Nghiên cứu sản xuất bộ sinh phẩm MĐC ELISA dùng cho chẩn đoán viêm não Nhật Bản

Bộ Y tế




đề tài KY 01 04

Đề tài nhánh của KY 01 04


Nghiên cứu sản xuất
bộ sinh phẩm MAC-ELISA dùng cho
chẩn đoán viêm no Nhật bản


Chủ nhiệm đề tài nhánh KY 01 04
TS. Phan Thị Ngà













6612

27/10/2007

Hà nội 1991 - 1993




1
Mục B
Nghiên cứu sản xuất bộ sinh phẩm Mac-elisa
Dùng cho chẩn đoán viêm no nhật bản (VNNB)


I. Đặt vấn đề:
Thử nghiệm miễn dịch enzym phát hiện kháng thể IgM kháng virut VNNB
(IgM antibody Capture ELISA gọi tắt là MAC-ELISA) đợc Bundo, K. và
Igarashi, A. nghiên cứu và đa vào áp dụng trong chẩn đoán nhanh, sớm và đặc
hiệu bệnh VNNB. Đây là một phơng pháp chẩn đoán huyết thanh học mới có
nhiều u điểm nổi bật nh:
- Huyết thanh sử dụng cho thử nghiệm không phải xử lý mà vẫn tránh
đợc dơng tính giả với yếu tố thấp khớp.
- Chẩn đoán sớm bệnh ngay sau khi mắc 2 - 4 ngày đầu. Chẩn đoán bệnh
bằng một mẫu huyết thanh đơn.
- Chẩn đoán đặc hiệu, có độ nhạy và chính xác cao.
Chính vì vậy mà phơng pháp chẩn đoán huyết thanh này nhanh chóng
đợc áp dụng ở nhiều nớc có lu hành bệnh VNNB để xác định căn nguyên.
Để áp dụng thử nghiệm MAC-ELISA trong chẩn đoán nhanh và sớm bệnh
VNNB, thì việc sử dụng sinh phẩm dới dạng những bộ sinh phẩm là rất thuận
tiện cho việc áp dụng thử nghiệm này. Do vậy mục đích nghiên cứu của chúng
tôi là:

Nghiên cứu sản xuất bộ sinh phẩm MAC-ELISA dùng cho chẩn đoán
nhanh bệnh VNNB.
II. Vật liệu:
1. Vật liệu để chế tạo sinh phẩm:
1.1. Động vật thí nghiệm:
- Chuột nhắt trắng giống Swiss loại 2 - 3 ngày tuổi.
- Chuột nhắt trắng giống Swiss 11 - 13 gam.
Do trung tâm nghiên cứu và sản xuất động vật thí nghiệm Viện Vệ Sinh
Dịch Tễ Học Hà Nội cung cấp.

2
1.2. Các hoá chất:
- Sucroza
- axeton.
- axit Boric
- Albumin bò.
- Tá dợc Freund
- Horse - Raddish - Peroxidaza
- Sephacryl S200
- O-Phenylene Diamine (OPD)
- Các muối:
+ axit citric
+ axit H
2
SO
4

+ KCl
+ NaH
2

PO
4
+ H
2
O
2

+ Na
2
CO
3

+ NaHCO
3

+ Na
2
HPO
4
. 12H
2
O.
+ O-Phenylene diamine

+ Twcen 20
1.3. Dụng cụ:
- Bơm tiêm 1 ml, 2ml, 5ml.
- Pipet 1 ml, 2ml, 5ml, 10ml.
- Tấm nhựa làm ELISA đáy bằng 96 giếng,
- Pipet man loại 20 àl, 100 àl, 1000 àl

- Pipet man 8 kênh 50-250 àl
- Đầu típ cho các loại pipet man trên
- Các dụng cụ thuỷ tinh trung tính và các đồ dùng phòng thí nghiệm cần
thiết khác.


