bào đơn hay
tế bào trần có sự hình thành mơ sẹo, phôi sinh dƣỡng trộn lẫn tế bào, không phải
là phôi nhƣ các tế bào ống và rễ. Ngƣợc lại, hệ thống TCL có sự hình thành
9


phần đó với số lƣợng lớn hơn. Chúng khơng những đƣợc tiếp xúc với mơi
trƣờng mà cịn đƣợc chƣơng trình hóa một cách riêng biệt. Khoảng thời gian để
q trình phát sinh hình thái xuất hiện tƣơng đối ngắn (trung bình khoảng 14
ngày sau khi cấy) và tần suất cũng khá cao. Các tính chất mong muốn có đƣợc
trong phƣơng pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào là sự đồng nhất về sinh lý, di
truyền và có thể ứng dụng phƣơng pháp này cho mọi thực vật [29].
1.5.2. Một số nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào
 Trong nƣớc:
Bùi Văn Lệ và cs (2003) đã tiến hành nghiên cứu tạo chồi từ lát mỏng
tTCL vùng đốt thân cây Điều trên mơi trƣờng MS có bổ sung BAP với nồng độ
thay đổi 1- 10 mg/l. Sự hình thành chồi đƣợc khảo sát từ 2 - 4 tuần. Kết quả cho
thấy là ở nồng độ BAP thấp (1,3 mg/l) thì số lƣợng chồi tạo ra cịn thấp (từ
10,2- 12,3 chồi/ mẫu cấy). Số lƣợng chồi đạt tối đa khi nồng độ BAP là 5 mg/l
(tỷ lệ chồi là 17,3 chồi/ mẫu cấy). Tuy nhiên số lƣợng chồi này lại giảm khi tăng
nồng độ BAP lên 10 mg/l [13].
Đỗ Đăng Giáp và cs (2009) đã nghiên cứu sự phát sinh mô sẹo từ nuôi
cấy lát mỏng tế bào mảnh lá ở cây Hồ tiêu. Môi trƣờng đƣợc dùng để khảo sát
sự tạo thành mơ sẹo là MS có bổ sung vitamin Morel, sucrose 30 g/l, agar 7 g/l
và chất ĐHST. Sử dụng môi trƣờng M1 (bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D và 5 mg/l BA)
để tạo mô sẹo từ tTCL mảnh lá và môi trƣờng M2 (bổ sung 5 mg/l BA) để
nghiên cứu sự phát sinh chồi từ mô sẹo đã đƣợc tạo ra khi nuôi cấy trên môi
trƣờng M1. Những kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu cấy tTCL mảnh lá dễ dàng
hình thành mơ sẹo trên mơi trƣờng M1. Sau 28 ngày, cấu trúc giải phẫu bên
trong cho thấy có sự phân lớp từ ngồi vào trong mẫu cấy. Trên môi trƣờng M2,

sau 28 ngày nuôi cấy, trên bề mặt các nốt sần xuất hiện các chồi, trung bình có
khoảng 67,89 ± 2,34% mẫu cấy hình thành chồi và 15,20 ± 1,51% chồi/ mẫu
cấy [4].
Hoàng Ngọc Nhung và cs (2012) đã nghiên cứu sự phát sinh cơ quan từ
lát mỏng tế bào cây Đƣơng quy Nhật Bản (Angelica acutiloba)từ nuôi cấy lát
mỏng tế bào của chồi ngọn và từ ni cấy phiến lá. Các lát mỏng có bề dày từ
10


