Nghien cuu san xuat khang sinh vancomycin

Kho tài liệu của diễn đàn Ketnooi.com

Bộ Coâng Thương
Trường Đại Học Coâng Nghiệp Thực Phẩm
Khoa Coâng Nghệ Sinh Học - Kỹ Thuật Môi Trường

BÀI TIỂU LUẬN
NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT
KHÁNG SINH VANCOMYCIN TỪ
XẠ KHUẨN STREPTOMYCES ORIENTALIS

GVHD: Nguyễn Thị Quỳnh Mai
Danh sách thành viên :
Nguyễn Tuấn Ngọc
2013100090
Lê Hồ Thảo Nguyên
2008100132
Huỳnh Ngọc Tuyền
2008100168
Lê Thị Thúy Hằng
2008100110
Tháng 12 -2011


MỤC LỤC
I. ĐẶT VẤN ĐỀT VẤN ĐỀN ĐỀ

2

II. NỘI DUNGI DUNG
1.

Khái quát về Streptomyces orientalis Streptomyces orientalis 3
1.1. Streptomyces

3

1.2. Streptomyces orientalis

3

1.3. Ứng dụng trong sản xuất kháng sinhng dụng trong sản xuất kháng sinhng trong sản xuất kháng sinhn xuất kháng sinht kháng sinh 4
2.

Khái quát về Streptomyces orientalis Vancomycin 4
2.1. Sinh tổng hợpng hợpp 5

2.2. Dượpc và hóa họcc 6
2.3. Cơ chế tác dụng chế tác dụng tác dụng trong sản xuất kháng sinhng 7
3.

Quy trình cơng nghệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ sản xuất kháng sinhn xuất kháng sinht kháng sinh vancomycin từ

xạ khuẩn Streptomyces orientalis khuẩn Streptomyces orientalisn Streptomyces orientalis 8
3.1. Chủng giống vi sinh vậtng giống vi sinh vậtng vi sinh vậtt

7

3.2. Lựa chọn mơi trường điều kiện lên men sinh kháng sinha chọcn mơ chế tác dụngi trường điều kiện lên men sinh kháng sinhng điều kiện lên men sinh kháng sinhiề Streptomyces orientalisu kiệ sản xuất kháng sinh vancomycin từn lên men sinh kháng sinh
củng giống vi sinh vậta chủng giống vi sinh vậtng
S. orientalis 4912

8

3.3. Nâng cao hoạ khuẩn Streptomyces orientalist tính kháng sinh củng giống vi sinh vậta chủng giống vi sinh vậtng S. orientalis 4912 9
3.4. Lựa chọn mơi trường điều kiện lên men sinh kháng sinha chọcn môi trường điều kiện lên men sinh kháng sinhng và điều kiện lên men sinh kháng sinhiề Streptomyces orientalisu kiệ sản xuất kháng sinh vancomycin từn lên men vancomycin c ủng giống vi sinh vậta
chủng giống vi sinh vậtng điều kiện lên men sinh kháng sinhột biếnt biế tác dụngn

9

3.5. Tách chiế tác dụngt và tinh chế tác dụng vancomycin từ dịch lên mench lên men
4. Một biếnt sống vi sinh vật ứng dụng khác của Streptomycesng dụng trong sản xuất kháng sinhng khác củng giống vi sinh vậta Streptomyces

11

12

4.1 Các chất kháng sinht kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn trong phòng trừn gống vi sinh vậtc xạ khuẩn Streptomyces orientalis khuẩn Streptomyces orientalisn trong phòng trừ
nất kháng sinhm gây bệ sản xuất kháng sinh vancomycin từnh thựa chọn mơi trường điều kiện lên men sinh kháng sinhc vậtt

12

4.2 Khuẩn Streptomyces orientalisn lạ khuẩn Streptomyces orientalisc củng giống vi sinh vậta Streptomyces sp trên môi trường điều kiện lên men sinh kháng sinhng agar

13

4.3 Streptomyces như một biếnt vậtt chủng giống vi sinh vật cho việ sản xuất kháng sinh vancomycin từc tiế tác dụngt ra các protein
dịch lên men điều kiện lên men sinh kháng sinhể sản xuất dược sinh học sản xuất kháng sinhn xuất kháng sinht dượpc sinh họcc 13
4.4 Vi sinh vậtt phân giản xuất kháng sinhi PhotPho (P)
I.

