Nghiên cứu sản xuất bộ sinh phẩm để chẩn đoán nhanh bệnh sốt dengue sốt xuất huyết dengue và bệnh viêm đường hô hấp cấp ( SARS ) ở việt nam

Bộ Khoa học và Công nghệ
Chơng trình KC- 04


Báo cáo
tổng kết khoa học và kỹ thuật Đề tài cấp nhà nớc
Đề tài: KC 04 - 32

Nghiên cứu sản xuất Bộ sinh phẩm để
chẩn đoán nhanh bệnh sốt Dengue/ sốt
xuất huyết Dengue và bệnh Viêm đờng hô
hấp cấp (SARS) ở Việt Nam.
GS.TS. Trơng uyên Ninh
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng











6701

24/12/2007

Hà Nội, 9- 2007

Bản quyền thuộc VVSDTTW- Bộ Y Tế


Những chữ viết tắt trong báo cáo





ARN Axit ribonucleic
ADN Axit deoxyribonucleic
CID Center of Infection Diseases
Trung tâm các bệnh nhiễm trùng
CDC Center of Diseases Control
Trung tâm kiểm soát bệnh tật
ELISA Enzym linked Immunosorbent Assay
Thử nghiệm miễn dịch men
GAC- ELISA IgG Capture ELISA
Kỹ thuật miễn dịch enzym phát hiện IgG
HI Hemagglutination Inhibition test
HT Huyết thanh
FBS Fetal Bovin Serum
IFAT (Immunofluorescent indirect Antibody Technique)
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
IFDT (Immunofluorescent direct Antibody Technique)
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

IFA (Immunofluorescent Indirect Antibody Technique)
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
MAC -
ELISA
IgM Capture ELISA
Kỹ thuật miễn dịch enzym phát hiện IgM
ML Maximum Likelihood
Phơng pháp chắc chắn tối đa
MP Maximum Pasimony

Phơng pháp chi li tối đa
NJ Neighbor Joining
Phơng pháp kế cận liền kề
NNKHC Ngăn ngng kết hồng cầu (HI)
Primer Đọan mồi ADN
PRNT Plaque Assay and Plaque Reduction Neutralization
tests.
Kỹ thuật trung hoà và Kỹ thuật Trung hoà giảm đám
hoại tử
PCR Polymerase Chain Reaction
Phản ứng chuỗi Polymeraza
RT- PCR Reverse transcriptase- Polymerase chain reaction
Phản ứng dao chép ngợc khuếch đại chuỗi
SARS Severe Acute Respiratory Syndrome
Hội chứng viêm đờng hô hấp cấp tính
SARS-CoV
Severe Acute Respiratory Syndrome associated Corona
virus
Virus Corona gây bệnh SARS
SD Sốt Dengue

SXHD Sốt xuất huyết Dengue
TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới
VVSDTTW Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương
VCNSH Viện Công nghệ Sinh học
WHO World Health Organization
(Tổ chức Y tế Thế giới)
WB Western Blot






Mục lục


Số TT Nội dung Trang


Đặt vấn đề
1



Chơng I.
Tổng quan tài liệu



A. Nghiên cứu virus Dengue gây nên bệnh Sốt

Dengue/ Sốt xuất huyết Dengue ở Việt Nam
1.1
Bệnh sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue
5
1.1.1
Biểu hiện lâm sàng
1.1.2
Tác nhân truyền bệnh
6
1.1.3
Tình hình dịch bệnh trên thế giới
8
1.1.4
Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam
11
1.2
Virus Dengue
11
1.2.1
Đặc điểm hình thái và cấu trúc
13
1.2.2
Genome của virus
13
1.2.3
Chu trình nhân lên và cơ chế gây bệnh của virus Dengue
15
1.2.4
Đặc điểm kháng nguyên
17

1.2.4.1
Phát hiện kháng thể
18
1.2.4.2
Phân lập virus
20



B. nghiên cứu virus corona gây bệnh viêm đờng
hô hấp cấp SARS ở Việt Nam
1.1
Tình hình nghiên cứu trên thế giới
26
1.2
Các nghiên cứu tại Việt nam
42



Chơng II
Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu


A. Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh bệnh Sốt Dengue/


Sốt xuất huyết Dengue
2.1
Đối tợng và vật liệu

44
2.1.1
Đối tợng
2.1.2
Vật liệu
2.1.3
Hoá chất
49
2.2
Trang thiết bị
54
2.3
Phơng pháp
55

Các phơng pháp sản xuất kháng nguyên và Kháng huyết thanh
2.3.1
Sản xuất kháng nguyên
55
2.3.2
Phơng pháp sản xuất kháng huyết thanh
58
2.3.3
Phơng pháp ELISA phát hiện IgM
59
2.3.4
Kỹ thuật trung hoà (Neutralization Test - NT)
59
2.3.5
Phơng pháp miễn dịch hấp phụ liên kết men

phát hiện KT IgG (GAC- ELISA)
60
2.4
Các phơng pháp phân lập và xác định type virus
60
2.4.1
Cấy truyền trên não chuột ổ (1-3 ngày tuổi)
60
2.4.2
Phơng pháp phân lập virus trên tế bào muỗi
Aedes. albopictus dòng C6/36.
61
2.4.3
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
(Direct ImmunoFluorescent Antibody Assay DFA).
64
2.4.4
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
(Indirect ImmunoFluorescent AntibodyAssay IFA).
65
2.4.5
Kỹ thuật Trung hoà giảm đám hoại tử
( Plaque Reduction Neutralization Test - PRNT )
66
2.4.6
Phơng pháp tổng hợp dây chuyền chuỗi nhờ polymerase
(RT-PCR - Polymerase Chain Reaction)
68