1- 1,5 mm cắt từ chồi in vitro đƣợc nuôi cấy trên các mơi trƣờng MS có bổ sung
NAA(0; 0,1;0,2 mg/l) kết hợp với TDZ (0,1; 0,5; 1 mg/l).Số chồi lớn nhất là ở
các lát mỏng chồi nuôi cấy trên mơi trƣờng có 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l
TDZ.Trên mơi trƣờng MS có bổ sung kinetin (0 hoặc 1 mg/l) kết hợp với NAA
(4; 6; 8;10;12 mg/l) hoặc IBA (4; 6; 8; 10; 12 mg/l), phiến lá mở thứ nhất (tính
từ ngọn) ni cấy trong điều kiện tối đã có đáp ứng tạo rễ khác biệt [19]
 Trên thế giới:
Trên thế giới đã có nhiều cơng trình nghiên cứu để ứng dụng phƣơng pháp
nuôi cấy lớp mỏng tế bào trên các đối tƣợng khác nhau nhƣ cây lƣơng thực, ngũ
cốc, dƣợc liệu.
Peng Zhao và cs (2007) đã áp dụng phƣơng pháp tái tạo chồi với tần số tái
sinh cao loài Lan hoàng thảo (Dendrobium Candidum) bằng việc sử dụng các
tTCL. Mơi trƣờng MS có bổ sung 1,2 mg/l-1 NAA và 1,2 mg/l-1 BA là tối ƣu
cho tái sinh chồi với tần suất tái sinh chồi cao (92%) và số lƣợng chồi cũng đạt
cao nhất ( trung bình là 24,5). Sự phát triển của chồi trên môi trƣờng dinh
dƣỡng 1/2MS và 2% đƣờng bổ sung thêm 1 mg/l-1 NAA và 1 mg/l-1 IAA.
Banana Chattopadhyaya và cs (2010) đã tiến hành nghiên cứu sự tái sinh
chồi của cây Vừng (Sesamum indicum L.) bằng cách sử dụng các tTCL. Tần
suất tái tạo chồi và số lƣợng chồi non đƣợc tạo ra từ các tTCL phụ thuộc đáng
kể vào độ tuổi và độ dày của các tTCL và các phytohormones bổ sung vào môi
trƣờng nuôi cấy. Sự kết hợp tốt nhất cho sự cảm ứng chồi là ở mơi trƣờng có bổ

sung 2 mg/l-1 BAP và 0,5 mg/l-1 NAA, với số lƣợng tối đa của chồi thu đƣợc ở
các phần tTCL dày 0,5-1 mm và có nguồn gốc từ cây giống 4-6 tuần của cây
Vừng. Các chồi phát triển mạnh đã đƣợc bắt nguồn từ môi trƣờng MS với các
phytohormone và 80% các cây đã đƣợc tái sinh thành công trong đất [28].
P. Azadi và cs (2016) đã nghiên cứu sự tái sinh của Nghệ tây (Crocus
sativus L.) bằng cách sử dụng các phôi tế bào mỏng. Theo chiều dọc và ngang,
lát tế bào mỏng có kích thƣớc xấp xỉ 1 mm của chồi đỉnh đƣợc nuôi cấy trên
môi trƣờng MS bổ sung 2,4-D, BAP và NAA. Số lƣợng cao nhất của cảm ứng

11


callus (100%) thu đƣợc từ các phôi tTCL của chồi đỉnh trong môi trƣờng MS
chứa 2 mg/l-1 BAP và 2 mg/l-1 NAA trong thời gian ủ 3 tháng trong điều kiện
tối ở 20°C. Phần trăm tối đa của tái sinh chồi (75%) đƣợc quan sát thấy trên môi
trƣờng MS chứa 0,5 mg/l-1 BAP. Kết quả của cuộc điều tra này cho thấy rằng
các TCLs từ chồi thích hợp cho việc tái sinh [30].

12


PHẦN II
MỤC TIÊU – NỘI DUNG – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu của đề tài
 Mục tiêu chung
Bƣớc đầu xây dựng đƣợc quy trình nhân giống lồi Củ dịm từ vật liệu lát
mỏng
 Mục tiêu cụ thể
- Xác định đƣợc công thức khử trùng tạo mẫu sạch đối với cây Củ dịm
- Xác định ảnh hƣởng của cơng thức môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả năng

tái sinh chồi từ lát mỏng.
- Xác định ảnh hƣởng của kích thƣớc lát cắt đến khả năng tái sinh.
- Xác định ảnh hƣởng của tổ hợp chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi
- Xác định đƣợc nồng độ chất ĐHST phù hợp ra rễ
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu công thức khử trùng tạo mẫu sạch đối với cây Củ dòm
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của công thức môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả
năng tái sinh chồi từ lát mỏng.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của kích thƣớc lát cắt đến khả năng tái sinh.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của tổ hợp chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh
chồi.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của ĐHST đến khả năng tạo rễ.
2.3. Đối tƣợng – phạm vi nghiên cứu
2.3.1. Đối tượng
- Đối tƣợng nghiên cứu: Cây Củ dòm (Stephania dielsiana Y.C.Wu)
- Vật liệu nghiên cứu: Lát mỏng cây Củ dịm
2.3.2. Địa điểm bố trí thí nghiệm
Địa điểm: Phịng thí nghiệm ni cấy mơ tế bào thực vật, Bộ môn Công
nghệ tế bào, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trƣờng Đại học Lâm nghiệp
Việt Nam.
13


2.3.3. Hóa chất và các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
2.3.3.1. Hóa chất
Mơi trƣờng sử dụng để ni cấy là môi trƣờng MS cải tiến (Murashige và
Skoog, 1962); các loại vitamin (B1, B2, B6, B12); các chất điều hoà sinh
trƣởng: Benzyl amino purine (BAP), Kinetin, Naphthyl acetic acid (NAA); các
chất kháng sinh nhƣ: kanamycin, cefotaxim,… đƣợc cung cấp bởi các hãng uy
tín và chất lƣợng trên thế giới nhƣ Sigma, Research oganic (Mỹ), Wako (Nhật).