KẾT LUẬNT LUẬNN

13

14
1


TÀI LIỆU THAM KHẢOU THAM KHẢOO 15
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, công nghệ sinh học được coi là một trong những ngành công nghệ
hàng đầu của thế giới. Và trong đó, công nghệ sinh học vi sinh vật sản xuất kháng
sinh, vitamin và các loại hoạt chất ứng dụng trong y học cũng như những lónh vực
khác phục vụ cho đời sống và nghiên cứu đang có những bước phát triển vượt bậc.
Từ những phương pháp sinh tổng hợp và bán tổng hợp thì công nghệ vi sinh
tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò quan trọng của mình. Trong số hơn
10.000 chất kháng sinh được tìm ra thì có khoảng 2.000 chất do thực vật tạo ra còn
có khoảng 8.000 chất là do kháng sinh vi sinh vật tổng hợp, trong đó xạ khuẩn tổng
hợp hơn 60%. Các công trình nghiên cứu đã chứng minh Streptomyces là một chi
xạ khuẩn gồm nhiều loài có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc
trúc và đặc điểm kháng khuẩn. Đặc biệt trong số đó có chất kháng sinh
Vancomycin đóng vai trò rất quan trọng, có nhiều ứng dụng trong thực tiễn đời
sống hiện nay.
Trong cuộc sống bình thường không chừa một ai, vì thế những nhà khoa học
cũng như những y bác sĩ khoâng ngừng học hỏi tìm tòi để có thể tìm được ra những
phương thức mới để kháng bệnh, và trong đó có “NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT
KHÁNG SINH VANCOMYCIN TỪ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES
ORIENTALIS” của các cán bộ thuộc Viện Công nghệ Sinh học thực hiện, được
nhóm tâm đắc nhất và nhóm đã quyết định tìm hiểu cũng như học hỏi phương pháp
ở đề tài này.

+ Mục tiêu :
Xây dựng quy trình công nghệ lên men sản xuất kháng sinh vancomycin từ
chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912 phù hợp với nguyên liệu và điều kiện
môi trường khí hậu Việt Nam.
+ Nội dung nghiên cứu :
- Nghiên cứu đặc điểm hình phái, đặc điểm phân loại và bảo quản chủng
Streptomyces orientalis trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Nghiên cứu lựa chọn môi trường thích hợp bằng các nguyên liệu trong nước
và điều kiện lên men chủng Streptomyces orientalis trong phòng thí nghiệm.
- Nghiên cứu tuyển chọn, bảo quản và nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng
giống.
- Nghiên cứu tối ưu môi trường và điều kiện lên men có bổ sung cơ chất.
- Nghiên cứu thử nghiệm lên men sản xuất ở trong nổi lên men nhỏ.
- Nghiên cứu tách chiết, tinh chế vancomycin từ dịch lên men chủng
Streptomyces orientalis 4912.
- Nghiên cứu điều chế vancomycin-Na.
2


II. NỘI DUNG
1. Khái quát về Streptomyces orientalis
1.1 Streptomyces
- Streptomyces laø lớn nhất chi của Actinobacteria vaø
chi nhập của gia đình streptomycetaceae. Hơn 500 loài
Streptomyces vi khuẩn đã được mô tả. Cũng như với các
Actinobacteria khác, Streptomyces là Gram dương, và có
bộ gen với cao GC . được tìm thấy chủ yếu trong đất và
thảm thực vật mục nát, nhất Streptomyces sản xuất bào tử,
và được ghi nhận về mùi của họ maø kết quả từ sản xuất của
một biến động chất chuyển hóa, geosmin. Streptomyces

được nghiên cứu rộng rãi nhất và được biết đến nhiều nhất
là chi của họ xạ khuẩn (atinomyces). Streptomyces thường

Hình 1.1
Streptomyces

sống ở đất và chúng nhận vai trò là vi sinh vật phân hủy rất quan trọng. Chúng
cũng sản xuất hơn một nửa số thuộc kháng sinh của thế giới và đó là sản phẩm có
giá trị lớn trong lónh vực y tế.

1.2 Streptomyces orientalis
Một loài Streptomyces sản xuất thuốc kháng sinh là Streptomyces orientalis ,
nay được gọi laø orientalis Amycolatopsis, vi khuẩn Streptomyces chủ yếu được tìm
thấy trong đất và thảm thực vật mục nát . Streptomyces orientalis ban đầu được tìm
thấy trong đất Ấn Độ và Indonesia. Nó được phát triển trên môi trường thạch men
một chiết xuất mạch nha và có một nhiệt độ tối ưu là 280C.
Streptomyces orientalis sản xuất Vancomycin kháng sinh, được sử dụng để
phòng ngừa và điều trị các bệnh nhiễm trùng gây ra bởi vi khuẩn Gram dương, đặc
biệt là khuẩn tụ cầu. Nó hoạt động bằng cách ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi
khuẩn Gram dương. Trong khi Vancomycin có thể hữu ích để ngăn ngừa viêm
nhiễm, nó cũng có thể gây ra vấn đề. Nó đã được báo cáo là gây độc cho thận, và
trong vài trường hợp gây độc cho tai, đặc biệt là các dây thần kinh thính giác. Do
đó, Vancomycin thường được sử dụng như một loại thuốc cuối cuøng, chỉ được sử
dụng khi không có gì khác.