C. Bộ sinh phẩm chẩn đóan nhanh

bệnh Viêm đờng hô hấp cấp SARS


2.1
Đối tợng nghiên cứu
73
2.2
Vật liệu
74
2.2.1
Mẫu bệnh phẩm
74
2.2.2
Tế bào
74
2.2.3
Sinh phẩm khác
74


2.2.4
Môi trờng và hoá chất
75
2.2.5
Trang thiết bị và dụng cụ
76
2.3
Phơng pháp
78
2.3.1

Phân lập virus SARS-CoV
78
2.3.2
Tạo plasmid tái tổ hợp.
78
2.3.3
Biểu lộ và tinh sạch kháng nguyên .
79
2.3.4
Phơng pháp hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme tóm bắt
kháng thể IgM (MAC- ELISA)
80
2.3.5
Phơng pháp Western Blot.
81



Chơng III
Kết quả và Bàn luận



A. Kết quả sản xuất bộ sinh phẩm chẩn đóan nhanh
bệnh sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue.
3.1
Nuôi cấy virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2), virus
Dengue type III (D3) và virus Dengue type IV (D4) trên tế bào muỗi
Aedes albopictus dòng C6/36.
82

3.1.1
Nhân virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2), virus
Dengue type III (D3) và virus Dengue type IV (D4) vào tế bào muỗi
Aedes albopictus dòng C6/36 để tách chiết ARN.
82
3.1.2
Quan sát sự nhân lên của virus Dengue trong tế bào muỗi Aedes
albopictus dòng C6/ 36 dới kính hiển vi điện tử
100
3.2
Nghiên cứu qui trình công nghệ biểu hiện, tách chiết, tinh chế kháng
nguyên Dengue tái tổ hợp các type.
106
3.2.1
Kháng nguyên Dengue thô
106
3.2.2
Kháng nguyên tái tổ hợp.
108
3.2.3
Quy trình tách chiết và tinh chế kháng nguyên tái tổ hợp của virus
dengue từ chủng E. coli cho cả bốn typ virus dengue
109
3.3
Tách dòng và xác định trình tự đọan gen PreM và E của 4 type virus
Dengue.
117
3.3.1
Tách RNA tổng số của tế bào muỗi C
6/36

117
3.3.2
Khuếch đại đoạn gene PreM và E bằng phơng pháp RT-PCR
118


3.3.3
Biểu hiện kháng nguyên màng và vỏ của virus Dengue type 1, 2, 3, 4
trong hệ nấm men Pichia pastoris
148
3.3.4
Biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên preM-E (gen preM-env) trong
Pichia pastoris
163
3.3.5
Kiểm tra phản ứng của kháng nguyên DxME tái tổ hợp với kháng thể
kháng virus Dengue tự nhiên bằng Western Blot
167
3.4
Thiết kế cặp mồi và xây dựng kế họach tách dòng gen mã hóa kháng
nguyên vỏ của virus Dengue các type I, II, III, IV.
168
3.5
Chế tạo cộng hợp (Gold monoclonal antibodies) gắn kháng nguyên vào
giá thể (màng thấm Nitrocellulo membrane)
173
3.6
Nghiên cứu dung dịch đệm buffer tối u
dùng trong phản ứng

179
3.7
Hoàn thiện Bộ sinh phẩm
183
3.8
Thử nghiệm Bộ sinh phẩm trong phòng thí nghiệm
198
3.8.1
Thờng qui sử dụng Bộ sinh phẩm chẩn đóan nhanh bệnh sốt Dengue/
sốt xuất huyết Dengue
200
3.8.2
So sánh kết quả thử nghiệm trong phòng thí nghiệm
204
3.9
ứng dụng Bộ sinh phẩm trong thực địa
210
3.9.1
Kết quả kiêm tra tại phòng thí nghiệm Sốt xuất huyêt Arbovirus, Viện
Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng
210
3.9.2
Giá thành và chất lợng Bộ sinh phẩm chẩn đóan nhanh bệnh sốt
Dengue/ sốt xuất huyết Dengue
211
3.9.3
Một số hình ảnh khi tiến hành thí nghiệm tại các điểm nghiên cứu
213

B. Kết quả sản xuất Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh
bệnh viêm đờng hô hấp cấp (SARS)
3.1
Kháng nguyên tái tổ hợp protein N - SARS-CoV
217
3.2
Xác định các thông số cơ bản cho bộ sinh phẩm MAC-ELISA chẩn
đoán nhiễm virus SARS-CoV
218
3.2.1
Xác định thời gian sử dụng tối u của bộ sinh phẩm.
219
3.2.2
Xác định độ đặc hiệu của Bộ sinh phẩm
220
3.2.3
Xác định độ nhạy của sinh phẩm.
220
3.3
Thành phần bộ sinh phẩm.
221
3.4
Phát hiện kháng thể IgM trong huyết thanh bệnh nhân SARS và nhân
221


viên y tế có tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân SARS.

Bàn luận

1
Một phơng pháp chẩn đoán sớm trong phòng thí nghiệm có hiệu quả
226
2
Trong giai đoạn đầu của dịch SARS, một số phơng pháp ELISA đợc
giới thiệu
234
3
Bộ sinh phẩm MAC- ELISA phát hiện sớm nhiễm virus SARS
236
4
Toàn bộ bệnh nhân đợc xác định nhiễm virus SARS-CoV trên lâm
sàng đã đợc khẳng định lại khi phát hiện đợc kháng thể IgM kháng
đặc hiệu virus SARS CoV thông qua phơng pháp MAC-ELISA.
239
5
Sự xuất hiện của KT kháng đặc hiệu virus SARS-CoV trên một số
ngời không có biểu hiện lâm sàng
239



