Ứng dụng phương pháp phân tích DNA góp phần chỉnh lý tên chi (bambusa schreb ) cho ba loài tre và đánh giá đa dạng nucleotide cho tám loài tre chưa có tên khoa học (bambusa SP ) ở việt nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT


VŨ THỊ THU HIỀN


ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA GÓP PHẦN
CHỈNH LÝ TÊN CHI (BAMBUSA SCHREB.) CHO BA LOÀI TRE
VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG NUCLEOTIDE CHO TÁM LOÀI TRE
CHƢA CÓ TÊN KHOA HỌC
(BAMBUSA SP.) Ở VIỆT NAM





LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - NĂM 201
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

2

.TSGS. TS. Lê Xu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

3

MỞ ĐẦU
Chi tre (Bambusa Schreb.) phân bố rộng rãi khắp mọi nơi ở Việt Nam. Đây là
nguồn tài nguyên có giá trị trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, gia dụng, cảnh quan,
thực phẩm,… Lần đầu tiên vào cuối thế kỷ XIX, nhà thực vật học người Pháp Balansa

(1890) đã phân loại tre Việt Nam có 5 chi và 7 loài, trong đó có 2 loài mới. Nhưng đến
cuối thế kỷ XX công trình phân loại tre của Lê Nguyên (1971) và Phạm Hoàng Hộ (1972,
1993, 2000) đã công bố khá đầy đủ với số lượng lên tới 22 chi và 123 loài. Nguyễn Khắc
Khôi và Nguyễn Thị Đỏ (2005) đã công bố Danh lục các loài tre trúc của Việt Nam có 29
chi và 127 loài. Trong hợp tác nghiên cứu giữa Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam với
các chuyên gia Trung Quốc đã công bố danh sách các loài và chi tre trúc ở Việt Nam có
25 chi và 216 loài [10], trong đó chi tre (Bambusa Schreb.) có 67 loài, thì có tới 37 loài
chưa định loại được tên loài (dạng sp. và aff.)… Bên cạnh đó Lê Việt Lâm (2008) cũng
đã phát hiện thêm 4 loài mới, trong đó 2 loài chưa xác định tên. Hiện nay, việc phân loại
và đ ương pháp hình thái. Tuy nhiên
phương pháp đòi hỏi mẫu vật phải có đầy đủ các đặc điểm phân loại đặc biệt là cơ
, hầu hết không có đặc
điểm về cơ quan sinh sản (hoa, quả) vì chu kỳ ra hoa tới vài chục năm. Hơn nữa trong
một số trường hợp, phương pháp phân loại bằng hình thái khó thực hiện hoặc nhầm lẫn
do mẫu mang đặc điểm trung gian hoặc đồng hình. Khó khăn này không chỉ ở Việt Nam
mà ngay cả trên thế giới. Vì vậy, việc định loại tên loài ở chi tre vẫn còn rất nan giải cần
có sự hỗ trợ của kỹ thuật phân tích DNA.
Kỹ thuật phân tích DNA cho kết quả khá chính xác, giúp cho việc phát hiện loài
mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di
truyền, chủng loại phát sinh và sự tiến hóa của nhiều loài động vật, thực vật và vi sinh
vật. So với phương pháp hình thái thì phương pháp DNA cho độ chính xác cao mà không
lệ thuộc vào các yếu tố môi trường. Đối với thực vật, hai nhóm gen nhân và gen lục lạp
(cpDNA) thường được sử dụng trong các nghiên cứu về tiến hoá, sinh thái và phát sinh
chủng loại ở thực vật [26], [33], [41], [46]. So với gen nhân thì các gen lục lạp có mức độ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

4

bảo thủ hơn bởi việc thay thế chỉ một vài nucleotide [34], [36], [39], [44]. Nhờ có kỹ
thuật này, mà trong ngân hàng Genbank (2012) đã lưu giữ 16542 trình tự nucleotide cho

phân loại Họ phụ tre (Bambusoideae), trong đó có 607 trình tự nucleotide cho chi
Bambusa, trong số này rất nhiều loài cũng có ở Việt Nam [24], [25]. Đây là cơ sở cho
nghiên cứu này. Ở Việt Nam có khá nhiều công trình công bố về hiệu quả của việc giải
mã trình tự một số vùng gen giúp cho việc định loại tên loài ở nhiều đối tượng sinh vật
[1], [3], [12], nhưng đối với các loài tre mới chỉ có Nguyễn Minh Tâm (2006) đã sử dụng
một số chỉ thị isozyme để nhận dạng cho hai loài tre của Việt Nam. Mặc dù, kết quả thu
nhận chưa nhiều nhưng cũng là cơ sở để ứng dụng phương pháp phân tích DNA góp phần
cho nghiên cứu để chỉnh lý tên chi và đánh đa dạng nucleotide cho tám loài tre chưa có
tên khoa học (Bambusa Schreb.) ở Việt Nam.
Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ứng dụng phƣơng
pháp phân tích DNA góp phần chỉnh lý tên chi (Bambusa Schreb.) cho ba loài tre và
đánh giá đa dạng nucleotide cho tám loài tre chƣa có tên khoa học (Bambusa sp.) ở
Việt Nam”, với các mục tiêu sau:
- Chỉnh lý tên chi cho ba loài tre: Dùng cầu hai [Bambusa (Lingnania) sp.],
Dùng phấn [Bambusa (Lingnania) chungii] và Lùng thanh hoá [Bambusa
(Lingnania) longissima] thuộc chi Bambusa hay Lingnania.
- Đánh giá mức độ đa dạng nucleotide cho 08 loài tre chưa có tên khoa học
(Bambusa sp.): Bạc mày, Mét ba vì, Mạy cượp, Mạy khô, Tre đông khê, Tre
lục bình, Tre không gai tân an và Tre trãi long an.








Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

5

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
1.1. Giới thiệu tổng quát về chi tre (Bambusa Schreb.)
Chi tre có danh pháp khoa học là Bambusa Schreb. thuộc họ Poaceae. Tre phân bố
ở vùng nhiệt đới, á nhiệt đới và ôn đới. Châu Á là nơi có số loài nhiều nhất với 65 chi và
900 loài, châu Mỹ 20 chi và 45 loài, châu Phi 3 chi và 5 loài, châu Đại Dương 4 chi và 4
loài, châu Âu không có tre. Trung Quốc là quốc gia chiếm nhiều chi, loài và cá thể nhất
với 39 chi và 500 loài, tiếp đến là Nhật Bản 13 chi và 237 loài, Việt Nam 25 chi và 216
loài, Ấn Độ 23 chi và 125 loài,…[10], [18].
Cuối thế kỉ XIX, tre ở Việt Nam được phân loại có 5 chi và 7 loài, trong đó có 2
loài mới [15]. Đến cuối thế kỷ XX tre Việt Nam có tới 22 chi và 123 loài [4], [5], [6].
Năm 2005 theo Nguyễn Khắc Khôi và Nguyễn Thị Đỏ cho rằng tre Việt Nam có 29 chi
và 127 loài [8]. Năm 2006, trong hợp tác nghiên cứu giữa Viện Khoa học Lâm nghiệp
Việt Nam với các chuyên gia Trung Quốc lại công bố danh sách các loài và chi tre trúc ở
Việt Nam có 25 chi và 216 loài [10], trong đó chi tre (Bambusa Schreb.) có 67 loài, thì có
tới 37 loài chưa định loại được tên loài (dạng sp. và aff.).
Vị trí phân loại của chi tre (Bambusa Schreb.) theo phân loại hệ thống cổ điển, tre
thuộc:
Giới (regnum): Plantae
Ngành (division): Magnoliophyta
Lớp (classic): Liliopsida
Bộ (ordo): Poales
Họ (familia): Poaceae
Phân họ: Bambusoideae
Chi ( genus): Bambusa schreb.
1.1.1. Một số đặc điểm sinh học chính của ba loài cần chỉnh lý tên chi
a) Dùng cầu hai (Bambusa (Lingnania) sp.)
Thân ngầm mọc cụm, thân khí sinh cao 12-13 cm, đường kính 4-5,8 cm, tròn đều
màu xanh; thân non phủ phấn trắng ở các đốt phía trên. Lóng khá dài, 50-55 cm, vách dày
7 mm. Vòng mo nhô cao, phủ lớp lông màu hung dày cao 4 mm, phía dưới có vòng phấn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