3


1.3. Ứng dụng trong sản xuaát kháng sinh
Chất kháng sinh là chất có nguồn gốc từ thiên nhiên và các sản phẩm cải biến

của chúng bằng con đường hóa học có khả năng tác dụng chọn lọc với sự phát triển
của VSV, tế bào ung thư ở ngay nồng độ thấp.
- Tại Hàn Quốc năm 2007 phân lập được loại xạ khuẩn Streptomyces sp. C684
sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng
methicillin và caùc cầu khuẩn khaùng vancomycin.
- Tại Nhật năm 2003, Yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn
Streptomyces sp. TP – A0356 bằng phương pháp sắc kí cột. CKS này có khả năng
kiềm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus và Candida albicans. Chất này còn có
khả năng chống lại các tế bào ung thư có giá trị Mic là 0,01 – 0,3 mg/ml.
- Để tránh dịch bệnh trong nông nghiệp, người ta còn có thể sử dụng một số
biện pháp kĩ thuật, như thay đổi cơ cấu cây trồng, mùa vụ. Tuy nhiên biện pháp này
gây xáo trộn hệ sinh thái đồng ruộng tạo điều kiện phát sinh một số bệnh mà trước
đây ít gặp. Việc tuyển chọn các dòng cây kháng bệnh này cũng chỉ được vài năm,
sau đó các tác nhân gây bệnh lại kháng lại.

Hình 1.2

Một số loại thuốc kháng sinh
Hình 1.3

2. Khái quát về Vancomycin
Vancomycin là chất kháng sinh thuộc nhóm
glycopeptid có tác dụng tích cực trong điều trị bệnh, từng
được coi là phương thuốc cuối cùng vì có khả năng điều
trị được các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do các chủng vi
sinh vật kháng methicillin (chất kháng sinh nhiễm βlactam) gây nên. Vancomycin đã được đưa vaøo chữa bệnh
từ hơn 40 năm qua, nhưng ngaøy nay vẫn được coi là kháng
sinh quan trọng do hiệu quả chữa bệnh cao khi dùng một
mình hoặc phối hợp với caùc khaùng sinh khaùc, chống lại
Hình 2.1

caùc vi khuẩn đã nhờn với nhiều loại kháng sinh thông dụng.
Bởi vậy, việc nghiên cứu sinh tổng hợp vancomycin vẫn được
quan tâm, phát triển, để từ đó hình thành nên thế hệ kháng sinh mới có hiệu quả
4


chữa bệnh cao. Hơn nữa nghiên cứu lên men vancomycin và nắm vững quy trình
sản xuất chất kháng sinh này còn tạo tiền đề cho việc xây dựng cơ sở sản xuất các
chất kháng sinh ở quy mô công nghiệp trong điều kiện Việt Nam, góp phần thực
hiện mục tiêu tới năm 2020 sản xuất được 50% tổng số thuộc, do Bộ Y tế đề ra.
Trong bối cảnh như vậy, việc nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất
vancomycin bằng nguyên liệu trong nước, phối hợp với điều kiện kinh tế và môi
trường khí hậu của Việt Nam là cần thiết. Cùng với nó, việc triển khai xâây dựng
một cơ sở sản xuất kháng sinh này với công suất 500 kg/năm góp phần phục vụ
công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

2.1 Sinh tổng hợp
Vancomycin sinh tổng hợp xảy ra thông qua tổng hợp protein khác nhau
nonribosomal (NRPSs) . Enzyme xác định trình tự axit amin trong quá trình lắp ráp
đến 7 mô-đun. Trước khi Vancomycin được lắp ráp thông qua NRPS, các axit amin
đầu tiên được sửa đổi. L-tyrosine được sửa đổi để trở
thaønh β
hydroxychlorotyrosine (β-hTyr) vaø 4-hydroxyphenylglycine (HPG) dư lượng . Mặt
khaùc, acetate được sử dụng để lấy 3,5 dihydroxyphenylglycine vòng (3,5-DPG).
Tổng hợp peptide Nonribosomal xảy ra thông qua phân biệt các mô-đun có thể
tải và mở rộng các protein axit amin, thông qua việc hình thành liên kết amide tại địa
điểm liên kết của các phạm vi hoạt động. Mỗi module thường bao gồm một
adenylation (A) tên miền, một chất vận chuyển peptidyl protein (PCP), miền và tên
miền ngưng tụ (C) hoặc kéo dài. Trong lĩnh vực A, amino axit cụ thể được kích hoạt
bằng cách chuyển đổi thaønh một phức tạp enzyme aminoacyl adenylate gắn liền với