3
1.4. Thiết bị phòng thí nghiệm
- Buồng vô trùng
- Máy nghiền não
- Máy li tâm lạnh 4
0
C (10.000 v/p)
- Tủ lạnh 4
0
C, - 20
0
C, - 70
0
C
- Tủ ấm 37
0
C
- Tủ xấy
- Máy đo pH
- Cân chính xác
- Máy hút chân không
- Máy quay điện từ
- Máy đọc ELISA
- Máy đông khô sinh phẩm

2. Sinh phẩm
2.1. Các sinh phẩm chuẩn
- Kháng nguyên VNNB chủng Nak. Biken Nhật Bản
- IgG chuột kháng virut VNNB chủng Nak. gắn Peroxydaza của Viện
Biken, Nhật Bản.
- Kháng IgM ngời đặc hiệu chuỗi à của cappel USA. sản xuất.
2.2. Các sinh phẩm tạo bộ sinh phẩm MAC-ELISA.
- Kháng nguyên VNNB do phòng thí nghiệm Viêm não sản xuất
- Huyết thanh mẫu chứng dơng và chứng âm do phòng thí nghiệm Viêm
não cung cấp.
- IgG chuột kháng virut VNNB gắn Peroxydaza do phòng thí nghiệm Hoá
sinh và phòng thí nghiệm Viêm não sản xuất.
- Kháng IgM ngời đặc hiệu chuỗi à của Cappel USA.
3. Mẫu bệnh phẩm cho kiểm tra bộ sinh phẩm:
- Các mẫu bệnh phẩm đợc lấy từ những bệnh nhân có hội chứng não cấp
cha rõ căn nguyên ở mọi lứa tuổi (bệnh nhân điều trị tại các bệnh viện hoặc
các ổ dịch và nghi là VNNB)

4
- Thời gian lấy mẫu: Sau khi mắc bệnh 1 - 2 ngày cho đến 60 ngày sau.
- Bệnh phẩm: Huyết thanh bệnh nhân lấy 0,1 ml - 1ml.
III. Phơng pháp.
1. Quy trình sản xuất kháng nguyên VNNB Nakayama theo phơng pháp
SUCROZA-AXETON:
- Não chuột ổ nhiễm virut VNNB đợc nghiền đồng nhất 20% trong
sucroza 8,5% bằng máy nghiền Nissei - Nhật Bản 2000 v/p trong 5 phút.
- Cho một thể tích hỗn dịch virut này vào 20 thể tích axêton lạnh.
- Ly tâm 1.800 v/p trong 15 phút loại bỏ nớc nổi.
- Làm tan cặn này bằng một thể tích axeton lạnh nh trên để 4
0

C/60 phút.
- Ly tâm 1.800 v/p trong 15 phút loại bỏ nớc nổi. Hoà cặn này bằng
axeton lạnh cho vào trong tube ly tâm 1.800 v/p trong 15 phút loại bỏ
nớc nổi.
- Trải rộng cặn trong tube và làm khô bằng máy hút chân không từ 1 - 2 giờ.
- Làm tan cặn bằng đệm Borat pH.9 có 0,4% Albumin bò để 4
0
C qua đêm.
- Ly tâm 10.000 v/p trong 60 phút ở 4
0
C lấy nớc nổi kiểm tra hiệu giá
bằng phản ứng ngng kết hồng cầu (kháng nguyên dùng cho thử nghiệm
MAC-ELISA hiệu giá phải đạt >1/256).
- Xác định hiệu giá thích hợp dùng cho thử nghiệm MAC-ELISA.
- Đông khô kháng nguyên, kiểm tra lại hiệu giá sau đông khô.
2. Quy trình sản xuất kháng thể virut VNNB gắn HRPO:
2.1. Quy trình sản xuất kháng thể kháng virut VNNB (Nak):
- Cách gây miễn dịch cho chuột Swiss 11- 13 gam:
+ Số lần gây miễn dịch: 5 lần, mỗi lần cách nhau 7 ngày.
+ Liều gây miễn dịch: 0,2 ml hỗn dịch virut (văcxin VNNB) với tá dợc
Freund theo tỷ lệ 1/1
+ Đờng tiêm: Tiêm vào phúc mạc.
- Lấy máu tim để kiểm tra hiệu giá kháng thể (ít nhất là 3 con chuột) sau
mũi tiêm thứ 4.
- Kiểm tra hiệu giá bằng phản ứng ngăn ngng kết hồng cầu hoặc bằng kỹ