6

trắng cao 5 mm. Mỗi đốt thân mang nhiều cành to gần như nhau, cỡ 4 mm. Bẹ mo hình
thang, đáy dưới rộng 21,7 cm, cao 22-27 cm, đáy trên rộng 11,2 cm, rụng sớm. Phiến mo
cụp về phía sau. Tai mo rộng 3,5 cm, cao phía trong 4 mm; mép ngoài thò dài 2 cm, cao 8
mm, có hàng lông tua dài 1 cm. Lưỡi mo nhỏ cao ở giữa, cao 1,5 mm, mép có răng cưa
thấp 0,5 mm. Phiến lá hình ngọn giáo, dài 22-24 cm, rộng 2,4-2,5 cm, đầu nhọn, gốc tròn
hay tim lệch. Tai một bên to (rộng 4 mm) mang 9 lông dài 1,1 cm; một bên nhỏ rất thấp,
mang 7 lông, dài 1 cm. Cuống lá dài 2 mm, rộng 2 mm. Măng tháng 6-8 [10].
b) Dùng phấn (Bambusa (Lingnania) chungii Mc Clure)
Thân ngầm dạng củ, mọc cụm thưa, thân khí sinh đứng thẳng, ngọn hơi cong, cao
5-10 (18) m, đường kính 3-5 (7) cm. Lóng dài 30-45(100) cm, vách dày 3-5 mm, khi non
phủ dày phấn sáp màu trắng, nhẵn. Vòng thân phẳng. Mo thân có bẹ mo hình thang, cao
30-35 cm, đáy dưới rộng 23-26 cm, cao 27-30 cm; đáy trên rộng 5,5-6,5 cm, hai đầu nhô
cao; mỏng, cứng; màu vàng nhạt. Tai mo hình dải hẹp; mép có lông mi màu nhạt, dài
mảnh và có ánh bóng. Lưỡi mo cao 1,5 mm. Phiến mo hình lưỡi mác hay trứng; đầu
nhọn, mép cuộn vào trong; gốc hình tròn thu hẹp; đáy rộng bằng khoảng 1/5 đầu bẹ mo
(dài 2,5-3 cm, cao 9-12 cm); màu lục-vàng nhạt. Tai mo cao 2-3 mm, dài 2-2,5 cm; mép
có hàng lông thô cứng, cao 1,2 cm; mặt trong có lông mềm dày. Sự phân cành bắt đầu từ
phía trên cao thân, khoảng đốt thứ 8 trở lên; ít hay nhiều cành, mọc cụm, kích thước gần
bằng nhau, nhẵn, có phủ sáp. Dùng phấn khác với các loài tre khác, mỗi đốt mang nhiều
cành phát triển từ 1 gốc giống như Nứa. Phiến lá hình lưỡi mác đến lưỡi mác dài, khi già
hình dải, dài 10-16 (20) cm, rộng 1-2 cm, hai bên gốc không đối xứng, đầu nhọn, gốc tròn
hay gần tròn, khá dày; mặt trên nháp, phần trên có lông; mặt dưới khi non phủ lông nhỏ,
khi già nhẵn; gân cấp 2 có 5-6 đôi. Thìa lìa 1 mm. Tai thấp, có lông cứng thưa, 5-6 cái,
dài 1,5 cm. Bẹ lá nhẵn. Măng vào mùa thu [10].
c) Lùng thanh hoá (Bambusa (Lingnania) longissima)
Thân ngầm mọc cụm dày, thân khí sinh đứng thẳng hay hơi cong; cao 10-20 m,

đường kính 6-10 cm. Lóng dài 50-80 (100) cm, đôi khi 140-160 cm, tròn đều; khi non
màu xanh lục, có phấn trắng; khi già màu xanh vàng, không phấn trắng; vách dày 6-7
mm. Mắt nhỏ, tròn, đường kính 1 cm. Vòng đốt không phình to, không có vòng rễ; vòng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

7

mo nhô cao, rộng 4 mm, phía dưới nhiều lông màu tím dài 5 mm. Phân cành từ khoảng
1/2 dưới thân trở lên, đốt 10-11; nhiều cành chính gần bằng nhau, góc chia cành 60
º
. Bẹ
mo hình chuông hay thang, đáy dưới rộng 31 cm, cao 20-30 cm, đáy trên rộng 7-8 cm.
Tai mo nhỏ, nhăn nheo, hơi cong, nhiều lông mi. Phiến mo hình tam giác dài, thon, dài 6-
7 cm, rộng 2-3 cm, thường lật về phía sau. Phiến lá hình mũi mác-thuôn hay ngọn giáo, dài
18-20 cm, rộng 2,5-3 cm; đầu nhọn, gốc hơi nhọn; mặt trên màu xanh thẫm, mặt dưới
màu xanh nhạt, gân 8-9 đôi. Bẹ lá có lớp lông vàng nhạt hay bạc ở nửa phía trên, gân
khoảng 18. Tai lá có 9-10 đôi lông nhô ra ngoài, màu bạc, dài 1 mm. Cuống lá dài 1 mm.
Ở nơi khô hạn lá có kích thước nhỏ hơn (dài 15 cm, rộng 2 cm) [10].
1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chính của tám loài tre chƣa có tên khoa học (Bambusa sp.)
a) Bạc mày (Bambusa sp.)
Thân ngầm mọc cụm dày, thân khí sinh cao 13-18 m, đường kính 13-15 cm, ngọn
hơi cong xuống. Lóng hơi uốn khúc, dài 26-35 (40) cm; vách dày 2,80-3,00 cm; khi non
có lông màu nâu, thưa; khi già nhẵn; vòng đốt nổi không phồng, có rễ khí sinh mọc rải
rác; giữa đốt có lông dài 1,4-1,5 mm, màu nâu; phía dưới đốt có vòng lông tơ dưới mỗi
vòng mo. Phân cành từ đốt 8-10, có một vài cành hướng lên; 3 cành dài ở đốt trên dài 4-5
m, gốc cành phồng và có rễ. Bẹ mo hình thang, cao 25-32 cm, có đáy dưới rộng 40-42
cm, đáy trên rộng 20-22 cm, cao 35-37 cm; mặt lưng có lông cứng ở 2/3 phía trên; rụng
sớm. Tai mo nhỏ. Thìa lìa cao 4-6 mm, mép có lông tua. Phiến mo hình tam giác rộng,
đáy rộng 3-4 cm, cao 6-8 cm, bằng 1/2 chiều rộng đáy trên bẹ mo, đầu nhọn; phiến thẳng,
tồn tại. Phiến lá hình lưỡi mác-thuôn, dài 16-28 cm, rộng 3-4 cm; mặt trên màu xanh;

mặt dưới màu xanh nhạt; gân thứ cấp 9-10; gân ngang nhỏ không rõ; mép có răng và
lông. Bẹ lá màu vàng. Tai lá cong hình lưỡi liềm, dài 3-5 mm. Thìa lìa cao 1mm. Mùa
măng tháng 7-9 [10].
b) Mạy cượp (Bambusa sp.)
Thân ngầm mọc cụm dày, 20-30 cây trong một bụi, cây mọc sát nhau. Thân khí
sinh cao 8-10 m, đường kính 8-10 cm, không được thẳng, hơi uốn cong. Lóng dài 34-38
(50) cm, vách dày 2-3 cm; khi non có lông màu hơi bạc; vòng đốt nổi, có vòng tròn. Phân
cành ngay từ gốc thân; mỗi đốt có 1 cành to và nhiều cành nhỏ, các cành dài rủ xuống.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