một đồng yếu tố 4'-phosphopantetheine bởi thioesterification phức tạp sau đó được
chuyển vào miền PCP với việc đẩy AMP. Trong sinh tổng hợp caùc Vancomycin, lĩnh
vực sửa đổi bổ sung có mặt, chẳng hạn như các epimerization (E) miền, được sử dụng
isomerizes axit amin từ một lập thể khác, và một teân miền thioesterase (TE) được sử
dụng như một chất xúc tác cho tạo vòng và vận hành của phân tử thông qua một
thioesterase phân cắt.
Một tập hợp các multienzymes (CEPA enzym tổng hợp peptide, CepB, và CepC)
chịu trách nhiệm lắp ráp các heptapeptide. (Hình 2). Các tổ chức của CEPA, CepB, và
CEP C chặt chẽ tương tự như tổng hợp peptide khác như những chất cho surfactin
(SrfA1, SrfA2, và SrfA3) vaø gramicidin (GrsA vaø GrsB). Mỗi enzym tổng hợp peptide
kích hoạt mã hoá cho các axit amin khác nhau để để kích hoạt từng lĩnh vực. CEPA mã
hóa cho mô-đun 1, 2, và 3. CepB mã hóa cho các mơ-đun 4, 5, và 6. và CepC mã hóa
cho mơ-đun 7. Sau khi phân tử heptapeptide tuyến tính được tổng hợp, Vancomycin đã
phải trải qua thay đổi hơn nữa, chẳng hạn như oxy hóa liên kết ngang và glycosyl hóa.
Để chuyển đổi heptapeptide tuyến tính, tám enzyme, open reading frames (ORF) 7, 8,
9, 10, 11, 14, 18, 20, vaø 21 được sử dụng. Enzyme ORF 7, 8, 9, vaø 20 laø những enzym
5


P450 . Và ORF 9 và 14 được xác định là enzym thủy phân giả định. Với sự gíup đỡ của
các enzym này, các nhóm β-hydroxyl được giới thiệu trên tyrosine dư lượng 2 vaø 6, vaø
khớp nối xảy ra trong vòng 5 và 7, vòng 4 và 6, và vòng 4 và 2. Ngồi ra,
haloperoxidase được sử dụng để gắn các nguyên tử clo vào vòng 2 và 6 thông qua một
quá trình oxy hóa.

Hình 2.2

6

2.2 Dược và hóa học
Vancomycin là một nhánh ba vòng peptide nonribosomal glycosyl hóa được
sản xuất bởi quá trình lên men của các loài actinobacteria Amycolatopsis orientalis
(trước đây là chỉ định Nocardia orientalis ).
Vancomycin exhibits atropisomerism – nó có nhiều hóa học khác biệt
rotamers do hạn chế luân phiên của một số liên kết. Các hình thái hiện diện trong
thuốc là các mặt nhiệt động ổn định hơn conformer và do đó có hoạt động mạnh
hơn.

2.3 Cơ chế tác dụng
Vancomycin hoạt động bằng cách ức chế tổng hợp thích hợp thành tế bào vi
khuẩn Gram dương. Do cơ chế khác nhau mà theo đó các vi khuẩn Gram âm sản
xuất thành tế bào của nó và các yêu tố khác nhau liên quan đến việc đi vào màng
ngoài của các sinh vật gram âm, vancomycin không phải là hoạt động chống lại
các vi khuẩn Gram (ngoại trừ một số loài do lậu cầu của Neisseria) .
Các phân tử ưa nước lớn có thể hình thành liên kết hydro tương tác với các
thiết bị đầu cuối D-alanyl-D-alanine moieties các NAM / NAG- peptide. Trong
những trường hợp bình thường, đây là một sự tương tác năm điểm . Điều này ràng
buộc của vancomycin D-Ala-D-Ala ngăn chặn tổng hợp thành tế bào trong hai caùch:
+ Ngăn chặn sự tổng hợp của polyme dài của N-acetylmuramic acid (NAM) và
N-acetylglucosamine (NAG) đã hình thành sợi xương sống của các tế bào vi khuẩn.
+ Ngăn cản các polyme xương sống để kìm chế sự hình thành, liên kết với
nhau.

Hình 2.5
Cơ chế tác dụng của Vancomycin

3. Quy trình công nghệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ
khuẩn Streptomyces orientalis
7

3.1 Chủng giống vi sinh vật
Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912 và các chủng vi sinh vật kiểm
định Bacillus subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC 21778, Staphylococcus aureus
209P, Sarcina lutea và Eschrochia coli PA2, các hóa chất dung để phân tích, định
lượng và vancomycin chuẩn (Merck) và các môi trường nghiên cứu là Gause 1, A4,
A-4H, TH447, A12, A-9, 48.

Hình 3.1
Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912
A. Hình dạng khuẩn lạc, B. Cuống sinh bào tử, C. bào tử.