5
thuật trung hoà trên tế baò nếu kết quả đạt:
+ Phản ứng ngăn ngng kết hồng cầu hiệu giá > 1/1.000
+ Kỹ thuật trung hoà trên tế bào hiệu giá > 10

6

- Lấy máu tách huyết thanh: Lấy máu cho vào tube để nghiêng ở nhiệt độ
phòng cho đông, đề vào 37
0
C/60p. Rồi để ở 4
0
C qua đêm để tách lấy huyết
thanh.
2.2. Quy trình sản xuất kháng thể IgG kháng virut VNNB gắn HRPO:
2.2.1. Tinh chế IgG kháng virut VNNB.

a. Pha loãng kháng thể virut VNNB trong PBS theo tỷ lệ 1/2.

b. Cho 1 thể tích loãng dung dịch (NH
4
)
2
SO
4
bão hoà vào 1 thể tích kháng
thể đã pha loãng trên.

c. Quay điện từ ở phòng thí nghiệm 20 phút.

d. Ly tâm 10.000 v/p trong 20 phút loại bỏ nớc nổi.

e. Làm tan cặn bằng PBS và thêm dung dịch (NH
4
)

2
SO
4
bão hoà để có
nồng độ cuối cùng là 39%.

f. Quay điện từ ở phòng thí nghiệm ít nhất 20 phút.

g. Ly tâm 10.000 v/p trong 20 phút.

h. Loại bỏ nớc nổi và làm tan cặn với PBS (làm nhắc lại nh các bớc e, f,
g, thêm 2 lần nữa.

i. Hoà tan cặn với một lợng PBS nhỏ nhất, thẩm tích trong PBS loại bỏ
(NH
4
)
2
SO
4
ở 4
0
C qua đêm.


6
k. Cho qua cột trao đổi Ion Sephacryl: S200) để chọn các mẫu có chứa IgG
kháng virut VNNB.

l. Hộn các mẫu có chứa IgG, cô đặc bằng áp lực chân không. Kháng thể

tinh chế này dùng để làm cộng hợp enzym.

2.2.2. Gắn IgG kháng virut VNNB tinh khiết với HRPO:


Quay điện từ ở phòng thí nghiệm trong 2 giờ (tránh ánh sáng). Để ở 4
0
C t
rong 2 giờ không quay điện từ. Cho qua cột trao đổi Ion (Sephacryl: S200).
Thu các mẫu và đo ở bớc sóng 280
nm
, 403
nm
.
Tính tỷ số mật độ quang học (OD) của bớc sóng 403/280.
Hộn các mẫu có tỷ số trong khoảng 0,3 - 0,6. Thêm 0,1% Albumin bò
(chất làm bền vững).
Xác định hiệu giá thích hợp dùng cho thử nghiệm MAC-ELISA
Đông khô.
3. Chọn mẫu huyết thanh chứng dơng và chứng âm:
3.1. Chọn mẫu huyết thanh dơng tính:
- Huyết thanh bệnh nhân có hội chứng não cấp nghi VNNB đợc làm xét
Thẩm tích IgG
(100mg) trong dung
dịch 0,01M Carbonat
pH 9,6 ở 4
0
C qua đêm
30 mg HRPO pha trong 12,3 ml
nớc cất cho 2,5ml 0,1M NaIO

quay điện từ 20 phút ở phòng thí
nghiệm.
Thẩm tích trong dung dịch 1M
Acetat pH 4,5 ở phòng thí
nghiệm qua đêm
Điều chỉnh pH tới 9,5 bằng dung
dịch 1M Cacbonat pH 9,6
+

7
nghiệm bằng kỹ thuật HI chọn mẫu xác định dơng tính có hiệu giá >1/80.
Kiểm tra lại bằng thử nghiệm MAC-ELISA từng mẫu huyết thanh riêng
(có đối chiếu với huyết thanh mẫu dơng chuẩn của Viện Nagasaki Nhật
Bản).
- Những mẫu huyết thanh thoả mãn hai điều kiện:
- Hiệu giá HI > 1/80
- MAC - ELISA dơng tính (OD mẫu thử/OD chứng âm >2).

