Phân lập và định danh chủng tảo chlorococcum sp tại cần giờ

lOMoAR cPSD| 27827034

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH
VIỆN KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ CAO NTT
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI: PHÂN

LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG

TẢO CHLOROCOCCUM SP. TẠI CẦN GIỜ

GVHD :

ThS. NGUYỄN THÀNH CƠNG

SVTH :

NGUYỄN ĐỒN THÚY VY

MSSV :

1800005061

LỚP

18DSH1A

:

TP. HCM, tháng 05 năm 2022


lOMoAR cPSD| 27827034

LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Nguyễn Tất Thành, Khoa Công
Nghệ Sinh Học đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu và
hồn thành khóa luận.
Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biêt sơn sâu sắc đến hai thầy hướng dẫn khóa luận: Thầy
Nguyễn Thành Cơng và Thầy Ơng Bỉnh Ngun, hai Thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ
bảo và giúp đỡ, động viên em trong suốt q trình nghiên cứu và hồn thành luận văn.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn bạn bè và gia đình đã động viên, khích lệ trong suốt
q trình học và nghiên cứu khoa học để em hoàn thành tốt khóa luận của mình.
Tuy nhiên, bài luận văn của em chắc chắn khơng thể tránh được những hạn chế, thiếu
sót. Em mong sự góp ý chân thành từ các Thầy, Cơ và mọi người để em có thể hồn
thành xuất sắc khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên
(ký và ghi rõ họ tên)


lOMoAR cPSD| 27827034

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ i
NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN ...................................................... ii

NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN PHẢN BIỆN ........................................................ iii
MỤC LỤC .................................................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ............................................................................... vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ ............................................... viii
KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... ix
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................x
1.

Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................x

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................1
1.1 Tổng quan Cần Giờ và khu vực sinh quyển Cần Giờ ..........................................1
1.2 Đặc điểm sinh học của Chlorococcum sp ...............................................................2
1.2.1 Ứng dụng của Chlorococcum sp. ...........................................................................2
1.2.2 Chỉ thị mã vạch DNA (DNA barcode) ....................................................................3
1.3 Phân lập và nghiên cứu ứng dụng vi tảo Chlorococcum sp. ở Việt Nam ............6
1.4 Phân lập và nghiên cứu vi tảo Chlorococcum sp. nước ngoài ..............................7
CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................8
2.1 Nơi thực hiện ............................................................................................................8
2.2 Nội dung nghiên cứu................................................................................................8
2.3 Bố trí thí nghiệm ......................................................................................................8
2.4 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................9
2.4.1 Phương pháp thu nhận mẫu ....................................................................................9
iv


lOMoAR cPSD| 27827034

2.5 Phương pháp phân lập, nuôi cấy và giữ giống ....................................................10
2.5.1 Phương pháp làm thuần giống vi tảo trên môi trường thạch ................................11

2.5.2 Phương pháp nuôi cấy vi tảo ................................................................................11
2.6 Phương pháp tách chiết DNA ...............................................................................12
2.6.1 Tách chiếc DNA tổng số .......................................................................................12
2.7 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose ................................................................13
2.7.1 Phương pháp khuếch đại trình tự DNA ................................................................13
2.8 Định danh phân tử chủng vi tảo phân lập được .................................................15
2.8.1 Giải trình tự sản phẩm PCR ..................................................................................15
2.9 Hiệu chỉnh trình tự ................................................................................................15
2.9.1 Loại bỏ những tín hiệu khơng chính xác ở hai đầu trình tự khảo sát ...................16
2.9.2 Kiểm tra các sai lệch giữa hai kết quả giải trình tự ..............................................16
2.9.3 Tạo trình tự đồng nhất ..........................................................................................17
2.10 Các phần mềm sử dụng trong nghiên cứu ........................................................17
2.11 Xây dựng cây phát sinh loài ................................................................................17
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................19
3.1 Thu thập mẫu và xử lý mẫu ..................................................................................19
3.2 Kết quả phân lập chủng tạo ..................................................................................23
3.3 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ tảo Cần Giờ .................................................26
3.4 Kết quả khuyếch đại sản phẩm PCR ...................................................................28
3.5 Kết quả giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự........................................................29
3.5.1 Kết quả giải trình tự ..............................................................................................29
..................................................................................................................................... 30
3.5.2 Hiệu chỉnh và lắp ráp trình tự ...............................................................................31

v


lOMoAR cPSD| 27827034

3.5.3 So sánh trình tự truy vấn của các mẫu nghiên cứu với cơ sở dữ liệu trên GenBank
..................................................................................................................................... 32

3.6 Xây dựng cây phát sinh chủng loài ......................................................................34
CHƯƠNG 4 ..................................................................................................................35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..........................................................................................35
PHỤ LỤC .....................................................................................................................36
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................37

vi


lOMoAR cPSD| 27827034

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1 Thành phần môi trường SFM ........................................................................11
Bảng 2.2 Cặp mồi sử dụng trong định danh phân tử chủng tảo ....................................13
Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR ............................................................................14
Bảng 2.4 Chu trình nhiệt khuếch đại vùng....................................................................14
Bảng 2.5 Cặp mồi sử dụng trong phản ứng giải trình tự ...............................................15
Bảng 3.1 Vĩ độ, hình ảnh thu mẫu, hình ảnh soi kính 100x ..........................................19
Bảng 3.2 kết quả đo OD của hai mẫu vi tảo .................................................................26

vii


lOMoAR cPSD| 27827034

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ

Hình 1.1 Vi tảo chlorococcum sp. ..................................................................................2
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí trí nghiệm .....................................................................................8
Hình 2.2 Sơ đồ Cần Giờ..................................................................................................9