3.2 Lựa chọn môi trường điều kiện lên men sinh kháng sinh của
chủng S. orientalis 4912
Thử nghiệm lên men trên một số môi trường thường dùng trong lên men sinh
kháng sinh ở xạ khuẩn cho thấy, chủng S. orientalis 4912 có hoạt tính kháng khuẩn
mạnh và đã lựa chọn được môi trường MT48 cho hoạt tính kháng sinh cao nhất có
thể làm môi trường cơ sở để nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng và
điều kiện lên men đến khả năng tạo kháng sinh.

Hình 3.2
Hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis 4912

Chủng S. orientalis 4912 sử dụng tốt nguồn đường sacchaose với hàm lượng
thích hợp là 3%, cho hoạt tính kháng sinh cao. Trong số các nguồn nitơ thử nghiệm
thì bột đậu tương cho hoạt tính kháng sinh cao nhất, với hàm lượng 0,2% là thích
hợp. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và pH cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho
sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. orientalis 4912 laø
8

280C vaø pH từ 6 đến 8. Lượng giống được cấy vào môi trường lên men thích hợp 6
- 8% so với môi trường lên men.
Nghiên cứu động thái quá trình men chủng S. orientalis 9412 cho thấy, sinh
khối và hoạt tính kháng sinh tăng dần và đạt cực đại sau 120 giờ lên men. Như vậy,
động thái quá trình lên men chủng này có đặc trưng giống như ở các chủng xạ
khuẩn sinh kháng sinh khác.

3.3 Nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis 4912
Trư c hết, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phươngt, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phươngc Viện Công nghệ sinh học áp dụng phươngn Công nghện Công nghệ sinh học áp dụng phương sinh học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phươngc áp dụng phươngng phươngng
pháp gây ch ng đột biến bằng tia UV. Kết quả nghieân cứu khả năng sống sót củat biết, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học aùp dụng phươngn bằng tia UV. Kết quả nghiên cứu khả năng sống sót củang tia UV. Kết, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phươngt quả nghiên cứu khả năng sống sót của nghiên cứu khả năng sống sót củau khả nghiên cứu khả năng sống soùt của năng sống soùt củang sống sót củang sót c a
tết, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phương bào tr n vaø baøo tử chủng S. orientalis 4912 sau khi xử lý UV ở độ sống sót từ ch ng S. orientalis 4912 sau khi xử chủng S. orientalis 4912 sau khi xử lý UV ở độ sống sót từ lý UV ở độ sống soùt từ đ ột biến bằng tia UV. Kết quả nghiên cứu khả năng sống sót của sống soùt củang soùt t ừ
1-10%, ki m tra hoạt tính kháng sinh theo phương pháp cục thạch cho thấy, khảt tính kháng sinh theo phươngng pháp cụng phươngc thạt tính kháng sinh theo phương pháp cục thạch cho thấy, khảch cho thấy, khảy, kh ả nghieân cứu khả năng sống soùt của
năng sống soùt củang sinh t ng h p kháng sinh c a ch ng này tăng sống sót củang lên từ 8-30,3% đống sót củai v i xử chủng S. orientalis 4912 sau khi xử lyù UV ở độ sống sót từ lý
bào tử và 66,33% đống soùt củai v i xử chủng S. orientalis 4912 sau khi xử lý UV ở độ sống sót từ lý tế bào tr n.

Khả năng sống sót của tế
Hoạt tính kháng sinh của các khuẩn lạc chủng S.
bào trần và bào tử chủng S.
orientalis 4912 xác định bằng phương pháp cục thạch
orientalis 4912 sau khi xử lý UV
(A) và đục lỗ (B)
và MNNG
Hình 3.3

Sau đó các nhà khoa học tiếp tục áp dụng phương pháp thứ hai, đó là gây
chủng đột biến bằng MNNG. Trên cơ sở lựa chọn nồng độ MNNG, pH và thời gian
xử lý thích hợp để xử lý bào tử và tế bào trần thì tỷ lệ biến chủng của hoạt tính
kháng sinh cao hơn chủng gốc laø 80,8 vaø 92,86 %. Kết quả nhận được biến chủng S.

orientalis 4912-81-61 (xử lý tế bào trần bằng MNNG) của hoạt tính kháng sinh cao
nhất là 1683 mcg/ml, được lựa chọn cho nghieân cứu điều kiện leân men sản xuất
vancomycin (hoạt tính kháng sinh chủng gốc là 866 mcg/ml).