Kết luận
241



Tài liệu tham khảo
244

1
Đặt vấn đề


Trong vòng 15 năm gần đây, nhiều dịch bệnh nguy hiểm ở qui mô khu vực cũng
nh toàn cầu đã xảy ra và lần đầu tiên gây ảnh hởng lớn đến nền kinh tế thế
giới. Tất cả các bệnh dịch nguy hiểm này (nh dịch hạnh ấn Độ vào năm 1994,
dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông 1997, dịch viêm não Nipah tại Malaysia, dịch
SARS hay hội chứng hô hấp cấp tính ở Trung Quốc từ năm 2002 đến 2003, và
cúm gia cầm ở vùng Đông Nam
á
từ năm 2003 đến2007) đều có mầm bệnh
từ động vật và phát sinh tại á Châu và dần dà lây lan làm ảnh hởng đến nền
kinh tế thế giới. Với tiến trình toàn cầu hoá hiện nay, chúng tôi thiết nghĩ trong
tơng lai sẽ xảy ra nhiều dịch bệnh ở tầm mức tơng tự. Hơn nữa, do các yếu tố
xã hội, văn hoá và nhân khẩu ở Châu
á
có lẽ vẫn là nơi tiếp tục xuất hiện các
dịch bệnh bắt nguồn từ động vật Việc phát hiện ổ dịch trong chơng trình
chiến lợc dự phòng sớm tại á châu sẽ giúp chúng ta chủ động phát hiện và
ngăn chặn kịp thời các bệnh dịch đã biết đến cũng nh các bệnh dịch mới phát
sinh. Trong các bệnh dịch mới gần đây, nổi lên có dịch SD/ SXHD và Viêm
đờng hô hấp cấp SARS

Sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue (SD/ SXHD) là một bệnh nhiễm trùng cấp
tính do virus Dengue gây ra. Bệnh không có vacxin và thuốc điều trị. Biểu hiện
lâm sàng của SD/ SXHD rất đa dạng từ sốt cao đột ngột kéo dài 2-7 ngày kèm
theo triệu chứng đau đầu, đau cơ, đau xơng, đau khớp, đau bụng cho tới buồn

nôn, phát ban Sau đó có thể có biểu hiện xuất huyết dới da, xuất huyết nội
tạng (chảy máu cam, chảy máu lợi, nôn ra máu, đi ngoài ra máu ). Ngoài ra
còn có thể có thêm các dấu hiệu khác nh gan to, sốc, huyết áp hạ và có thể dẫn
tới tử vong (Barnes W. J. S. và Rosen L., 1974). Bệnh SD/ SXHD là bệnh do
muỗi (Aedes aegypti, Aedes albopictus) [33] truyền vì vậy bệnh thờng dễ dàng
phát triển thành dịch. Virus Dengue đợc Sabin phân lập đầu tiên ở Calcuta, ấn


2
đ
ộ, New-Guinea và Hawaii (Sabin A. và cs, 1952) Sau này đợc xác định là
virus Dengue type 1-Hawaii và virus Dengue type 2-New-Guinea. Các type virus
Dengue 3 và virus Dengue 4 đợc Hammon W.M. và cs phân lập ở Philippines
vào năm 1956 (Hammon W.M. và cs 1960). Tiếp đó nhiều chủng virus Dengue
đã đợc phân lập từ nhiều vùng khác nhau trên thế giới nhng đều đợc xác định
là thuộc 4 type huyết thanh nêu trên (Anonymous, 1986).


Tới năm 1997 bệnh SD/ SXHD đã lan rộng trên phạm vi toàn thế giới. Theo
Gubler, D.J. (1997) thì hiện nay có tới hơn 2,5 tỷ ngời đang sống trong khu vực
có lu hành SD/ SXHD và hàng năm có khoảng 100 triệu ngời mắc bệnh này.
Để có thể phòng chống bệnh một cách hiệu quả thì việc chủ động giám sát
huyết thanh học, dịch tễ học, côn trùng học virus Dengue gây nên bệnh sốt
Dengue/sốt xuất huyết Dengue là hết sức cần thiết.

Các phơng pháp chủ yếu chẩn đoán huyết thanh học của virus Dengue bao
gồm: Phản ứng Ngăn ngng kết hồng cầu (HI), phản ứng kết hợp bổ thể (CF),
phản ứng trung hòa giảm đám hoại tử (PRNT), phản ứng miễn dịch hấp phụ gắn
enzym phát hiện kháng thể IgM (MAC-ELISA) và phản ứng miễn dịch hấp phụ
gắn enzym phát hiện kháng thể IgG (GAC-ELISA), kỹ thuật RT- PCR

Ngoài bệnh SD/ SXHD, Hội chứng viêm đờng hô hấp cấp tính nặng (SARS) là
một bệnh dịch mới xuất hiện trên phạm vi toàn cầu. SARS đã xuất hiện tại 23
Quốc gia: Trung Quốc, Hồng Kông, Singapore, Canada, Hoa Kỳ, Việt Nam,
Malaysia, Thái Land Tính đến tháng 04 năm 2004 trên toàn thế giới đã có
tổng số mắc/ tổng số chết là: 3169/ 144 ngời (Theo Tổ chức Y tế Thế giới-
WHO) [39].

Tác nhân gây bệnh SARS là một biến thể họ Corona (Coronaviridae); Một
nhóm virus có thể gây bệnh cho cả ngời và động vật [41]. Trên ngời, Corona
thờng gây ra viêm đờng hô hấp trên, chủ yếu ngời trởng thành. Ngoài ra


3
cũng cần chú ý tới một số loại vi khuẩn, virus cơ hội thờng xuyên có mặt ở
đờng hô hấp của ngời; Có thể góp phần gây ra các bội nhiễm đờng hô hấp
dới và viêm phổi không điển hình trên bệnh nhân SARS.