Hình 2.3 Phương pháp thu mẫu thực tế ..........................................................................9
Hình 2.4 Sơ đồ các bước định danh phân tử vi tảo .......................................................17
Hình 3.1 tế bào đơn được nuôi cấy trong môi trường SFM .........................................23
Hình 3.2 Tảo cấy ria trên đĩa petri và soi vật kính dầu dầu 100x .................................23
Hình 3.3 Tảo ni trong bình erlen 250ml ...................................................................23
Hình 3.4 kết quả điện di DNA tổng số của hai mẫu vi tảo ...........................................23
Hình 3.5 kết quả điện di PCR của hai vùng ITS và 18S ...............................................24
Hình 3.6 kết quả giải trình tự ITS ................................................................................24
Hình 3.7 kết quả giải trinh tự 18S .................................................................................25
Hình 3.8 Kết quả hiệu chỉnh trình tự ITS và 18S .........................................................25
Hình 3.9 kết quả so sánh dữ liệu GenBank 18S ...........................................................26

viii


lOMoAR cPSD| 27827034

KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

TỪ VIẾT TẮT
DNA
CTAB
PCR
TBE
SFM
STE
TE
RNA
ITS
EtBr

ABI
NCBI
OD
NICEM
rDNA
rRNA

GIẢI THÍCH
Deoxyribonucleic Acid
Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
Polymerase Chain Reaction
Tris HCL – Borate – EDTA
Tris HCL – EDTA
Ribonucleic Acid
Internal Transcribeb Acetic Acid

Ribosom deoxyribonucleic acid
Ribosom ribonucleic acid

ix


lOMoAR cPSD| 27827034

LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cần giờ là một huyện ngoại thành ven biển, nằm về phía Đơng Nam Thành phố Hồ
Chí Minh. Hằng năm, khu vực này nhận được một lượng lớn phù sa từ sông Đồng Nai,
cùng với ảnh hưởng của biển kề cận và các đợt thủy triều, do đó hình thành nên nhiều
khu hệ thủy vực đa dạng. Rừng cần giừo cịn được xem là khu dự trữ sinh quyển vì

mức độ đa dạng về lồi vi tảo. Nhiều lịai vi tảo ở Cần Giờ như: Silic Thalassiosira sp.,
Chaetoceros lauderi Ralfs, Silic Entomoneis,… đã được phân lập và nghiên cứu.
Vi tảo là lồi thực vật phù du có kích thước từ 1- 50µm, chỉ quan sát được dưới kính
hiển vi. Hiện nay, có hơn 100.000 lồi vi tảo đã được xác định vì chúng có kích thước
rất nhỏ, đa dạng lồi, tăng sinh nhanh và chứa nhiều thành phần có thể khai thác sử
dụng trong nhiều lĩnh vực như: dùng làm nguồn cung cấp thức ăn cho động vật, xử lý
môi trường nước, bên cạnh đó vi tảo cũng được sử dụng làm nhiên liệu sinh học, mỹ
phẩm và y dược. Vi tảo Chlorococcum sp. là một vi tảo lục, sống trong môi trường
nước mặn, chịu được nhiệt độ và ánh sáng cao. Chlorococcum sp. có các hàm lượng
như: flavonoid chiếm 10,57mg/g, lipid chiếm 27,87%, protein chiếm 22,38mg/g,
carotenoid chiếm 8,58µg/l, astaxanthin chiếm 1,24mg, hàm lượng diệp lục là
13,65µg/ml-1. Một số nghiên cứu cho thấy vi tảo Chlorococcum sp. có thể tổng hợp
astasxanthin từ β – caroten thông qua canthanxanthin và adonoxanthin. Ngồi ra phân
tích hóa học cho thấy sự tồn tại của các hợp tính sinh học như carotenoid, alkaloids,
favanoids, fatacid, saponin, aminoacid và carbohydrate có trong vi tảo Chlorococcum
sp. cho thấy các hoạt tính ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn và nấm độc gây
bệnh cho người như: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella
typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Vibreo cholerae, Staphylococcus aureus,
Bacillus subtilis, Candida albicans, Aspergillus niger và Aspergillus niger. Hiện nay,
vi tảo còn biết đến là nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng cho nhiều đối tượng nuôi trồng
thủy hải sản, các thành phần hoạt tính sinh học có tiềm năng đối với con người. Các
kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh học và nuôi đủ sinh khối tảo cho tách chiết các hợp
chất có giá trị từ vi tảo Chlorococcum sp. là hoàn toàn mới với Việt Nam. Do đó, tơi đã
thực hiện đề tài phân lập và định danh chủng tảo Chlorococcum sp. tại Cần Giờ.
x


lOMoAR cPSD| 27827034

2. Mục tiêu của đề tài

Thu nhận và phân lập thành công một chủng tảo Chlorococcum sp.
Định danh hình thái Chlorococcum sp