3.4 Lựa chọn môi trường và điều kiện lên men vancomycin của chủng
đột biến
Dựa trên môi trường lên men thích hợp cho chủng S. orientalis 4912, đã tiến
hành lựa chọn môi trường lên men tối ưu theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm
của Box-Wilson cho biến chủng S. orientalis 4912-81-61 như sau Saccharose 49,8
g/l; glucose 17 g/l; bột đậu tương 30,6 g/l; NaCl 2,5 g/l; CaCO3 2 g/l; CaCl2 40 mg/
l; CuSO4 10 mg/l.
9


Ảnh hưởng của của các yếu tố điều kiện lên men cho thấy, tỷ lệ tiếp giống 4%,
nhiệt độ leân men tối ưu 28oC và nồng độ pH thích hợp 7. Nghiên cứu ảnh hưởng
của hàm lượng oxy hòa tan (dO2) trong môi trường tới sự sinh trưởng và sinh tổng
hợp vancomycin, các thí nghiệm lên men biến chủng S. orientalis 4912-81-61 được
thực hiện trong hệ thống Bioflo 110 dung tích 7,5 lit với các điều kiện pH, nhiệt độ
và tỉ lệ giống được xác định ở trên. Kết quả xác định sinh khối khô và hoạt tính
kháng sinh sau 120 giờ leân men cho thấy, khi dO2 được duy trì ở mức 20-30% thì
lượng vancomycin và sinh khối đạt cao nhất, tương ứng bằng 2983 mcg/ml vaø 9,8
mg/ml. Như vậy, kết quả của các thí nghiệm này cho thấy việc cung cấp đủ oxy hòa
tan và bảo đảm đảo trộn tốt trong bình lên men là điều kiện thiết yếu của sản xuất
vancomycin.
Để xaùc định thời điểm thu hồi vancomycin thích hợp nhất, biến chủng S.
orientalis 4912-81-61 được ni trong thiết bị lên men Bioflo 110 dung tích với
thành phần môi trường lên men tối ưu cho thấy, biến chủng này phát triển tốt trong
bình lên men, đặc biệt từ giờ thứ 48 sinh khối của chủng tăng nhanh đạt 5,8 mg/ml.
Cũng tại thời điểm naøy chủng bắt đầu sinh vancomycin, tới 120 giờ nồng độ đạt cực

đại laø 2983 mcg/ml.
Biến động quá trình
lên men sinh tổng
hợp
vancomycin
bởi biến chủng S.
orientalis 4912-8161 trên thiết bị
Bioflo 5000

3.5 Tách chiết và tinh chế vancomycin từ dịch leân men

10


Hình 3.4

Quy trình chiết xuất vancomycin
Kế tác dụngt quản xuất kháng sinh kiể sản xuất dược sinh họcm tra vancomycin taùch chiế tác dụngt từ biế tác dụngn chủng giống vi sinh vậtng S. orientalis
4912-81-61 b$ng sắc ký lớp mỏng trên hệ dung mơi Butanol - axit acetic - H2Oc ký lớp mỏng trên hệ dung mơi Butanol - axit acetic - H2Op mỏng trên hệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ dung môi Butanol - axit acetic - H2O
(4 : 3 : 7) cho gía trịch lên men Rf củng giống vi sinh vậta các mẫu là 0,75; bằng phương pháp phổ khốiu là 0,75; b $ng ph ươ chế tác dụngng phaùp ph ổng hợp kh ống vi sinh vậti
Agilent 6310 Ion Trap trên máy HPLC-MS, trọcng lượpng phân tử là 1449,27 và là 1449,27 và
b$ng sắc ký lớp mỏng trên hệ dung mơi Butanol - axit acetic - H2Oc ký l)ng cao caááp trên máy HPLC-SPA-10 Shimadzu, th ờng điều kiện lên men sinh kháng sinhi gian l ưu là
* 4,4 phút giống vi sinh vậtng như vancomycin chuẩn Streptomyces orientalisn (Merck). Sắc ký lớp mỏng trên hệ dung mơi Butanol - axit acetic - H2Oc ký điều kiện lên men sinh kháng sinhồn gốc xạ khuẩn trong phịng trừ HPLC cho th ất kháng sinhy
không có caùc pic tạ khuẩn Streptomyces orientalisp chứng dụng khác của Streptomycesng t) vancomycin ch ế tác dụng phẩn Streptomyces orientalism khaù tinh s ạ khuẩn Streptomyces orientalisch, điều kiện lên men sinh kháng sinhột biến tinh
khiế tác dụngt điều kiện lên men sinh kháng sinhạ khuẩn Streptomyces orientalist 95,4%.

Kiểm tra vancomycin bằng
sắc ký lớp mỏng
1. Vancomycin từ môi trường
Phỏ UV của vancomycin

Phỏ HPLC của vancomycin
nuôi cấy 2. Vancomycin được chuẩn (trên) và vancomycin chuẩn (trên) và vancomycin chủng S.
tách chiết vaø laøm tinh khiết; chủng S. orientalis 4912 (dưới) orientalis 4912 (dưới)
và 3. Vancomycin chuẩn
(Merck)