Virus này có sức đề kháng yếu, tồn tại với động lực lớn trong không khí mát
lạnh khoảng 2- 5 giờ. Virus SARS nhạy cảm với nhiệt độ cao, tia cực tím, các
hoá chất khử trùng

Nguồn bệnh và ổ chứa virus SARS: Cha biết rõ ràng. Ngời có thể là nguồn
bệnh chính trong chuỗi mắt xích lây truyền Ngời- Ngời. Ngời bệnh SARS,
nhất là bệnh nhân nặng đang trong giai đoạn khởi phát và toàn phát là nguồn
truyền nhiễm nguy hiểm. Theo qui luật chung của các bệnh do virus thì SARS
có thể thải mầm bệnh từ 5 đến 15 ngày sau khởi phát. Thời gian ủ bệnh trung
bình 7 ngày; Một số trờng hợp có thể kéo dài tới 14- 15 ngày [32].

Triệu chứng: Hắt hơi, chảy nớc mũi, ngạt mũi, ho, đau họng hoặc khó thởCó

thể dẫn đến biến chứng nh: Nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não do bội nhiễm
vi khuẩn

Để chẩn đoán bệnh này, ngời ta thờng:
Phát hiện trực tiếp virus hoặc kháng nguyên virus. Có thể có kết quả trong vài
giờ nếu bệnh phẩm lấy tốt; Rồi tiến hành các kỹ thuật:
- Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp là phơng pháp nhạy cảm để phát hiện virus
trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng và nuôi cấy tế bào. Tỷ lệ dơng tính là 30%.
- Các phơng pháp khác: Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) dùng trong nghiên
cứu. Kỹ thuật này khá chính xác nhng đòi hỏi các trang bị kỹ thuật đắt tiền
cũng nh tay nghề của cán bộ kỹ thuật

Việc phát hiện nhanh virus Dengue gây bệnh SD/ SXHD hay bệnh Viêm đờng
hô hấp cấp SARS sẽ giúp cho các bác sỹ lâm sàng có hớng điều trị thích hợp và


4
các nhà Dịch tễ học đa ra các giải pháp hữu hiệu, làm giảm tỷ lệ mắc và tỷ lệ
chết vì bệnh này.

Có nhiều phơng pháp chẩn đoán hai bệnh trên trong phòng thí nghiệm, tuy
nhiên đều tuân thủ nguyên tắc:
- Phát hiện kháng thể (IgG, IgM) kháng virus Dengue hay virus Corona trong
huyết thanh bệnh nhân.
- Xác định virus trong huyết thanh hoặc trong các tổ chức có khả năng nhiễm
virus
.


Dựa vào các điều kiện trên mà chúng tôi đa ra mục tiêu của Chơng trình

nghiên cứu này là:
1. Xây dựng đợc qui trình kỹ thuật chẩn đoán nhanh và chính xác sốt
Dengue/ sốt xuất huyết Dengue và bệnh Viêm đờng hô hấp cấp (SARS).
2. Sản xuất Bộ sinh phẩm chất lợng cao, dễ sử dụng cho việc chẩn đoán
bệnh sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue và bệnh Viêm đờng hô hấp cấp
(SARS).













5
Chơng I.
Tổng quan tài liệu

A. Nghiên cứu virus dengue gây bệnh Sốt Dengue/ Sốt xuất
huyết Dengue ở Việt Nam


1.1 Bệnh sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue
1.1.1. Biểu hiện lâm sàng
Sốt Dengue/ Sốt xuất huyết Dengue đợc chia thành nhiều cấp độ khác nhau tuỳ

theo mức độ nặng của bệnh mà bệnh nhân có những biểu hiện nh: sốt cao từ
38
0
C đến 40
0
C, thời gian kéo dài 2-7 ngày kèm theo các triệu chứng đau đầu,
đau cơ, buồn nôn, phát ban, có thể kèm theo rét tuy không thành cơn, choáng
váng, chóng mặt, xuất huyết dới da, xuất huyết niêm mạc, xuất huyết phủ tạng.
ở thể nặng bệnh nhân có thể bị sốc hay còn gọi là hội chứng sốc Dengue
(HCSD). HCSD xảy ra với trẻ em nhiều hơn ở ngời lớn, phổ biến nhất vào ngày
sốt thứ 4 đến thứ 6, ở bệnh nhân nặng có dấu hiệu suy tuần hoàn, đau bụng, bồn
chồn, vật vã, nếu không đợc can thiệp sớm bệnh nhân có thể bị tử vong sau từ
12 đến 24 giờ [8].

Các triệu chứng của bệnh thờng rất đa dạng nhng lại không có tính chất đặc
trng. Do đó, không thể phân biệt đợc sự khác biệt về lâm sàng giữa các bệnh
nhân nhiễm các type virus Dengue khác nhau. Mặt khác, các triệu chứng này
cũng tơng tự nh các triệu chứng gặp phải khi bị nhiễm các loại virus gây bệnh
khác nh cúm, sởi, viêm não.

Căn cứ theo biểu hiện lâm sàng của bệnh SD/ SXHD có thể chia thành 3 cấp độ
sau đây :
+ Sốt Dengue (SD): còn gọi là sốt Dengue cổ điển, thờng có các triệu


6
chứng nh các bệnh nhiễm virus khác là: sốt từ 38
0
C- 40
0

C, đau mỏi cơ và các
khớp xơng, đau đầu vùng trán và thái dơng, rất ít gặp mảng xuất huyết dới
da, tỉ lệ tử vong thấp (khoảng 0.018%) [21].
+ Sốt xuất huyết Dengue: Sốt cấp tính cao, kéo dài 2-7 ngày kèm theo nhức
đầu, đau khớp, đau cơ, xuất hiện mảng hoặc chấm xuất huyết dới da, niêm
mạc, xuất huyết nội tạng, hạ sốt do xuất huyết nhiều, xuất hiện các biểu hiện
nh chảy máu mũi, chảy máu chân răng nhiều và kéo dài [21]
+ Hội chứng sốc Dengue: có các biểu hiện tợng tự nh SXHD nhng còn
kèm theo hiện tợng mạch đập nhanh, huyết áp tụt, da lạnh và ớt. Khi sốc sâu,
kéo dài có thể dẫn tới suy thận cấp, rối loạn tiêu hoá, ngừng tim, xuất huyết nội
tạng và tử vong sau 12-24 giờ [30].