3.2. Chọn mẫu huyết thanh âm tính:
- Huyết thanh ngời lành ở vùng không có lu hành dịch VNNB đợc làm
xét nghiệm kiểm tra bằng kỹ thuật HI và MAC-ELISA xác định âm tính
(có đối chiếu với huyết thanh mẫu âm chuẩn của Viện Nagasaki).
4. Pha các dung dịch đệm cho bộ sinh phẩm.
4.1. Dung dịch phủ bản pH. 9,6:
Na
2
CO
3
1,59 g
NaHCO

3
2,93 g
NaN
3
0,2 g
Nớc cất vừa đủ 100 ml

4.2. Dung dịch 0,05M Citrat phopat pH 5,0 đặc 10 lần:
axit Citric 5,04 g
Na
2
HPO
4
12H
2
o 17,90 g

4.3. Pha dung dịch 0,05M Citrat phophat pH.5,0 đặc 10 lần có H
2
O
2
:
1 ml dung dịch Citrat phophat pH.5,0 đặc 10 lần
0,003 ml H
2
O
2

4.4. Pha dung dịch axit dừng phản ứng:
H

2
SO
4
đậm đặc 10,6 ml
(Chú ý cho từ từ axit đậm đặc vào nớc)

8

4.5. PBS tinh thể:
NaCl 8,0 g
KCl 0,2 g
Na
2
HPO
4
1,15 g
KH
2
PO
4
0,2 g
(Khi dùng pha trong 1.000 ml nớc cất)
* Các dung dịch đệm và hoá chất đợc đóng lọ đủ dùng cho từng bộ sinh
phẩm 96 thử nghiệm.

5. Cố định kháng thể IgG kháng IgM ngời đặc hiệu chuỗi à trên phiến
nhựa 96 ghiếng:
- Chuẩn độ hiệu giá kháng thể kháng IgM ngời theo phơng pháp của
Bundo, K. và Igarashi, A. để xác định hiệu giá thích hợp.
- Pha kháng thể kháng IgM ngời trong dung dịch phủ bản pH 9,6

- Cho vào các giếng của bản nhựa mỗi ghiếng 100 àl, để 4
0
C qua đêm.
- Rửa bản nhựa bằng dung dịch PBS-T 5 lần
- Các bản nhựa đã cố định kháng thể IgG đợc bọc kín bằng giấy bạc bảo
quản ở 4
0
C hoặc -20
0
C.

6. Nguyên lý thử nghiệm MAC-ELISA:

Nguyên lý: Thử nghiệm Miễn dịch enzym phát hiện kháng thể IgM kháng virut
viêm não Nhật Bản (IgM Antibody Capture ELISA gọi tắt là MAC-ELISA) là
một thử nghiệm miễn dịch gián tiếp để xác định sự có mặt của kháng thể IgM
kháng virut VNNB trong huyết thanh hoặc nớc não tuỷ bệnh nhân.





9
Tóm tắt sơ đồ:
Nguyên lý kỹ thuật MAC-ELISA
Pha
rắn
1 2 3 4 5
1. IgG thỏ kháng IgM ngời đặc hiệu chuỗi à.
2. Kháng thể IgM có trong máu hoặc dịch não tuỷ.

3. Kháng nguyên VNNB (Nak)
4. IgG chuột kháng vi rút VNNB gắn Peroxydaza.
5. Cơ chất hiện màu OPD.

Tiêu chuẩn nhận định dơng tính đọc bằng máy đọc ELISA ở bớc sóng 492 nm.
OD chứng dơng
2
OD chứng âm

OD mẫu thử
2
OD chứng âm
IV. Kết quả.