xi


lOMoAR cPSD| 27827034

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan Cần Giờ và khu vực sinh quyển Cần Giờ
Cần giờ là một huyện ngoại thành ven biển, nằm về phía Đơng Nam Thành phố Hồ
Chí Minh. Đây là huyện tiếp giáp với biển Đông với khoảng 20km bờ biển. Khu rừng
ngập mặn Cần Giờ là một khu rừng đan xen với hệ thống sông rạch dày đặc, chứa
đựng nhiều hệ sinh thái mang tính đa dạng sinh học cao, với nhiều loài động thực vật
đặc hữu của miền duyên hải Việt Nam. Chính nhờ vào những ưu điểm mà thiên nhiên
bang tặng này nên Cần giờ đã được tổ chức UNESCO thế giới công nhận là một trong
những khu dự trữ sinh quyển bậc nhất thế giới. Ngoài ra Cần Giờ còn là một hệ sinh
thái trung gian giữa nước mặn và nước ngọt, dưới sự ảnh hưởng của biển và thủy triều,
nơi này đã hình thành hệ thực vật phong phú, và là nơi cung cấp thức ăn, nơi cư trú
nhiều loại sinh vật khác nhau. Trong hệ sinh thái thủy sinh, nhóm sinh vật quang tự
dưỡng bao gồm thực vật phù du đóng vai trị quan trọng khi vừa làm nguồn thức ăn sơ
cấp trong chuỗi thức ăn (Reynolds, et al. 2000) vừa là nhân tố giữ cân bằng sinh học
cho mơi trường mà chúng sinh trưởng. Trong đó Vi tảo là các loài sinh vật nhân sơ
hoặc nhân thực có khả năng quang hợp và tồn tại hầu hết các hệ sinh thái trên trái đất
(Hà 2019). Phần lớn vi tảo là một nhóm vi sinh vật lớn đa dạng, bao gồm nhiều loài
sinh vật nhân thực quang tự dưỡng và tảo lam nhân sơ, có kích thước hiển vi (Singh
and Saxena 2015). Ước tính có khoảng vài triệu loài vi tảo so với khoảng 250.000 loài
thực vật bậc cao, có khoảng 40.000 đã được nhận diện và các loài mới đang vẫn tiếp
tục được phát hiện ở tốc độ nhanh, vài loài/tuần. Ngoài ra chúng phát triển được trong

mơi trường nước ngọt và nước mặn, có một số phát triển trong môi trường rất mặn
(Hunter-Cevera and Belt 1996). Hiện nay ngành tảo lục (Chlorophyta) với khoảng
20.000 loài là một bộ phận quan trọng của quần xã thực vật phù du và là ngành lớn
nhất trong các ngành tảo (Tiến and Hành 1997). Tảo Chlorococcum sp. là chi tảo nước
mặn trong ngành tảo lục Chlorophyta. Chúng có các tế bào sinh dưỡng, khơng di động,
mỗi tế bào có một lục lạp hình cốc và chứa một pyrenoid, chúng có động bào tử, có
vách nhày với hai roi có chiều dài bằng nhau, phát triển cả môi trường dưới nước và
trên cạn.
1


lOMoAR cPSD| 27827034

1.2 Đặc điểm sinh học của Chlorococcum sp.
Chlorococcum sp. là một chi tảo lục, thuộc họ Chlorococcaceae, ngành Chlorophyta.
Đặc điểm hình thái Chlorococcum sp.
Trong giai đoạn tăng trưởng logarit, các tế bào sinh dưỡng khác nhau giữa các tế bào
hình cầu có đường kính 10- 15µm với thành tế bào có đường kính 1µm. Tế bào hình
elip có đường kính từ 5- 7 x 8- 11µm với thành tế bào mỏng hơn 0,5µm. Trong pha
tĩnh, các tế bào có hình cầu, đường kính lên đến 16µm với thành tế bào dày hơn có
đường kính lên đến 2µm. Các tế bào có một pyrenoid riêng biệt được bao quanh bởi
một vỏ bọc tinh bột hai mặt và khơng có nhân.(Blackwell, et al. 1991)
Vực: Eukaryota
Giới: Plantae
Ngành: Chlorophyta
Lớp: Chlorophyceae
Bộ: Chlamydomonadales
Họ: Chlorococcaceae

Hình 1.1 Vi tảo chlorococcum sp.

Chi: Chlorococcum sp.
Chlorococcum sp. sinh sản vơ tính bằng động bào tử và bào tử trứng được hình thành
bởi các nhị bội liên tiếp của nguyên sinh chất, hình bầu dục có kích thước rộng 35µm, dài 8- 10µm, với đầu nhụy ở giữa, nhân trước, roi phát sinh từ một nhu nhỏ.
(Archibald 1988),(Archibald 1979)
1.2.1 Ứng dụng của Chlorococcum sp.
Một dòng vi tảo lục Chlorococcum sp. đã nghiên cứu cho thấy chúng tích lũy lipid cao
đến 56% trọng lượng khô, hơn nữa các metyl este của axit béo chính là C16:0, C18:1,
C18:2, C18:3, hàm lượng lipid cao và thành phần axit béo làm cho vi tảo một nguồn
tài nguyên tiềm năng cho thực phẩm, mỹ phẩm và dầu diesel sinh học (Harwati, et al.
2012)