ở ngời mắc sốt Dengue thờng thấy các đặc điểm nh: Hạch lympho sng đau
toàn thân, lợng tiểu cầu ít giảm, giãn mạch ngoại vi, bạch cầu giảm, hematocrit
tăng nhẹ. Đối với trờng hợp mắc SXHD thì có thêm các đặc điểm khác nữa
nh: gan to, tiểu cầu giảm, hematocrit tăng hơn 20% so với bình thờng, có biểu
hiện vàng da, xuất huyết phủ tạng hệ tiêu hoá và ngoài tiêu hoá nh não, màng
não nặng có thể chuyển sang các giai đoạn khác nghiêm trọng hơn nh SXHD
thể não (hội chứng não cấp), SXHD thể suy gan cấp

1.1.2 Tác nhân truyền bệnh
Bệnh SD và SXHD lây qua đờng máu. Các nghiên cứu về trung gian truyền
bệnh đã xác định muỗi vằn Aedes aegypti (A.aegypti) là vector chủ yếu, ngoài ra
các loại muỗi khác nh Aedes albopictus, Aedes polynesiens cũng có thể truyền
bệnh SXHD. Muỗi A.aegypti là loại muỗi sống ở trong nhà hoặc xung quanh
nhà. Chỉ có muỗi cái đốt ngời vào ban ngày, chủ yếu vào sáng sớm và chiều tối
[35]. Muỗi cái có thể truyền bệnh sau thời kỳ ủ bệnh 3 đến 10 ngày hoặc có thể
truyền bệnh ngay nếu đang hút máu bệnh nhân dở dang rồi đốt sang ngời khác.
Nơi đậu của muỗi là những chỗ tối tăm trong nhà nh: hốc tủ, gầm giờng, gầm

7
bàn, chỗ treo quần áo, chăn màn (80.5%) và những vật dụng khác. Một điểm
đáng lu ý là muỗi A.aegypti có khả năng truyền virus Dengue qua lăng quăng,
nghĩa là virus Dengue có chu kỳ xuyên qua trứng. Đây cũng là một yếu tố quan
trọng trong công tác phòng chống bệnh, diệt muỗi trởng thành phải đi đôi với
diệt lăng quăng trong các vật chứa nớc. Điều này chính là cơ sở của phơng
pháp quản lý muỗi dựa và cộng đồng. Vòng đời của muỗi A.aegypti đợc thể
hiện ở Hình 1.1.










Sau khi bị nhiễm virus, muỗi sẽ bị nhiễm suốt đời. Muỗi cái có thể truyền virus
Dengue cho trứng và trứng lại có khả năng tồn tại rất lâu trong điều kiện khô
hạn (có thể trên 1 năm) [24], đây là một yếu tố khó khăn cho việc diệt muỗi.
Muỗi sinh sản vào mùa ma, ở những nơi chứa nớc nhân tạo (vũng nớc đọng,
chum, vại v.v).

Thời gian virus nhân lên trong hạch nớc bọt muỗi là từ 3 10 ngày tuỳ theo
nhiệt độ môi trờng. Muỗi cái có thể truyền dọc virus Dengue sang thế hệ sau
tuy nhiên đờng truyền dọc này không có vai trò lớn trong cơ chế lây truyền
Dengue sang ngời, ngời vẫn là vật chủ chính nhân virus Dengue.
1.1.3 Tình hình dịch bệnh trên thế giới

Sốt Dengue/ Sốt xuất huyết Dengue là bệnh nhiễm virus cấp tính đang lan tràn
rộng trên thế giới Bệnh thông thờng là nhẹ (sốt Dengue - SD) nhng có thể
H
ình 1.1. Vòng đời của Muỗi


8
nặng nếu có xuất huyết (Sốt xuất huyết Dengue- SXHD). Bệnh hay bùng nổ
thành dịch lớn ở những vùng cha từng bị nhiễm virus Dengue và có điều kiện
thuận lợi cho sự phát triển lan tràn của vectơ truyền bệnh.

Dịch Sốt Dengue lần đầu tiên đợc Y văn ghi nhận là vào mùa hè năm 1780 tại
Philadenphia, Hoa Kỳ. Sau đó bệnh đợc thấy ở nhiều nớc nhiệt đới và cận
nhiệt đới Tại châu A, năm 1953, SXHD xuất hiện lần đầu tiên ở Manila
(philipin). Rồi Thái Lan, Indonexia, Singapore, India, Banglades ở vùng Tây
Thái Bình Dơng, có từ 28 đến 35 nớc đã trải qua các vụ dịch SD/ SXHD. Sốt
Dengue và sốt xuất huyết Dengue đã đợc các nớc trên thế giới công nhận là
một vấn đề Y tế công cộng quan trọng [34].

Tại Việt Nam, SXHD đợc phát hiện lần đầu tiên ở miền Bắc vào năm 1958;
Còn miền Nam là năm 1960. Sau đó dịch lan rộng tới hầu hết các tỉnh trong cả
nớc Những năm có dịch lớn là: 1969,1977,1978,1979,1980,1983,1987,1991,
1994, 1998. Hiện nay bệnh SD/ SXHD không chỉ lu hành ở thành thị, khu vực
đông dân c mà còn lan tràn cả các vùng nông thôn đồng bằng, trung du và
miền núi [26].