2.3.3.2. Thiết bị
Máy đo pH, bình tam giác 250 ml, bình trụ, ống phalcon 10ml, ống
phalcon 50ml, giấy thấm, bình thủy tinh chịu nhiệt, nồi hấp vô trùng, tủ sấy,
máy nƣớc cất một lần, hai lần, tủ ấm, tủ lắc, box cấy vô trùng, buồng tối, phịng
ni cấy mơ của Phịng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào, Viện Công nghệ sinh học
Lâm nghiệp, Đại học Lâm nghiệp.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp luận
- Các nhân tố là chỉ tiêu nghiên cứu: phải đƣợc chia thành các cơng thức
thí nghiệm khác nhau, có cơng thức đối chứng.
- Các nhân tố không phải là chỉ tiêu nghiên cứu: phải đồng nhất ở các
thí nghiệm.
- Số mẫu thí nghiệm ở từ cơng thức phải đảm bảo đủ lớn (≥30)
- Thí nghiệm đƣợc lặp lại ≥3 lần.
2.4.2. Phương pháp thực nghiệm
Thí nghiệm 1. Xác định được cơng thức khử trùng tạo mẫu sạch
Đoạn thân cây Củ dòm khi đƣợc lấy về từ vƣờn ƣơm Viện Công nghệ
sinh học Lâm nghiệp, đƣợc cắt bỏ bớt phần lá, để lại phần cuống dài 1 – 1,5cm,
cắt mẫu thành từng đoạn dài 10cm có 2 – 3 mắt ngủ, đủ để cho vừa bình Scott.
Sử dụng phƣơng pháp khử trùng bằng cồn 700 trong 1 phút và HgCl2 0,1%
trong các khoảng thời gian khác nhau và sử dụng môi trƣờng nuôi cấy MS.
Bƣớc 1. Xử lý mẫu bên ngoài box cấy

14


Mẫu đƣợc xử lý bằng xà phịng lỗng và nƣớc cất ở bên ngoài box cấy,
khi đã sạch đƣa vào phịng thí nghiệm để khử trùng trong box cấy.
Bƣớc 2. Khử trùng trong box cấy vô trùng
Trong box cấy vô trùng sử dụng hóa chất khử trùng là cồn 700 trong 1

phút và HgCl2 0,1% trong các khoảng thời gian khác nhau là: 2; 3; 4; 5; 6; 7
phút. Dùng nƣớc cất đã khử trùng để loại bỏ hóa chất sau sử dụng hóa chất để
thu đƣợc mẫu sạch.
Đoạn thân sau khi khử trùng sạch, cắt bỏ đầu thân bị tổn thƣơng thâm
đen, thành từng đoạn 3,5 – 5 cm, trên mỗi đoạn có ít nhất 1 mắt ngủ và cấy vào
môi trƣờng khởi đầu (MS + 20g glucose + 6g/l agar). Theo dõi kết quả sau 2
tuần nuôi cấy và ghi lại số liệu nhƣ đã bố trí ở bảng 2.1
Bảng 2.1. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến kết
quả tạo mẫu sạch
Thời gian khử

CTTN

trùng

Số mẫu nghiên

Tỷ lệ mẫu

phút)

cứu (mẫu)

sạch (%)

Lần 1

Lần 2

KT0

0

-

30

KT1

2

1

30

KT2

3

2

30

KT3

4

3

30

KT4

5

1

30

KT5

6

1

30

KT6

7

1

30

Tỷ lệ mẫu
sạch tái sinh
(%)

Thí nghiệm 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của mơi trường dinh dưỡng đến khả

năng tái sinh chồi từ lát mỏng
Sử dụng các mẫu sạch tạo đoạn thân cây Củ dịm đƣợc cắt thành từng lát
mỏng (tTCL) có độ dày ngẫu nhiên để thử nghiệm môi trƣờng tái sinh phù với
15


lát cắt. Sau đó đặt lát cắt mỏng vào các cơng thức mơi trƣờng ni cấy tái sinh
khác nhau có bổ sung thêm: 20g/l glucose + 6g/l thạch agar + pH = 5,8 và chất
ĐHST (0,1mg/l NAA + 0,3mg/l BAP), đƣợc bố trí theo các cơng thức dƣới
bảng 2.2.
Bảng 2.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả năng tái sinh
chồi từ lát mỏng
Mơi