2


lOMoAR cPSD| 27827034

Chlorococcum sp. là chủng tảo được ghi nhận có thể tích lũy astaxanthin và các este
carotenoid thức cấp(Zhang, et al. 1997). Chlrococcum cũng được cho rằng đây là một
chủng tảo tiềm năng để sản xuất các carotenoid thứ cấp, bởi đặc tính chịu được nhiệt
độ cao và khoảng pH khắc nghiệt. Chúng cũng có tốc độ tăng trưởng nhanh và thích
hợp với hệ thống ni bể hở ngồi trời (Blackwell, et al. 1991)
Một số nghiên cứu về các hợp chất thứ ba của Chlorococcum cho thấy chúng có khả
năng ức chế enzyme cholinesterase và khả năng chống oxy hóa cao. Các hợp chất có
khả năng chống oxy hóa cao của chủng tảo này gồm: 3- tert- Butyl- 4- hdroxyanisole,
butylated hydroxytoluene, phytol và neophytadiene (Olasehinde, et al. 2021)
Nghiên cứu của Bhagavathy về tảo Chlororcoccum cho thấy dịch chiết của chủng tảo
này có khả năng kháng khuẩn. Bhagavathy sử dụng các dung môi hữu cơ khác nhau
như: acetone, benzene, chlorofrom, diethyl ether, ethyl acetate, ethanol, hexane và
methanol để tách chiết các hợp chất từ sinh khối chủng tảo này. Cao phân đoạn

benzene và ethyl acetate được cho thấy có khả năng ức chế vi sinh vật khá cao ( ức chế
80% sự phát triển cảu vi sinh vật). Thành phần carotenoid và chlorophyll của chủng
tảo này cũng cho thấy khả năng ức chế vi sinh vật (Bhagavathy, et al. 2011). Các
chủng vi sinh vật mà dịch chiết của tảo Chlorococcum có khả năng ức chế là:
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, pneumoniae,
Vibreo cholerae, Staphylococcus aureus (Bhagavathy, et al. 2011). Các chủng vi sinh
vật này đều có khả năng gây bệnh trên người.
1.2.2 Chỉ thị mã vạch DNA (DNA barcode)
Các kỹ thuật truyền thống để nhận diện các mẫu sinh vật như là thơng qua hình thái
bên ngồi hoặc đặc tính sinh lý sinh hóa bên trong như xác định các hợp chất quý có
trong mẫu. Tuy nhiên, phương pháp này khó có hiệu quả trong các trường hợp như
mẫu vật bị hư hỏng, mẫu vật ở dạng bột hay mẫu vật chưa phát triển đầy đủ các đặt
tính hình thái. Vì vậy, DNA barcode ra đời như một biện pháp hữu ích, giải quyết được
các vấn đề mà phương pháp truyền thống mắc phải.
Mã vạch DNA (DNA barcode) là một khái niệm mới được đưa ra bởi Hebert vào năm
2003. Mã vạch DNA là trình tự nucleotide của một chuỗi DNA ngắn, có cùng nguồn
3


lOMoAR cPSD| 27827034

gốc tổ tiên (orthologous), trong đó có vùng ít bị thay đổi và có vùng để thay đổi trong
q trình tiến hóa. Dựa vào mức độ thay đổi trong trình tự DNA này để đánh giá sự sai
khác di truyền giữa các sinh vật. Chỉ thị DNA được sử dụng nhiều trong nghiên cứu
quan hệ di truyền, phát sinh chủng loại và phân loại phân tử; trong lập bản đồ liên kết
di truyền, nhận biết gen; và trong chọn giống bao gồm đánh giá đa dạng di truyền,
nhận biết giống, chọn lọc các tính trạng kháng bệnh, chống chịu các điều kiện bất lợi
của môi trường, năng suất và phẩm chất giống (Thành 2014)
Các vi khuẩn và nấm việc xác định bằng chỉ thị phân tử của chúng đáng tin cậy và
nhanh chóng hơn khi định danh vi tảo. Đối với giới động vật dụng gen ty thể

cytochrome c oxidase tiểu đơn vị I (COI) đã được sử dụng rộng rãi để định danh
(Hebert, et al. 2003) ). Sau khi xác định thành công chỉ thị phân tử ở động vật, vi
khuẩn và nấm, các chỉ thị phân tử tương tự đã được thử nghiệm với vi tảo như 18S
rRNA (Rasoul-Amini, et al. 2009), (Radha, et al. 2013), ITS-2 (Radha, et al. 2013),
rbcl (Radha, et al. 2013), và gen ty thể cytochrome c oxidase tiểu đơn vị I (COI) (Lee,
et al. 2012).
1.2.2.1 Vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer - ITS)
Vùng đệm trong được sao mã nằm giữa gen RNA ribosome tiểu đơn vị nhỏ và gen
RNA ribosome tiểu đơn vị lớn đây là một dấu hiệu phát sinh gen được sử dụng cho
phân loại nhiều loài. Vùng ITS ở thực vật nhân thực chứa rRNA 5,8S được bảo tồn và
các khu vực vùng ITS1 và ITS2 có thể biến đổi. Các vùng này có chiều dài có thể thay
đổi và khuếch đại bằng cách sử dụng các đoạn mồi bổ sung cho các vùng được bảo tồn
của các gen sườn của chúng. (Bùi 2020)
Các vùng tổ chức nhân nằm trong nhiễm sắc thể chứa các DNA ribosime là các phần
của các đơn vị lặp lại được sắp xếp theo thứ tự nhất định với số lượng bản sao trong tế
bào. Các gen DNA ribosome (rDNA) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa
dạng thích hợp để phân biệt các lồi gần gủi. Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như
các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S và
xen giữa là các trình tự khơng mã hóa ITS1, ITS2 (Internal transcribed spacers) nằm ở
hai bên sườn của vùng 5,8S. Vùng mã hóa của ba gen rDNA được bảo tồn cao hơn hai
vùng ITS. Hai vùng đệm ITS1 và ITS2 có độ dài khơng vượt quá 300 bp, tổng độ dài
vùng ITS dao động từ 600 – 700 bp (Bùi 2020). Một điểm đặc biệt cho vùng gen này là
mức độ tiến hóa của nó nhanh nên dễ dàng thay đổi về trình tự cũng như độ dài.
4