Theo thống kê cuả TCYTTG thì ở Việt Nam từ năm 1963 đến năm 1988 có số
bệnh nhân mắc trên số bệnh nhân chết về SD/ SXHD là 1.111.734/ 10.415; đây
là số lợng bệnh nhân mắc và chết lớn nhất so với các nớc trong khu vực Đông
Nam A và Tây Thái Bình Dơng, tính trung bình hàng năm có 50.000 - 100.000

ngời mắc SD/ SXHD.
Bệnh cảnh lâm sàng của sốt Dengue kèm theo xuất huyết đợc Hamon và CS
mô tả năm 1953 ở Manila (Philippine). Đến năm 1956, cũng tại Manila, virus
Dengue đã đợc Sabin phân lập từ máu bệnh nhân và muỗi.

Từ năm 1979 đến năm 1980 dịch lan sang vùng nam Thái Bình Dơng, Bắc
Qeensland (Australia)


9

ở châu Mỹ, sau vụ dịch đầu tiên tại Philadenphia năm 1780 thì mãi đến năm
1826-1828, ngời ta lại ghi nhận có những trận dịch tơng tự xảy ra tại vùng
biển Caribe (Nam Mỹ). Trong thập kỷ từ 1950 đến 1960, tại vùng này có những
chiến dịch lớn nhằm loại trừ muỗi truyền bệnh đã đợc tiến hành ở Mexico,
Panama Nhng sau đó muỗi lại xuất hiện ở hầu hết các nớc trong vùng. Từ
đó tần số các vụ dịch SXHD lại tăng lên với đầy đủ cả 4 type virus Dengue.
Trong 15 năm gần đây do sự giao lu thuận tiện nên chỉ từ tháng 1 đến tháng
10/1995 đã có 200.000 bệnh nhân sốt Dengue và 5.500 bệnh nhân sốt xuất huyết
Dengue đợc báo cáo từ các nớc: Brazin, Hondurat, Nicaragoa, Venezuela.

Nhìn vào Hình 1.2. Bản đồ dịch tễ về tình hình mắc SD/ SXHD trên thế giới có
thể nhận thấy rằng dịch SD/SXHD có xu hớng lan rộng không những trong mỗi
nớc mà còn ra nhiều nớc khác; Năm 1970- 1980 SD/ SXHD lan ra các nớc
trong khu vựv Đông Nam A; Tiếp theo 1980- 1997, dịch SD/ SXHD lan sang Ân
Độ.Từ đó hàng năm có sự gia tăng số nớc báo có dịch và số trờng hợp mắc
bệnh. Rồi tiếp đến các nớc vùng Tây Thái Bình Dơng và Trung Mỹ đang là
vùng hoạt động mạnh của virus Dengue gây nên bệnh SD/ SXHD. Theo thống
kê của WHO từ năm 1995 đến nay, mỗi năm có khoảng 50 triệu ngời bị nhiễm
virus Dengue với khoảng 500.000 trờng hợp phải nhập viện do mắc SXHD,

trong đó có khoảng 12.000 trờng hợp tử vong hoặc cao hơn nữa nếu nh bệnh
nhân không đợc chẩn đoán và điều trị kịp thời. Đặc biệt vào những tháng đầu
năm 2004, tại Inđônêxia dịch SD/SXHD đã bùng phát mạnh với tổng số trờng
hợp bị nhiễm hơn 80.000, số tử vong là hơn 1000 trờng hợp [17].


10

Hình 1.2. Bản đồ dịch tễ về tình hình mắc SD/ SXHD trên thế giới
Nhìn vào Hình 1.3, ta thấy bệnh SD/ SXHD hiện đang lu hành tại vùng
Trung, Nam Mỹ và vùng Đông Nam A.



Hình 1.3. Vùng lu hành bệnh SD/ SXHD hiện nay


11

Bệnh SD/ SXHD hiện đang đe dọa tính mạng và sức khỏe tời hàng tỷ ngời nằm
trong khu vực nhiệt đới, A nhiệt đới [14].

1.1.4 Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam
ở Việt Nam, từ năm 1913, Gaide đã thông báo về bệnh Dengue cổ điển ở miền
Bắc và miền Trung. Năm 1929, Boye có viết về một vụ dịch Dengue cổ điển xảy
ra ở miền Nam Việt nam vào năm 1927.

Miền Bắc Việt Nam, vụ dịch SXHD đâu tiên đợc Mirosky. J, F. Vymola,
Hoang Thuc Thuy ghi nhận vào mùa hè năm 1958 [19]. Nhiều tác giả đã mô tả
các đặc điểm lâm sàng của 68 bệnh nhân nằm viện giống hệt nh các nét lâm

sàng của những trờng hợp mắc SXHD ở các nớc khác trong vùng đã đợc xác
minh về mặt virus học. Tiếp đó, năm 1969, đã có dịch lớn xảy ra ở 19 tỉnh,
thành phố miền Bắc [23]. Theo Trơng Uyên Ninh và CS [27]: Năm 1976 có 11
tỉnh thì đến 1987 lên đến 17 tỉnh thành miền Bắc có SD/ SXHD.

Miền Nam Việt Nam, dịch SXHD đợc mô tả đầu tiên vào năm 1960 với 60
bệnh nhân tử vong. Tiếp theo, từ tháng 6 đến tháng 10 năm 1963, có 331 bệnh
nhân nhập Viện và tử vong 116 trờng hợp do virus Dengue type 2 đã đợc
Halstead ghi nhận. Sau đó, liên tục năm nào cũng có bệnh nhân thờng xảy ra
hàng năm ở các tỉnh, thành phố đông ngời, miền đồng bằng châu thổ và các
vùng ven biển. Bệnh đã lan rộng đến các thị xã, thị trấn, huyện lỵ miền núi, trên
các trục đờng giao thông chính liên tỉnh. Số mắc trung bình hàng năm từ
50.000 - 100.000 ngời. Trong giai đoạn 1980-1989, SD/ SXHD có tỷ lệ chết
đứng đầu: 0,84/100.000 dân. Từ 1985-1989 tỷ lệ mắc cao thứ ba trong các bệnh
truyền nhiễm: 201,5/ 100.000 dân, sau hội chứng cúm và ỉa chảy [9]. Theo Lê
Hồng Hinh và CS [10] thì SD/ SXHD là một trong 10 bệnh truyền nhiễm có tỷ
lệ mắc và chết cao nhất ở Việt Nam (1994).