4. Một soá ứng dụng khác cuûa Streptomyces
11


4.1 Các chaát kháng sinh có nguồn goác xạ khuẩn trong phòng trừ
naám gây bệnh thực vật
Để tránh dịch bệnh trong nông nghiệp, người ta có thể sử dụng một số biện
pháp kỹ thuật, như thay đổi cơ cấu cây trồng, mùa vụ. Tuy nhiên biện pháp này
gây xáo trộn hệ sinh thái đồng ruộng, tạo điều kiện để phát sinh một số bệnh mà
trước đây ít gặp. Việc tuyển chọn các dòng cây kháng bệnh cũng chỉ được vài năm,
sau đó các tác nhân gây bệnh lại kháng lại.
Việc sử dụng CKS trong trồng trọt nhằm các mục đích như chống bệnh do
nấm gây ra trên rau quả và cây trồng, chống bệnh do vi khuẩn gây ra, diệt côn
trùng và cỏ dại… kiềm chế các bệnh thực vật sinh ra từ đất. So với thuốc hoá học,
dùng các chất CKS trong bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân huỷ, các
tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp gây ô nhiễm môi trường, còn có khả năng ức
chế các VSV đã kháng thuốc hoá học. CKS và dịch lên men các chủng sinh CKS
còn dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh ở bên ngoài và
trong hạt, diệt bệnh ở cả các bộ phận nằm trên đất của cây và khử trùng đất.
Ngày nay, việc sử dụng các CKS trong bảo vệ thực vật được phổ biên rộng rãi
trên thế giới nhất là ở các nước Nga, Nhật, Trung Quốc, n Độ… Ở Trung Quốc đã
tuyển chọn được nhiều chủng xạ khuẩn từ đất và nghiên cứu sản xuất nhiều CKS
phòng chống bệnh cây có hiệu quả cao như policin chống bệnh đạo ôn, jangamicin
chống bệnh khô vằn.

Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp.201 có khả
năng sinh CKS mới là z –methylheptyl iso –nicotinate, chất kháng sinh này có khả
năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, F.solani…
Ở Việt Nam cũng đã sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực
vật từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng xạ khuẩn có
khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn và F.oxysporum gây bệnh thối
rễ ở thực vật.

4.2 Khuẩn lạc của Streptomyces sp trên môi trường agar.
Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên thành sợi khí sinh
thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có nhiều dạng khác
nhau tuỳ loài : thẳng, lượn sóng xoắn, có móc, vòng….

Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng 2 phương pháp : phân đoạn
và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường
12


kính khoảng 1,5 µm. Màng tế bào có thể nhẵn, gai khối u, nếp nhăn…. Tuỳ thuộc
vào lõi xạ khuẩn với môi trường nuôi cấy.
Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza thì bào tử thể hiện
đặc điểm rất rõ. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sinh khí cũng rất khác nhau tuỳ
theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi khi nuôi cấy trên môi
trường khác nhau.
Các loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn gram
(+), hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là 25 – 300C, pH
tối ưu 6,5 – 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn
(xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh).
Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS ức chế vi
khuẩn, nấm sợi và các tế bào ung thư, virus và động vật nguyên sinh.

4.3 Streptomyces như một vật chủ cho việc tiết ra caùc protein dị để
sản xuất dược sinh học
Việc sản xuất thương mại protein chữa bệnh hoặc chẩn đoán vi sinh vật lý tổ
hợp được quan tâm đáng kể.
Một số hệ thống sản xuất protein của vi khuẩn đang được phát triển.
Một số chi của caùc vi khuẩn Gram dương đang được thử nghiệm như laø vật chủ
lưu trữ để sản xuất protein dị do khả năng tiết ra các protein có hiệu quả trong môi
trường nuôi cấy.
Trong số đó chi Streptomyces nhiều kể từ khi các loài của nó được biết là tiết
ra một lượng protein cao.
Vì sự vắng mặt của một hệ thống hạn chế, thay đổi rộng lớn, hoạt động của
protease hạn chế về sự sẵn có của hệ thống vector thích hợp, Streptomyces lividans
được chọn lựa cho việc tiết của các protein dị.
Các kết quả trình bày cho thấy rằng lividans coù thể hoạt động như một vật chủ
lưu trữ thuù vị để sản xuất một số protein hữu ích cho một số bệnh quan trọng trong
ngành thương mại dược phẩm trên toàn thế giới như là: ung thư, miễn dịch học,
bệnh tim mạch và các bệnh truyền nhiễm.