Bảng 1. So sánh hiệu giá các sinh phẩm sản xuất:

Sinh phẩm Viện BiKen Viện VSDT
Hiệu giá - kháng nguyên > 1/2000 > 1/2000
Hiệu giá - Cộng hợp enzym > 1/2000 > 1/2000


10
Bảng 2
. Theo dõi điều kiện và thời gian bảo quản sinh phẩm:

Thời gian bảo
quản
Sinh phẩm Hình thức
40
0

C - 20
0
C
1. Tấm nhựa 96 giếng Đã gắn kháng IgM ngời 3 tháng 1 năm
2. Kháng nguyên VNNB Đông khô 3 tháng 3 năm
3. Huyết thanh âm Đông khô 3 tháng 3 năm
4. Huyếnt thanh dơng Đông khô 3 tháng 3 năm
5. IgG chuột kháng virut VNNB
gắn HRPO
Đông khô 3 tháng 3 năm
6. O-Phenylene diamine Tinh thể 3 tháng 1 năm
7. Đệm pha cơ chất có H
2
O
2
(đặc
10 lần)
Dung dịch 3 tháng
8. PBS (pha 1 lít) Tinh thể 12 tháng
9. Tween 20 Dung dịch 12 tháng
10. H
2
SO
4
4N Dung dịch 12 tháng
11. Nớc cất 2 lần 12 tháng



Bảng 3

. So sánh độ nhậy của 2 thử nghiệm HI và MAC-ELISA đối với 173
mẫu máu sớm

(Lấy sau khi mắc bệnh 1 - 5 ngày, trong vụ dịch 1988)

Kết quả Số mẫu
MAC-ELISA HI
37
71
60
5
(+)
(+)
(-)
(-)
Có kháng thể
(-)
(-)
Có kháng thể
Tổng số 108/173 (62,42%) 42/173 (24,27%)




11
Bảng 4
: Kết quả ứng dụng bộ sinh phẩm MAC-ELISA trong chẩn đoán và
giám sát bệnh Dengue và VNNB

Kết quả

Loại mẫu bệnh phẩm Số mẫu
Kháng nguyên
VNNB (NaK)
Kháng nguyên
Dengue (D2)
Máu ngời lành 1992 4
3
245
(+)
(-)
(-)
(-)
(+)
(-)
Máu bệnh nhân
- Có chẩn đoán lâm sàng nghi
VNNB
- Sốt cao không rõ căn nguyên

40

2

(+)

(-)

(-)

(+)

Bảng 5
: Sự phân bố VNNB đợc xác định bằng MAC-ELISA theo lứa tuổi
(1989 - 1991)

Nhóm tuổi 0 - 4 5 - 9 10 - 14 15 - 19 > 19 Tổng số
Xác định
VNNB
174 169 38 2 18 401
43,39 42,14 9,48 0,50 4,49 100 %
85,53 9,48 4,99 100


12

Bảng 6
: Những địa phơng có bệnh nhân VNNB đã đợc xác định bằng
MAC-ELISA (1989 - 1991)

Địa phơng Chẩn đoán lâm sàng Xác định VNNB
Nội thành 20 8 Hà Nội
Ngoại thành 138 77
Hà Bắc 118 68
Hà Sơn Bình 117 64
Hải Hng 104 66
Hà Nam Định 30 19
Thái Bình 2 2

Vĩnh Phú 28 14
Thanh Hoá 5 3
Lạng Sơn 4 3
Bắc Thái 12 9
Quảng Ninh 2 1
Không xác định 213 67
Tổng số 793 401


13

Bảng 7
: Những địa phơng có bệnh nhân VNNB đã đợc xác định bằng
MAC - ELISA 1992

Tỉnh/ thành phố Số mẫu xét nghiệm MAC - ELISA (+)
Nội thành 7 5 Hà Nội
Ngoại thành 29 24
Thái Bình 52 25
Ninh Bình 5 5
Thanh Hoá 2 2
Nam Hà 28 25
Hà Bắc 69 64
Vĩnh Phú 30 25
Hải Hng 60 51
Bắc Thái 4 3
Quảng Ninh 1 1
Hà Tây 58 50
Hoà Bình 4 3
Nghệ An 2 0

Hà Tĩnh 1 1
Lai Châu 1 0
Lạng Sơn 3 2
Tuyên Quang 2 1
Yên Bái 4 1
Sơn La 1 0
Quảng Trị 1 1
Huế 28 11
Không rõ địa chỉ 138 39
Tổng số 530 339