12
1.2. ViruS Dengue


M
E
Lipids t vt ch
H gen ssRNA
~ 11 kb

Capsid

3
N.R.

V
ựng cu
trỳc
V
ựng khụng
cu trỳc
CAP
5

N.C.R
~ 100 nt
Si ARN n cha khong 11,000 baz
650


prM

E

NS

NS

NS
2a 2b 4a 4bC

: NS2B/NS3 serine protease complexe
: Furin-like Golgi protease

: ER signalases

Enzymes liờn quan
n quỏ trỡnh dch
mó

Hình 1.4. Hình thái cấu trúc của virus Dengue
Vùng NS1 NS5: Khu vực có cấu trúc giống các virus thuộc họ Flaviviridae
(Chiếm >50% số lợng nucleotid trong chuỗi ARN)
Vùng C-prM-E: Khu vực có cấu trúc riêng biệt (Khu vực mở)
1.2.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc
Virus Dengue thuộc họ Flaviridae, giống Flavivirus bao gồm 4 type huyết
thanh là Dengue1, Dengue2, Dengue3, Dengue4. Virus Dengue hình khối cầu có
đờng kính khoảng 40-50 nm, chứa một sợi ARN đơn-dơng (khoảng 10200
nucleotide). Cũng nh các Flavivirus khác virus Dengue có một lớp vỏ


13
(envelope) bản chất là glycoprotein-lipit bao quanh màng protein, lớp vỏ này bắt
nguồn từ màng tế bào vật chủ (Hình 1.4). Ngoài ra nucleocapsid có cấu trúc đối
xứng 20 mặt. Hạt virus có hệ số lắng khoảng 175S đến 215S. Tỷ trọng xác định
bằng ly tâm gradien sacarosa khoảng 1.19 g/cm
3
. Tỷ lệ này có thể thay đổi đôi
chút do các kỹ thuật tinh chế [25]

1.2.2 Genome của virus
Virus Dengue có hệ gen của Flavivirus điển hình. Genome là một sợi ARN đơn,
dơng có chiều dài xấp xỉ 10200 ribonucleotit. Hệ gen chứa một khung đọc mở
mã hoá thành một chuỗi polyprotein duy nhất. Chuỗi này, sau đó sẽ đợc phân
cắt bởi các enzyme của tế bào vật chủ và các enzyme của virus thành 10 phân tử
protein chức năng, bao gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein phi cấu trúc. Genome
của virus Dengue có cấu trúc phân bố của các gen theo thứ tự nh sau: 5-C-
preM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3 (Hình 1.5).











- Đầu 5 không mã hoá dài khoảng 100 nucleotit.
- Đầu 5 không mã hoá dài khoảng 100 nucleotit, đợc metyl hoá đảm
bảo sự bền vững cho vật liệu di truyền. Đầu 3 (không đợc polyadenin hoá)
không mã hoá dài khoảng 400 nucleotit.
H
ình 1.5. Cấu trúc bộ gen của virus Dengue


14
- Khoảng một phần t chiều dài của genome tính từ đầu 5 mã cho các
protein cấu trúc: protein lõi (C), protein màng (M), protein vỏ (E). Đoạn gen này

đã đợc hiểu rõ và đã đợc giải trình tự. Đoạn này chứa nhiều vùng đặc hiệu loài
và đặc hiệu type. Ngời ta dựa vào các vùng đặc biệt này để phân biệt cấu trúc
gen của các virus trong nhóm và các type virus trong loài.
-Phần còn lại của genome mã hoá cho 7 protein phi cấu trúc thực hiện các
chức năng sinh học xác định vòng đời của virus. Chức năng của các protein này
đến nay vẫn cha đợc biết đầy đủ.
Khoảng 1/ 4 chiều dài của genome tính từ đầu 5 (khoảng hơn 2000
nucleotid) mã hoá cho các protein cấu trúc. Đoạn gen này chứa nhiều vùng
quyết định kháng nguyên quan trọng góp phần đánh giá đặc hiệu type. Tính chất
đặc trng của vùng này cho phép phân biệt cấu trúc gen của các virus trong
nhóm và trong cùng type huyết thanh. Hiện nay đã phân biệt đợc 4 type huyết
thanh của virus Dengue gây bệnh là: virus Dengue type I (D1), virus Dengue
type II (D2), virus Dengue type III (D3) và virus Dengue type IV (D4). Về
phơng diện kháng nguyên , cả 4 type huyết thanh này đều có liên quan chặt chẽ
với nhau và có phản ứng chéo nhau [6]. Khi cơ thể nhiễm một trong bốn type
virus Dengue, cơ thể sẽ sinh miễn dịch đối với type virus đó trong một thời gian
dài nhng không có tác dụng miễn dịch đối với các type còn lại. Điều này giải
thích tại sao một ngời có thể nhiễm cả bốn type virus trong suốt cuộc đời [12,
25].


Protein cấu trúc

Bao gồm protein lõi (C), protein vỏ (E), protein màng (M).
+ Protein lõi (C) là protein có kích thớc nhỏ và là thành phần cơ
bản tạo nên lõi nucleocapsit của virus.
+ Protein vỏ (E) có nguồn gốc từ màng tế bào chủ, đợc glycosyl
hoá ở pH thấp, mang các kháng nguyên trung hoà, kháng nguyên gây ngng kết
hồng cầu và tơng tác với các thụ thể gây ra các triệu chứng của SD/SXHD.