8

Bẹ mo hình thang, cao 12-25 cm, ở các đoạn thân phía trên có đáy dưới rộng 30-36 cm,
cao 14-18 cm; đáy trên hơi lõm, rộng 7-10 cm; mặt ngoài có lông thưa màu nâu đen. Tai
mo rộng 3-3,5 cm, cao 2-2,5 cm; mép lượn sóng, có lông cứng dài 6 mm, thưa. Thìa lìa
cao 6 mm, có lông cứng dài 3 mm, khi rụng còn lại như răng cưa. Phiến mo đáy rộng 3-
3,3 cm, cao 5-5,6 cm, mặt trong có lông. Phiến lá hình mũi giáo, dài 23-30 cm, rộng 4,5-
4,8 cm; gốc tù. Bẹ lá cao 1 mm, có lông dài 4 mm, thưa, sớm rụng. Cuống là dài 2-3 mm.
c) Mạy khô (Bambusa sp.)
Thân ngầm mọc cụm thưa, thân khí sinh cao 13-15 m, đường kính 4-5 (7) cm; lóng
dài 20-25 cm, tròn đều, vách dày 2-3 cm. Phân cành ngay từ gốc: mỗi đốt có 1 cành to và
nhiều cành nhỏ, nhiều cành nhỏ mọc dày bao quanh thân cây. Bẹ mo hình thuôn đứng
hay hình thang cao 25-32 cm, 2 mép mỏng, có gân mịn và dày, đáy dưới hơi lượn sóng,
đáy trên nhỏ cao ở giữa và hơi lõm ở ngoài; mặt ngoài có lông màu đen, thưa, sớm rụng.
Đoạn thân phía trên các bẹ mo có đáy dưới rộng 29-30 cm, cao 20-21 cm, đáy trên rộng
15-17 cm; đoạn thân phía dưới bẹ mo có đáy dưới rộng 22-26 cm, cao 11-14 cm, đáy trên
rộng 12-13 cm, tai mo một bên xuôi xuống và nhô ra ngoài; một tai đứng, rộng 3 cm và
cao 2 cm, có lông dày dài đến 2 mm, thìa lìa cao 4 mm; có lông mịn và thấp, dài 1 mm.
Phiến mo ở đoạn thân phía trên có đáy rộng 1,5 cm, cao 4 cm; có lông thưa, ngắn; ở đoạn
thân phía dưới có đáy rộng 3 cm, cao 1,2 cm; có lông thưa dày, dài đến 6 mm. Phiến lá

hình nêm, dài 7,5-8,5 (14) cm, rộng 1,5 (2) cm; gốc bằng, cắt ngang; gân 5-6 đôi. Tai lá
có lông thưa, dài 1 mm. Bẹ lá không lông. Cuống lá dài 1 mm. Măng có vào các tháng
mùa mưa [10].
d) Mét ba vì (Bambusa sp.)
Thân ngầm mọc cụm, thân khí sinh cao 9-12 m, đường kính 7-8 cm, ngọn cong
xuống. Lóng dài 30-35 cm, hơi uốn cong; khi non có lông thưa; khi già nhẵn; vách dày
1,5-2,0 cm; vòng đốt cao 6-10 mm, phồng lên với vòng rễ, dưới vòng mo có vòng màu
xám, chồi mắt phồng lên. Phân cành từ dưới thấp; các đốt phía gốc có 1 cành; các đốt
phía trên có 3 đến vài cành, cành giữa to và dài hơn rõ rệt. Bẹ mo hình thang, cao 30-35
cm, có đáy dưới dài 40 cm, cao 30 cm, đáy trên dài 18 cm. Tai mo rõ, có lông cao 6-8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

9

mm. Thìa lìa dài 8-10 mm, mép có răng và lông ở rìa. Phiến mo lật ngược ra phía ngoài,
tồn tại, hình tam giác-trái xoan hay ngọn giáo, đáy rộng 3-4 cm dài bằng 1/3 đáy trên bẹ
mo, cao 20-22 cm gốc có tơ màu nâu cả 2 mặt. Phiến lá hình mũi mác-thuôn, dài 14-20
(28) cm, rộng 2-3 (8) cm mặt trên màu xanh, mặt dưới màu xanh nhạt; gân cấp hai có 7-
8, gân ngang nhỏ không rõ; mép có lông. Tai lá cong lưỡi liềm. Thìa lìa cao 1 mm. Mùa
măng tháng 4-9 [10].
e) Tre đông khê (Bambusa sp.)
Thân ngầm mọc cụm dày, thân khí sinh cao 10-13 m, đường kính 4,5-6 cm, đứng
thẳng hay hình chữ chi (Zic Zắc) ở phía gốc; nhiều lông màu nâu thẫm và phấn trắng;
lóng khá dài, dài 85-90 cm; vòng thân nổi; vòng đốt có lông dài màu nâu thẫm cong
xuống; vách mỏng, chỉ dày 2-3 mm. Phân cành: có một cành to hơn và nhiều cành nhỏ
hơn. Bẹ mo hình chuông, thuôn, cao 25-35 cm, có đáy dưới rộng 12-32 cm, cao 28-32
cm; dạng lượn sóng, lõm; đáy trên rộng 11-13 cm phồng to và nhô ra ngoài ở hai mép,
dạng lượn sóng, 1 mép to và 1 mép nhỏ, mép nhỏ bằng 1/2 mép to. Tai mo lệch, rộng 3-6
cm, cao 3-4 mm, 1 tai cao và 1 tai bằng; có lông cao đến 5 mm, cứng, thưa. Thìa lìa cao
đến 2 mm, có lông thưa dài đến 1 cm. Phiến mo hình tam giác, dài 14-15 cm, rộng 5-6

cm; đầu có mũi nhọn dài, đáy hơi lõm; mặt trong phía dưới có lông dày, màu nâu bạc.
Phiến lá hình dải, thuôn dài, dài 22-24 cm, rộng 2-2,4 (4) cm; gốc nhọn và lệch; gân lá 6-
7 đôi; mặt dưới nhiều lông nhung màu bạc; mặt trên lông thưa hơn. Tai lá rộng 2-3 mm,
cao 1 mm; có nhiều lông dài đến 3 mm, cứng, thưa. Thìa lìa cao đến 1 mm, có lông mịn.
Bẹ lá có gân chính nổi rõ và nhiều lông mịn màu nâu. Mùa măng tháng 8-9; măng có
màu bạc-đỏ, nhiều phấn trắng dày đặc [10].
f) Tre không gai tân an (Bambusa sp.)
Thân ngầm mọc cụm dày đặc, thân khí sinh cao 8-12 m, đường kính 5-5,5 cm,
đứng thẳng. Lóng dài 28-33 (45) cm, tròn đều; khi non màu xanh thẫm, khi già mẫu xanh
xám; vách dày 5-7 mm; vòng đốt nổi. Phân cành với mỗi đốt 1 cành to, dài, vươn cao, gốc
cành có rễ khí sinh; nhiều cành nhỏ. Bẹ mo hình chuông rộng, cao 18-20 cm, có đáy dưới
rộng 22-23 (28) cm, cao 15-18 (35) cm, đáy trên rộng 3-3,5 (5) cm; ở đoạn thân phía trên,
bẹ mo có đáy dưới nhỏ hơn (chỉ rộng 16-22 cm), nhưng cao hơn (cao 22-23 cm), đáy trên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

10

cũng lớn hơn (rộng 4-5,5 cm); mặt ngoài có lông màu đen, thưa. Tai mo lõm, có lông tua
dài. Thìa lìa cao đến 3 mm, có lông tua cứng. Phiến mo ở đoạn thân phía dưới đáy rộng
1,2-2 cm, cao 4-7 cm; ở đoạn thân phía trên rộng 2,5-3 cm, cao 12-16 cm. Phiến lá dài 9-11 (15)
cm, rộng 1,8-2 cm; gốc tròn hay hình nêm, hơi cắt ngang; mép có răng cưa nhỏ; gân 5-6
đôi. Tai lá có lông ngắn, màu trắng. Thìa lìa ngắn, có lông dài. Cuống lá dài 1-2 mm [10].
g) Tre lục bình (Bambusa sp.)
Thân ngầm mọc cụm dày đặc, thân khí sinh cao 5-7 m đường kính 3-4,5 cm. Lóng
dài 30-32 cm, tròn đều; khi non hình chữ chi (Zic zắc), màu xanh, nhẵn bóng; vách mỏng,
dày 3-5 mm; vòng đốt hơi nổi. Phân cành với đốt có 1 cành to và 2 hay nhiều cành nhỏ.
Bẹ mo hình thang cao, cao 15-20 cm, đoạn thân phía dưới bẹ mo có đáy dưới rộng 12-
15(17) cm, cao 11-12 (23) cm, đáy trên rộng 4-4,5 (7) cm; đoạn thân phía trên bẹ mo có
đáy dưới rộng 13-15 cm, cao 22-24 cm, đáy trên rộng 6-6,5 cm. Tai mo rộng 2-4 mm, cao
3-10 mm. Thìa lìa cao 1-2 mm; lông tua dài, thưa. Phiến mo đáy rộng 3-3,5 cm, cao 4,5-8