lOMoAR cPSD| 27827034

Nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng vùng gen ITS có thể được tiến hành bằng cách:
Sử dụng những cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại số lượng bản sao vùng gen mong

muốn; tiến hành giải trình tự trực tiếp; xây dựng cây phát sinh phân loài sử dụng các
trình tự nghiên cứu và các trình tự tham chiếu có sẵn trên Genbank (Bùi 2020)
1.2.2.2 18S rRNA
RNA ribosome 18S là một phần của RNA ribosome và RNA cấu trúc cho thành phần
nhỏ của ribosome tế bào nhân thực. Nó là một trong những thành phần cơ bản của tất
cả các tế bào nhân thực. Các gen mã hóa cho rRNA 18S được gọi là 18SrDNA. Gen
18S rRNA của tiểu đơn vị nhỏ là một trong những gen được sử dụng thường xuyên
nhất trong các nghiên cứu phát sinh loài và là một dấu hiệu quan trọng cho PCR mục
tiêu ngẫu nhiên trong sàng lọc đa dạng sinh học môi trường (Uddin and Cheng 2015)
Ribosome bao gồm hai phần, được gọi là tiểu đơn vị nhỏ và lớn. Sinh vật nhân chuẩn
có ribosome 80S, bao gồm một tiểu đơn vị nhỏ (40S) và lớn (60S). Tiểu đơn vị 40S
của chúng bao gồm RNA 18S và 33 protein. Trong khi đó, tiểu đơn vị lớn được cấu tạo
bởi 5S RNA, 5,8S, 288 RNA và 16 protein (Alanís 2013). Phân tích dữ liệu chuỗi
DNA bắt đầu vào những năm 1980 với các nghiên cứu được thực hiện trên màu xanh
lục thực vật, nghiên cứu này sử dụng chị thị nrDNA 5,8S. Sau đó, tiểu đơn vị nhỏ
(SSU) 18S rRNS trở thành một trong những gen được sử dụng thường xuyên nhất
trong các nghiên cứu phát sinh lồi (Alanís 2013).
Gen rRNA 18S của tiểu đơn vị nhỏ (SSU) là một trong những gen được sử dụng
thường xuyên nhất trong các nghiên cứu phát sinh loài và là dấu hiệu quan trọng
cho phản ứng chuỗi polymerase đích ngẫu nhiên (PCR) trong sàng lọc đa dạng sinh
học môi trường (Meyer, et al. 2010). . Nhìn chung, trình tự gen rRNA dễ dàng tiếp cận
do các vùng bên sườn được bảo tồn cao cho phép sử dụng các đoạn mồi phổ quát. Sự
sắp xếp lặp đi lặp lại của chúng trong bộ gen cung cấp quá nhiều DNA khuôn mẫu cho
phản ứng PCR, ngay cả ở những sinh vật nhỏ nhất (Meyer, et al. 2010). Gen 18S là
một phần của lõi chức năng của ribosom và tiếp xúc với các lực chọn lọc tương tự ở tất
cả các sinh vật. Do đó, khi các nghiên cứu phát sinh lồi quy mơ lớn đầu tiên dựa trên
trình tự 18S được cơng bố (Field, et al. 1988).
5

lOMoAR cPSD| 27827034

1.3 Phân lập và nghiên cứu ứng dụng vi tảo Chlorococcum sp. ở Việt Nam
Ở Viết Nam, việc nghiên cứu vi tảo và đặc biệt vi tảo ứng dụng còn mới mẻ hơn so với
các nước, đặc biệt là đối với các nước phát triển như Mỹ, Nhật và các Châu Âu. Hầu
hết những nghiên cứu về vi tảo ở Việt Nam chủ yếu đi về các nghiên cứu cơ bản như
phân loại, đa dạng sinh học và sinh thái như Nguyễn Văn Tuyên (trường ĐH Sư phạm
Tp. HCM), Nguyễn Thanh Tùng (trường ĐH KHTN Tp. HCM) và một số nhà nghiên
cứu khác tại các trường cao đẳng, đại học và các viện nghiên cứu. Hiện nay có một số
nghiên cứu về phân lập và ứng dụng vi tảo tại Việt Nam như: phân lập và xác định
thành phần dinh dưỡng của vi tảo như các loài vi tảo Chlorella sp. (Nhàn, et al. 2020),
(Hà 2006). Phân lập các chủng vi tảo dầu từ nguồn nước ngọt, nước lợ và nước mặn
(Thảo, et al. 2016). Ngoài ra phân lập được một chủng vi tảo có chứa lipid (Lan, et
al.). Phân lâp và nuôi sinh khối vi tảo Scenedesmus acutus bằng các loại môi trường
khác nhau (Lan, et al. 2021). Phân lập và khảo sát một số đặc điểm sinh học của một
số loài vi tảo (Nguyễn 2019) . Trong những năm gần đây thì vi tảo càng được nghiên
cứu và ứng dụng nhiêu trong các lĩnh vực như thẩm mỹ, sức khỏe, ni trồng thủy sản
ngồi ra vi tảo cịn ứng dụng trong quy trình xử lý nước thải.
Trong ni trồng thủy sản, một số lồi đã được nghiên cứu, phân lập và sử dụng:
Chaeto calcistrans Paulse (Mai, et al. 2009), một số chủng tảo silic Skeletonema
costatum (Liên and Development 2018). Haematococcus Pluvialis còn được nghiên
cứu để làm thức ăn bổ sung cho cá koi (Trí, et al. 2021). Nghiên cứu vi tảo Spirulina
làm thực phẩm chức năng (Thảo, et al. 2013), Vi tảo Amphiprora alata được nghiên
cứu đểu ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng phục vụ nhu cầu sức khỏe cho
con người (Thắm, et al.). Gần đây vi tảo còn được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong
việc xử lý nước thải trong chăn nuôi và nước thải trong công nghiệp và sinh hoạt như
vi tảo Chlorella vulgaris (LÊ 2021), (Phan 2020), (Khánh 2017). Ngồi ra có một
nghiên cứu đặc điểm sinh học và ni sinh khối lồi vi tảo lục Nannochloris atomus
được phân lập tại bờ biển Nha Trang (Tâm, et al.), thì phát hiện có lồi vi tảo
Chlorococcum sp. nhưng nhìn chung việc nghiên cứu vi tảo nội địa cho ứng dụng hầu