15
+ Protein màng (M) Có hai dạng phụ thuộc vào độ sinh trởng của
virus bao gồm M có khối lợng phân tử 8 kDa và pre_M có khối lợng phân tử
19 23 kDa.

Protein phi cấu trúc

Chức năng của nhóm protein này cha đợc biết một cách đầy đủ. Các
chức năng sinh học này xác định vòng đời của virus . Cấu trúc đoạn gen này khá
giống nhau ở các type virus Dengue khác nhau, đây chính là nguyên nhân gây
lên các phản ứng chéo nhau trong chẩn đoán huyết thanh học.
+ NS1 là glycoprotein ở dạng chất tiết hoặc không tiết, có thể giữ vai
trò sao chép ban đầu
+ NS2 có thành phần là các enzyme quan trọng trong việc sao chép
ARN, helicase và ARN triphotphatase tạo thành cấu trúc đầu 5, protease để
phân cắt polyprotein và liên kết với màng.
+ NS5 thành phần là các enzyme polymerase phụ thuộc ARN có chức
năng phiên mã DNA và enzyme methyltransferase metyl hoá đầu 5.
+ Ngoài ra còn có các vị trí của NS2A, NS2B, NS4A, NS4B. Các
protein này cùng phối hợp thực hiện các chức năng sinh học trong vòng đời của
virus [12].

1.2.3 Chu trình nhân lên và cơ chế gây bệnh của virus Dengue



16

dng sao chộp
B mỏ
y

Golgi

nhõn
Endoplasmic reticulum
Plasma membrane
E
n
d
os
o
m
e
H
+

H
+

H
+

H
+

H
+

H
+

H
+

H
+

H
+

RCs
+
-
-
+
NC
3-10 h p.i.
dsRN
A
prME
NS1

Flaviviri
on
> 20 h p.i.
Cỏc nhõn t gn v th th


>15 h p.i.
+
+
RCs
RF
IR
Ht virut


Hình 1.6. Cơ chế gây bệnh của virus Dengue

Sau khi bám vào tế bào chủ, nhờ liên kết với các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế
bào chủ thích hợp là Fc và C
3
, virus Dengue xâm nhập ngay vào tế bào theo cơ
chế thực bào. Tại vùng có pH thấp, hình dạng của virus bị biến đổi, xảy ra quá
trình dung giải vỏ protein E, ARN virus đợc giải phóng vào trong bào tơng.
ARN virus hoạt động nh một mARN nhờ enzyme polymerase của tế bào chủ
trực tiếp dịch mã thành polyprotein. Hoạt động này diễn ra trong tế bào chất
vùng gần nhân và đợc sự hỗ trợ của mạng lới nội chất. Để sao chép genome
của mình, virus phải tạo một sợi ARN âm bổ sung với sợi đơn dơng của mình.
Quá trình này đợc xúc tác bởi một protein là replicase và enzyme ARN
polymerase của tế bào chủ, sau đó ARN sợi đơn âm này sẽ đợc sử dụng nh
một sợi khuôn để tổng hợp ra một bản sao mới của sợi dơng. Khi các protein

capsit đợc tổng hợp đủ, chúng tập hợp lại thành một cấu trúc rỗng gọi là
procapsit, sợi ARN dơng đi vào cấu trúc này và kết hợp thành nucleocapsit.


17
Các nucleocapsit này di chuyển đến màng tế bào chất nhờ bộ máy Golgi, sau đó
chúng di chuyển đến mặt trong của màng và đợc bao bọc bởi màng. Các hạt
virus trong một tế bào đợc hình thành và giải phóng ra ngoài do tế bào chủ bị
huỷ hoại. Các nucleocapsit có màng bao chính là màng sinh chất của tế bào chủ
cũ và các virion mới có thể sử dụng các bao màng này để hoà nhập với màng
của tế bào chủ mới (Hình 1.6).

ở trong cơ thể, virus Dengue tăng sinh trong các đại thực bào. Khi cơ thể bị
nhiễm virus Dengue type khác thì những kháng thể có sẵn trong cơ thể không có
khả năng phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên nên không trung hoà đợc kháng
nguyên của virus. Virus xâm nhập vào bạch cầu đơn nhân, số lợng bạch cầu
đơn nhân to tăng lên. Hoạt hoá các CD4, CD8, lympho độc tế bào. Các lympho
T hoạt hoá giải phóng ra nhiều cytokinin, các bạch cầu đơn nhân to nhiễm virus
bị ly giải do đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. Xuất hiện thoát huyết
tơng và xuất huyết [15]. Theo thống kê có đợc từ Tổ Chức Y Tế Thế Giới thì
cả bốn type virus đều có thể gây SD, SXHD và shock Dengue.

1.2.4. Đặc điểm kháng nguyên
Virus Dengue mang các kháng nguyên trung hoà, kháng nguyên gây ngng kết
hồng cầu, kháng nguyên kết hợp bổ thể trên protein màng (E) [15]. Virus
Dengue có nhiều kháng nguyên, trong đó có kháng nguyên đặc hiệu type, kháng
nguyên chung của phân nhóm và của nhóm, dựa vào sự khác biệt giữa các đặc
điểm quyết định kháng nguyên ngời ta phân chia virus Dengue thành 4 type
khác nhau từ virus Dengue type I (D1) đến virus Dengue type IV (D4). Cả 4
type huyết thanh của virus Dengue rất gần nhau về phơng diện kháng nguyên

nhng khác nhau ở chỗ có một phần miễn dịch chéo. Virus Dengue còn có
chung một số đặc điểm kháng nguyên với một số Flavivirus khác. Kháng
nguyên của virus Dengue khu trú ở đại thực bào phổi, lách, gan, tuyến ức, các tổ
chức da và bạch cầu đơn nhân. Khi xâm nhập vào cơ thể các kháng nguyên của
virus là kháng nguyên trung hoà, kháng nguyên ngng kết hồng cầu và kháng