(15) cm. Phiến lá hình nêm hay ngọn giáo dài, dài 8-9 (17) cm, rộng 0,5-1 (2) cm; gốc hơi
nhọn; gân lá 5-6 đôi. Tai lá thấp, có lông thưa, sớm rụng. Cuống lá dài 1 mm [10].
h) Tre trãi long an (Bambusa sp.)
Thân ngầm mọc cụm dày đặc, thân khí sinh cao 10-12 m, đường kính 4,5-5 cm,
đứng thẳng. Lóng dài 35-39 cm; vách dày 1-1,5 cm; vòng đốt nổi; chồi mặt hình tam giác;
ở phía chồi trên mặt lóng có vết lõm chạy dài gần hết lóng. Phân cành với 1 cành to và 1-
2 cành nhỏ hay rất nhỏ; gốc cành to phù lên và có rễ khí sinh; gần vòng đốt có vòng màu
vàng, khi mo rụng có màu nâu bạc. Bẹ mo hình thang cao 15-20 cm, có đáy dưới rộng 20-
22 cm, cao 17-18 cm; đáy trên rộng 2,2-3 cm, hơi lõm; mặt ngoài có lông đen mịn và dày
ở 2 bên, ở giữa lông sớm rụng; mặt trong bóng láng. Tai mo có lông tua. Thìa lìa cao 1
mm, có lông tua dài 5 mm. Phiến mo đáy rộng 1,1-1,2 cm, cao 3-3,5 cm; có lông tua
cứng, thưa. Phiến lá hình nêm, dài 12-13 cm, rộng 1,7-1,8 cm, gốc tù hay hình nêm. Tai lá
cao 1 mm, có lông thưa dài đến 0,4 cm. Bẹ lá nhẵn, cuống lá dài 2 mm [10].
1.2. Một số vƣớng mắc trong phân loại bằng phƣơng pháp hình thái ở tre
- Các loài tre cần chỉnh lý tên chi: Các loài thuộc chi Bambusa và Lingnania đều
có một số đặc điểm hình thái giống nhau như thân ngầm mọc cụm, thân khí sinh cao 10-
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

11

18 m, đường kính thân 4-7 cm,… Song giữa hai chi này có vài đặc điểm hình thái khác
nhau, các loài thuộc chi Bambusa mỗi đốt thân chỉ có 3 cành chính, lóng ngắn (40 - 50
cm), vách dày và phiến mo ôm sát thân; còn các loài thuộc chi Lingnania thì mỗi đốt thân
có rất nhiều cành chính, lóng rất dài (60-80 cm), vách mỏng và phiến mo đôi khi ngửa
giáp xuống thân hoặc ngửa gần sát xuống thân [7]. Năm 1940, McClure đã tách chi
Lingnania ra khỏi chi Bambusa Schreb [29]. Sau đó một số nhà thực vật Trung Quốc và
thế giới đã không công nhận chi mới này và chỉ xếp thành chi phụ (sub gen. Lingnania)
của Bambusa [19]. Ở Việt Nam, Nguyễn Khắc Khôi và Nguyễn Thị Đỏ (2005), Nguyễn
Hoàng Nghĩa (2006) thì vẫn cho rằng đó là hai chi độc lập.
Cho đến nay ba loài Dùng cầu hai, Lùng thanh hóa và Dùng phấn vẫn chưa rõ

thuộc chi Bambusa hay Lingnania, bởi chúng đều có một số đặc điểm hình thái giống với
cả hai chi, mà cơ quan sinh sản lại chưa bắt gặp. Vì vậy cần có sự hỗ trợ của phân tích DNA.
- Các loài tre chưa có tên khoa học: Vì chưa bắt gặp được cơ quan sinh sản nên ở
chi tre có tới 37 loài chưa có tên khoa học [10]. Trong số đó có 8 loài được lựa chọn cho
nghiên cứu này đó là: Bạc mày, Mét ba vì, Mạy cượp, Mạy khô, Tre đông khê, Tre lục
bình, Tre không gai tân an và Tre trãi long an. Tám loài tre này vẫn chưa có tên khoa học
và đều thuộc chi Bambusa.
1.3. Giới thiệu một số phƣơng pháp phân loại học thực vật
- Phương pháp phân loại bằng đặc điểm hình thái (Morphology): Đây là phương
pháp truyền thống được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu phân loại học, tiến hoá và giám
định sinh vật. Phương pháp chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái của các cơ quan và cơ
thể, đặc biệt là cơ quan sinh sản. Phương pháp phân loại bằng hình thái đòi hỏi mẫu vật
phải có đầy đủ các đặc điểm phân loại. Tuy nhiên trong thực tế mẫu vật thu được không
phải luôn luôn thỏa mãn yêu cầu trên, trong một số trường hợp, phương pháp phân loại bằng
hình thái khó thực hiện hoặc nhầm lẫn do mẫu mang đặc điểm trung gian hoặc đồng hình.
- Phương pháp phân loại bằng hoá học (Chemitaxonomy): Phương pháp xây
dựng trên cơ sở nghiên cứu tiến hoá học của các taxon thực vật. Tiến hành phân loại hoặc
định loại dựa trên một số phương pháp như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí khối phổ và sắc
ký lỏng cao áp. Việc định loại hoặc giám định loài dựa vào dấu vân hoá học (chemical
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

12

fingerprint), thực chất đấy là tổ hợp các hợp chất điển hình cho mỗi loài và có đặc điểm ít
biến động. Ưu điểm của phương pháp này là cho kết quả nhanh, chính xác và có thể cho
biết thêm các số liệu về thành phần hoá học. Phương pháp không yêu cầu tính nguyên vẹn
của mẫu vật. Đây là phương pháp đang được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới. Ở nước
ta, phương pháp này mới chỉ được bắt đầu nghiên cứu ở một vài cơ sở. Tuy nhiên, do
thành phần hoá học thường biến động theo tuổi, thời vụ và điều kiện môi trường, nên đòi
hỏi người nghiên cứu cần có kiến thức rộng trên một số lĩnh vực.

- Phương pháp phân loại bằng giải phẫu vi cấu trúc (Micro structure): Chủ yếu
dựa trên đặc điểm cấu trúc hiển vi của các nhóm thực vật. Phương pháp không đòi hỏi kỹ
thuật phức tạp nhưng cho kết quả khá chính xác. Ưu điểm không cần sử dụng các tiêu bản
đủ tiêu chuẩn. Đối với các loài cây gỗ thường sử dụng đặc điểm giải phẫu thân (gỗ) để
định loại, trong khi với các loài cây thảo thường sử dụng đặc điểm cấu trúc của biểu bì.
Hiện phương pháp này được sử dụng khá rộng rãi tại nhiều quốc gia (Mỹ, Đức, Hà Lan,
Trung Quốc, ). Một số nước (Mỹ, Trung Quốc, Indonesia, Malaysia, ) sử dụng phương
pháp này trong giám định mẫu của các loài cây gỗ khi không có tiêu bản, đặc biệt giám
định gỗ các loài quý hiếm trong công tác xuất nhập khẩu. Ở Việt Nam, trường Đại học
Lâm nghiệp đang thực hiện phương pháp này để giám định một số loài cây gỗ.
- Phương pháp định loại bằng nhiễm sắc thể (Chromosome identification): Là
phương pháp định loại các loài sinh vật dựa trên số lượng và đặc điểm cấu trúc của bộ
nhiễm sắc thể. Với phương pháp này, việc định loại các loài trong chi cho kết quả chính
xác cao. Hiện nay, trên thế giới đã có một số ngân hàng lưu trữ về bộ nhiễm sắc thể của
nhiều loài sinh vật. Tuy vậy, trong một số trường hợp việc ứng dụng phương pháp này
gặp khó khăn (hiện tượng dãy nhiễm sắc của một loài,…).
- Phương pháp phân loại học phân tử (Molecular taxonomy): là hướng nghiên
cứu được phát triển mạnh trên thế giới trong những năm gần đây. Phân loại học phân tử
giải quyết 3 vấn đề chính: (1) Nghiên cứu cấu trúc chủng quần (chẳng hạn như sự biến đổi
địa lý, tính dị hợp, hệ giao phối và quan hệ cá thể); (2) Nhận biết ranh giới các loài (giám
định gen); (3) đánh giá sự phát sinh chủng loại (tiến hóa loài) [22]. Phương pháp được
xây dựng dựa trên thành phần và cấu trúc của các gen đặc hữu của các taxon sinh vật nên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