như rất ít và chưa được cơng bố rộng rải trên các tập chí trong và ngồi nước, đặc biệt
là trong việc phân lập, nghiên cứu úng dụng vi tảo Chlorococcum sp.
6


lOMoAR cPSD| 27827034

1.4 Phân lập và nghiên cứu vi tảo Chlorococcum sp. nước ngoài
Vào đầu thế kỹ XX trên thế giới bắt đầu con đường nuôi cấy vi tảo, chủ yếu là nghiên
cứu phân loại dựa vào hình thái và đa dạng sinh học, sinh thái. Năm 1991
Chlorococcum submarinum (Chlorococcales) được phân lập từ một bãi đá thủy triều
(Blackwell, et al. 1991), 2019 một loại vi tảo Chlorococcum sp. được phát hiện tại cửa
sông Ampenan của Đảo Lombok (Putri, et al. 2019). Hiện nay vi tảo trên thế giới ngày
càng được chú trọng và khai thác ứng dụng trong các lĩnh vực như nông nghiệp, thực
phẩm và nuôi trồng thủy sản. Đặc biệt ngày nay vi tảo còn được nghiên cứu và khám
phá nguồn nhiên liệu sinh học thay thế cho sự cạn và khủng hoảng về nhiên liệu hóa
thạch xăng, dầu trên toàn cầu (Chisti 2008).
Một số nghiên cứu và ứng dụng Chlorococcum sp. như: Chlorococcum sp . MM11 —
một phyco-nanofactory mới để tổng hợp các hạt nano sắt (Subramaniyam, et al. 2015).
Sự hình thành carotenoid thứ cấp bởi tảo lục Chlorococcum sp.(Liu and Lee 2000),
(Zhang, et al. 1997). Đặc điểm và sự tích tụ lipid trong vi tảo Chlorococcum sp.
(Harwati, et al. 2012), (Mahapatra and Ramachandra 2013). Chlorococcum sp. còn
được nghiên cứu trong sử lý chất thải (Lv, et al. 2018) (Upadhyay, et al. 2020). Nghiên
cứu cho thấy ứng dụng của Chlorococcum sp. trong sản xuất ketocarotenoid trong một
máy phản ứng quang hình ống ngồi trời (Zhang and Lee 1999). Ngồi ra vi tảo cịn
được nghiên cứu thành phần và con đường sinh tổng hợp của carotenoid trong tảo lục
Chlorococcum sp tạo ra astaxanthin (Liu and Lee 1999).

7

lOMoAR cPSD| 27827034

CHƯƠNG 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nơi thực hiện
Phịng thí nghiệm Cơng NGhệ Sinh Học của Viện Khoa Học- Kỹ thuật Công nghệ cao,
trường Đại học Nguyễn Tất Thành, Phường 13, Quận 4, Thành phố Hồ Chí Minh.
2.2 Nội dung nghiên cứu
Nội dụng 1: thu thập mẫu tại Cần Giờ
Nội dung 2: phân lập và định danh hình thái
Nội dung 3: định danh phân tử
Bố trí thí nghiệm

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí trí nghiệm

8


lOMoAR cPSD| 27827034

2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp thu nhận mẫu
Mẫu tảo được thu tại các bải bùng ven đường thuộc huyện Cần Giờ Tp. HCM

Hình 2.3 Sơ đồ Cần Giờ
Mẫu tảo thu bằng nhiều phương pháp khác nhau tùy vào điều kiện và vị trí: Tại các bải
bùng, ao, sông, mẫu tảo được thu bằng cách vớt các ván, bọt nước có màu tại bề mặt
nước và các ván có màu ở dưới đáy bùn cũng được thu thập. Mẫu sau khi lấy lên được

bỏ vào ống fancon thể thích 50ml, sau đó được đưa về phịng thí nghiệm và tiến hành
làm thí nghiệm.