4.4 Vi sinh vật phân giải PhotPho (P)
Trong tự nhiên, P nằm trong nhiều dạng hợp chất khác nhau. Các hợp chất P
hữu cơ trong đất có nguồn gốc từ xác động vật, thực vật, phân xanh, phân chuồng…
Những hợp chất P hữu cơ này được vi sinh vật phân giải tạo thành những hợp chất
P vô cơ khó tan, một số ít được tạo thành ở dạng dễ tan. Hợp chất P hữu cơ quan
trọng nhất được phân giải ra từ tế bào vi sinh vật là nucleotide.
Nucdeotide có trong thành phần nhân tế bào. Nhờ tác động của các nhóm vi
sinh vật hoại sinh trong đất, chất này tách ra từ thành phần tế bào và được phân
giải thành 2 phần protein và nuclein. Protein sẽ đi vào vùng chuyển hoá và các
hợp chất nitrogen, nuclein sẽ đi vào vòng chuyển hoá các hợp chất P. Sự chuyển
13

hoá các hợp chất P hữu cơ thành muối của H3PO4 được thực hiện bởi nhóm vi sinh
vật phân huỷ P hữu cơ theo sơ đồ tổng quát sau :
Nucleoprotein  Nuclein  Acid.Nucleic  H2SO4
Vi sinh vật phaân hủy P hữu cơ chủ yếu thuộc 2 chi Bacillu vaø Pseudomonas.
Các loài có khả năng phân giải mạnh là : B.megaterium, Serratia, B.subtilis,
Serratia,
Proteus, Arthrobster, ...
 Vi khuẩn: Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Agrobacterium.
 Xạ khuẩn: Streptomyces...

III. Keát luận
Vancomycin là một kháng sinh nhóm glycopeptid được sử dụng để chữa các
bệnh nhiễm trùng do các vi khuẩn Gram dương gây ra, đặc biệt là các vi khuẩn
kháng lại kháng sinh methicillin và penicillin. Kết quả nghiên cứu được xây dựng
được quy trình thích hợp để sản xuất vancomycin từ biến chủng nhận được cao hơn
chủng gốc 344%. Chất khaùng sinh thu nhận được từ dịch lên men tương đương với
vancomycin chuẩn (Merck).
Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng 4912: Chủng này có đặc điểm giống
loại S.orientales như chủng chuẩn ISP 504 được mô tả, sử dụng hầu hết các nguồn
đường, sinh trưởng phaùt triển tốt, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu ở 28-300C, pH thích
hợp cho sự phát triển của chủng này từ 6 đến 9, chịu muối đến 6% và không có khả
năng tạo xenlulaza.
Chủng S. orientalis 4912 có hoạt phổ kháng khuẩn rộng giống lồi Streptomyces
orientalis Pittenger & Brigham, ức chế được cả vi khuẩn Gram dương vaø vi khuẩn
Gram âm.
Đã lựa chọn môi trường thích hợp MT 48 làm môi trường cơ sở để nghiên cứu
tối ưu thành phần môi trường và điều kiện lên men. Chủng 4912 có đặc điểm sinh
học giống lồi Streptomyces orientalis và hoạt tính kháng sinh cao. Kết quả nghiên

cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp khaùng sinh cho thấy nguồn
dinh dưỡng thích hợp là saccaroza 3%, bột đậu tương 0,2%, pH 7,0 - 7,5 nhiệt độ leân
men 300C vaø tỷ lệ cấy giống 10%. Lượng sinh khối vaø kháng sinh cao nhất của quá
trình lên men ở 120 giờ nuôi cấy.
Đã nghiên cứu sự biến động tự nhiên về hoạt tính kháng sinh của chủng S.
orientalis 4912 và nhận thấy, chủng này không có biến động lớn về hoạt tính kháng
sinh; không có biến chủng âm tính và được lựa chọn được 1 chủng có hoạt tính
kháng sinh cao nhất.

14


Ñaõ lựa chọn được chủng xạ khuẩn S. orientalis 4912-81-345 có khả năng sinh
tổng hợp vancomycin cao và các chủng được đột biến có khả năng sinh tổng hợp
kháng sinh cao hơn chủng gốc.
Đã nghiên cứu và sử dụng kỹ thuật gây đột biến tế bào trần bằng tia UV và
nâng cao được hoạt tính của chủng S. orientalis 4912.
Được xác định được hoạt tính kháng sinh của các biến chủng sau khi xử lý UV:
Hoạt tính kháng sinh của các chủng dương tính đều cao hơn chủng gốc và biến
chủng âm đều thấp hơn chủng gốc.
Đã nghiên cứu tối ưu hóa môi trường lên men tổng hợp vancomycin của chủng
gốc và các chủng đột biến; Nghiên cứu động thái quá trình lên men trên nội lên
men 5 lít và 80 lít.
Đã nghiên cứu tách chiết kháng sinh từ dịch nuôi cấy của chủng S. orientalis
4912 bằng dung môi và các chất hấp phụ, sản phẩm nhận được là vancomycin.
Đã nghiên cứu tinh chế và điều chế vancomycin.HC1 và bào chế 2 dạng
thuốc : Thuốc tiêm và viên nang.

TÀI LIỆU THAM KHAÛO
(1) />(2) />(3) />(4) />(5) />(6) www.en.wikipedia.org/wiki/Vancomycin

(7) www.dspace.isivast.org.vn/dspace/bitstream/123456789/3266/1/dt1.doc
(8) www.scribd.com/doc/35890819/STREPTOMYCES
Tạp chí công nghệ sinh học

15