13

có hiệu quả cao trong việc định loại và giám định loài. Cơ sở của phương pháp này là dựa
trên kỹ thuật phân tích DNA còn được gọi là “dấu vân DNA- DNA fingerprint”. Vì các
giá trị khoa học nêu trên, đến nay kỹ thuật sinh học phân tử đang là công cụ hỗ trợ đắc lực
cho các nhà nghiên cứu trong việc phát hiện các loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về

vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và mức độ
tiến hoá của nhiều loài động thực vật và vi sinh vật. So với chỉ thị hình thái thì chỉ thị
DNA cho độ chính xác cao mà không lệ thuộc vào bất cứ yếu tố khách quan nào. Hiện
nay, ở Việt Nam phương pháp đang được sử dụng trong nghiên cứu phân loại, định loại,
tiến hóa,… trên nhiều đối tượng sinh vật ở Viện Công nghệ sinh học, Viện Sinh thái và
Tài nguyên sinh vật, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam,…
1.4. Hệ gen sử dụng trong nghiên cứu phân loại phân tử ở thực vật
1.4.1. Một số vùng gen thuộc hệ gen lục lạp
Hệ gen lục lạp (cpDNA) là một phân tử DNA vòng, sợi đơn, mỗi gen thường
không lặp lại, có kích thước từ 120 kb - 220 kb. Không giống như các gen nhân, các gen
lục lạp chỉ mã hoá các protein cần thiết cho chức năng quang hợp. Hệ gen lục lạp thường
được sử dụng cho nghiên cứu phân loại ở thực vật do đặc tính di truyền theo dòng mẹ,
không bị tái tổ hợp di truyền cho thế hệ sau và rất bảo thủ [34].







Hình 1.1. Hệ gen lục lạp của cây Arabidopsis thaliana [34]
Hệ gen lục lạp được đánh giá là sự tích lũy các đột biến theo thời gian, nên phản
ánh đúng mức độ tiến hóa của loài. Các gen lục lạp có tốc độ đột biến thấp hơn từ 4-5 lần
so với gen trong nhân, nhưng nhanh hơn khoảng ba lần so với DNA ty thể thực vật và
Vùng
gen
nghiên
cứu
Vùng
gen

nghiên
cứu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

14

thường xuyên được sử dụng trong nghiên cứu phân loại. Hiện nay, các vùng gen matK,
trnL-trnF, vùng đệm psbA-trnH, rpoC2…hay được sử dụng trong nghiên cứu hệ thống
học phân tử thực vật. Tất cả các gen thuộc hệ gen lục lạp thường có mức độ biến đổi
không lớn hơn 2% giữa các loài lân cận.
Vùng đệm psbA - trnH: thường được sử dụng cho nghiên cứu phân loại [36], [45].
Vùng này có kích thước xấp xỉ 450bp, xác suất nhân bản thành công rất cao (100% với
các loài đã được nghiên cứu). Mức độ khác biệt trình tự nucleotide giữa các loài trung
bình là 1,24% và sự khác biệt bên trong loài rất thấp từ 0 - 0,08% [36]. Trình tự psbA -
trnH cũng đã được công bố trên ngân hàng gen với nhiều loài khác nhau thuộc thực vật
hạt trần, dương xỉ, rêu và rêu tản (liverwort).
Gen matK: cùng với vùng đệm psbA - trnH đã được đề xuất làm DNA barcode
cho nhóm thực vật có hoa. Kết quả sử dụng gen matK cho phân loại đã thu được sự tương
đồng rất cao với phân loại hình thái và cho giá trị bootstrap từ 92 – 100% [31].
Gen trnL: Là gen mã hoá cho tARN vận chuyển Leucine trong lục lạp, có kích
thước từ 452bp đến 528bp với các loài thuộc họ đậu. Gen này được sử dụng nhiều trong
nghiên cứu phân loại phân tử [327], [30], [43]. Các kết quả thu được trong các nghiên cứu
nguồn gốc phát sinh loài sử dụng gen trnL cho thấy đây là một vùng DNA hữu ích cho
phân loại.
Ngoài các locus được nêu trên, các vùng gen rbcL, vùng đệm trnL-trnF, trnT-
trnL, thuộc hệ gen lục lạp cũng thường được sử dụng cho nghiên cứu phân loại, tiến
hóa, Việc sử dụng mỗi vùng gen cho những ưu nhược điểm khác nhau, kết quả phân
loại sẽ chính xác hơn khi phân tích tổ hợp nhiều gen.
1.4.2. Vùng gen nhân (ITS)

Vùng ITS (internal transcribed spacer) của gen mã hoá cho ribosome nhân gồm
các đơn vị gen 18S, 5,8S và 26S (Hình 1.2). Giữa các đơn vị gen có các đoạn ITS-1 và
ITS-2, các thành phần này tạo thành một nhóm gen cơ bản. Các nhóm gen như vậy lặp lại
liên tục trong hàng nghìn bản sao trong hệ gen nhân và chúng được ngăn cách bởi vùng
NTS (nontranscribed spacer) (Hình 1.2).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

15

Trong các nghiên cứu phân loại ở mức độ loài, vùng ITS đã được các nhà nghiên
cứu kiến nghị làm vùng DNA barcode cho nhiều loài thực vật [14], [16], [17]. Ở mức độ
loài, vùng ITS có mức độ đa dạng cao (khoảng 13,6% giữa các loài gần gũi), nhưng lại có
mức độ biến đổi thấp bên trong loài [17]. Với sự hiện diện của trên 70.000 trình tự ITS
được công bố trên ngân hàng Genbank năm 2011 đây là nguồn tư liệu có giá trị, mở ra
những triển vọng lớn cho nghiên cứu phân loại và giám định.





Hình 1.2. Sơ đồ vùng gen ITS
- Gen PIF (P instability factor): PIF - like transposable elements là đoạn DNA có
khả năng di chuyển độc lập ngay trong nội bộ một thể nhiễm sắc hoặc từ thể nhiễm sắc
này sang thể nhiễm sắc khác, còn gọi là gen nhảy (transposon). Gen nhảy lần đầu tiên
được Barbara McKlintock (1941) phát hiện nghiên cứu ở cây ngô từ những năm 40 của
thế kỷ XX, nhưng mãi đến những năm 70 - 80 với sự tiến bộ của kỹ thuật phân tích di
truyền người ta mới hiểu rõ được cấu trúc và cơ chế hoạt động của transposon.
Transposon được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm, thực vật, động vật và con người. Chúng rất đa
dạng về độ lớn và cơ chế hoạt động, nhưng đều có điểm chung là được xếp xen kẽ vào hệ
gen và sử dụng enzym transposaza để di chuyển từ vị trí này sang vị trí khác của phân tử

DNA. Với khả năng di động di chuyển vị trí, các gen nhảy tạo nên sự tổ hợp lại hệ gen
làm cho hệ gen càng đa dạng. Hơn nữa gen nhảy còn gia tăng tần số đột biến. Các gen
nhảy có thể được xếp xen kẽ vào các đoạn exon, các đoạn intron hoặc vào vùng DNA
điều chỉnh của gen và tạo nên các đột biến gen rất đa dạng [2 ], [9].
Các yếu tố di chuyển (transpoable elements – TEs) được chia làm hai nhóm dựa
vào cơ chế di chuyển vị trí. Nhóm I là các retrotransposons di chuyển thông qua dạng
trung gian ARN nhờ enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase). Ngược lại, nhóm II là