14
V. Nhận xét và bàn luận
1. Các sinh phẩm sản xuất đạt hiệu giá cao, tinh khiết để sử dụng cho thử
nghiệm MAC - ELISA hiệu giá kháng nguyên (kiểm tra bằng phản ứng ngng
kết hồng cầu - HA) >1/2000, hiệu giá công hợp enzym >1/2000 (Bảng 1)
2. Qua theo dõi điều kiện bảo quản sinh phẩm đã xác định thời gian bảo quản
sinh phẩm.
- ở 4
0
C trong 3 tháng
- ở - 20
0
C trong 3 năm
3. ứng dụng bộ sinh phẩm MAC-ELISA trong chẩn đoán nhanh và sớm bệnh
VNNB thấy có những u điểm nổi bật nh:
- Chẩn đoán bệnh với một mẫu huyết thanh, huyết thanh không phải xử lý,
tránh đợc dơng tính giả, chẩn đoán sớm bệnh. Trong 173 mẫu máu đơn (lấy
sau khi mắc 1 - 5 ngày) thử nghiệm MAC-ELISA. Xác định dơng tính là

108/173 (62,42%) trong khi đó thử nghiệm HI chỉ xác định đợc 42/172
(24,27%) mẫu có kháng thể.
- Điều tra tình trạng nhiễm ẩn virut Dengue và virut VNNB trong 252 mẫu
máu lấy ở ngời bình thờng tại Hải Hng 6/1992. Bằng thử nghiệm MAC-
ELISA có 245 mẫu âm tính với cả kháng nguyên Dengue và VNNB. Nhng có
4 mẫu dơng tính với kháng nguyên VNNB và âm tính với kháng nguyên
Dengue, có 3 mãu dơng tính với kháng nguyên Dengue và âm tính với kháng
nguyên VNNB.
(Bảng 4) ứng dụng thử nghiệm MAC-ELISA chẩn đoán xác định bệnh
cũng cho kết quả tơng tự, không có sự chéo giữa kháng nguyên viêm não và
kháng nguyên Dengue.
Nh vậy MAC-ELISA là một thử nghiệm đặc hiệu, không chéo với kháng
nguyên cùng nhóm Flavi virut, nó rất có ý nghĩa trong chẩn đoán, giám sát
bệnh ở những nơi có lu hành cả virut Dengue và virut VNNB nh ở nớc ta.
4. Từ những kết quả chẩn đoán bệnh bằng thử nghiệm MAC-ELISA đã xác định
một số đặc điểm dịch tễ về VNNB.

15
- Dịch thờng xảy ra về mùa hè đỉnh cao của dịch thờng là tháng 6, tỷ lệ
xác định dơng tính vào thời điểm này là 216/295 (hình 1).
- Tỷ lệ mắc VNNB cao nhất ở nhóm tuổi 0 - 9 (85,53%) bảng 5
- Kết quả xác định VNNB tại các tỉnh và thành phố không phản ánh đợc
thực chất tình hình bệnh VNNB tại các nơi đó, nhng nó có ý nghĩa trong việc
xác định sự có mặt của virut VNNB tại các địa phơng đó (bảng 6 và bảng 7).

VI. Kết luận:
Qua các kết quả đạt đợc chúng tôi nhận thấy:
1. Các sinh phẩm sản xuất đạt hiệu giá cao và độ tinh khiết dùng cho thử
nghiệm MAC-ELISA
- Kháng nguyên VNNB hiệu giá <2000 (phản ứng HA)

- Cộng hợp enzym hiệu giá >2000 (ELISA)
2. Thời gian và điều kiện bảo quản sinh phẩm
- ở điều kiện 4
0
C bộ sinh phẩm có hạn dùng trong 3 tháng
- ở điều kiện - 20
0
C bộ sinh phẩm có hạn dùng 12 tháng.
3. Bộ sinh phẩm MAC - ELISA đợc ứng dụng trong chẩn đoán bệnh VNNB
cho kết quả nhanh, sớm chính xác.