9


lOMoAR cPSD| 27827034

Hình 2.4 Phương pháp thu mẫu thực tế

2.4 Phương pháp phân lập, nuôi cấy và giữ giống
Mẫu tảo thu ở Huyện Cần Giờ sau đó đưa về phịng thí nghiện được bảo quản ở nhiệt
độ phịng trừ 18- 20oC sau đó tiến hành phân lập.
Tảo được phân lập bằng phương pháp hút tế bào đơn phỏng theo hướng dẫn của
(Andersen and Kawachi 2005). Mẫu tảo được quan sát dưới kính hiển vi và tế bào đơn
được hút bằng micropipette để môi trường trong đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng chứa
50µl mơi trường Walne, điều kiện bằng nguồn đèn huỳnh quang ở 50µmol.m-2.s-1, chu
kỳ sáng: 12 sáng/12 tối và nhiệt độ 25oC. Sau 2 tuần nuôi cấy, hút bỏ tồn bộ mơi
trường ni cấy. Tiếp theo, rửa giếng ni cấy tế bào bằng 50µl dung dịch đệm PBS đã
được vơ trùng. Sau đó, bổ sung 50µl mơi trường vào trong giếng, trộn đều. Sau đó, lần
lượt pha lỗng mẫu tảo đến 10-6 và tiếp tục nuôi cấy vi tảo ở điều kiện như trên đến khi
giếng 10-6 có màu xanh tại đáy.
Khi giếng ở nồng độ 10-6 có màu xanh tại đáy, thì chúng ta bỏ tồn bộ môi trường và
rửa giếng 3 lần vơi sdung dịch đệm PBS và bổ sung vào giếng 100 µl mơi trường và
chuyển sang phương pháp làm thuần giống vi tảo trên thạch.
10


lOMoAR cPSD| 27827034

2.4.1 Phương pháp làm thuần giống vi tảo trên mơi trường thạch
Hút 10µl mơi trường trong đĩa 96 giếng lên môi trường thạch, dùng que cấy trang giàn
đều vi tảo lên mơi trường Walne có bổ sung 1,5% agar. Đĩa thạch được nuôi bằng
nguồn sáng đèn huỳnh quang ở 50µmol.m-2.s-1, chu kỳ sáng 12 sáng/12 tối và ở nhiệt
độ 25oC.
2.4.2 Phương pháp nuôi cấy vi tảo
Khuẩn lạc vi tảo được cấy chuyển bình erlen 250ml với thể tích mơi trường SFM vào
khoảng 100ml (có sục khí, chiếu sáng liên tục bằng đèn huỳnh quang ở 100µmol.m-2.s1

) cho đến khi đạt mật độ 105 tế bào/ml. Mật độ tế bào tảo được xác định bằng buồn

đếm hồng cầu Nebaure (Hirschmann, Đức) (Andersen 2005).
Bảng 2.1 Thành phần môi trường SFM
Thành phần Stock
NaH2PO4.2H2O
NaNO3
Na2 EDTA
Na2 SiO3
MnCl2.H2O
FeCl3
H3BO3
Định mức
Thành phần Stock 2
ZnCl2
CoCL2.6H2O
(NH4)8.Mo7O24.4H2O
CuSO4.7H2O
FeCl3.6H2O
Định mức
Thành phần Stock 3

B12
Thiamine
Biotin

Định lượng
20 gr/L
100 gr/L
5 gr/L
40 gr/L
0,36 gr/L
1,3 gr/L
10 gr/L
1000ml
Định lượng
21 gr/L
2 gr/L
0.9 gr/L
20 gr/L
3.15 gr/L
100 ml
Định lượng
0.1 gr/L
20 gr/L
0.1 gr/L

11


lOMoAR cPSD| 27827034

2.5 Phương pháp tách chiết DNA
2.5.1 Tách chiếc DNA tổng số
Phương pháp tách chiết và thu nhận DNA tổng số tách chiết DNA bằng phương pháp
CTAB có hiệu chỉnh (Doyle 1991), (Surek, et al. 1994). Thành phần đệm gồm:
-

CTAB 2% (w/v)

-

Mercaptoethanol 0,2%

-

EDTA 0,5M, pH = 8

-

TrisHCL 1M, pH = 7,5

-

NaCL 5M

Quá trình tách chiết DNA được thực hiện theo các bước sau:
Bước 1: Hút 0,5ml tảo vào ống ly tâm 1,5ml. Sau đó ly tâm 3000 vịng/phút, trong
3 phút, đổ bỏ dịch nổi. Thêm 0,5ml H2O cất, vortex kỹ (bằng máy vorkex) trong 5
phút. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi. lập lại rửa với nước cất
3 – 4 lần.
Bước 2: Sau khi rửa tảo và loại bỏ dịch nổi thì thu được 0,1gam tảo, thêm 100µl

dung dịch đệm CTAB (đệm CTAB đã được ủ ở 65 °C trước đó). Tiếng hành nghiền
mẫu bằng chày nghiền đến khi tảo đổi màu. Bổ sung thêm 5 μL Proteinase K (10
mg/ml) và ủ ở 65 °C trong 60 phút, lắc trộn thường xuyên.
Bước 3: Ly tâm tốc độ 13500 vòng/phút khoảng 10 phút ở 4 °C. Hút dịch nổi
chuyển qua ống li tâm 1,5 ml mới và thêm một lượng thể tích tương đương phenol:
chloroform: isoamyl alcohol (tỉ lệ 25:24:1) và trộn đều khoảng 5 phút.
Bước 4: Li tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 °C. Chuyển pha lỏng ở phía
trên qua ống mới, thêm một lượng thể tích tương đương chloroform: isoamyl alcohol
(tỉ lệ 24:1) và trộn đều khoảng 5 phút.
Bước 5: Li tâm ở 12000 vòng/phút

trong 10 phút ở 4 °C. Chuyển pha lỏng ở

phía trên qua ống mới, thêm isopropanol lạnh với lượng bằng 2/3 thể tích dịch nổi để
tủa DNA. Ủ mẫu qua đêm ở -20 °C.