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

16

DNA transposon di chuyển trực tiếp thông qua DNA và các phản ứng chuyển vị được xúc
tác bởi enzym transposase được mã hóa bởi DNA transposon độc lập (autonomous DNA
transposons) [47]. PIF là một DNA transposon độc lập, lần đầu tiên được xác định trình
tự qua phân tích 6 đoạn chèn độc lập vào cùng vị trí chính xác trong intron 2 của gen R ở
ngô, PIF sau đó còn được phát hiện ra ở nhiều loài thực vật, nấm và giun tròn, từ đó được
phân loại nằm trong liên họ PIF/Harbinger và được đặc trưng trong nhiều sinh vật nhân
chuẩn. PIF bao gồm 2 khung đọc mở (ORF), khung đọc thứ nhất mã hóa cho một protein
kết hợp với DNA, khung đọc thứ hai mã hóa cho enzym transposase. Trình tự amino acid
trong PIF khá bảo thủ trong cả các loài động vật và thực vật, vì vậy gần đây thường được
dùng để thiết lập mối quan hệ tiến hóa giữa các loài.
1.5. Một số thành tựu ứng dụng phƣơng pháp phân tích DNA vào phân loại ở tre
Ngoài nước: Từ hàng nghìn năm nay, tre trúc đã đi vào đời sống của hàng triệu
người dân ở Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam và các nước Châu Á khác nên rất được
quan tâm nghiên cứu. Vì thế, cho đến nay trong cơ sở dữ liệu gen [24], [25] đã lưu giữ
16542 trình tự nucleotide cho phân loại Họ phụ tre (Bambusoideae), trong đó có 607 trình
tự nucleotide cho chi Bambusa, trong số này rất nhiều loài cũng có ở Việt Nam. Hai nhóm
gen chính thường được sử dụng là gen nhân và hệ gen lục lạp (cpDNA) vào nghiên cứu
phân loại, nhận dạng và tiến hóa trên nhiều đối tượng sinh vật. Ngay ở tre, cũng có khá

nhiều công bố về mối quan hệ chủng loại và nhận dạng loài. Chẳng hạn, Sun và cộng sự
(2005) đã sử dụng trình tự nucleotide DNA vùng ITS nhân để nghiên cứu 21 loài tre
thuộc các chi Bambusa, Dendrocalamopsis, Dendrocalamus, Guadua, Leleba và
Lingnania, từ các kết quả thu nhận đã giải quyết được mối quan hệ di truyền của một số
loài thuộc chi Bambusa (B. subaequalis, B. multiplex, B. emeiensis, B. chungii, B.
contracta, B. hainanensis, B. flexuosa, B. sinospinosa, B. tuldoides, B. surrecta, B.
intermedia và B. valida) [38]. Tương tự, Yang và cộng sự (2007) cũng đã xác định trình
tự nucleotide gen GBSSI và trnL cho 53 loài cần chỉnh lý tên chi (Schizostachyum,
Cephalostachyum, Dinochloa, Leptocanna, Melocanna, Melocalamus và
Pseudostachyum), thông qua kết quả so sánh trình tự nucleotide các tác giả đã đề nghị
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

17

chuyển loài C. virgatum và loài C. pergracile về chi Schizostachyum; Melocanna và
Pseudostachyum là những chi độc lập [43]. Năm 2009, Wu và cộng sự đã công bố trình tự
hệ gen lục lạp đầy đủ của 2 loài tre là Dendrocalamus latiflorus và Bambusa oldhamii,
với kích thước tương ứng là 139.350 bp và 139.365 bp [25], [42]. Yang và cộng sự (2010)
đã sử dụng 01 vùng gen nhân (GBSSI) và ba vùng gen lục lạp (psbA-trnH, rpl32-trnL và
rps16 intron) để xác định trình tự nucleotide và lập cây phát sinh chủng loại cho 64 loài
thuộc tông phụ tre. Kết quả xác định trình tự bốn vùng gen, các tác giả đã đề nghị chuyển
loài D. rongchengensis về chi Bambusa, ngược lại các tác giả lại không đồng ý quan điểm
của Staleton và Xia (1996) là chuyển loài D. membranaceus về chi Bambusa [37]. Hay
Zhou và cộng sự (2010) cũng đã làm rõ mối quan hệ di truyền các loài tre thuộc các chi
Guaduinae, Shibataceae, Arudinarieae, Bambusinae, Melocananinae và Chusqueeae trên
cơ sở xác định trình tự vùng gen PIF. Tương tự, Goh và cộng sự (2010) đã xác định trình
tự nucleotide vùng gen nhân GBSSI và bốn vùng gen lục lạp (rps16-trnQ; trnC-rpoB;
trnH-psbA; trnD-trnT) để nghiên cứu mối quan hệ di truyền gần gũi giữa các loài tre
(climbing bamboos) ở Đông Nam Á với các loài trong chi Bambusa [21].
Trong nước: Các nghiên cứu về đa dạng di truyền phục vụ công tác bảo tồn đa

dạng sinh học và tái tạo nguồn gen đã được thế giới quan tâm và phát triển. Theo hướng
này, các nhà nghiên cứu trong nước cũng đã từng bước tiếp cận. Gần đây, việc ứng dụng
các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại và nhận dạng
mẫu sinh vật ở Việt Nam cũng đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng sinh vật [1], [3],
[12]. Tuy nhiên đến nay, đối với các loài tre Việt Nam mới chỉ có Nguyễn Minh Tâm
(2006) sử dụng một số chỉ thị isozyme để nhận dạng cho hai loài tre của Việt Nam [13].
Mặc dù các kết quả thu nhận chưa nhiều nhưng cũng là cơ sở cho công tác bảo tồn đa
dạng di truyền nguồn tài nguyên sinh vật ở Việt Nam.
Tuy nhiên, đến nay chưa có một công trình công bố nào đề cập đến việc ứng dụng
kỹ thuật phân tích DNA để hỗ trợ cho phân loại ở phân Họ tre (Bambusoideae) nói chung
và chi tre (Bambusa) nói riêng ở Việt Nam.


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

18

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu: Bao gồm 11 loài tre như sau:
- Tám loài tre chưa xác định tên khoa học (Bambusa sp.): Bạc mày, Mét ba vì, Mạy
cượp, Mạy khô, Tre đông khê, Tre lục bình, Tr .
- Ba loài chỉnh lý tên chi: Dùng phấn (Bambusa (Lingnania) chungii), Dùng cầu hai
(Bambusa (Lingnania (Bambusa (Lingnania) longissima).
Mỗi loài nghiên cứu chọn 03 mẫu làm đại diện cho mỗi địa điểm thu mẫu. Các mẫu
lá và thân do PGS.TS. Nguyễn Khắc Khôi, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật cung
cấp. Các mẫu được xác định chính xác về mặt hình thái theo mô tả của Wu và cộng sự
(2009); Phạm Hoàng Hộ (1972, 1993, 2000); Nguyễn Hoàng Nghĩa (2006). Mẫu lá, thân
sau khi thu được bảo quản trong sillicagel và giữ ở nhiệt độ phòng cho tới khi sử dụng.
Ký hiệu, địa điểm thu thập mẫu và một số đặc điểm hình thái của 11 loài tre nghiên cứu

được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Nguồn gốc, ký hiệu mẫu và một số đặc điểm hình thái của 11 loài tre sử dụng
trong nghiên cứu
Tên
loài
Tên khoa
học
Ký hiệu
Mã hiệu
mẫu*
Địa điểm thu mẫu
Đặc điểm hình thái
Các loài chỉnh lý tên chi: gồm 3 loài
Dùng
cầu
hai
Bambusa
(Lingnania)
sp.
K3001/2
VNMN B000197
Cầu Hai, Phú Thọ
Mỗi đốt thân có rất
nhiều cành chính,
phiến mo ngửa giáp
xuống thân hoặc ngửa
gần sát xuống thân.
K3001/8
VNMN B000201
Đồng Hỷ, Thái Nguyên

K3001/9
VNMN B000202
Chiêm Hoá, Tuyên
Quang
Dùng
phấn
Bambusa
(Lingnania)
chungii
K3002/1
VNMN B000203
Cầu Hai, Phú Thọ
Mỗi đốt thân có rất
nhiều cành chính,
phiến mo ngửa giáp
xuống thân hoặc ngửa
gần sát xuống thân.
K3002/5
VNMN B000206
Chợ Đồn, Bắc Kạn
K3002/15
VNMN B000212
Uông Bí, Quảng Ninh
Lùng
thanh
hóa
Bambusa
(Lingnania)
longissima
K3003/5

VNMN B000218
Quỳ Châu, Nghệ An
Mỗi đốt thân có rất
nhiều cành chính,
phiến mo có hai dạng:
ngửa sát xuống hoặc
ngửa gần sát xuống thân
K3003/10
VNMN B000221
Thuận Châu, Sơn La
K3003/14
VNMN B000222
Ba Bể, Bắc Kạn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

19

Các loài chƣa xác định tên khoa học dạng Bambusa sp.: gồm 8 loài
Bạc
mày
Bambusa sp.
K3004/1
VNMN B000223
Cầu Hai, Phú Thọ
Thân khí sinh cao 13-
18 m, đường kính 13-
15 cm, ngọn hơi cong
xuống, lóng hơi uốn
khúc, bẹ mo hình thang.
K3004/2