Số mẫu ban

trƣờng

đầu(lát)

MT1

MS

30

MT2

½ MS

30

MT3

WPM

30

CTTN

Tỷ lệ mẫu
tái sinh
(%)

Chiều cao

Đặc điểm

chồi (cm)

chồi

Thí nghiệm 3. Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ các lát cắt có kích thước
khác nhau
Trên cơ sở chọn đƣợc môi trƣờng dinh dƣỡng từ thí nghiệm 2, tiến hành cắt lát
đoạn mẫu in vitro thành các lát có kích thƣớc 0,4; 0,7; 1; 1,3; 1,6mm rồi cấy vào
môi trƣờng MS + 20g/l glucose + 6g/l agar + (0,1 mg/l NAA + 0,3 mg/l BAP),
pH = 5,8. Nhằm lựa chọn đƣợc kích thƣớc lát cắt phù hợp cho kết quả tái sinh
cao nhất. Công thức thí nghiệm đƣợc bố trí khác nhau thể hiện ở bảng 2.3

16


Bảng 2.3. Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ các lát cắt có kích thƣớc
khác nhau.
CTTN

Kích

Số mẫu

Tỷ lệ tái

Chiều cao

Đặc điểm

thƣớc lát

cấy ban

sinh chồi

chồi (cm)

chồi

mỏng

đầu (lát)

(%)

(mm)
MT4

0,4

30

MT5

0,7

30

MT6

1

30

MT7

1,3

30

MT8

1,6

30

Thí nghiệm 4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ĐHST đến khả năng
nhân nhanh chồi
Việc chọn đƣợc mơi trƣờng ni cấy thích hợp và kích thƣớc lát cắt phù
hợp, tơi tiếp tục bố trí thí nghiệm và bổ sung chất ĐHST dựa trên cơ sở sử dụng
nhóm chất Auxin phối hợp với Cytokinin giúp tăng trƣởng chồi non và khởi
phát sự tạo mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô tƣơng ứng giúp tăng tỷ lệ tái
sinh. Các cơng thức thí nghiệm đƣợc bố trí với các thang nồng độ của NAA và
BAP khác nhau thể hiện ở bảng 2.4.
Bảng 2.4. Ảnh hƣởng của tổ hợp chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh
chồi

CTTN

Chất ĐHST

Số chồi sau

(mg/l)

nhân

NAA

BAP

NN1

0,2

NN2

0,3

NN3

0,2

TB/mẫu

(chồi)

0,4

NN4

0,5

NN5

0,6

Số chồi

17

Chiều cao

TB/ chồi
(cm)

Đặc điểm
chồi


Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của ĐHST đến khả năng tạo rễ
Vật liệu nuôi cấy là chồi Củ dòm đủ điều kiện ra rễ, cao từ 3 - 4cm trở lên và
có ít nhất 2 - 3 cặp lá thu đƣợc từ các thí nghiệm trên. Mơi trƣờng dinh dƣỡng sử
dụng là: MS + 6g/l agar + chất ĐHST đƣợc bố trí theo các cơng thức nghiên cứu
khác nhau về loại chất và hàm lƣợng của mỗi loại nhƣ bảng 2.5 dƣới đây:
Bảng 2.5. Ảnh hƣởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ in vitro
CĐHST (mg/l)
NAA

IBA

Tổng số
mẫu cấy
(chồi)

0

0

30

0,1

0,1

30

0,2

0,1

30

0,3

-

30

0,4

-

30

CTNC
R0
R1
R2
R3
R4

Tỷ lệ

chồi
Số rễ
ra rễ TB/cây
(%)

Chiều dài
rễ TB
(cm)

Chất
lƣợng
cây con

2.4.3. Phân tích và xử lý số liệu
Số liệu thu thập đƣợc từ hiện trƣờng cũng nhƣ các thí nghiệm đƣợc phân
tích và xử lý bằng các tiêu chuẩn thống kê phù hợp với sự hỗ trợ của phần mềm
Excel và hàm thống kê Anova.
- Các chỉ tiêu theo dõi :
+) Tỷ lệ tái sinh chồi (%) =
+) Hệ số chồi (lần) =
+) Tỷ lệ tái sinh(%) =
+) Tỷ lệ chồi ra rễ (%) =
+) Số rễ trung bình =

18


+) Chiều dài rễ trung bình (cm) =
+) Đặc điểm của rễ: hình dạng, màu sắc,...
Xử lý số liệu trên máy tính theo chƣơng trình Excel và hàm thống kê

Anova.

19