12


lOMoAR cPSD| 27827034

Bước 6: Li tâm ở 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 °C và loại bỏ dịch nổi. Cặn
tủa được rửa với 500 ethanol 70% khoảng 1-2 lần để loại bỏ muối. Li tâm 14000
vòng/phút trong 10 phút ở 4 oC. Cặn tủa được để khô ở nhiệt độ phòng hoặc 37 °C
trong khoảng 30 phút. Hòa tan cặn tủa trong 100 μl nước cất 2 lần khử ion hoặc đệm
TE 0,1X.
- Trữ mẫu ở -20 °C đến khi sử dụng.
2.6 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose
Chuẩn bị gel: Cân 0,4 gam Agarose rồi thêm vào 50ml đệm TBE 1X, đun hỗn hợp
đến khi tan hoàn toàn, khuấy đều và làm nguội đến 50 – 60oC, thêm ethidium bromide

(EtBr) đạt nồng độ cuối là 0,2µl/ml, khuấy đều và cho vào khuôn đã gắn lược, để yên
khoảng 30 phút cho gel đông.
Đặt khuôn gel vào máng điện di có chứa TBE 1X sao cho dung dịch đệm ngập trên gel
khoảng 1cm, giếng lược của bản gel đặt về phía cực âm.
Pha các mẫu DNA với lượng dung dịch đệm tải loading dye 6X thích hợp, nạp mẫu
vào các giếng, chạy song song với thang DNA chuẩn 1kb của BIOLINE . Chạy ở dòng
điện 100V, 75mA, trong 20- 30 phút. Quan sát các băng DNA trên hộp đèn UV bước
sóng 254nm.
2.6.1 Phương pháp khuếch đại trình tự DNA
Để định danh vi tảo, chúng tôi sử dụng 2 marker phân tử là gene mã hóa RNA
ribosome 18S và vùng ITS với các cặp mồi được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 2.2 Cặp mồi sử dụng trong định danh phân tử chủng tảo
Marker

Cặp mồi

Tham khảo

RNA

5’ - ACCTGGTTGATCCTGCCAGTA - 3’

(Maltsev and

ribosome 18S

5’ – GATCCTTCTGCAGGTTCACCTACG -3’

Konovalenko
2017)

5’ - CTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTC- 3’
ITS

5’ - CTCCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGG- 3’

(Marin, et al. 2003)

5’ - TCACCTACAGCWACCTTGTTACGAC- 3’
13


lOMoAR cPSD| 27827034

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR
Thành phần

Nồng độ cuối

Thể tích (µL)

2x Mytaq Mix

1X

12,5

Mồi ngược (10 µM)

0,2 µM

0,5

Mồi xi (10 µM)

0,2 µM

0,5

DNA khn

(50-100 ng/μl)

2

Nước cất vơ trùng

9,5

Tổng thể tích

25

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt khuếch đại vùng
Giai đoạn

Nhiệt độ

Thời gian

Chu kỳ

Tiền biến tính

95oC

5 phút

1

Biến tính

95oC

30 giây

Mồi bắt cặp

53oC

30 giây

Kéo dài

72oC

1 phút

Kết thúc

72oC

5 phút

Làm mát

4oC

35

1

Kết quả của phản ứng khuếch đại được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên
gel agarose 1% được nhuộm với EtBr 0,5 µg/mL. Điện di được thực hiện trong 30
phút ở hiệu điện thế 100V, 75mA trong dung dịch TAE 1X và Marker DNA chuẩn 1kb
được sử dụng để kiểm tra sản phẩm PCR có đúng với kích thước mong muốn hay
khơng. Bản gel được quan sát trên đèn UV và chụp hình để lưu trữ.

14


lOMoAR cPSD| 27827034

2.7 Định danh phân tử chủng vi tảo phân lập được
2.7.1 Giải trình tự sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR sau khi được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, nếu kết
quả khuếch đại thành công sẽ cho một vạch DNA sáng, gọn, không xuất hiện vệt dài
hay băng phụ sẽ được tinh sạch bằng kit và giải trình tự cả hai chiều (chiều xi và
chiều ngược) bằng phương pháp Sanger tại công ty 1st Base - Malaysia.
Khi tiến hành giải trình tự chúng tơi sử dụng các cặp mồi liệt kê trong bảng sau,

thông tin chi tiết về cặp mồi này xem Bảng dưới đây.
Bảng 2.5 Cặp mồi sử dụng trong phản ứng giải trình tự
Trình tự mồi
Tên mồi

(5’ - 3’)

Marker

5’ - GWATTACCGCGGCKGCTG - 3’
ITS

5’ - GAAACTGCGAATGGCTC - 3’

ITS

5’ – ATCAACCTGACAAGGCAACC - 3’

(Marin, et al.
2003)
(Nakada, et al.

5’ – GGCTTCACTGTCTGGGACTC - 3’
18S

Tham khảo

RNA 18S

2010), (Nozaki,

et al. 1995)

2.8 Hiệu chỉnh trình tự
Sau khi có được kết quả giải trình tự cả hai chiều (chiều xi và chiều ngược),
các trình tự sẽ được hiệu chỉnh như sau:
2.8.1 Loại bỏ những tín hiệu khơng chính xác ở hai đầu trình tự khảo sát
Các tín hiệu thu được nằm ở đầu và cuối trình tự thường có tín hiệu khơng rõ ràng,
các đỉnh (peaks) chồng lấp lên nhau và các peak nhỏ khơng đồng dạng nằm bên dưới
peak chính, các peak của cùng một nucleotide có độ cao khơng đều nhau (high
background/noisy sequencing signal) và không thể phân biệt rõ ràng các đỉnh tín hiệu.
Do đó việc ghi nhận các base ở vùng này không đảm bảo được độ tin cậy và cần phải
được loại bỏ bằng các tính năng trong phần mềm FinchTV 1.4.0. Việc loại bỏ không

15