VNMN B000224
Cầu Hai, Phú Thọ
K3004/5
VNMN B000226
Châu Mộng, Phú Thọ
Mét
ba vì
Bambusa sp.
K3007/1
VNMN B000253
Ba Vì
Thân khí sinh cao 9-
12 m, đường kính 7-8
cm, ngọn cong xuống,
bẹ mo hình thang.
K3007/2
VNMN B000254
Ba Vì
K3007/5
VNMN B000257
Ba Vì
Mạy
cượp
Bambusa sp.
K3009/1
VNMN B000261
Khuổi Chám, Kim
Bình, Tuyên Quang
Thân khí sinh cao 8-
10 m, đường kính 8-

10 cm, không được
thẳng, hơi uốn cong,
bẹ mo hình thang.
K3009/2
VNMN B000262
Khuổi Chám, Kim
Bình, Tuyên Quang
K3009/5
VNMN B000265
Bó Củng, Kim
Bình, Tuyên Quang
Mạy
khô
Bambusa sp.
K3010/5
VNMN B000267
Bản Nà Nghè,
Mường Phăng, Điện
Biên
Thân khí sinh cao 13-
15 m, đường kính 4-5
(7) cm; lóng dài 20-
25 cm, tròn đều, vách
dày 2-3 cm, bẹ mo hình
thuôn đứng hay hình thang.
K3010/8
VNMN B000270
Chiềng An, Thanh
An, Điện Biên
K3010/9

VNMN B000271
Thuận Châu, Sơn La
Tre
đông
khê
Bambusa sp.
K3012/3
VNMN B000277
Thái Cường, Thạch
An, Cao Bằng
Thân khí sinh cao 10-
13 m, đường kính
4,5-6 cm, đứng thẳng
hay hình chữ chi (Zic
Zắc) ở phía gốc, bẹ
mo hình chuông.
K3012/5
VNMN B000278
Thái Cường, Thạch
An, Cao Bằng
K3012/6
VNMN B000279
Thái Cường, Thạch
An, Cao Bằng
Tre
lục
bình
Bambusa sp.
K3013/2
VNMN B000281

Tân Thạnh, Long An
Thân khí sinh cao 5-7
m đường kính 3-4,5
cm, bẹ mo hình thang cao.
K3013/5
VNMN B000283
Cao Lãnh, Đồng Tháp
K3013/6
VNMN B000284
Châu Thành, Tiền Giang
Tre
không
gai
tân an
Bambusa sp.
K3014/2
VNMN B000285
Tân Thạnh, Long An
Thân khí sinh cao 8-
12 m, đường kính 5-
5,5 cm, đứng thẳng,
bẹ mo hình chuông rộng.
K3014/5
VNMN B000286
Mỹ Xuyên, Sóc Trăng
K3014/8
VNMN B000288
Bình Thuỷ, Cần Thơ
Tre
trãi

long
an
Bambusa sp.
K3015/1
VNMN B000289
Tân Thạnh, Long An
Thân khí sinh: cao
10-12 m, đường kính
4,5-5 cm, đứng thẳng,
bẹ mo hình thang.
K3015/2
VNMN B000290
Cao Lãnh, Đồng Tháp
K3015/4
VNMN B000292
Mỹ Xuyên, Sóc Trăng
* Ghi chú: Mã hiệu mẫu lưu giữ tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam (VNMN).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

20

Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu: Thông tin chính (kí hiệu, trình tự, kích thước
lý thuyết,…) của 05 cặp mồi đặc hiệu (01 cặp mồi nhân bản vùng gen nhân và 04 cặp mồi
nhân bản vùng gen lục lạp) sử dụng trong nghiên cứu như trong bảng 2.2. Trình tự của
các cặp mồi được tổng hợp bởi hãng IDT (Integrated DNA Technology, Mỹ).
Bảng 2.2. Kích thước lý thuyết của các cặp mồi dùng trong nghiên cứu
Vùng
gen
Ký hiệu

cặp mồi
Trình tự nucleotide (5’– 3’)
Kích
thƣớc
lý
thuyết
(bp)
Nhiệt
độ bắt
cặp
(Tm)
C
Nguồn gốc
tổng hợp cặp
mồi
ITS
(PIF)
PIF5/
PIF3
GGGGCTTTGGATGGAACACA
ATGGCGAGGTTGAACAACTC
450
50
Zhou et al.,
(2010)
trnL-
trnF
trnLF/
trnFR
CGAAATCGGTAGACGCTACG

ATTTGAACTGGTGACACGAG
1000
55
Taberlet et al.,
(1991)
psbA
-trnH
psbA3'f/
trnHf
GTTATGCATGAACGTAATGCTC
CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
680
55
Sang et al., (1997)
Tate et al., (2003)
matK
matK19F/
matKR
CGTTCTGACCATATTGCACTATG
TACGAGCTAAAGTTCTAGC
1560
50
Thiết kế dựa
vào trình tự
nucleotide loài
Bambusa
chungii mã số
HM448934
Genbank (2011)
rpoC2

rpoC2F2/
rpoC2R2
TGTTTGGGGATTTCTATTGA
TCTTTTGTTCCTTGATGCTC
600
52
Thiết kế dựa
vào trình tự
nucleotide loài
Bambusa
oldhamii mã
số FJ970915
Genbank (2011)

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu bao gồm: Hóa chất tách chiết và tinh sạch
DNA (CTAB, EDTA, Tris-HCl, Isopropanol, ethanol, ARNase, chloroform, Kit tinh sạch
genomic tổng số, Kit phân tích PCR, Kit tinh sạch sản phẩm PCR, đệm TAE, agarose, TE
là của các hãng Fermentas, Biobasis, QIAGEN,
Các thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: Các thiết bị chính sử dụng trong thí nghiệm: Máy PCR System 9700
(Applied Biosystem, Mỹ), máy ly tâm của hãng Hitachi (Nhật Bản), bộ điện di
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

21

Nytechnich (Anh), máy chụp ảnh gel (Cleaver, Đức), máy ổn nhiệt (Memmert, Đức). Xác
định trình tự trên máy ABI PRISM
®
3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems), …
Dụng cụ: Cối, chày sứ, thìa vô trùng, giấy thấm vô trùng, ống eppendorf, đầu côn

các loại,…của các hãng Canada, Mỹ, Trung Quốc và Việt Nam.
2.2. Nội dung nghiên cứu
1) Xác định, phân tích và so sánh trình tự nucleotide của 04 vùng gen (01 vùng gen
nhân và 03 vùng gen lục lạp) với các trình tự liên quan trên ngân hàng Genbank phục vụ
việc chỉnh lý tên chi cho ba loài tre;
2) Đánh giá mức độ đa dạng nucleotide trên cơ sở xác định phân tích trình tự
nucleotide 05 vùng gen (01 vùng gen nhân và 04 vùng gen lục lạp) cho 08 loài tre chưa có
tên khoa học.
2.3. Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại Phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng
nguồn gen - Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam - 18 Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Tách chiết DNA tổng số từ 11 loài tre thuộc chi Bambusa Schreb.
DNA tổng số được tách chiết từ mẫu lá hoặc thân của 11 loài tre nghiên cứu
(1987) [20]. Tinh sạch DNA tổng số bằng bộ kít
Genomic DNA Purification kit (#KO512, Fermentas). Sản phẩm DNA tổng số được kiểm
tra bằng cách điện di trên gel agarose 0,9%. Nhuộm gel bằng Ethidium bromide và soi
dưới đèn UV. Xác định nồng độ DNA bằng máy đo quang phổ hấp phụ.
2.4.2. Thiết kế cặp mồi
Để thiết kế được cặp mồi có tính đặc hiệu cao và giảm thiểu khả năng bắt cặp
không đặc hiệu. Chúng tôi đã khai thác các dữ liệu trong ngân hàng gen Genbank để tìm
ra tất cả các trình tự gen mã hoá cho vùng gen matK và rpoC2 đối với chi Bambusa
Schreb. Sau đó sử dụng phần mềm BioEdit để so sánh, vùng bảo thủ nhất được sử dụng
để thiết kế cặp mồi. Cặp mồi matK19F/matKR nhân bản vùng gen matK được thiết kế
dựa vào trình tự nucleotide loài Bambusa chungii mã số HM448934 trên ngân hàng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

22

Genbank. Cặp mồi rpoC2F2/rpoC2R2 nhân bản vùng gen rpoC2 được thiết kế dựa vào

trình tự nucleotide loài Bambusa oldhamii mã số FJ970915 trên ngân hàng Genbank. Quá
trình thiết kế cặp mồi được thực hiện trên phần mềm DNAstar.
2.4.3. Phương pháp nhân bản PCR
Nhân bản PCR và đọc trình tự: Mỗi phản ứng PCR có thể tích 25µl với các thành
phần: 13 µl H
2
O deion; 2,5 µl buffer 10X; 1 µl MgCl
2
25mM; 2,5 µl dNTPs 2,5mM; 1,25
µl mồi xuôi (10 pmol); 1,25 µl mồi ngược (10 pmol); 0,5 µl Taq polymerase (5U/µl); 3 µl
DNA. Phản ứng được thực hiện trên máy PCR model 9700 (GeneAmp PCR System 9700,
Mỹ). Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm: 94C trong 3 phút; 35 chu kỳ nối tiếp nhau
với các bước: 94C trong 50 giây, 50 đến 55C trong 55 giây (nhiệt độ bắt cặp của từng
cặp mồi như trong bảng 1), 72C trong 45 giây; kết thúc phản ứng nhân gen ở 72C trong
10 phút, giữ sản phẩm ở 4C.
2.4.4. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR
Tinh sạch sản phẩm PCR là bước quan trọng để thực hiện phản ứng giải trình tự.
Quá trình tinh sạch nhằm thu được sản phẩm đoạn gen mong muốn. Sản phẩm PCR được
điện di trên gel agarose 0,9%, cắt lấy phân đoạn DNA quan tâm trên bàn soi UV và tinh
sạch bằng bộ KIT QIAquick Gel Extraction của QIAGEN. Kiểm tra sản phẩm thu được
trên gel agarose 0,9%. Chụp ảnh sản phẩm thôi gel và xác định hàm lượng DNA để gửi đi
xác định trình tự.
2.4.5. Xác định trình tự nucleotide các đoạn DNA
Trình tự nucleotide được xác định bằng kỹ thuật xác định trình tự trực tiếp từ sản
phẩm PCR theo hai chiều (mồi xuôi và mồi ngược) trên máy đọc trình tự ABI PRIMS
®

3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) tại phòng thí nghiệm trọng điểm
công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học.
2.4.6. Phân tích số liệu

Xử lý số liệu: Dữ liệu được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng BioEdit, Mega
4.0, Clustal X 2.1, DNAstar,…vv. Trình tự nucleotide của 11 loài nghiên cứu được so
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

23

sánh với các trình tự của vùng gen trnL-trnF, psbA-trnH, matK, rpoC2 và PIF đã công bố
trên Genbank.
Xây dựng cây phát sinh chủng loại: Có 4 phương pháp tạo cây bao gồm: (1)
phương pháp Neighbor – Joining (NJ), (2) phương pháp Minimum Evolution, (3) phương
pháp Maximum Parsimony và (4) phương pháp UPGMA, trong đó Neighbor - Joining là
phương pháp thường được sử dụng nhất. Khoảng cách di truyền giữa các loài cũng được
ước lượng thông qua độ dài của cành cây. được xây dựng theo phương pháp NJ
(Neighbor Joining) [32].
Dữ liệu DNA sau khi thực hiện ghép nối, xắp xếp thẳng hàng (alignment) để lập
cây tiến hoá bằng phần mềm MEGA 4.0, sử dụng phương pháp Neighbor - Joining (NJ)
với các thông số phân tích như sau:
- Kiểm tra phân tích: kiểm tra bằng giá trị bootstrap với số lần lặp lại (replicate) là
1000 lần.
- Dữ liệu thiếu/ khoảng trống nucleotide (do đột biến thêm bớt tạo ra): được xoá bỏ
theo cặp (pairwise deletion).
- Mô hình đột biến: mô hình Maximum composite Likelihood với số lượng đột biến
được tính bao gồm cả đột biến hoán đổi (A↔T, G↔C) và hoán vị (A↔C, A ↔ G, T ↔
C, T↔ G).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

24

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả tách chiết và làm sạch DNA tổng số từ các mẫu tre
Đã tách chiết và làm sạch DNA tổng số của 33 mẫu lá và thân đại diện cho 11 loài
tre nghiên cứu. Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,9% tại hình 3.1A
cho thấy chất lượng DNA tương đối sạch. Kết quả đo OD cũng cho thấy chỉ số
OD260/OD280 của các mẫu luôn nằm trong khoảng 1,8 đến 2 (dung dịch DNA có độ
sạch rất cao). Để phản ứng PCR có độ nhạy cao, đảm bảo kết quả xác định trình tự
nucleotide được chính xác chúng tôi đã tiến hành tinh sạch DNA tổng số bằng bộ KIT
tinh sạch DNA (DNA Purification Kit) (Hình 3.1B).







Hình 3.1. Kết quả kiểm tra DNA tổng số (A) và DNA tinh sạch (B) đại diện của 11 loài
tre trên gel agarose 0,9% (giếng 1: Bạc mày; 2: Mét ba vì; 3: Mạy cượp; 4: Mạy khô; 5:
Tre đông khê; 6: Tre lục bình; 7: Tre không gai tân an; 8: Tre trãi long an; 9: Dùng cầu
hai, 10: Dùng phấn; 11: Lùng thanh hoá)
3.2. Kết quả nhân bản trình tự DNA của 11 loài tre nghiên cứu với các vùng gen đích
Tổng số năm cặp mồi đặc hiệu đã được sử dụng và nhân bản thành công năm đoạn
gen đích, trong đó cặp mồi PIF5/PIF3 dùng để nhân bản vùng gen nhân và 04 cặp mồi

trnLF/trnLR, matK19F/matKR, psbA3’f/trnH và rpoC2F2/rpoC2R2 nhân bản các vùng
gen lục lạp. Để có độ tin cậy cao về kết quả phân tích cho từng nhóm đối tượng loài, trong
nghiên cứu này mỗi loài sử dụng 03 mẫu. Bốn vùng gen (01 vùng gen nhân (PIF) và 03
vùng gen lục lạp (trnL-trnF, matK và vùng psbA-trnH) đã được sử dụng để xác định trình
tự cho 03 loài tre cần chỉnh lý tên chi (Dùng phấn (Bambusa (Lingnania) chungii), Dùng
A B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

25

cầu hai (Bambusa (Lingnania (Bambusa (Lingnania)
longissima)); Đối với 08 loài tre chưa xác định tên khoa học (Bambusa sp.) đó là Bạc
mày, Mét ba vì, Mạy cượp, Mạy khô, Tre đông
Tre trãi long an thì ngoài việc giải mã bốn vùng gen trên chúng tôi còn giải mã thêm 01
vùng gen lục lạp (rpoC2).
3.2.1. Kết quả nhân bản trình tự DNA của 11 loài tre với cặp mồi PIF5/PIF3
Trình tự đoạn gen đích đã được nhân bản thành công với cặp mồi PIF5/PIF3 cho
tất cả các mẫu nghiên cứu. Hình 3.2 là kết quả đại diện của 11 loài tre nghiên cứu (mỗi
loài 1 mẫu), sản phẩm PCR chỉ xuất hiện duy nhất 01 băng có kích thước khoảng 450 bp.
Kết quả này cũng phù hợp với kích thước lý thuyết dự đoán. Do vậy, sản phẩm PCR tiếp
tục được tinh sạch phục vụ cho việc giải mã trình tự nucleotide.

Hình 3.2. Sản phẩm PCR đại diện của 11 loài tre phân tích với cặp mồi PIF5/PIF3 điện
di trên gel agarose 0,9%. (M: marker phân tử 1 kb, từ giếng 1 đến 11 đại diện cho 11 loài
tre (1mẫu/loài), thứ tự các loài đại diện như trong hình 3.1)
3.2.2. Kết quả nhân bản trình tự DNA của 11 loài tre với cặp mồi psbA3’f/trnH
Vùng psbA – trnH đã được chứng minh là vùng dễ thực hiện phản ứng PCR nhất
đối với rất nhiều loài thực vật [35]. Do có một vùng không mã hoá nên kích thước của
vùng psbA - trnH cũng thay đổi khác nhau giữa các loài. Vùng này có kích thước biến đổi
trong một giới hạn rất lớn, từ 247bp đến 1221bp [27]. Cặp mồi psbA3’f/trnH đã được sử
dụng để nhân bản đoạn DNA cho tất cả 11 loài tre nghiên cứu. Kết quả cho thấy sản phẩm
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M
0.25 kb
0.5 kb